JPH05501058A - 乳頭腫ウイルス属のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 乳頭腫ウィルス属のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害発明の分野 本発明は、乳頭腫ウィルス属の阻害および乳頭腫ウィルス属によって引き起こさ れる動物の感染の診断および治療に関する１本発明は、更に、乳頭腫ウィルス属 を含んでいると疑われるｔｉ：料での乳ＢＸｍウィルス属の検出および定量に間 する。

更に、本発明は、乳頭腫ウィルス属由来のメツセンジャーＲＮＡの機能を妨害す るかまたは変調するオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体に関す る。このような妨害を、乳頭腫ウィルス属感染の診断および治療の手段として用 いることができる。それは、検査試薬のための並びに研究用および診断用双方の キットのための主成分を形成することもできる。

発明の背景 乳頭腫ウィルス属（ＰＡ）は天然に広く分布しており、概して、いぼとして一般 的に称される良性の上皮および線維上皮病変に関係している。それらは、ヒト、 ウシ、ウサギ、シカおよび数種類の鳥類の種を含む様々な高等を推動物で検出さ れ且つ単離された。これらのウィルスは、概して、良性の病変に関係しているが 、ある特定の種類のウィルスは、癌に進行することがある病変に関係していた。

これらのウィルスがある種のヒトの癌の発達において病因の役割を果たすことが あるという密接な関係は、転写活性ヒト乳頭腫ウィルス（ＨＰＶ）デオキシリボ 核酸がある種の癌病変に高率で存在することを示した多数の研究の結果による。

ツア・ハウゼン・エイチ（Ｚｕｒ　Ｈａｕｓｅｎ、Ｈ）およびシュナイダー・エ イ（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、Ａ、＞１９８７．Ｔｈｅ　Ｐａ　ｏｖａｖｉｒｉｄａ ｅ。

第２巻、エヌ・ピー・ザルラマン（Ｎ、Ｐ、Ｓａｌ　ｚｍａｎ）およびビー・エ ム・ハウリー（Ｐ、Ｍ、Ｈｏｗｌｅｙ）監修、２５４〜２６４頁、プレナム・プ レス（Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク。

ヒトにおいて、ヒト乳頭腫ウィルスは、手および足の一般的ないぼ、喉頭いぼ並 びに性器いぼを含む種々の疾患を引き起こす、５７種類を上回るＨＰＶがこれま でに確認された。各ＨＰＶには好ましい解剖学的感染部位があり、各ウィルスは 、概して、特定の病変に関係することがある。性病いぼおよび尖圭コンジローム とも称される性器いぼは、Ｐｖ感染の最も重大な発現の一つである。疾病管理セ ンターによって報告されたように、性器いぼの性的伝播形式は十分に確立され− 性器いぼの発生率は増加しつつある。性器いぼの重要性は、ＨＰＶ　ＤＮＡが頚 部上皮的新形成の全グレード（ＣＩＮ　Ｉ〜ＩＩＩ）で見出すことができること および特定の種類のＨＰＶ種を頚部の現場の癌で見出すことができるという最近 の発見によって強調されている。したがって、特定のＨＰＶ種を含む性器いぼの ある女性は、子宮頚癌の発達の危険性が高いと現在考えられている。性器いぼに 対する現在の治療は不十分である。

乳頭腫ウィルス属を妨害することができる物質の組成物を提供する大きな希望は あるが、今のところまだ果たされていない、同様に、動物の乳頭腫ウィルス属感 染のための治療法および診断法を達成することが望まれる。更に、乳頭腫ウィル ス属の研究で用いるための改良されたキットおよび検査試薬が必要である。

発明の目的 本発明の目的は、乳頭腫ウィルス属のメツセンジャーＲＮＡとハイブリッド形成 して、そのメツセンジャーＲＮＡの機能を阻害することができるオリゴヌクレオ チドおよびオリゴヌクレオチド類似体を提供することである。

もう一つの目的は、ウィルスのメツセンジャーＲＮＡとのアンチセンス相互作用 によって乳頭腫ウィルス属ＤＮＡの機能性発現を変調することができるオリゴヌ クレオチドおよび類似体を提供することである。

本発明のもう一つの目的は、動物における乳頭腫ウィルス属のための診断法およ び治療法を提供することである。

乳頭腫ウィルス属を含んでいると疑われる試料でのその存在または不在を検出す るための方法、材料およびキットは、本発明のもう一つの目的である。

新規のオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体は本発明のその他の 目的である。

これらの目的および他の目的は、本明細書および添付の請求の範囲を検討するこ とにより当業者に明らかになるものである。

図面の簡単な説明 図１は、若干のＰｖゲノムの遺伝体制の概略地図である。

図２は、ウシ乳頭腫ウィルスであるＢＰＶ−１の部分的な遺伝子地図であり。

ゲノムは読取り枠０ＲＦｓを示し、メツセンジャーＲＮＡはそのゲノムから転写 されている。

図３は、ヌクレオチド２４４３から４２０３までを示すＢＰＶ−Ｉ　Ｅ２トラン スアクティベーター遺伝子ｍＲＮＡのヌクレオチド配列である。

図４は、ヌクレオチド２４４３から３０８０ｔでを有するドメイン示すＢＰＶ− Ｉ　Ｅ２トランスアクティベーター遺伝子ｍＲＮＡのヌクレオチド配列である。

図５は、ヌクレオチド８９から３０４までを有するドメイン示す初期メツセンジ ャーＲＮＡをコードするＢＰＶ−１の５′共通非翻訳領域のヌクレオチド配列で ある。

図６は、本発明の技法によって製造されたアンチセンスオリゴヌクレオチドのヌ クレオチド配列およびＥ２　ｍＲＮＡ上のオリゴヌクレオチドの相対位置である 。オリゴヌクレオチドの識別記号、配列および機能的役割を記載する。

