HUT62944A - Inhibition of papilloma virus with opposite oligonucleotides - Google Patents
Inhibition of papilloma virus with opposite oligonucleotides Download PDFInfo
- Publication number
- HUT62944A HUT62944A HU921865A HUP9201865A HUT62944A HU T62944 A HUT62944 A HU T62944A HU 921865 A HU921865 A HU 921865A HU P9201865 A HUP9201865 A HU P9201865A HU T62944 A HUT62944 A HU T62944A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- oligonucleotides
- papillomavirus
- oligonucleotide
- mrna
- cells
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/708—Specific hybridization probes for papilloma
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/315—Phosphorothioates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
A találmány papillomavírus gátlására, és állatok papillomavírus által okozott fertőzéseinek diagnosztizálására és kezelésére vonatkozik. A találmány papillomavírus kimutatására és mennyiségének meghatározására is vonatkozik, a vírust feltehetőleg tartalmazó mintákban.. Ezenkívül a találmány oligonukleotidokra és oligonukleotid analógokra is vonatkozik, amelyek a papillomavírusból származó messenger RNS (mRNS) működését zavarják vagy módosítják. Az ilyen zavarást a papillomavírus okozta fertőzések diagnosztizálására és kezelésére eszközként alkalmazhatjuk. Ez lehet az alapja a kutatási célokra alkalmazott reagenseknek és a kutatásban vagy diagnosztizálásra alkalmazott készleteknek is.
A papillomavírus (PV) a természetben igen elterjedt, és rendszerint közönségesen szemölcsnek nevezett, jóindulatú hámszövet! és rostos hámszöveti elváltozásokat okoz. A papillomavírust számos magasabb rendű gerincesben - például emberben, szarvasmarhában, nyúlban, szarvasban és számos madárfajban - kimutatták már és izolálták is ezekből. Noha ezek a vírusok általában jóindulatú elváltozásokat okoznak, bizonyos körülmények között olyan elváltozásokat is okozhatnak, amelyek elrákosodhatnak. Számos tanulmányban kimutatták, hogy bizonyos rákos elváltozásokban nagy százalékban vannak jelen transzkripcionálisan aktív humán papillomavírus (HPV) dezoxiribonukleinsavak, és ebből arra következtethetünk, hogy ezek a vírusok kóroktani szerepet játszhatnak bizonyos humán daganatok kifejlődésében [zűr Hausen H. és Schneider A.: The Papovaviridae, 2. kötet, szerk. N.P. Salzman és P.M. Howley, 245-264. oldal, Plenum Press, New York • * ·
- 3 (1987)] .
Emberben a humán papillomavírus különféle betegségeket okoz, például közönséges szemölcsöt a kézen és lábon, gégeszemölcsöket és genitális szemölcsöket. Több, mint 57 fajta HPV-t azonosítottak eddig. Mindegyik HPV-nek van egy kedvelt anatómiai helye a fertőzésre; általában mindegyik vírus egy specifikus lézióval kapcsolatos. A PV fertőzések egyik legsúlyosabb megnyilvánulását képezik a genitális szemölcsök, amelyeket venereás (szexuális közösüléssel terjedő) szemölcsnek vagy condylomata acuminatanak is neveznek. A Center fór Disease Controll jelentése szerint a genitális szemölcsök átadásának szexuális módja bizonyított, és a genitális szemölcsök előfordulásának gyakorisága egyre növekedik. A genitális szemölcsök súlyosságát hangsúlyozza az a legújabb felfedezés, hogy a HPV DNS megtalálható a méhnyaki intraepiteliális neoplázia (CIN I-III) minden fokozatában, és a HPV típusok specifikus összetételben megtalálhatók a cervix karcinomájában in situ. Ezért azok a nők, akiknek specifikus HPV típusokat tartalmazó genitális szemölcsük van, fokozottan veszélyeztetettek a méhnyakrák kifejlődése szempontjából. A genitális szemölcsök jelenlegi kezelése elégtelen.
Nagy, és ezidáig kielégítetlen igény van olyan készítményekre, amelyek a papillomavírussal interféráinak. Hasonlóképpen igény van az állatok papillomavírus fertőzéseinek gyógyítására és diagnosztizálására szolgáló eljárásokra is. Ezenkívül szükség van a papillomavírus tanulmányozására alkalmas jobb készletekre és reagensekre is.
• ·
- 4 A találmány egyik célja olyan oligonukleotidok és oligonukleotid analógok előállítása volt, amelyek képesek a papillomavírus mRNS-ével hibridizálódni, és ezáltal a mRNS működését gátolni.
A találmány további célja olyan oligonukleotidok és oligonukleotid analógok előállítása volt, amelyek képesen a papillomavírus DNS funkcionális expresszióját módosítani a vírus mRNS-ével való, úgynevezett ellentétes értelmű (antiszensz) kölcsönhatás révén.
A találmány célja ezenkívül az állatok papillomavírus fertőzéseinek diagnosztizálására és gyógyítására szolgáló eljárások kidolgozása volt.
A találmány ezenkívül új oligonukleotidokra és oligonukleotid analógokra vonatkozik.
A találmány egyéb céljai szakember számára az alábbi leírásból nyilvánvalóvá válnak.
Az ábrákat röviden az alábbiakban ismertetjük.
Az 1. ábra mutatja néhány PV genom genetikus szerveződésének sematikus térképét.
A 2. ábrán látható a BPV-1 marha papillomavírus részleges géntérképe, amely mutatja a nyitott leolvasási kereteket, ORF-eket, és a genomból átírt mRNS-eket.
A 3. ábrán látható a BPV-1 E2 transzaktivátor gén mRNS nukleotid szekvenciája, amely a 2443-4203. nukleotidokat tünteti fel.
A 4. ábrán látható a BPV-1 E2 transzaktivátor gén mRNS nukleotid szekvenciája, amely a 2443-3080. nukleotidokat tartalmazó domént tünteti fel.
• ·* ·
- 5 Az 5. ábrán látható a BVP-1 korai mRNS-eket kódoló 5' közös nem-transzlatált régiójának nukleotid szekvenciája, amely a 89-304. nukleotidokat tartalmazó domént tünteti fel.
A 6. ábra mutatja a találmány szerinti ellentétes értelmű oligonukleotidok nukleotid szekvenciáját, és az oligonukleotidok relatív helyzetét az E2 mRNS-ben. Feltüntettük az oligonukleotid azonosítási jelét, szekvenciáját és funkcionális szerepét is.
A 7. ábra mutatja grafikusan a találmány szerinti ellentétes értelmű oligonukleotidok hatását az E2 expressziójára. A mRNS CAP régióját és az E2 transzaktivátor transzlációs kodonját befolyásoló oligonukleotidok (11751 illetve 11753) vizsgálataink szerint mikromoláris koncentrációban csökkentik az E2 transzaktivációt.
A 8. ábrán grafikusan ábrázoljuk a találmány szerinti ellentétes értelmű oligonukleotidok dózis-hatás görbéjét.
A dózis-hatás görbéből látszik, hogy az E2 transzaktivátor mRNS-sel komplementer ellentétes értelmű oligonukleotid, az 11753 50 %-os gátló koncentrációja (IC5Q) a transzlációs iniciátor kodont magában foglaló régióban 50-100 nmol/1, míg az ugyanazon üzenet CAP régiójára ható oligonukleotid (11751) IC5Q értéke 500 nmol/1 körül van.
A 9. ábrán látható az E2 mRNS transzaktivátor és transzrepresszor régióit befolyásoló találmány szerinti ellentétes értelmű oligonukleotidok nukleotid szekvenciája.
A 10. ábra mutatja grafikusan az E2 mRNS transzaktivátor régióját befolyásoló kiválasztott oligonukleotidok hatásait. A találmány szerinti 15-20-mer ellentétes értelmű • · · • ·· oligonukleotidok láthatólag gátolják az E2 transzaktivációt.
A 11. ábra mutatja grafikusan az E2 mRNS transzrepresszor régióját befolyásoló kiválasztott oligonukleotidok hatásait. A találmány szerinti 15-20-mer ellentétes értelmű oligonukleotidok láthatólag gátolják az E2 transzrepressziót.
A 12. ábra fényképen mutatja az E2 transzaktivátor gátlás következményeinek hatását in situ a BVP-1 biológijára. Vizsgáltuk a találmány szerinti ellentétes értelmű oligonukleotidok hatását C127 sejtek BVP-1 általi transzformálásának gátlására vagy gyengítésére. A fényképen a vizsgált sejtek tenyészetét tartalmazó petricsészék láthatók.
A 13. ábra mutatja grafikusan az E2 mRNS transzaktivátor régióját befolyásoló kiválasztott oligonukleotidok hatásait. Látható a BVP-1 gócok kialakulásának gátlása a találmány szerinti oligonukleotidok által. Az 11751 és 11753 dózis-hatás görbéi azt mutatják, hogy az 11753 IC50 értéke 10 nmol/1 körüli, míg az 11751 IC5Q értéke 100 nmol/1 körül van.
A 14. ábra grafikusan mutatja a találmány szerinti ellentétes értelmű oligonukleotidok hatását a BVP-1 saját genomját replikáié képességére. A vírussal transzformált sejteket 11753-mal és 11751-gyel kezeltük, és meghatároztuk a virális DNS mennyiségét.
A 15. ábrán láthatók az immunprecipitációs vizsgálatok eredményei, amelyekben metabolikusan jelzett oligonukleotiddal kezelt sejteket vagy kezeletlen kontrollokat immunprecipitáltunk monoklonális antitesttel.
β··· • · · _ 7 — ·· ·· · · *·
A 16. ábrán látható a HPV-11 nukleotid szekvenciája az E2 transzlációs iniciátor kodon régiójában.
A találmány előnyös kiviteli alakjai olyan oligonukleotidok vagy oligonukleotid analógok, amelyek a papillomavírus mRNS-ével hibridizálnak. Ezt a kölcsönhatást nevezzük egyszerűen ellentétes értelmű-nek. Az oligonukleotidok és oligonukleotid analógok képesek az RNS funkcióját gátolni, vagy proteinné való transzlációjának, vagy citoplazmába való átjutásának, vagy bármely egyéb, általános biológiai funkciójához szükséges aktivitásának gátlása révén. A mRNS részleges vagy teljes működésképtelensége a papillomavírus genomjában olyan hibát okoz, hogy az nem képes megfelelően expresszálódni; nem szaporodik, nem alakulnak ki pontos utódok megfelelő számban, és az ilyen utódok káros hatása a papillomavírussal fertőzött állatra megváltozik.