図７は、本発明の技法によって製造されたアンチセンスオリゴヌクレオチドのＥ ２発現に対する作用を示すグラフである＊　ｍＲＮＡのＣＡＰ領域を標的とする オリゴヌクレオチド（１１７５１）およびＥ２トランスアクティベーターの翻訳 コドン（１１７５３）は、マイクロモルの濃度でＥ２１−ランスアクティベータ ーンを減少させることが分かる。

図８は、本発明の技法によって製造されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの用 量反応を示すグラフである。

これらの用量反応曲線は、翻訳開始コドンを含む領域のＥ２トランスアクティベ ーションメッセンジャーＲＮＡに相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチド １１７５３の５０％阻害濃度（ＩＣ５ｏ）は５０〜１００ナノモルであるが、同 一のメツセージのＣＡＰ領域を標的とするオリゴヌクレオチド（１１７５１）の Ｉ　Ｃ５ｏは５００ナノモルの範囲であることを示す。

図９は、本発明の技法によって製造され、Ｅ２　ｍＲＮＡのトランスアクティベ ーターおよびトランスソグレマザー領域を標的としたアンチセンスオリゴヌクレ オチドのヌクレオチド配列である。

図１０は、Ｅ２　ｍＲＮＡのトランスアクティベーター領域を標的とする選択さ れたオリゴヌクレオチドの作用を示すグラフである１本発明の技法によって製造 された１５〜２０マーのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｅ２トランスアク ティベーションを阻害することが示される。

図１１は、Ｅ２　ｍＲＮＡのトランスリグレマザー領域を標的とする選択された オリゴヌクレオチドの作用を示すグラフである０本発明の技法によって製造され た１５〜２０マーのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｅ２トランスリプレッ ションを阻害することが示される。

図１２は、ＢＰＶ−１の生物学上、現場でＥ２）−ランスアクティベーターの減 少の結果を示す写真である０本発明の技法によって製造されたアンチセンスオリ ゴヌクレオチドは、Ｃ１２７４［Ｂ胞のＢＰＶ−１形質転換を阻害または減少さ せる能力について試験された。

図１３は、Ｅ２　ｍＲＮＡのトランスアクティベーター領域を標的とする選択さ れたオリゴヌクレオチドの作用を示すグラフである０本発明の技法によって製造 されたアンチセンスオリゴヌクレオチドによるＢＰＶ−１フオーカス形成の阻害 を示す、１１７５１および１１７５３についてのこれらの用量反応曲線により、 １１７５３のＩＣは１０ナノモルの範囲であるが、１１７５１のＩＣ５ｏは１０ ０ナノモルの範囲であることが示される。

図１４は、ＢＰＶ−１のゲノムを複製するその能力に対する本発明の技法によっ て製造されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの作用を示すグラフである。ウィ ルスによって形質転換された細胞を１１７５１および１１７５３で処理し、ウィ ルスのＤＮＡを定量した。

図１５は、代謝的にＷＡ識されたオリゴヌクレオチドで処理した細胞または未処 理対照を単クローン性抗体を用いて免疫沈降させた免疫沈降検定の結果を示す。

図１６は、Ｅ２の翻訳開始コドンの領域でのＨＰＶ−１１のヌクレオチド配列で ある。

発明の要約 本発明の好ましい実施！９′ｍにより、乳頭腫ウィルス属由来のメツセンジャー ＲＮＡとハイブリッド形成しうるオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド 類似体を提供する。この関係を、一般的に、「アンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｓ ｅ）」と称する。オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体は、ＲＮ Ａの機能であるタンパク質への翻訳、細胞質への転座かまたはその生物学的機能 全体に必要な任意の他の活性を阻害することができる。メツセンジャーＲＮＡが その機能の全部または一部分を行うことができないと、乳頭腫ウィルス属ゲノム は適切に発現されないことになり、すなわち、増殖しないし、正しい子孫が有効 数で形成されないし、そして乳頭腫ウィルス属に感染した動物によるこのような 子孫の有害な作用が変調される。

ここで、乳頭腫ウィルス属のいくつかのメツセンジャーＲＮＡによって表わされ るアンチセンス攻撃に対するそのゲノム部分を標的とするのが好ましいことが分 かった。ここで、乳頭腫ウィルス属のＥ２、Ｅｌ、ＥｌおよびＥ６−７のｍＲＮ Ａがこの研究に特に適していることが発見された０例えば、オリゴヌクレオチド またはオリゴヌクレオチド類似体によるハイプリダイセーションに望ましいメツ センジャーＲＮＡは、Ｅ２、Ｅｌ、ＥｌまたはＥ６−７のメツセンジャーＲＮＡ であることが好ましい、なお一層好ましい実施態様により、ウシ乳頭腫ウィルス −１においてヌクレオチド２４４３から３０８０までまたは８９から３０４まで で例示されるような乳頭腫ウィルス属のＥ２）−ランスアクティベーター領域ま たは５′共通非翻訳領域から転写されたＲＮＡ部分と相補的であるように設計さ れたヌクレオチド塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド 類似体を提供する。

最も好ましい実施！ｇ様により、Ｅ２トランスアクティベーターに対するｍＲＮ Ａ　ＣＡＰ領域および翻訳コドンを標的とするオリゴヌクレオチドを提供する。

これらのオリゴヌクレオチドは、ＢＰＶ−１のヌクレオチド２４４３から４１８ ０まででコードされるＥ２　ｍＲＮＡとハイブリッド形成するように設計される 。

ここで、乳頭腫ウィルス属の発現を変調させる方法は、前記の乳頭腫ウィルス属 由来のメツセンジャーＲＮＡを、その乳頭腫ウィルス属由来のメツセンジャーＲ ＮＡとハイブリッド形成しうるオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類 似体と接触させることを含み、そのオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチ ド類似体は、それとハイブリッド形成した場合、前記のメツセンジャーＲＮＡの 機能を阻害することが発見された。乳頭腫ウィルス属のＥ２、Ｅｌ、Ｅｌまたは Ｅ６−７のｍＲＮＡとハイブリッド形成するように設計されているオリゴヌクレ オチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を用いることは好適である。

更に、ここで、動物における乳頭腫ウィルス属感染の作用を変調する方法は、そ の動物を乳頭腫ウィルス属由来のメツセンジャーＲＮＡとハイブリッド形成しう るオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体と接触させることを含み 、それによって、それとハイブリッド形成した場合、前記のメツセンジャーＲＮ Ａの機能を阻害することが発見された。乳頭腫ウィルス属のＥ２、Ｅｌ、Ｅｌま たはＥ６−７のｍＲＮＡとハイブリッド形成しうるオリゴヌクレオチドまたはオ リゴヌクレオチド類似体は好適である。

このようなオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を用いて乳頭腫 ウィルス属の存在または不在を検出するための診断法は、更に、このようなハイ ブリダイゼーションによるこの種の診断上の活性のためのキットおよび検査用試 薬と同様に本発明の範囲内である。

発明の詳細な説明 性器いぼは、最も頻繁に診断されるウィルス性の性的伝播疾患である。臨床的に は、それらは二つの主要なグループ、すなわち、尖圭コンジロームおよび偏平顕 部いぼに分類することができる。コンジロームはウィルス粒子を含むことが分か っており、分子研究により、９０％を上回るこれらの病変がＨＰＶ−６かまたは ＨＰＶ−１１のＤＮＡを含むことが実証された。ギスマン・エル（Ｇｌｓ″ｓｍ ａｎｎ、Ｌ、）、ウォルニク・エル（Ｗｏｌｎｉｋ、Ｌ、）、イケンバーグ・エ イチ（Ｉｋｅｎｂｅｒｇ、Ｈ，）、コルドフスキー・ニー（Ｋｏ　ｌ　ｄ、ｏｖ ｓｋｙ、Ｕ、）　、シュナーチ・エイチ・ジー（Ｓｃｈｎｕｒｃｈ。

Ｈ，Ｇ、）およびツアーハウゼン・エイチ（ｚｕｒ　Ｈａｕｓｅｎ、Ｈ，）。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ、８０，５６０〜５６３（ １９８３）、尖圭コンジロームは、概して、陰茎、外陰部または肛門周囲部分に 生じる。それらは自然に後退するかまたは何年も存続することがあり、侵食癌へ の進行は低頻度でのみ生じる。他の性器いぼとは異なり、子宮頚部で生じるもの は尖形よりもむしろ偏平な形態を示し、通常、パパニコラウスミアで臨床的に検 出される。子宮頚部形成異常の病因である乳頭腫ウィルス属は、１９７０年代の 末期に、ＨＰＶ感染による細胞学的変化と形成異常のものとのババニコラウスミ アでの関係を実証した細胞学者の研究によって示唆された。ｆｌ！１の研究では 、これらの病変の形成異常細胞の多くにウィルス粒子およびウィルスカプシド抗 原が存在することが示された。この関係は、従来の臨床研究で、子宮頚部形成異 常（ＣＩＮまたは頚部上皮肉新生物とも称する）は現場の癌に対する前駆体であ って、順次に、頚部の侵食鱗状上皮細胞癌に対する前駆体であると認められると いうことが確証されたので重要である。ＨＰＶ−１６型および１８型は子宮頚癌 から直接クローン化された。デュルスト・エム（Ｄｅｕｒｓｔ、Ｍ）　、ギスマ ン・ポジヤード・エム（Ｂｏｓｈａｒｔ、Ｍ、）、ギスマン・エル、イケンバー グ・エイチ、クラインハインツ・エイ（Ｋｌｅｉｎｈｅｌｎｚ、Ａ）、シュアレ ン・ダブリュー（Ｓｃｈｅｕｒｆｅｎ、Ｗ、）およびツア・ハウゼン・エイチ、 ＥＭＢＯＪ、、旦、１１５１〜１１５７　（１９８４）、これらをハイプリダイ セーションプローブとして引き続き用いて、７０％を上回るヒト子宮頚癌および 誘発された細胞系がこれらの両方のＨＰＶ型の存在に対して陽性であることを示 した。他の２０％には、更に別のＨＰＶ型、例えば、ＨＰＶ−３１、ＨＰＶ−３ ３およびＨＰＶ−３５が含まれる。