Felismertük, hogy előnyös, ha az ellentétes értelmű támadás célpontjául a papillomavírus genom bizonyos mRNS-ek által képviselt részeit választjuk. Azt tapasztaltuk, hogy a papillomavírus E2, El, E7 és E6-7 mRNS-ei különösek alkalmasak a fenti szempontból. így az oligonukleotidokkal vagy oligonukleotid analógokkal hibridizálandó mRNS előnyösen az E2, El, E7 vagy E6-7 mRNS. Még előnyösebben olyan oligonukleotidokat vagy oligonukleotid analógokat állítunk elő, amelyek a papillomavírus 5' közös nem-transzlatált régiójából vagy E2 transzaktivátor régiójából átírt RNS-szakaszokkal komplementer nukleotid bázis szekvenciákkal rendelkeznek.
Legelőnyösebben olyan oligonukleotidokat állítunk elő, amelyek a mRNS CAP régiójával és az E2 transzaktivátor «··* transzlációs kodonjával lépnek kölcsönhatásba. Ezeket az oligonukleotidokat úgy tervezzük meg, hogy a BPV-1 2443-4180 nukleotidjai által kódolt E2 mRNS-sel hidridizálódjanak.
A találmány szerinti új módszer szerint a papillomavírus expresszióját úgy módosítjuk, hogy a papillomavírusból származó mRNS-t a mRNS-sel hibridizálódni képes oligonukleotiddal vagy oligonukleotid analóggal hozzuk érintkezésbe, amely oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg a mRNS-sel való hibridizálódás által gátolja a mRNS működését. Előnyösek azok az oligonukleotidok vagy oligonukleotid analógok, amelyek a papillomavírus E2, El, E7 vagy E6-7 mRNS-eivel hibridizálódnak.
Ezenkívül kifejlesztettünk olyan új módszereket is, amelyekkel módosíthatjuk az állatokban a papillomavírus fertőzés hatását, oly módon, hogy az állatot a papillomavírusból származó mRNS-sel hibridizálható oligonukleotiddal vagy oligonukleotid analóggal kezeljük, amely a mRNS-sel való hibridizálódás által gátolja a mRNS működését. Előnyösek azok az oligonukleotidok vagy oligonukleotid analógok, amelyek a papillomavírus E2, El, E7 vagy E6-7 mRNS-eivel hibridizálódnak.
A találmány körébe tartoznak a fenti oligonukleotidok vagy oligonukleotid analógok alkalmazásán alapuló diagnosztikumok is papillomavírus jelenlétének vagy távollétének kimutatására, a fenti diagnosztizálásra alkalmas készletek vagy a fenti hibridizálódástól függő reagensek kifejlesztése révén.
A genitális szemölcs a leggyakrabban diagnosztizált,
virális eredetű, szexuális úton terjedő betegség. Gyógyászati szempontból két fő csoportba osztható: condyloma acuminata és sírna méhnyaki szemölcs. A condylomákról kimutatták, hogy vírus részecskéket tartalmaznak, és molekuláris vizsgálatokkal bizonyították, hogy az ilyen léziók több, mint 90 %-a vagy HPV-6 vagy HPV-11 DNS-t tartalmaz [Gissmann L., Wolnik L., Ikenberg Η., Koldowsky U., Schnurch H.G. és Hausen Η. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80. 560-563 (1983)]. A condyloma acuminata rendszerint a peniszen, a vulván vagy a perianalis régióban jelenik meg. Ez spontán módon visszafejlődhet, vagy éveken keresztül fennmaradhat, de invazív karcinomává csak igen ritkán fejlődik tovább. Ettől eltérően a egyéb genitális szemölcsök, amelyek a méhnyakon fordulnak elő, morfológiailag rendszerint inkább laposak, mint hegyesek, és klinikailag renszerint Pap kenettel detektálhatok. Az 1970-es évek végén citológiai tanulmányokban feltételezték, hogy a méhnyaki diszpláziát papillomavírus okozza, mivel összefüggést találtak a HPV okozta citológiai elváltozások Pap kenete és a diszpláziás Pap kenet között. Más vizsgálatokban kimutatták virális részecskék és virális kapszid jelenlétét a fenti léziók esetében egyes diszpláziás sejtekben. Ez az összefüggés azért jelentős, mert korábbi klinikai vizsgálatokban megállapították, hogy a méhnyaki diszplázia (amelyet CIN-nek, vagy méhnyaki intraepitel neopláziának is neveznek) a prekurzora a karcinamának in situ, amelyről viszont kimutatták, hogy a cervix invazív pikkelyes hámsejt karcinamájának a prekurzora [Dürst Μ., Gissmann L.,
Ikenberg H. és zűr Hausen Η., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 3812-3815 (1983); Boshart Μ., Gissmann L. , Ikenberg Η. , Kleinheinz A., Scheurlen W. és zűr Hausen Η., EMBO J. 3, 1151-1157 (1984)]. A 16-os és 18-as típusú HPV-ket közvetlenül klónozták méhnyaki karcinomából.Ezeket azután hibridizációs próbaként alkalmazták annak kimutatására, hogy a humán méhnyak-karcinomák több, mint 70 %-a és a belőlük származó sejtvonalak pozitívak a fenti HPV típusok valamelyikének jelenlétére nézve. A többi 20 % más HPV típusokat, például HPV-l-et, HPV-33-at és HPV-35-öt tartalmaz.
A National Therapeutic Index adatai szerint 1984-ben 224 900 új beteg kereste fel az orvosokat genitális szemölccsel és 156 720 genitális herpesszel. A genitális szemölcsök előfordulása az 1970-es és 1980-as években állandóan növekedett, és egy epidemiológiai tanulmányban most kimutatták, hogy az átlagos előfordulás 1950 és 1978 között elérte a 106,5/100000 fő csúcsértéket. A méhnyaki HPV fertőzés aránya 25-55 éves nőknél 0,8 %, de a 22 éves nőknél 2,7 %. A legújabb tanulmányok szerint citológiai szempontból normális nőknél a látens fertőzés gyakorisága 11 %. A fenti adatok szerint a betegségnek van egy látens szakasza is, amely még magasabb előfordulási gyakoriságra és arányra utal.
Aktív genitális szemölcsöt a terhes amerikai asszonyok mintegy 2,5 %-ában ki lehet mutatni, így évente 60000·^ 90000 terhes nőt érint. A HPV fertőzések gyakorisága kétszeres a terhes nőknél. Minden évben mintegy 1500 új esetben diagnosztizálnak gége-papillomatőzist, ami az jelenti, hogy az újszülöttek anya általi fertőzésének veszélye 1:80 11 « ·
- 1:200.
A gége-papillomák a gége jóindulatú tumorai. Két PV típus, a HPV-6 és a HPV-11 van leggyakrabban kapcsolatban a gége-papillomákkal. Klinikailag a gége-papillomák két csoportra oszthatók, a fiatalkori és a felnőttkori előfordulásra. Fiatalkori előfordulás esetében feltételezik, hogy az újszülött az anya szülőcsatornáján való áthaladás közben fertőződik, ha az anya genitális PV-vel fertőzött. A betegség általában kétéves korban jelentkezik, és a jóindulatú papillomák lassú, de állandó növekedésében nyilvánul meg, amelyek végül - sebészeti beavatkozás hiányában - elzárják a légutat. Ezeket a gyerekeket általában többször is megoperálják, de a papillomák mindig kiújulnak. A betegek végül a sok sebészeti beavatkozás okozta komplikációk miatt halnak meg. Napjainkig nincs kuratív kezelés fiatalkori gége-papillomatozis esetén, és a spontán regresszió ritka. A felnőttkori gége-papillomatózis nem ilyen súlyos, és gyakran spontán módon visszafejlődik.
A papillomavírus fertőzéssel kapcsolatos leggyakoribb betegség a jóindulatú szemölcs a bőrön. A közönséges szemölcs általában 1-es, 2-es, 3-as, 4-es vagy 10-es HPV típust tartalmaz. Ezek a szemölcsök jellegzetesen a talpon (talpszemölcsök) vagy a kézen jelennek meg. Közönséges bőrszemölcsök leggyakrabban gyerekeken és fiatal felnőtteken találhatók. Az élet során később a közönséges szemölcsök megjelenésének gyakorisága csökken, feltehetőleg az immunológiai és fiziológiai változások következtében. A talpsze mölcsök gyakran panaszokat okozhatnak és sebészeti beavat • ·
- 12 kozást igényelnek, és gyakran kiújulnak a műtétet követően. Ezidáig még nincs megbízható módszer a talpszemölcsök kezelésére. A kézen előforduló közönséges szemölcsök szemmel nem láthatók, és ritkán okoznak panaszt, ezért sebészeti beavatkozás általában nem szükséges.
Az epidermodysplasia verruciformis (EV) ritka, genetikusán átadott betegség, amelynek jellemzője, hogy kis, vöröses foltokként elszórtan lapos szemölcsök jelennek meg. Az EV-vel számos HPV típus kapcsolatos. Idővel az EV-s betegek mintegy egyharmadában a bőrön több helyen pikkelyes sejtes karcinoma (SCC) fejlődik ki. Általában az SCC a bőr napfénynek kitett részein jelenik meg. Az SCC esetében csak az EVszal kapcsolatos PV bizonyos típusai, a HPV-5 és HPV-8 találhatók meg következetesen. Az ilyen betegekben az SCC kifejlődéséért genetikus hajlam, immunológiai rendellenességek, ultraibolya sugárzás ugyanúgy szerepet játszhat, mint a HPV.
A PV genom egy mintegy 8000 bázispár hosszú, kettős szálú, kovalensen zárt, cirkuláris DNS molekulából áll. Számos állati és humán PV teljes nukleotid szekvenciáját és genetikus szerkezetét meghatározták már, így például az 1-es típusú marha papillomavírusét (BPV-1) is [Chen E.Y., Howley P.M., Levinson A.D. és Seeburg P.H., Natúré 299. 529-534 (1982)]. Néhány PV genom sematikus térképe az 1. ábrán látható. A virális transzkripció egyirányú: az összes virális mRNS ugyanabból a virális DNS szálból íródik át [Engel L.W., Heilman C.A. és Howley P.M., J. Virol. 47, 516-528 (1983); Heilman C.A., Engel L., Lowy D.R. és Howley P.M., Virology
119, 11-34 (1982)]. A kódoló szál 10 megjelölt nyitott leolvasási keretet (ORF) tartalmaz. Az egyes ORF-eket két csoportba osztják a PV genomban elfoglalt helyzetük és az eredménytelenül fertőzött, transzformált sejtekben az eredményesen fertőzött sejtekkel szembeni exprssziós mintájuk szerint, úgymint korai és késői ORF-ek. A 2. ábrán látható az 1-es típusú marha papillomavírus különböző ORF-jei közötti öszszefüggés.