米国治療指数から集められたデータにより、１９８４年には、性器いぼの初診が ２２４，９００件および陰部ヘルペスの初診１５６．７２０件であることが示さ れた。性器いぼの発生率は、１９５０年から１９７８年の平均発生率がｉｏｏ、 ｏｏｏ人当り１０６．５人に達したという疫学的研究によって実証されたように 、１９７０年から１９８０年にわたって着実に増加してきた。２５才から５５才 の女性での頚部ＨＰＶ感染の罹患率は０．８％であったが、２２才の女性では２ ．７％であった。細胞学的に正常な女性についての最近の研究により、潜伏感染 の発生率は１１％であることが実証された。したかって、一層高い発生率および 罹患率を示唆する疾患の潜伏期があると考えられる。

活発な性器いぼは妊娠した米国人女性の約２．５％で確認することができ、した がって、１年間に６０．０００〜９０．０００件の妊娠に関係している。ＨＰ■ ＰＶは、妊娠した女性で流行するとして３回以上である。毎年、喉頭乳頭重症の 新規の症例が推定で１，５００件あり、母親から新生児への感染の危険率がに８ ０〜１　：　２００であることを示している。

喉頭乳頭腫は喉頭の良性上皮腫瘍である。２種類のＰＶ型、すなわち、ＨＰＶ− ６およびＲＰＶ−１１が喉頭乳頭腫に最も一般的に関係している。臨床的には、 喉頭乳頭腫は二つのグループ、すなわち、未成年者の発病および成人の発病に分 類される。未成年者の発病では、新生児が、性器Ｐ■に感染した！親の産道を通 過した時点で感染すると考えられる。疾患は、通常、２才で判明し、良性乳頭腫 が徐々にはであるが着実に成長して、外科的介入がないと最終的には気道を閉塞 することを特徴とする。これらの子供は、典型的に、乳頭腫を再発する度に何度 も外科手術を受ける。ｆｋ終的に、患者は度重なる外科手術による合併症に倒れ る。

現在のところ、未成年者で発病する喉頭乳頭腫症に対する治療法はなく、自然の 後退はまれである。成人で発病する喉頭乳頭腫は攻撃的ではなく、自然緩解の経 過をとることが多い。

乳頭腫ウィルス属感染に関係した最も一般的な疾患は、良性の皮膚いぼである。

概して、一般的ないぼはＨＰＶＩ型、２型、３型、４型または１０型を含む、こ れらのいぼは、典型的に、足の裏に生じる足底いぼかまたは手に生じる。一般的 な皮膚いぼは、子供および若い成人で見出されるのが最も多い、晩年には、一般 的ないぼの発生率は、おそらくは免疫学的変化および生理的変化によって低下す る１足底いぼは、しばしば衰弱させることがあり且つ外科的に除去することが必 要であり、それらは手術後に再発することが多い、現在のところ、足底いぼに対 する信頼できる治療法はない０手の一般的ないぼは醜いが、衰弱させることはほ とんどなく、したがって、外科的に処置しないのが一般的である。

ゆうぜい状表皮発育異常症（ＥＶ）は、希な遺伝的伝播疾患であり、小さい赤み がかった斑として現れる散在性偏平いぼを特徴とする０種々のＨＰＶ型がＥＶに 関係していた０時がたつにつれて、ＥＶ患者の約３分の１が、多数の部分で皮膚 の偏平上皮癌（ＳＣＣ）を発症する。概して、ＳＣＣは、皮膚の太陽に晒された 部分で生じる。ＥＶに関係した種類のＰＶのみがＳＣＣで見出され、ＨＰＶ−５ およびＨＰＶ−８である。遺伝的素因、免疫学的変化およびＵＶ照射並びにＨＰ Ｖはいずれも、これらの患者のＳＣＣの発症の原因となることがある。

Ｐ■ゲノムは、約８，０００の塩基対を有する二重鎖の、共有結合によって閉じ た環状ＤＮＡ分子から成る。多数の動物およびヒトのＰＶの完全なヌクレオチド 配列および遺伝体制は、ウシ乳頭腫ウィルス１型（ＢＰＶ−１１などで決定され た。チェノ・イー・ワイ（Ｃｈｅｎ、Ｅ、Ｙ、）　、ハウソー・ピー・エム（Ｈ ｏｗｌｅｙ、Ｐ、Ｍ、）、レビンソン・エイ・ディー（Ｌｅｖｉｎｓｏｎ。

Ａ、Ｄ、）およびシーバーブ・ピー・エイチ（Ｓｅｅｂｕｒｇ、Ｐ、Ｈ，）、Ｎ ａｔｕｒｅ、２９９．５２９〜５３４　（１９８２）、若干のｐｖの概略地図を 図１に示す、ウィルスの転写は一定方向であり、すなわち、ウィルスｍＲＮＡ全 部が同一のウィルスＤＮＡ！Ｉｆから転写される。エンゲル・エル・ダブリュー （Ｅｎｇｅ　ｌ、Ｌ、Ｗ、）、バイルマン・シー・エイ（Ｈｅ　ｉ　Ｉｍａｎ、 Ｃ。

Ａ、　）　オヨヒハ’ｙ’）−−ｈ”−−エム、Ｊ、Ｖｉ　ｒｏ　１．．４７． ５１６〜５２８（１９８３）；バイルマン・シー・エイ、エンゲル・エル、ロー ライ・ディー・アール（Ｌｏｗｙ、Ｄ、Ｒ，）およびハウソー・ピー・エム、兄 上−立±立五ヱ１１１９．２２〜３４　（１９８２）、遺伝暗号鎖は読取り枠（ ＯＲＦ　ｓ　）と称される１０種類を含む１個々の０ＲＦｓは、生産性に感染し た細胞に対する非生産性細胞でのＰｖゲノムおよびそれらの発現パターンにおけ るそれらの位置に基づいて「初期Ｊかまたは「後期」として分類される０図２は 、ウシ乳頭腫ウイルスー１のいくつかの０ＲＦｓの関係を示す。

替歯類動物４Ｉ胞を形質転換し且つそのゲノムを形質転換した細胞中のエビソー ムとして保持する能力ゆえに、ＢＰＶ−１はインビトロの研究での模範の乳頭腫 ウィルス属として役立った。結果として、ＢＰＶ−１は、全乳頭展属ウィルスの 中で最も特徴を示すものである。ＢＰＶ−１ゲノムは長さが７９４６塩基対であ り、クローン化され且つ配列順序が決定された。チェ２ら、１９８２．上記、Ｂ ＰＶ−１のＤＮＡ配列分析により、８個の初期（Ｅ）および２個の後期（Ｌ）！ 収り枠＜０ＲＦｓ）を決定しな、初期または後期という０ＲＦｓの呼称は、寛容 的に感染した細胞に対する非生産的に感染した形質転換細胞でのそれらの発現パ ターンに基づいた。バイルマンら、１９８２．上記；ベーカー・シー・シー（Ｂ ａｋｅｒ、Ｃ，Ｃ，）およびハウツー・ビー・エム、ＥＭＢＯＪ、、６゜１０２ ７〜１０３５　（１９８７）。

０ＲＦｓ全部は同一のＤＮＡ！ａ上に含まれ、そして現在特徴化されているｍＲ ＮＡ全部が遺伝暗号鎖から転写されていることが示された。アムトマン・イーい くつかの０ＲＦｓが多機な機能を有することが分かった。Ｅ５およびＥ６は、（ Ｌｕｓｋｙ、Ｍ、）およびボチャン・エム・アール（Ｂｏｔｃｈａｎ、Ｍ。

スＤＮＺ複製の変調暗号をコードする。ロバーツ・ジェイ・エム（Ｒｏｂｅｒｔ ｓ、Ｊ、Ｍ、）およびワイントララブ・エイチ（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ、Ｈ，）、 Ｃｅ１１．生６，７４１〜７５２　（１９８６）。

完全な長さのＥ２　０ＲＦは、ウィルスの転写をトランスアクティベートするタ ンパク質をコードし［スパルホルッ・ビー・エイ（Ｓｐａｌｈｏｌｚ、Ｂ、Ａ、 ）、ヤン・ワイ・シーおよびハウツー・ビー・エム、Ｃｅ目、４２，１８３〜１ ．９１　（１９８５）］、そして３’Ｅ２　０ＲＦは、ウィルスの転写のトラン スリプレッサーをコードする。ランバート・ビー・エフ（Ｌａｍｂｅｒｔ、Ｐ。