Mivel a BPV-1 képes a rágcsálósejtek transzformálására és a transzformált sejtekben episzómaként megtartja saját genomját, ez a vírus szolgál modellként a papillomavírus in vitro tanulmányozására. Ennek következtében az összes papillomavírus közül a BPV-1 a legjobban jellemzett. A BPV-1 genom 7946 bázispár hosszúságú, amelyet klónoztak és szekvenáltak [Chen és munkatársai fent idézett munkája (1982)]. A BPV-1 DNS szekvencia analízisével 8 korai (E) és 2 késői (L) nyitott leolvasási keretet (ORF) határoztak meg. Az ORF-ek korai és késői ORF-kénti jelölése a nem eredményesen fertőzött, transzformált sejtekben való expressziós mintájukon alapul, szemben az eredményesen fertőzött sejtekkel [Heilman és munkatársai fent idézett munkája (1982); Baker C.C. és Howley P.M., EMBNO J. 6, 1027-1035 (1987)].
Az összes ORF ugyanazon a DNS szálon helyezkedik el, és az eddig jellemzett összes mRNS-ről kimutatták, hogy a kódoló szálból Íródik át [Amtmann E. és Sauer G., J. Vírol. 43, 59-66 (1982)]. A BPV-1 ORF-ek funkcióját rekombináns DNS módszerrel és in vitro sejttenyészetekben analizálták. Néhány ORF-ről kimutatták, hogy több funkciója van. Az E5 és
Ε6 ORF-ek transzformáló proteineket kódolnak [Yang Y.C., Okayama H. és Howley P.M. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 1030-1034 (1985)]. Az El és E7 ORF-ek a BPV-1 genom fertőzött sejtben való nagy példányszámú fennmaradásában vesznek részt [Lusky M. és Botchan M.R. , J. Virol. 53,, 955-965 (1985)].
A 3' El ORF egy, a virális genom replikálódásához és a verális genom fenntartásához szükséges faktort kódol [Lusky M. és Botchan M.R., J. Virol. 60, 729-742 (1986)]. Az 5' El ORF a virális DNS replikálódás egyik tényezőjét kódolja [Roberts J.M. és Weintraub Η., Cell 46, 741-752 (1986)]. Az E2 ORF tejes hosszúságában egy, a virális transzkripciót transzaktiváló proteint kódol [Spalholz B.A., Yang Y.C. és Howley P.M., Cell 42, 183-191 (1985)], míg a 3' E2 ORF a virális transzkripció egy transzrepresszorát kódolja [Lambert P.F., Spalholz B.A. és Howley P.M., Cell ,50, 69-78, (1987)]. Az BVP-1 E3, E4, E8 ORF-jeinek funkcióját ezidáig nem határozták meg.
Az L1 [Cowsert L.M., Pilacinski W.P. és Jenson A.B., Virology 165, 613-615 (1988)] és az L2 kapszid-proteineket kódol.
A találmány értelmében szakemberek számára nyilvánvaló, hogy a mRNS - amelyet annak a DNS-nek a nyitott leolvasási keretei felismernek, amelyből átíródott - nemcsak a DNS ORF-jeiből származó információt tartalmazzák, hanem olyan ribonukleotidokkal is kapcsolódnak, amelyek a szakemberek számára mint 5' CAP régió, 5' nem-transzlatált régió és 3' nem-transzlatált régió ismertek. Ezért a találmány értelmében az oligonukleotidokat vagy oligonukleotid analógokat úgy alakíthatjuk ki, hogy azok részben vagy teljesen a fenti kapcsolódó ribonukleotidokkal, valamint az információt tartalmazó ribonukleotidokkal hibridizálódjanak.
A BPV-1 genomban egy mintegy 1000 bázispár hosszúságú, a 48. és 7094. nukleotid között elhelyezkedő régiót azonosítottak, amelynek nincs erős kódoló potenciálja. Ezt a régiót hosszú kontroll régiónak (LCR) nevezik. Az LCR több CIS kontroll elemet tartalmaz, amelyek a virális transzkripció és virális replikáció szabályozása szempontjából kritikusak. Az ORF-ek funkcionális szerepének összefoglalása az 1. táblázatban található.
A BPV-1 genom transzkripcióját megnehezíti a többszörös promoterek, komplexek és alternatív összeillesztési minták jelenléte. Különféle módszerekkel eddig 18 különböző mRNS fajtát azonosítottak [Amtmann E. és Sauer G., J. Virol.
43. 59-66 (1982); Burnett S., Moreno-Lopez J. és Pettersson
U., Nucleic Acid Rés. 15, 8607-8620 (1987); Engel L.W., Heilman C.A. és Howley P.M., J. Virol. 47, 516-528 (1983)]; Heilman C.A., Engel L., Lowy D.R. és Howley P.M., Virology 119, 22-34 (1982); Baker C.C. és Howley P.M., EMBO J., 6, 1027-1035 (1987); Stenlund A., Zabielski J., Ahola H., Moreno-Lopez J. és Pettersson U., J. Mól. Bioi. 182. 541-554 (1985); és Yang Y.C., Okayama H. és Howley P.M., Proc. Natl. Acad. sci. USA 82, 1030-1034 (1985)].
Úgy tűnik, hogy az összes korai mRNS egy közös poliadenilezési jelet használ a 4180. nukleotidnál (nt), amely a korai ORF-ektől 3' irányban helyezkedik el, míg a késői mRNS-ek egy második poliadenilezési jelet használnak a 7156. nukleotidnál. A BPV-1 cDNS-ek szekvencia-analízisével felderítették több 5', illetve 3' összeillesztési hely (a
304., 864., 1234., 2505., 3764., és 7385., illetve 528.,
3225., 3605. és 5609. nukleotidnál) jelenlétét, ami alternatív illeszkedést eredményez. A BPV-1 mRNS-ek többségének 5' vége a 89. nukleotidhoz illeszkedik és egy közös régiót tartalmaz a 89. nukleotid és a 304. nukleotidnál lévő első összeillesztési donor hely között. A többi mRNS 5' vége a
890., 2443. és 3080. nukleotidhoz illeszkedik.
Várható, hogy a különböző papillomavírus speciesekből, és egy speciesen belül a különböző típusokból származó DNS-ekben vannak különbségek. Jelenleg azonban úgy gondoljuk, hogy a különböző papillomavírusok ORF-jei közötti hasonlóságok - mivel ezek a találmány megvalósíthatóságát befolyásolhatják - fontosabbak, mint a különbségek. Ügy véljük, hogy például a különböző PV-k E2 régiói lényegében ugyanazt a funkciót szolgálják a megfelelő PV-kben, és az E2 genetikus információ expressziójának megzavarása hasonló eredményeket fog hozni a különféle speciesekben. Véleményünk szerint ez így van annak ellenére, hogy kétségtelenül van különbség az egyes PV speciesek nukleotid szekvenciájában.
Ezzel összhangban magától értetődik, hogy a leírásban ismertetett nukleotid szekvenciák az adott speciesre igazak. A találmány körébe tartoznak azonban a különféle papillomavírus speciesek homológ vagy analóg szekvenciái is.
Korábbi genetikai kísérletek azt mutatták, hogy az
E2 deléciója vagy mutációja a BPV gócképző aktivitásának el • · · * · * • » · · · » ♦ ♦· • · · ····« · · * vesztését eredményezi C127 sejtekben, amelyből az E2 transzformáló funkciójára lehet következtetni. Későbbi tanulmányokban kimutatták, hogy az E2 a virális transzkripció egyik regulátora, és azt, hogy a transzformáló képesség elvesztése az E2 mutációja által egyéb transzformáló gének represszálásának következménye volt az E2 feltételes növekedése miatt. Az E2 ORF teljes hossza az E2 transzaktivátort kódolja, amely a virális korai gének transzkripcióját stimulálja. Az E2 transzaktivátor egy összeillesztetlen raRNS-ből íródik át, amelynek 5' vége a 2443. nukleotidhoz illeszkedik, amint az az N molekulafajta esetében a 2. ábrán látható. Az E2 transzrepresszor az E2 transzaktivátornak egy N-terminálison megcsonkított formája, amely akkor keletkezik, ha a transzkripciót az E2 ORF-en belül egy promoter a 3089. nukleotidnál iniciálja (0 molekulafajta, 2. ábra). Azonosítoták az E2 (transzaktiváló (5' rész) és DNS-kötő doménjeit (3' rész), valamint a palindroma DNS felismerő szekvenciát (ACCN6GGT). Mind az E2 mRNS, mind a protein igen rövid, nagyságrendileg 60 percnél rövidebb félélettartammal rendelkezik. Az E2 transzregulátor kör a papillomavírusokra általánosan jellemző. Az E2 transzregulátort minden eddig vizsgált papi llomavírusban kimutatták.
A PV genom egy 55 nm átmérőjű, csupasz ikozahedrális kapszidba van csomagolva. A virális kapszidnak nincs borítékja és nem glikozilezett. A kapszidot két virálisan kódolt protein, az LI és L2 alkotja. Az LI a fő kapszid-protein, a virionban lévő protein 80 %-ét ez teszi ki, és átlagos móltömege 50 és 60 kD között van. Az L2 a kisebb mennyiségben lévő kapszid-protein, amelynek átlagos elméleti móltömege 51 kD, de vándorlását is figyelembevéve móltömege 76 kD. Mivel a PV in vitro nem állítható elő és a termelőképes lézlókban csak igen kevés érett virion található, a PV részletes szerológiai vizsgálatát még nem lehetett elvégezni.
A papillomavírus életciklusa komplex, és jelenleg csak keveset tudunk róla. Ezidáig nem sikerült olyan in vitro rendszert kialakítani, amely lehetővé teszi az érett PV virionok képződését, ezért még nem volt lehetséges a papillomavírusok életciklusának tanulmányozása. A PV gazda-spektruma korlátozott, és ritkán lépi át a fajta-korlátokat. Ezenkívül a PV csak differenciálódó hámsejteket fertőz, akár nyálkahártya- akár elszarusodott sejtekről van szó. A PV génexpresszió szabályozásáról feltételezik, hogy szorosan kötődik a gazda-hámsejtek differenciálódási programmjához. A PV életciklusának jelenlegi legelfogadottabb modellje az alábbi: A fertőző PV részecskék trauma útján behatolnak a hám külső rétegeibe és megfertőzik a gazda-szövet bazális sejtjeit. Itt a vírus viszonylag kis példányszámú extrakromoszomális elemként fennmarad. Amikor a hámsejtek differenciálódni kezdenek, a PV genom nagyobb példányszámban replikálódik, és amikor a sejtek a differenciálódás utolsó stádiumába érnek, a késői gének expresszálódnak és a virális genom kapszulázódik.