Ｆ、）、スパルホルツ・ビー・エイおよびハウツー・ビー・ダタブリュー。

Ｃｅ１ｌ、旦旦、６９〜７８　（１９８７）、ＢＰＶ−１のＥ３、Ｅ４およびＥ ８についての機能はまだ決定されていない。

Ｌｌ［カラサート・エル・エム（Ｃｏｗｓｅｒｔ、Ｌ、Ｍ、）、ピラジンスキ・ ダブリュー・ビー（Ｐｉ　１ａｃｉｎｓｋｉ、Ｗ、Ｐ、）およびジｓ’／ソン・ エイ・ビー（Ｊｅｎｓｏｎ、Ａ、Ｂ、）、ｖｔ　ｒｏし２ｊＬＬ・　１６旦・６ １３〜をまたは一部分を標的とするオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチ ド類似プライスパターンの存在によって複雑になっている。これまでに、１８種 類の異なるｍＲＮＡＮが、種々の方法によって決定された。アムトマン・イーお よびサワー・ジー、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、旦、５９〜６６　（１９８２）；プルネ ット・ニス（Ｂｕｒｎｅｔｔ、Ｓ、＞、モレノ・ロベツ・ジェイ（Ｍｏｒｅｎｏ −シー・エイ、エンゲル・エル、ローライ・ディー・アールおよびハウツー・ビ ー・エム、Ｖｉｒｏｌｏ　、１上９．２２〜３４　（１９８２）；ベーカー・シ ー・シーおよびハウツー・ビー・エム、ＥＭＢＯＪ、、旦、１０２７〜１０３５ （１９８７）、ステンランド・エイ＜５ｔｅｎＪｕｎｄ、Ａ、＞、ザビールスキ ・ジェイ（Ｚａｂｉｅｌｓｋｉ、Ｊ、）、オーラ・エイチ（ＡｈｏＩａ、Ｈ，） 、モレノ・ロペツ・ジェイおよびペターマン・ニー、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、。

１旦２，５４１〜５５４　（１９８５）；並びにヤン・ワイ・シー、オカヤマ・ エイチおよびハウツー・ビーエム、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ、Ｓｃ１゜と の間の共通の領域を含む、他のｍＲＮＡ５の５′末端はｎｔ８９０．２４４３ス カプシドにはエンベロープがなく、グリコジル化されていない、ＬＬおよびＬ２ と称する２８Ｍのウィルスにコードされたタンパク質がカプシドを構成している 。Ｌｌは主要なカプシドタンパク質であり、とリオン中に存在するタンパク質の ８０％を含み且つその分子量は５０〜６０ｋＤである。Ｌ２は少量のカプシドタ ンパク質であり、理論分子量は５１ｋＤであるが、７６ｋＤに移動することが分 かった。Ｐｖはインビトロで生産されることができないし、しかも生産性病変で は極めて僅かの成熟ピリオンしか見出されないので、ＰＶの血清学についての詳 細な研究を行うのは不可能であった。

乳頭腫ウィルス属の生活環は複雑であり、今の時点ではほとんど理解されていな い、現在のところ、成熟Ｐ■ピリオンの生産を可能にするインビトロのシステム は、乳頭腫ウィルス属の生活環を特徴化することが不可能であった結果として、 開発されていなかった。ＰＶの宿主域は限定され、種の障壁を滅多に越えること がない、更に、ＰＶ感染は、粘膜かまたは角質の上皮を差別するのみである。Ｐ ■遺伝子発現の調節は、宿主上皮細胞の差別プログラムに最初に連結されると考 えられる。Ｐ■生活環の現在のところ好ましいモデルは下記のとおりであり、す なわち、感染性１７粒子が外傷を介して上皮外層に貫入し且つ宿主組織の基底細 胞に感染する。ウィルスは比較的低コピーの染色体外の要素として保持される。

上皮細胞が差別を受け始めると、ＰＶゲノムは高コピー数に複製され、細胞が終 末段階の差別を受け始めると、後期遺伝子が発現され、そしてウィルスゲノムが 被包される。

乳頭腫ウィルス属は、アンチセンス療法に理想的な標的であることが発見された 。第一に、乳頭腫ウィルス属病変は外面的であり、アンチセンスオリゴヌクレオ チドを送出する局所的試験を可能にし、急速なりリアランスなどの多くの問題を 排除し、そして合成オリゴヌクレオチドの全身性投与にｒＩＩＪ（Ｘしたオリゴ ヌクレオチドの臨床的活性組ＩＩ濃度が得られる。第二に、ウィルスゲノムは感 染した細胞中で分離遺伝要素として保持される。これは、症状を泊陵するのに提 案されたように、ｂイルスの複製機能を攻撃することによって治療法の可能性へ の扉を開くものである。

乳頭腫ウィルス属ゲノムのＥ２　０ＲＰは、特に、アンチセンスオリゴヌクレオ チド設計に十分に遺していることが発見された。Ｅ２は、ＢＰＶ−１およびＨＰ ｖ系双方におけるウィルス転写の主要なトランスアクティベーターであることが 分かった。Ｅ２　０ＲＦの突然変異は、形質転換および染色体外ＤＮＡ複製に対 する多面発現作用を有する。ディメイオ・ディー（ＤｉＭａｉｏ、Ｄ、）＋　Ｊ 。

Ｖｉｒｏｌ、、旦ヱ、４７５〜４８０　（１９８６）；ディメイオ・ディーおよ びセトルマン・ジェイ（Ｓｅｔｔｌｅｍａｎ、Ｊ、）、ＥＭＢＯＪ、、７゜１１ ９７〜１２０４　（１９８８）；グロブ。ディー・イー（Ｇｒｏｆｆ、Ｄ。