Kiderült, hogy a papillomavírus ideális célpont az ellentétes értelmű kölcsönhatáson alapuló terápia számára. Először is, a papillomavírus léziók külsődlegesek, ami lehetővé teszi az ellentétes értelmű oligonukleotidok helyi al • · « · · * «)-·· » ·· • · · ♦ · · « · *·· · · · , « ·· ···«· · · * • * ·· · « kalmazását, és ezzel számos probléma, például a gyors clearance kiküszöbölődik, és a szintetikus oligonukleotidok szisztémikus beadásával járó, győgyászatilag hatásos oligonukleotid-koncentrációk kaphatók a szövetekben. Másodszor, a virális genom elkülönült genetikus elemként marad fenn a fertőzött sejtben. Ez lehetőséget nyit a kuratív terápiára, a szimptómák kezelésével szemben, mivel a vírus replikációs funkcióit támadjuk.
Felismertük, hogy a papillomavírus genomon levő E2 ORF különösen alkalmas az ellentétes értelmű oligonukleotidok tervezése szempontjából. Az E2 bizonyítottan a virális transzkripció fő transzaktivátora mind BPV-1, mind HPV rendszerekben. Az E2 ORF-ben bekövetkezett mutációk pleiotropiás hatást fejtenek ki a transzformációra és az extrakromoszomális DNS replikációra [Di Maio D., J. Virol. 57, 475-480 (1986); diMaio D. és Settleman J., EMBO J. 7, 1197-1204 (1988); Groff D.E. és Lancaster W.D., Virology 150. 221230 (1986); Rabson M.S., Yee C., Yang Y.C. és Howley P.M., J. Virol. 60, 626-634 (1986); és Sarver Ν., Rabson M.S, Yang Y.C., Byrne J.C. és Howley P.M., J. Virol. 52, 377388 (1984)]. Ezt követően kimutatták, hogy az E2 ORF egy transzkripciós transzaktivátort kódol [Spalholz B.A., Yang Y.C. és Howley P.M., Cell 42, 183-191 (1985)]. Az E2 egy csonka változatáról - amelyet a transzláció egy külső AUG-n való iniciálásával kaptak - kimutatták, hogy az a transzkripció transzrepresszora [Lambert P.F., Spalholz B.A. és Howley P.M., Cell 50, 69-78 (1987)]. Mind a DNS-kötő domént, mind a karboxil-terminális 100 aminosavat [McBride A.A., Schlegel
R. és Howley P.M., EMBO J. 7, 533-539 (1988)], mind az
ACCN6GGT DNS-felismerő szekvenciát [Androphy E.J., Lowy D.R.
és Schiller J.T., Natúré 325, 70-73 (1987); és Moskaluk C.
és Bastia D., Proc. Natl. Acad. SCi. USA 84, 1215-1218 (1987)] azonosították. Az E2 transzkripciós regulátor kör a papillomavírusok között általános jellemző. Az E2 transzregulációt dokumentálták az összes többi eddig vizsgált papillomavírusban [Gius D., Grossman S., Bedell M.A. és Laimins
L. A., J. Virol. 62, 665-672 (1988); Hirochika Η., Bróker T.R. és Chow L.T., J. Virol. 61, 2599-2606 (1987); Chin M.T., Hirochika R., Hirochika H., Bróker T.R. és Chow L.T., J. Virol.
62. 2994-3002 (1988); Phelps W.C. és Howley P.M., J. Virol.
61, 1630-1638 (1987); és Thierry F. és Yaniv. Μ., EMBO J.
6, 3391-3397 (1987)].
A találmány azon a felismerésen alapul, hogy egy kötelező virális transzkripciós elem azonosítása - amely az állati és humán papillomavírusokban közös - alkalmassá teszi az E2-t arra, hogy elsődleges célpontja legyen a papillomavírus kutatás, diagnosztika és terápia ellentétes értelmű kölcsönhatásokon alapuló megközelítésének.
Azt is felismertük, hogy az El lokusz is ígéretes a papillomavírus elleni támadás helyeként. Rágcsáló fibroblasztok BPV-1 transzformálásának kezdeti mutációs analízise szerint az El valószínűleg a virális replikáció egyik regulátora. A 3' El ORF egy, a virális genom replikációjához és fennmaradásához szükséges faktort kódol [Sarver Ν., Rabson
M. S., Yang Y.C., Byrne J.C. és Howley P.M., J. Virol. 52, 377-388 (1984); Lusky M. és Botchan M.R., J. virol. 53., 955
- 21 -965 (1985); és Lusky M. és Botchan M.R., J. Virol. 60, 729-742 (1986)]. Az El expressziójának gátlása valószínűleg gátolja a BPV-l-et (és feltehetőleg a HPV-t) abban, hogy saját DNS-ét replikálja a fertőzött sejtben.
Kimutattuk azt is, hogy az E7 hely valószínűleg újabb pontot jelent az gyógyszerek, diagnosztikumok és a kutatás számára a papillomavírusokhoz. A BPV-l-ben az E7 a vizsgálatok szerint a virális DNS replikációjában vesz részt [Berg L.J., Singh K. és Botchan Μ. , Mól. Cell. Bioi.
6, 859-869 (1986)]. A HPV-16-ban az E7 bizonyítottan a transzformációban és a fennmaradásban játszik szerepet. Jelenleg nem világos, hogy a HPV-k E7-je a virális DNS replikációjában résztvesz-e, azonban úgy gondoljuk, hogy az E7-specifikus ellentétes értelmű oligonukleotidok és oligonukleotid analógok gátolni fogják a BPV-1 virális DNS replikációját.
Az E6-E7 régió a kutatási eredmények szerint transzformáló régió. A fenti régió pontos szerepe a vírus életciklusában jelenleg még ismeretlen. Mivel azonban ez a régió a vírus által indukált léziókban az ellentétes értelmű kölcsönhatások központja, megállapítható, hogy a fenti régiót célzó oligonukleotidok valószínűleg hasznosak a találmány célkitűzése szempontjából is.
A legújabb vizsgálatokból arra következtethetünk, hogy a mRNS-ek 5' régióit, és előnyösen a CAP régiót és a start kodont célzó oligonukleotidok gátolják leghatásosabban a génexpressziót. A papillomavírus transzkripció egyik jellemzője, hogy sok mRNS közös 5' nem-transzlatált régiót és » ««·
CAP régiót tartalmaz. így megállapítható, hogy a fenti régiót célzó ellentétes értelmű oligonukleotidok potenciálisan egynél több mRNS gátlására képesek. A virális genom fertőzött sejtekből való kitörlésében a többszörös virális gének leárnyékolása valószínűleg minimálisan addtív hatást jelent, de lehetséges, hogy a hatás szinergetikus.
Magától értetődően a papillomavírus genomjainak azon ORF-jei, amelyek a találmány szerinti ellentétes értelmű kölcsönhatáson alapuló támadás célpontját képező mRNS-ek keletkezését segítik elő, más mRNS-ek részeit is kódolják. A fenti ORF-ek összefoglalóan az 1. táblázatban láthatók.
1. táblázat: Papillomavírus nyitott leolvasási keretei, és az azokhoz kapcsolódó funkciók
| ORF | Kapcsolódó funkció |
| E (BPV-1) | (3' rész) Replikácó (BPV-1) |
| E2 (teljes hossz) | Transzkripciós transzaktiváció (BPV-1, |
| HPV-6, HPV-16) | |
| (3' rész) | Transzkripciós represszió (BPV-1) |
| E4 | Citoplazmatikus foszfoprotein szemölcsök- |
| ben (HPV-1) | |
| E5 | Transzformáció, DNS szintézis stimulálás |
| (BPV-1) | |
| E6 | Transzformáció (BPV-1) |
| E7 | Plazmid példányszámának szabályozása |
| (BPV-1) | |
| L1 | Fő kapszid-protein |
| L2 | kis jelentőségű kapszid-protein |
*·4Ι · π -> · · · · ···· ; ’ .
A találmány értelmében oligonukleotidokat és oligonukleotid analógokat alkalmazunk a papillomavírus mRNS-ei funkciójának gátlására ellentétes értelmű kölcsönhatással. A leírásban oligonukleotid alatt a természetben előforduló bázisokból és ciklofuranozilcsoportokból természetes foszfodiészter kötéssel kialakult polinukleotidokat értünk. A fenti kifejezés magában foglalja a természetes oligonukleotidokat, és a természetben előforduló alegységekből, vagy ezek közeli homológjaiból szintetikus úton előállított oligonukleotidokat.
Oligonukleotid analóg alatt a leírásban az oligonukleotidokhoz hasonló funkciót betöltő maradékokat értünk, amelyeknek vannak természetben nem előforduló részei, és amelyek nem közeli homológok. így az oligonukleotid analógok eltérő cukormaradékokat vagy cukrok közötti kapcsolódásokat tartalmazhatnak. Példaként említhetják a foszforotioátot és egyéb, a szakirodalomból ismert kéntartalmú analógokat. A találmány bizonyos előnyös megvalósítási módjai szerint az oligonukleotidok foszfodiészter-kötései közül néhány olyan szerkezettel van helyettesítve, amely fokozza a vegyület bejutását a sejt azon régiójába, ahol a megváltoztatandó aktivitású RNS található. A fenti helyettesítések előnyösen foszforotioát-kötéseket, metil-foszfotioát-kötéseket vagy rövid szénláncú alkil- vagy cikloalkil-szerkezeteket jelentenek. A találmány további előnyös megvalósítási módjai szerint a foszfodiészter-kötések olyan szerkezetekkel vannak helyettesítve, amelyek lényegében nem-ionosak és optikailag nem aktívak. Szakemberek számára nem jelent problémát egyéb » A * 4» · * • « > · · · ·♦ • « A · ···· · · ·· ·· · ♦ * - 24 kötéseket kiválasztani a találmány gyakorlati megvalósítására.
Az oligonukleotid analógok azokat a vegyületeket is magukban foglalják, amelyek legalább néhány módosított bázist tartalmaznak. így alkalmazhatók például olyan purinok és pirimidinek, amelyek a természetben nem fordulnak elő. Hasonlóképpen a nukleotid alegységek ciklofuranóz-részében is lehetnek módosítások, amennyiben a találmány alapvető elvei ezt megengedik.
Ezek a analógok legjobban úgy jellemezhetők, hogy funkcionálisan felcserélhetek a természetes oligonukleotidokkal (vagy a természetes oligonukleotidokkal megegyező szintetikus oligonukleotidokkal), de a természetes szerkezettől egy vagy több eltérést tartalmaznak. A találmány szerinti megoldás az összes ilyen analógot magában foglalja, amennyiben azok képesek a papillomavírus mRNS-ével hibridizálódni, és ezáltal az RNS működését gátolni.
A találmány szerinti oligonukleotidok és oligonukleotid analógok előnyösen mintegy 3-50 alegységet tartalmaznak. Még előnyösebb, ha a fenti oligonukleotidok és oligonukleotid analógok mintegy 8-25 alegységből, még előnyösebben mintegy 12-20 alegységből állnak. Magától értetődően az alegység egy bázis és egy cukor kombinációja (vagy azzal analóg), amely a szomszédos alegységekkel megfelelő módon, foszfodiészter vagy egyéb kötéssel kapcsolódik.