Ｅ、）およびランカスター・ダブリュー・ディー（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ、Ｗ。

Ｄ、）、Ｖｉ二立上旦盈ヱ、上５０，２２１〜２３０　（１９８６）；ラプソン ・エム・ニス（Ｒａｂｓｏｎ、Ｍ、Ｓ、）、イー・シー（Ｙｅｅ、Ｃ，）、ヤン ・ライ・シーおよびハウソー・ビー・エム、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、並、６２６〜６ ３４　（１９８６）；並びにサーバー・エフ（Ｓａｒｖｅｒ、Ｎ、）、ラプソン ・エム・ニス、ヤン・ライ・シー、バーン・ジエイ・シー（Ｂｙｒｎｅ、Ｊ。

Ｃ，＞およびハウソー・ビー・エム、Ｊ、Ｖｉ　ｒｏ　１．．５２．３７’７− ３８８（１９８４）、続いて、Ｅ２　０ＲＦは転写トランスアクティベーターを コードすることが分かつな、スバルホルツ・ビー・エイ、ヤン・ライ・シーおよ びハウソー・ビー・エム、Ｃｅ１１．旦、１８３〜１９１　（１９８５）、内部 のＡＵＧでの翻訳開始によって生じたＥ２の一部省略された翻訳部分は、転写の トランスリプレッサーであることが分かった。ランバート・ビー・エフ、スバル ホルツ・ビー・エイおよびハウソー・ビー・エム、Ｃｅ１ｌ、Σ旦、６９〜７８ （１９８７＞、ＤＮＡ結合ドメインであるカルボキシ末端の１００個のアミノ酸 ［マクブライド・エイ・エイ（ＭｃＢｒｉｄｅ、Ａ、Ａ、）、シュシーゲル・ア ール（Ｓｃｈｌｅｇｅ７．Ｒ，）およびハウソー・ビー・エム、ＥＭＢＯＪ、。

ヱ、５３３〜５３９　（１９８８＞］およびＤＮＡ認識配列であるＡＣＣＮ６０ ＧＴ［アンドロフィー・イー・ジエイ（Ａｎｄｒｏｐｈｙ、Ｅ、Ｊ、）、Ｑ−ラ イ・ディー・アールおよびシラー・ジェイ・ティー（ＳｃｈＩ　Ｉ　Ｉｅｒ、Ｊ 、Ｔ、）、Ｎａｔｕｒｅ、３２旦、７０〜７３　（１９８７）並びにモスカルク ・シー（Ｍｏｓｋａｌｕｋ、Ｃ，）およびバスティア・ディー　（Ｂａｓｔ　ｔ ａ、Ｄ、）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｆ、ＵＳＡ、旦４．１２１５ 〜１２１８（１９８７＞　］が決定された。Ｅ２転写調節回路は乳頭腫ウィルス 属それぞれの一般的な特徴である。Ｅ２トランスレギュレーションは、これまで に試験された他の乳頭腫ウィルス属それぞれにおいて実証された。ギウス・ディ ー（Ｇｉ、ｕｓ。

Ｄ、）、グロスマン・ニス（Ｇｒｏｓｓｍａｎ、Ｓ、）、ベデル・エム・エイ（ Ｂｅｄｅ　１１．Ｍ、Ａ、）およびライミンス・エルーＸイ（Ｌａｉ、ｍ１ｎｓ 。

Ｌ、Ａ暑、Ｊ、Ｖｉ　ｒｏ　１．．６２．６６５〜６７２　（１９８８１；ヒロ チカ・エイチ（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａ、Ｈ，＞、ブローカー・ティー・アール（Ｂ ｒｏｋｅｒ、Ｔ、Ｒ，）およびチャタ・エル・ティー＜Ｃｈｏｗ、Ｌ、Ｔ、）、 Ｊ、Ｖｉ　ｒｏ　１．．６１．２５９９〜２６０６　（１９８７）；チン・エム ・ティー　（Ｃｈｉ　ｎ、Ｍ、Ｔ、）　、ヒロ千カ・アール（Ｈｉｒｏｃｈｔｋ ａ、Ｒ，）、ヒロ千カ・エイチ、ブローカー・ティー・アールおよびチャタ・エ ル・ティー、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、６２．２９９４〜３００２　（１９８８）；フ ェルラス・ダブりニー・シー（Ｐｈｅ　ｌｐｓ、ｗ、Ｃ１）およびハウソー・ビ ーーｘム、正。

Ｖｉ　ｒｏｌ、、６１．１６３０−１６３８　（１９８７）；並びにスイーリー ・エフ（Ｔｈｉｅｒｒｙ、Ｆ、）およびヤニブ・エム（Ｙａｎｉｖ、Ｍ、）　、 ＥＭ旦ＯＪ、、６２３３９１〜３３９７　（１９８７）。

本発明で、動物およびヒト乳頭腫ウィルスそれぞれに分担されている義務的なウ ィルス転写要素の差別は、Ｅ２が乳頭腫ウィルス属の検査、診断および治療に対 するアンチセンスアプローチのための最も重要な標的であるようにするというこ とを決定した。