A találmány szerinti oligonukleotidokat és oligonukleotid analógokat úgy tervezzük, hogy azok a papillomavírus mRNS-ével hibridizálhatók legyenek.
- 25 44·· »· • * • ···
4 * ··
Ha ilyen hibridizáció végbemegy, zavart okoz a mRNS normális működésében, amelynek következtében a vírus azt nem tudja használni. A mRNS megzavart funkciója bármelyik életfunkció lehet, így például az RNS áthelyeződése (transzlokációja) a proteinné való transzláció helyére, maga a protein transzláció az RNS-ből, és feltehetőleg még ettől független katalitikus aktivitás is, amelyet az RNS végez. Az RNS funkciója ilyen megzavarásának összességében vett hatása a papillomavírusra az, hogy a vírus nem tudja használni az RNS-t és végül a virális genom expressziójának zavarához vezet. Az ilyen zavar általában végzetes a vírus számára.
A találmány értelmében előnyösen olyan oligonukleotidokat vagy oligonukleotid analógokat tervezünk, amelyek a vizsgálatok szerint a vírus számára fokozott metabolikus jelentőséggel bíró mRNS-eket zavarják. Amint azt fent kifejtettük, az El, E2, E7 vagy E6-7 papillomavírus mRNS-ek az előnyös célpontok.
Előnyös azoknak az RNS-eknek a zavarása is, amelyeket az 1-es típusú marha papillomavírus genom 2443-3080 vagy 89-304. nukleotidjavai lényegében ekvivalens nukleotidok kódolnak, mivel ezek valószínűleg különösen sebezhető helyet képviselnek a támadás szempontjából, ugyanis feltételezhetően ezek kódolnak számos, létfontosságú proteinhez vezető RNS-t. Magától értetődően a különböző papillomavírusok szerkezete valamennyire eltérhet az 1-es típusú marha papillomavírusétól, de a lényegében hasonló területek rutinszerűen meg határozhatók.
A 3., 4. és 5. ábra a fenti területeket mutatja az
1-es típusú marha papillomavírus genomban és bármely oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, amelyet úgy tervezünk, hogy az adott papillomavírusban az ezek megfelelői által kódolt RNS-t zavarja, valószínűleg különösen alkalmas az adott papillomavírusok működésének megzavarására. Az 1-es típusú marha papillomavírus E2 mRNS elleni oligonukleotidok néhány képviselőjét a 2. táblázatban foglaljuk össze.
2. táblázat: BVP-1 E2 ellentétes értelmű oligonukleotidjai
Oligonukleotid 5'
3' Megjegyzés
001(LC001.AB1) AGGTTTGCACCCGACTATGCAAGTACAAAT mRNS CAP régió
002(LC002.AB1) TATGCAAGTACAAAT mRNS CAP régió
003(LC003.AB1) CTGTCGCATGCTGTCTCCATCCTCTTCACT transzlációs iniciátor
004(LC004.AB1) GCATGCTGTCTCCAT transzlációs iniciátor
005(LC005.AB1) AAATGCGTCCAGCACCGGCCATGGTGCAGT transzrepreszszor start
006(LC006.AB1) AGCACCGGCCATGGT transzrepreszszor start
007(LC007.AB1) CAATGGCAGTGATCAGAAGTCCAAGTCGGC transzlációs
008(LC008.AB1) GCAGTGAÍTCAGAAGT terminátor transzlációs terminátor
009(LC009.AB1) ATTGCTGCAGCTTAAACCATATAAAATCTG 3' nem-transzlatált régió
- 27 2. táblázat folytatása
Oligonukleotid 5'
3' Megjegyzés
| 010(LC010.AB1) | CTTAAACCATATAAA | 31 nem-transz- latált régió |
| 011(LC011.AB1) | AAAAAAAGATTTCCAATCTGCATCAGTAAT | 5' nem-transz- |
| latált régió | ||
| 012(LC012.AB1) | AAGATTTCCAATCTG | 5' nem-transz- |
| latált régió | ||
| 013(LC013.AB1) | CAGTGTCCTAGGACAGTCACCCCTTTTTTC | 5’kódoló régió |
| 014(LC014.AB1) | GGACAGTCACCCCTT | 5'kódoló régió |
| 015(LC015.AB1) | TGTACAAATTGCTGTAGACAGTGTACCAGT | középső kódoló |
| régió | ||
| 016(LC016.AB1) | GCTGTAGACAGTGTA | középső kódoló |
| régió | ||
| 017(LC017.AB1) | GTGCGAGCGAGGACCGTCCCGTACCCAACC | 3'kódoló régió |
| 018(LC018.AB1) | GGACCGTCCCGTACC | 3'kódoló régió |
| 019(LC019.AB1) | TTTAACAGGTGGAATCCATCATTGGTGGTG | 5'kódoló régió |
| 020(LC020 AB1) | GGAATCCATCATTGG | 5'kódoló régió |
A HPV-11 transzlációs iniciátor kodonja elleni oligonukleotidok néhány példáját a 3. táblázat tartalmazza.
3. táblázat: A HPV-11 transzlációs iniciátor kodonja elleni ellentétes értelmű oligonukleotidok
| Cl | --3’ Szekvencia azo- nosítási száma | |
| veyyuici. bóama | ||
| 12100 | GCTTCCATCTTCCTC | 1 |
| 12101 | GCTTCCATCTTCCTCG | 2 |
| 12102 | TGCTTCCATCTTCCTCG | 3 |
| 12103 | TGCTTCCATCTTCCTCGT | 4 |
| 12104 | TTGCTTCCATCTTCCTCGT | 5 |
| 12105 | TTGCTTCCATCTTCCTCGTC | 6 |
Előnyösen a fenti 20 oligonukleotid (vagy analógjaik) bármelyikét, vagy bármely hasonló oligonukleotidot (vagy oligonukleotid analógot) alkalmazhatunk, amelyeket egy szakember a papillomavírus genom E2 ORF megfelelő, előnyös régióinak ismeretében a fentiek alapján előállíthat. Hasonló táblázatokat készíthetünk a papillomavírusok egyéb előnyös ORF célpontjaira, vagyis az El, E7 és E6-7 ORF-re is a megfelelő régiók szekvenciáinak ismeretében.
Az oligonukleotidoknak vagy oligonukleotid analógoknak nem feltétlenül szükséges pontosan megegyezniük a fenti táblázatban ismertetettekkel, vagy pontosan olyanoknak lenniük, mint amit a papillomavírus genom térképének szolgai interpretációja megkíván. Ellenkezőleg, a találmány szellemében nem kell szigorúan ragaszkodni a genom szerkezethez és annak oligonukleotidokká való pontos fordításához, némi el9 · térés megengedhető. Az ilyen szerkezetek módosíthatók, feltéve, hogy megmarad az oligonukleotidok és analógjaik alapvető hibridizáló funkciója.
Hasonlóképpen az is magától értetődő, hogy a különböző papillomavírusok között fajtától függően különbségek lehetnek. Noha egyes régiók, például az E2, El, stb. egymáshoz igen hasonlóak a különféle fajták esetében, bizonyos differenciálódás előfordulhat. A találmány egyik különleges célját képezi az oligonukleotidok és oligonukleotid analógok olyan módosítása, ami figyelembe veszi a fenti változásokat.
A találmány értelmében alkalmazott oligonukleotidokat és oligonukleotid analógokat célszerűen és rutinszerűen az ismert szilárd fázisú szintézis jól ismert módszerével állíthatjuk elő. Az ilyen szintézisre alkalmas berendezéseket több gyártó, például az Applied Biosystems is forgalmaz. A szintézist azonban egyéb módon is elvégezhetjük. Az alkalmas oligonukleotidot célszerűen fermentációs eljárásokkal állíthatjuk elő, amelyek külpnpsen akkor előnyösek, ha nagy mennyiségű anyagot kívánunk előállítani. Az oligonukleotidok szintézisére adott esetben alkalmazandó eljárások a szakember köteles tudását képezik.
Ismeretes az is, hogy más oligonukleotid analógok, például foszforotioátok és alkilezett származékok előállítására hasonló eljárások alkalmazhatók.
Az E2-specifikus ellentétes értelmű oligonukleotidok E2 expresszióját gátló hatása vizsgálatának előnyös módszere az E2 jól dokumentált transzaktivátor tulajdonságain alapul [Spalholtz és munkatársai, J. Virol. 61, 2128-2137 (1987)].
Egy riporter plazmidot (E2RECAT) szerkesztünk úgy, hogy tartalmazzon E2-re reagáló elemet, amely E2-függő erősítőként működik. Az E2RECAT az SV40 korai promotert, egy korai poliadenilációs jelet, és a kloramfenikol-acetil-transzferáz gént (CAT) is tartalmazza. A fenti plazmid úgy van felépítve, hogy a CAT expresszió az E2 expressziójától függ. A CAT expressziójának az E2 jelenlététől való függését úgy vizsgáljuk, hogy a fenti plazmidot BPV-l-gyel transzformált C127 sejtekbe, fertőzetlen C127 sejtekbe és E2RECAT-tal és egy E2 expressziós vektorral kotranszfektált C127 sejtekbe transzfektáljuk.
Az ellentétes értelmű oligonukleotidot úgy tervezzük, hogy az a fő E2 transzaktivátor mRNS ellen irányuljon (6. ábra). A célpont többek között a mRNS CAP régió, a transzlációs iniciátor kodon, a transzlációs terminátor kodon és a poliadenilezési jel lehet. A különböző célpontokkal komplementer 15 vagy 30 maradékot tartalmazó oligonukleotidot szintetizáltunk, vad típusú foszfodiészter internukleozidos kötéssel, vagy módosított foszforotioát internukleozidos kötéssel. Az mRNS CAP régió ellen (11751) és az E2 transzaktivátor transzlációs kodonja ellen (11753) irányuló oligonukleotidok előzetes vizsgálatok szerint 1 gmol/l koncentrációban képesek csökkenteni az E2 transzaktivációt (7. ábra). Az E2 transzrepresszor transzlációs iniciátor kodonja ellen irányuló oligonukleotid, az 11756 (6. ábra) képes a transzrepresszió részleges gátlására, amit a CAT aktivitás emelkedése mutat (7. ábra). Hasonló hosszúságú és bázisösszetételű más oligonukleotidok, amelyek az E2 mRNS más « · · területei ellen irányulnak, valamint más, nonszensz kontrollok nem adnak ellentétes értelmű kölcsönhatást. Általában a foszforotioát internukleozidos kötéssel módosított oligonukleotidok hatásosabbak, mint az azonos szekvenciájú, de természetes foszfodiészter internukleozidos kötést tartalmazó oligonukleotidok. Ez feltehetőleg a foszforotioátoknak a szérumban és a sejten belül lévő nukleázokkal szembeni fokozott rezisztenciájának tulajdonítható. A dózis-hatás görbék azt mutatják, hogy az 11753 5 %-os gátló koncentrációja (IC50) 50 és 100 nmol/1 között van, míg az 11752 IC50 értéke 10-szer magasabb, 500 nmol/1 körül van (8. ábra). Az E2 transzaktivátor és transzrepresszor transzlációs iniciátor kodonjának, mint sikeres ellentétes értelmű célpontnak az azonosítása után a foszforotioátok egy újabb sorozatát úgy terveztük meg, hogy még jobban illeszkedjen az egyes régiókhoz (9. ábra). Ezek az adatok azt mutatják, hogy a megfelelő AUG-t fedő 15 vagy 20 tagú oligonukleotidok képesek gátolni vagy az E2 transzaktivációt vagy a transzrepressziót (10. és 11. ábra). Az E2 transzaktivátor gátlása in situ következményeinek hatását a BPV-1 biológiájára úgy vizsgáltuk, hogy meghatároztuk az ellentétes értelmű oligonukleotidoknak a C127 sejtek BPV-1 általi transzformációját gátló vagy gyengítő képességét (12. ábra). Az 11751 és 11753 dózis-hatás görbéi azt mutatják, hogy az 11753 IC5Q értéke 10 nmol/1 körüli, míg az 11751 IC5Q értéke 100 nmol/1 körül van (13. ábra) , ez a 10-szeres különbség a fenti két vegyület ICgQ-jeiben ebben a vizsgálatban hasonló ahhoz, amit a transzaktiváció gátlásának vizsgálatakor megfigyeltünk, ami azt jelenti.
♦ · hogy a transzlációs iniciátor kodon jobb célpont.
Az E2 ellen irányuló ellentétes értelmű oligonukleotidoknak a BPV-1 saját genomját replikáló képességére kifejtett hatásának vizságálatára a BPV-l-gyel stabilan transzformált 1-38 sejteket 11753-mal és 11751-gyel kezeljük, és meghatározzuk a virális DNS-t (14. ábra). Az 1 /zmol/l koncentrációban végzett kezelés után 48 órával a virális DNS sejtenként! példányszáma mintegy harmadrészére csökken. A fenti vizsgálat folyamán a sejtek 2-3-szor osztódnak. A fenti adatok azt jelentik, hogy a virális DNS nem replikálódik szinkronban a celluláris DNS-sel.
Az 11753-nak az E2 protein-szintézisre kifejtett hatásának vizsgálatára 1-38 sejteket metabolikusan jelzünk, és E2 specifikus monoklonális antitesttel immunprecipitáljuk. Az oligonukleotiddal nem kezelt, vagy értelmes vagy nem megfelelő oligonukleotidokkal kezelt sejtekben a 46 kD E2 protein jelen van (15. ábra). Az E2 ellen irányuló oligonukleotidokkal kezelt sejtekben a 46 kD sáv eltűnik, ami azt jelenti, hogy az oligonukleotid a transzlációt lezáró hibridizálással működik.
A találmány szerinti oligonukleotidokat és oligonukleotid analógokat diagnosztikumokban, gyógyszerekben és kutatási célokra reagensként és készletként alkalmazhatjuk. Gyógyászati célokra az oligonukleotidokat és oligonukleotid analógokat papillomavírus fertőzések, például lábon lévő szemölcsök, gége-szemölcs, condylomata acuminata, epidermodysplasia verruciformis, lapos méhnyaki szemölcsök, méhnyaki intraepitel neoplázia vagy bármely egyéb papillomavírus fér • · tőzés kezelésére adagoljuk a betegnek. A találmány szerinti hatóanyagokat előnyösen helyileg vagy interlézionálisan adagolhatjuk. Megfelelők lehetnek az egyéb adagolási módok is, például a transzdermális vagy intramuszkuláris adagolás. A hatóanyag kúp formájú készítmény formájában alkalmazva nagyon előnyös lehet. A találmány szerinti oligonukleotidok és oligonukleotid analógok megelőzés céljára is alkalmasak. Erre a célra a hatóanyagot bevonatként alkalmazhatjuk kondomokban és hasonló eszközökben. Bizonyos kiviteli alakokban előnyös lehet gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagok alkalmazása is.
A találmány szerinti megoldás diagnosztikai és kutatási célokra is alkalmazható. Mivel a találmány szerinti oligonukleotidok és oligonukleotid analógok hibridizálódnak a papillomavírussal, szendvics- vagy egyéb vizsgálatok könnyen tervezhetők ezen tény hasznosítására. Rutinszerűen kialakíthatók eszközök az oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg papillomavírussal való hibridizálásának kimutatására, feltételezhetően papillomavírust tartalmazó mintákban. Ilyen módszer lehet például az enzim-konjugáció, radioizotóppal való jelzés vagy bármely egyéb, arra alkalmas detektáló rendszer. Előállíthatunk olyan készleteket is, amelyek alkalmasak a papillomavírus jelenlétének vagy hiányának detektálására.
1. példa
BPV-1 E2 expressziójának gátlása ellentétes értelmű oligonukleotidokkal
BPV-l-gyel transzformált C127 sejteket oltunk 12 rezervoáros lemezekre. Az E2RE1 sejtekkel való transzfekció e lőtt 24 órával a sejteket előkezeljük a tápközeghez 5, 15 és 30 mmol/1 végkoncentrációban adott ellentétes értelmű oligonukleotidokkal. A következő napon a sejteket 10 gg E2RE1CAT-tal transzfektáljuk, kalcium-foszfátos precipitálással. 10 Mg E2RElCAT-ot és 10 Mg hordozó DNS-t (PUC19-et) 62 μΐ 2 mol/1 koncentrációjú CaCl2-dal elegyítünk 250 μΐ végtérfogatban vízzel, majd hozzáadunk 250 μΐ 2x HBSP-t (1,5 mol/1 Na2PO2, 10 mmol/1 KC1, 280 mmol/1 NaCl, 12 mmol/1 glukóz és 50 mmol/1 HEPES, pH 7,0) és szobahőmérsékleten 30 percen keresztül inkubáljuk. A fenti oldatból 100 μΐ-t mérünk minden egyes rezervoárba, és 37 °C-on 4 órán keresztül inkubáljuk. Az inkubálás után a sejteket szobahőmérsékleten 1 percen keresztül glicerinnel sokkoljuk, 15 % glicerint, 0,75 mmol/1 Na2PO2-t, 5 mmol/1 KCl-t, 140 mmol/1 NaCl-t, 6 mmol/1 glukózt és 25 mmol/1 HEPES-t (pH 7,0) tartalmazó pufferrel kezelve. A sokkolás után után a sejteket szérum-mentes DMEMmel kétszer mossuk, és 10 % magzati marha szérumalbumint és eredeti koncentrációban ellentétes értelmű oligonukleotidot tartalmazó DMEM tápközegben tovább tenyésztjük. 48 óra elteltével a transzfektált sejteket összegyűjtjük és meghatározzuk a CAT aktivitást.
A CAT aktivitás meghatározására a sejteket kétszer mossuk foszfáttal pufferolt sóoldattal, majd lekaparással összegyűjtjük. A sejteket 100 μΐ 250 mmol/1 koncentrációjú Tris-HCl-ben (pH 8,0) újra szuszpendáljuk, és háromszori fagyasztással-felolvasztással feltárjuk. A sejt-extraktumból 24 μΐ-t használunk fel az egyes vizsgálatokban. Az egyes vizsgálatokban az alábbi komponenseket elegyítjük egy 1,5
- 35 - ........
ml-es Eppendorf-csőben: 25 μΐ sejt-extraktum, 5 μΐ 4 mmol/1 koncentrációjú koenzim A, 18 μΐ Η£θ és 1 μΐ 14C-kloramfenikol (40-60 mCi/mmol/1), és az elegyet 37 °C-on 1 órán keresztül inkubáljuk. Az inkubálás befejezése után a kloramfenikolt (acetilezett és nem acetilezett formában) etil-acetáttal extraháljuk és szárazra pároljuk. A mintákat 25 μΐ etil-acetátban újra szuszpendáljuk, TLC lemezre cseppentjük, és kloroform-metanol (19:1) eleggyel kromatografáljuk. A TLC-t autoradiográfiásan értékeljük ki. Az acetilezett vagy nem acetilezett 14C-kloramfenikolnak megfelelő foltokat a TLC lemezről eltávolítjuk és a CAT aktivitás meghatározására folyadék-szcintillációs számlálóval mérjük a beütések számát. Pozitívnak azokat az ellentétes értelmű oligonukleotidokat tekintjük, amelyek a CAT aktivitást dózistól függő módon csökkentik.
2. példa
HPV E2 expresszió gátlása ellentétes értelmű oligonukleotidokkal
A HPV E2 ellentétes értelmű oligonukleotidokkal való gátlásának vizsgálatát lényegében a BPV-1 E2-re ismertetett módon végezzük. A HPV vizsgálatára a megfelelő HPV-vel vagy CV-1 vagy A431 sejteket transzfektálunk PSV2NEO sejtekkel együtt, kalcium-foszfátos módszer alkalmazásával. Azokat a sejteket, amelyek felvették a DNS-t, G418 antibiotikumot tartalmazó tápközegben való tenyésztéssel szelektáljuk. A G418-cal szemben rezisztens sejteket ezután HPV DNS-re és RNS-re analizáljuk. E2-t expresszáló sejteket alkalmazunk célsejtként az ellentétes értelmű kölcsönhatás tanulmányozá • ••· * ♦ ·**· ·♦ • · · · · · • · ··· · ···.
, ·· Λ · · · · · · · *· « ’ ** sára. Minden egyes ellentétes értelmű oligonukleotid esetében a sejteket a fent ismertetett módon előkezeljük, majd E2RElCAT-vel transzfektáljuk és a CAT aktivitást a fent ismertetett módon meghatározzuk. Azokat az ellentétes értelmű oligonukleotidokat tekintjük pozitívnak, amelyek dózistól függő módon képesek a CAT aktivitást gátolni.
3. példa
HPV E7 expresszió gátlása ellentétes értelmű oligonukleotidokkal
A HPV-16 E7 ismert módon képes transzaktiválni az Ad E2 promotert [Phelps W.C., Yee C.L., Munger K. és Howley P. M.: The Humán Papillomavirus Type 16 E7 Gene Encodes Transactivation and Transformation Functions Similar to Those of Adenovirus E1A, Cell 53, 539-547 (1988)]. A fenti aktivitás kimutatására olyan plazmidot szerkesztünk, amely a kloramfenikol transzferáz gént az Ad E2 promoter (AdE2CAT) kontrollja alatt tartalmazza. A fenti vizsgálati körülmények között a CAT expresszió a HPV E7 expressziójától függ. A fenti vizsgálat céljára olyan sejtvonalakat fejlesztünk ki, amelyek a HPV E7-et az SV40 korai promoter kontrollja alatt tartalmazzák. Minden egyes ellentétes értelmű oligonukleotid esetében a sejteket a fent ismertetett módon előkezeljük, majd AsE2CAT-tal transzfektáljuk és a CAT aktivitását a fent ismertetett módon meghatározzuk.
4. példa
BPV-1 El expresszió gátlása ellentétes értelmű oligonukleot idokká1
A BPV-l-ben lévő El a virális genom replikáció e • · gyik regulatora. Az ellentétes értelmű oligonukleotidok virális replikációra kifejtett hatásának vizsgálatára BPV-1-gyel fertőzött C127 sejteket El-specifikus ellentétes értelmű oligonukleotidokkal kezelünk oly módon, hogy az oligonukleotidokat 5, 15 és 30 gmol/l végkoncentrációban adjuk a tápközeghez. Az oligonukleotidok hatását szokásos Northern biot analízissel végezzük, mind az El-specifikus RNS, mind az összes virális RNS mennyiségének meghatározására. Ezenkívül az összes genom-DNS Southern biot analízisével meghatározzuk az ellentétes értelmű oligonukleotidok virális genom példányszámára kifejtett hatását is.
5. példa
BPV-1 ellentétes értelmű oligonukleotidok hatékonyságának vizsgálata kísérletesen indukált marha fibropap i1lomákra
Több marha fibropapillomát indukálunk borjakban az epidermis BPV-l-gyel való közvetlen fertőzésével. Kifejlődésük után a fibropapillomákat az in vitro kísérletekben pozitív hatásúnak bizonyult oligonukleotidokkal, valamint kontrollokkal kezeljük. Pozitív hatásúnak azokat az oligonukleotidokat tekintjük, amelyek a fibropapillomákban regressziót indukálnak.
6. példa
E2 mRNS-sel komplementer oligonukleotidok tervezése és szintézise
Az E2 mRNS különböző régióival komplementer ellentétes értelmű oligonukleotidokat terveztünk a BPV-1 ismert nukleotid szekvenciája [Chen E.Y., Howley P.M., Levinson A.
.. ..
« « · · · • · · ··· • »· · and Genetic Organ1 Genom, Natúré
- 38 D. és Seeburg P.H.: The Primary Structure ization of the Bovine Papillomavirus Type
299, 529-534 (1982)] és fő E2 transzaktivátor mRNS cDNS szerkezete [Yang Y.C., Okayama H. és Howley P.P.: Bovine Papillomavirus Contains Multiple Transforming Genes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 1030-1034 (1985)] alapján. A HPV-11 E2 transzlációs iniciátor kodonja elleni ellentétes értelmű oligonukleotidok a HPV-1 ismert szekvenciáján [Dartmann K. , Schwarz E., Gissmann L. és zűr Hausen, Virology 151, 124-130 (1986)] alapulnak. A szilárd fázisú oligodezoxiribonukleotid szintézist Applied Biosystems 380B automata DNS szintetizátorban végeztük. A foszforotioát oligonukleotidok előállítására a szulfurálást minden egyes kapcsolás után elvégeztük 0,2 mol/1 koncentrációban acetonitrilben oldott 3H-1,2-benzoditiol-3-on-l,1-dioxid alkalmazásával, Iyer és munkatársai módszere szerint [Iyer R.P., Phillips L.R., Egan W. , Regan J. és Beaucage S.L.: The Automated Synthesis of Sulfur-Containing Oligodeoxyribonucleotides Using 3H-1,2-Bensodithiol3-one 1,1-Dioxide as a Sulfur-Transfer Reagent, J. Org. Chem.
55, 4693-4699 (1990)]. A tökéletes tioátképzés biztosítására a növekvő láncú oligonukleotidot minden egyes szulfurálási lépés után védjük. A szintézis mátrixáról való lehasítás után a védőcsoportjuktól megfosztott oligonukleotidokat NaCl-ból kétszer kicsapjuk és vízben szuszpendáljuk. Az oligonukleotid koncentrációját 260 nm-en mért optikai sűrűségük alapján határozzuk meg. A sejttenyészetekben végzett vizsgálatok céljára az oligonukleotidokból 100 gmol/l koncentrációjú törzsoldatokat készítünk, amelyeket -80 °C-on tárolunk a • 9 felhasználásig. Az oligonukleotidok tisztaságát, integritását és mennyiségét elektroforézissel határozzuk meg, 20 %-os akril-amid - 7 mol/1 karbamid gélben (40 cm x 20 cm x 0,75 mm), Maniatis és munkatársai módszere szerint [Maniatis T., Fritsch E.F. és Sambock J.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982)]. Az elektroforetizált oligonukleotidokat festéssel tesszük láthatóvá a gélben, a festést Stain-all-lal (l-etil-2-[3-(l-etil-naftol[1,2-d]tiazolin-2-ilidén)-2-metil-propenil-naftol[l,2-d]tiazolium-bromid, Sigma, E-9379) végezzük [Dahlberg A.E., Digman C.W. és Peacock A.C., J. Mól.Bioi. 41, 39 (1969)].
7. példa
Molekuláris szerkesztések
A találmány értelmében alkalmazott E2 kloramfenikol-acetil-traszferáz (CAT) riporter plazmid ismert [Spalholz B.A., Byrne J.C. és Howley P.M.: Evidence fór Cooperativity between E2 Binding Sites in E2 Trans-regulation of Bovine Papillomavírus type 1, J. Virol. 62, 3143-3150 (1988)]. Röviden, a BPV-1 E2-felelős elemét, az E2REl-et (7611-7806. nukleotid) rekonstruáljuk oligonukleotidok alkalmazásával és pSV2CAT-ba klónozzuk, amelyből töröltük az SV40 fokozót, az Sphl fragmenst. A CAT expressziója ebből a plazmidból bizonyítottan az E2 teljes hosszától függ. A C59 plazmid egy majom vírus (SV40) promoterből és fokozóból expresszált E2 cDNS-t tartalmaz és már részletesen leírták [Yang Y.C., Okayama H. és Howley P.M.: Bovine Papillomavírus Contains Multiple Transformig Genes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82.
1030-1034 (1985)]. Két teljes hosszúságú HPV-1 E2 expressziős konstruktumok állítunk elő. Az IPV115 a HPV-1 XmnI fragmensét (2665-4988. nukleotid) a pMSG (Pharmacia, katalógusszám: 27-4506) Smal helyére klónozva tartalmazza, az IPV118 ugyanezt a HPV-11 XmnI fragmenst tartalmazza a pSVL (Pharmacia, katalógusszám: 27-4509) Smal helyére klónozva.
8. példa
Sejtvonalak
Az egér C127 sejteket [Dvoretzky I., Schober R. és Lowy D.: Focus Assay in Mouse Cells fór Bovine Papillomavirus typ 1, Virology 103, 369-375 (1980)] Dulbecco-féle módosított Eagle-tápközegben tenyésztjük, amelyet 10 % magzati marhaszérummal, 100 egység/ml penicillinnel, 100 gg/ml streptomicinnel és 4 mmol/1 glutaminnal egészítettünk ki. Az 1-38 sejtvonal tisztított BPV-l-gyel transzformált C127 sejtek egyetlen telepéből származik [Cowsert L.M., Laké P. és Jenson A.B.: Topographical and Conformational Epitopes of Bovine Papillomavírus type 1 Defined by Monoclonal Antibodies].
9. példa
Oligonukleotid gátlás E2 dependens transzaktiváció vizsgálatában
Az oligonukleotidok E2 transzaktiválást vagy transzrepressziót gátló hatásának vizsgálatára 1-38 sejteket szélesztünk 1 x 104 sejt/cm 2 sűrűségben 60 mm-es petricsészékbe 24 órával a transzfekció előtt. A transzfekció előtt 16 órával a tápközeget leszívatjuk és meghatározott koncentrációban oligonukleotidot tartalmazó tápközeggel helyettesít> ·** jük. A transzfekció előtt 1 órával a tápközeget leszívatjuk és oligonukleotidot nem tartalmazó friss tápközeggel helyettesítjük. A sejteket kalcium-foszfátos precipitálással transzfektáljuk Graham és munkatársai módszere szerint [Graham F.L. és van dér Eb A.J.: A New Technique fór the Assay of Infectivity of Humán Adenovirus 5 DNA, Virology 52, 456-461 (1973)], összesen 20 μg DNS/ml precipitátumal. Mindegyik 60 mm-es petricsészébe 200 μΐ precipitátumot mérünk, amely 4 μg DNS-t tartalmaz. A precipitált DNS beadagolása után 4 órával a felülúszókat leszívatjuk és a sejteket 15 % glicerinnel kezeljük [Frost E. és Williams J.: Mapping Temperature-Sensitive and Host-Range Mutation of Adenovirus type 5 by Marker Rescue, Virology 91, 39-50 (1978)]. A sejteket mossuk, majd az oligonukleotidot eredeti koncentrációban tartalmazó tápközeg hozzáadásával 48 órán keresztül inkubáljuk.
A találmányt természetesen nem kívánjuk a fent közölt specifikus megvalósítási módokra korlátozni.
Claims (7)
1. Papillomavírusból származó E2, El, E7 vagy
E6-7 mRNS-sel hibridizálódó, 8-50 bázisból álló oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, amely a hibridizálódás következtében gátolja a mRNS működését.
2. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, amely a papillomavírus E2 transzaktivátor részét tartalmazó E2 mRNS-sel hibridizálódik.
3. Oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, amelynek bázisszekvenciája a 2. táblázatban megadott szekvenciák egyike.
4. Eljárás papillomavírus expressziójának módosítására, azzal jellemezve, hogy a papillomavírusból származó mRNS-t az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti oligonukleotiddal vagy oligonukleotid analóggal hozzuk érintkezésbe.
5. Eljárás papillomavírus általi fertőzés hatásainak módosítására valamely állatban, azzal jellemezve , hogy az állatot az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti oligonukleotiddal vagy oligonukleotid analóggal hozzuk érintkezésbe.
6. Eljárás feltételezhetően papillomavírust tartalmazó mintában a vírus jelenlétének vagy hiányának kimutatására, azzal jellemezve, hogy
- a mintát az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti oligonukleotiddal vagy oligonukleotid analóggal hozzuk érintkezés999» ••·· ·· • · 0 4 * ♦
9 9 9 » 9 9 999
9 9 9 9 ···· 4 * · »« ♦· * · ·♦
- 43 be, és
- a hibridizálást detektáljuk.
7. Készlet feltételezhetően papillomavírust tartalmazó mintában a vírus jelenlétének vagy hiányának kimutatására, azzal jellemezve, hogy az
- egy, az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti oligonukleotidot vagy oligonukleotid analógot és
- a hibridizálás detektálására alkalmas eszközöket tartalmaz.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US44519689A | 1989-12-04 | 1989-12-04 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9201865D0 HU9201865D0 (en) | 1992-09-28 |
| HUT62944A true HUT62944A (en) | 1993-06-28 |
Family
ID=23767951
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU921865A HUT62944A (en) | 1989-12-04 | 1990-12-03 | Inhibition of papilloma virus with opposite oligonucleotides |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0503002B1 (hu) |
| JP (1) | JPH05501058A (hu) |
| KR (1) | KR960012069B1 (hu) |
| AT (1) | ATE163973T1 (hu) |
| AU (1) | AU650257B2 (hu) |
| BR (1) | BR9007892A (hu) |
| CA (1) | CA2070664C (hu) |
| DE (1) | DE69032134T2 (hu) |
| FI (1) | FI922593A0 (hu) |
| HU (1) | HUT62944A (hu) |
| WO (1) | WO1991008313A1 (hu) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5447839A (en) * | 1988-09-09 | 1995-09-05 | Hoffmann-La Roche Inc. | Detection of human papillomavirus by the polymerase chain reaction |
| US5457189A (en) * | 1989-12-04 | 1995-10-10 | Isis Pharmaceuticals | Antisense oligonucleotide inhibition of papillomavirus |
| US6339066B1 (en) | 1990-01-11 | 2002-01-15 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense oligonucleotides which have phosphorothioate linkages of high chiral purity and which modulate βI, βII, γ, δ, Ε, ζ and η isoforms of human protein kinase C |
| US5587361A (en) * | 1991-10-15 | 1996-12-24 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity |
| US5635488A (en) * | 1991-10-15 | 1997-06-03 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compounds having phosphorodithioate linkages of high chiral purity |
| US5620963A (en) * | 1991-10-15 | 1997-04-15 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides for modulating protein kinase C having phosphorothioate linkages of high chiral purity |
| US5599797A (en) * | 1991-10-15 | 1997-02-04 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity |
| US5576302A (en) * | 1991-10-15 | 1996-11-19 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides for modulating hepatitis C virus having phosphorothioate linkages of high chiral purity |
| US5661134A (en) * | 1991-10-15 | 1997-08-26 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides for modulating Ha-ras or Ki-ras having phosphorothioate linkages of high chiral purity |
| US5607923A (en) * | 1991-10-15 | 1997-03-04 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides for modulating cytomegalovirus having phosphorothioate linkages of high chiral purity |
| US5654284A (en) * | 1991-10-15 | 1997-08-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides for modulating RAF kinase having phosphorothioate linkages of high chiral purity |
| US6537973B1 (en) | 1992-03-16 | 2003-03-25 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotide inhibition of protein kinase C |
| WO1995028942A1 (en) * | 1994-04-26 | 1995-11-02 | Genta Incorporated | Antisense oligomers for inhibiting human papillomaviruses |
| US5750341A (en) * | 1995-04-17 | 1998-05-12 | Lynx Therapeutics, Inc. | DNA sequencing by parallel oligonucleotide extensions |
| US6458940B2 (en) * | 1995-06-06 | 2002-10-01 | Hybridon, Inc. | HPV-specific oligonucleotides |
| US6509149B2 (en) * | 1995-06-06 | 2003-01-21 | Hybridon, Inc. | HPV-specific oligonucleotides |
| FR2758725B1 (fr) * | 1997-01-29 | 1999-04-02 | Pasteur Institut | Composition comprenant une proteine e2 de papillomavirus ou une sequence de nucleotides codant pour une proteine e2 de papillomavirus |
| CN101970662A (zh) * | 2007-11-05 | 2011-02-09 | 波罗的科技发展有限公司 | 带有修饰碱基的寡核苷酸作为抗病毒剂的应用 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4806463A (en) * | 1986-05-23 | 1989-02-21 | Worcester Foundation For Experimental Biology | Inhibition of HTLV-III by exogenous oligonucleotides |
| DE3853678T2 (de) * | 1987-02-26 | 1995-08-31 | Univ Sydney | Verfahren zum nachweis des karzinogenen menschlichen papillomavirus. |
| US4849334A (en) * | 1987-06-09 | 1989-07-18 | Life Technologies, Inc. | Human papillomavirus 43 nucleic acid hybridization probes and methods for employing the same |
| US4849331A (en) * | 1987-06-09 | 1989-07-18 | Life Technologies, Inc. | Human papillomavirus 44 nucleic acid hybridization probes and methods for employing the same |
| US4849332A (en) * | 1987-05-26 | 1989-07-18 | Life Technologies, Inc. | Human papillomavirus 35 nucleic acid hybridization probes and methods for employing the same |
| US4908306A (en) * | 1987-06-12 | 1990-03-13 | Life Technologies, Inc. | Human papillomavirus 56 nucleic acid hybridization probes and methods for employing the same |
| FR2629458B2 (fr) * | 1987-07-31 | 1991-08-09 | Ire Celltarg Sa | Nouvelles sondes d'acides nucleiques specifiques de differents types de virus de papillome humain |
| US4886741A (en) * | 1987-12-09 | 1989-12-12 | Microprobe Corporation | Use of volume exclusion agents for the enhancement of in situ hybridization |
| DE3838269A1 (de) * | 1988-11-11 | 1990-05-17 | Behringwerke Ag | Nachweis humaner papillomavirus dna und ihrer expression in zervix-abstrichen |
| US5027693A (en) * | 1989-11-24 | 1991-07-02 | Allied-Signal Inc. | Combination diaphragm and valve body |
| AU7302191A (en) * | 1990-01-30 | 1991-08-21 | Children's Hospital Of Los Angeles | Inhibition of transcription by double-stranded oligonucleotides |
-
1990
- 1990-12-03 CA CA002070664A patent/CA2070664C/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-12-03 EP EP91902031A patent/EP0503002B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-03 AT AT91902031T patent/ATE163973T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-12-03 DE DE69032134T patent/DE69032134T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-12-03 HU HU921865A patent/HUT62944A/hu unknown
- 1990-12-03 WO PCT/US1990/007067 patent/WO1991008313A1/en active IP Right Grant
- 1990-12-03 JP JP91502693A patent/JPH05501058A/ja active Pending
- 1990-12-03 BR BR909007892A patent/BR9007892A/pt not_active Application Discontinuation
- 1990-12-03 KR KR1019920701324A patent/KR960012069B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1990-12-03 AU AU71756/91A patent/AU650257B2/en not_active Ceased
-
1992
- 1992-06-04 FI FI922593A patent/FI922593A0/fi unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69032134D1 (de) | 1998-04-16 |
| EP0503002B1 (en) | 1998-03-11 |
| HU9201865D0 (en) | 1992-09-28 |
| EP0503002A4 (en) | 1993-03-10 |
| AU650257B2 (en) | 1994-06-16 |
| AU7175691A (en) | 1991-06-26 |
| FI922593A (fi) | 1992-06-04 |
| WO1991008313A1 (en) | 1991-06-13 |
| FI922593A0 (fi) | 1992-06-04 |
| DE69032134T2 (de) | 1998-07-23 |
| BR9007892A (pt) | 1992-09-29 |
| KR960012069B1 (ko) | 1996-09-12 |
| CA2070664C (en) | 2000-08-08 |
| EP0503002A1 (en) | 1992-09-16 |
| JPH05501058A (ja) | 1993-03-04 |
| CA2070664A1 (en) | 1991-06-05 |
| ATE163973T1 (de) | 1998-03-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5665580A (en) | Antisense oligonucleotide inhibition of papillomavirus transformed cells | |
| HUT62944A (en) | Inhibition of papilloma virus with opposite oligonucleotides | |
| Stoler et al. | Differentiation-linked human papillomavirus types 6 and 11 transcription in genital condylomata revealed by in situ hybridization with message-specific RNA probes | |
| Cowsert et al. | In vitro evaluation of phosphorothioate oligonucleotides targeted to the E2 mRNA of papillomavirus: potential treatment for genital warts | |
| Thomison III et al. | Human papillomavirus: molecular and cytologic/histologic aspects related to cervical intraepithelial neoplasia and carcinoma | |
| US5811232A (en) | Oligonucleotides for Papillomavirus | |
| Cid et al. | Cell-type-specific activity of the human papillomavirus type 18 upstream regulatory region in transgenic mice and its modulation by tetradecanoyl phorbol acetate and glucocorticoids | |
| US6174870B1 (en) | Antisense oligonucleotide inhibition of papillomavirus | |
| US5756282A (en) | Oligonucleotides for the diagnosis of papillomavirus | |
| Yutsudo et al. | Human papillomavirus type 17 transcripts expressed in skin carcinoma tissue of a patient with epidermodysplasia verruciformis | |
| Kulke et al. | Duplication of enhancer sequences in human papillomavirus 6 from condylomas of the mamilla | |
| Morgan et al. | Transformation of C127 mouse fibroblasts by human papillomavirus 16 | |
| Morin et al. | A colposcopical lesion of the uterine cervix frequently associated with papillomavirus type 16 as detected by in situ and southern blot hybridization: a cytohistological correlation study | |
| Roberts | Biology of the E4 protein | |
| von Knebel Doeberitz et al. | Papillomaviruses and Human Cancer | |
| Nurshamimi Nor | Disruption of mammalian dream complexes by human papilomavirus E7 proteins/Nurshamimi Nor Rashid | |
| Hara et al. | Human papillomavirus infection of the uterine cervix analyzed by nonisotopic in situ hybridization | |
| Bernard | Human papillomavirus and malignant transformation | |
| Pater et al. | Glucocorticoid requirement for growth of human papillomavirus 16-transformed primary rat kidney epithelial cells: correlation of development of hormone resistance with viral RNA expression and processing | |
| Howley | The biology of the papillomaviruses | |
| Hall | Regulation of human papillomavirus expression during malignant transformation: analysis in an in vitro model system | |
| Duffy | Visualizing the Productive Program of HPV in Differentiating Squamous Epithelial Tissue | |
| Zhou | Molecular mechanism of immortalization of differentiated human keratinocytes by human papillomavirus type 16 | |
| Harwood | Irene M. Leigh, Judy A. Breuer, John AG Buchanan, Catherine A. Harwood, Sarah Jackson, Jane M. McGregor, Charlotte M. Proby, and Alan Storey | |
| Galloway et al. | Fred Hutchinson Cancer Research Center Seattle, Washington 98104 and Department of Pathology |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFD9 | Temporary protection cancelled due to non-payment of fee |