本発明は、Ｅ１遺伝子座が、更に、乳頭腫ウィルス属による攻撃のための位置と して有望であることを決定した。Ｍ歯頚動物の線維芽細胞のＢＰＶ−１形質転換 についての最初の突然変臭分析で、ＥｌをウィルスＤＮＡ複製の候補レギュレー ターとして決定した。３’Ｅ１　０ＲＦは、ウィルスゲノム複製および維持に必 要な因子をコードする。サーバー・エフ、ラブマン・エム・ニス、ヤン・ライ・ シー、バーン・ジェイ・シーおよびハウソー・ビー・エム、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、。

Σ２，３７７〜３８８　（１９８４）ニラスキー・エムおよびボチャン・エム・ アール、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、５ユ、９５５〜９６５　（１９８５）；並びにラス キー・エムおよびボチャン・エム・アール、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、６０．７２９〜 ７４２　（１９８６）、Ｅ１転写の発現の阻害は、ＢＰＶ−１（および潜在的に 、）（ＰＶ）の、そのＤＮＡを感染しな＃Ｉ胞中で複製する能力を阻害するへし いと考えられる。

発明者は、更に、Ｅ７部位が、乳頭腫ウィルス属の治療、診断および検査のため の別の入り口をおそらく提供するであろうということを決定しな、ＢＰＶ−１に おいて、Ｅｌは、ウィルスＤＮＡ複製の調節に関係していることが分かった。

ベルブ・エル・ジェイ（Ｂｅｒｇ、Ｌ、Ｊ、＞、センス・ケイ（Ｓｉｎｇｈ。

Ｋ、）およびボチャンーｘム、Ｍｏ１．ｅｅｌ　１．Ｂｉｏｌ、、６．８５９〜 ８６９　（１９８６）、ＨＰＶ−１６において、Ｅｌは、形質転換および不滅化 に関係していることが実証された。今のところ明らかではないが、ＨＰＶｓのＥ ｌがウィルスＤＮＡの複製に関係しているならば、しかしながら、Ｅ７特異性ア ンチセンスオリゴヌクレオチドおよび類似体はＢＰＶ−１ウイルスＤＮＡの複製 を阻害すると考えられる。

ＨＰＶのＥ６−Ｅ７領域は、形質転換領域であることが分かった。ウィルスの生 活環におけるこの領域の正確な役割は今のところ知られていない、しかしながら 、この領域は、ウィルスによって誘発された病変のアンチセンスの生物学におい て中心となっているので、この領域を標的とするオリゴヌクレオチドも、おそら く同様に、本発明の目的に有用であると決定された。

最近の研究で、ｍＲＮＡ５の５′領域、好ましくは、キャップ領域および開始コ ドンに対して向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、遺伝子の発現を阻 害するのに最も有効であるということが示唆された。乳頭腫ウィルス属転写の一 つの特徴は、多数のｍＲＮＡ５が共通の５′非翻訳領域およびキャップを有する ことである。したがって、この領域に対して向けられたアンチセンスオリゴヌク レオチドは多数のｍＲＮＡの能力を奪う可能性を有すると決定された。多数のウ ィルス遺伝子の阻害は、おそらく、追加の方式においておよび感染した細胞から のウィルスゲノムの放射においておそらく相乗作用によって最低限度で作用する 。

本発明のある種の好ましい実施態様を実施することによって、アンチセンス攻撃 に好ましい標的であるｍＲＮＡ５を生じる乳頭腫ウィルス属ゲノムのＯＲ，Ｆｓ も、同様に、他のｍＲＮＡ５の部分をコードすることは理解される。

前述の０ＲＦｓを表１に要約する。

紅 乳頭型ウィルス属読取り枠およびそれらに帰属した機能ＯＲＦ　！Ｉ（１属機能 Ｅ（ＢＰＶ−１＞　（３′部分）複製（ＢＰＶ〜１）Ｅ２（全長）　転写トラン スアクティベーション（ＢＰＶ−１、ＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１６＞ （３′部分）　転写阻害（ＢＰＶ−１）Ｅ４　いぼ中の細胞質リンタンパク質（ ＨＰＶ−１）Ｅ５　形質転換、ＤＮＡ合成の刺激（ＢＰＶ−１）Ｅ６　形質転換 （ＢＰＶ−１） Ｅｌ　プラスミドコピー数制御（ＢＰＶ−１＞Ｌｌ　主要カプシドタンパク質 Ｌ２　少量カアシドタンパク質 本発明は、乳頭腫ウィルス属のメツセンジャーＲＮＡの機能のアンチセンス阻臀 で用いるためのオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体を用いる。

本発明の文脈において、「オリゴヌクレオチド」という用語は、本来のホスホジ エステル結合によって結合した天然に存在する塩基およびシクロフラニシル基か ら生成されたポリヌクレオチドを意味する。この用語は、天然に存在するｓｉま たは、天然に存在するサブユニットまたはそれらに近い同族体から生成された合 成種を効果的に意味する。

ｒオリゴヌクレオチド類似体」という用語を本発明に関して用いる場合、オリゴ ヌクレオチドと同様に機能するが、天然に存在しない部分を有し、そして近密に 相同ではない部分を意味する。したがって、オリゴヌクレオチド類似体は、糖部 分または筒内結合が変更されていてもよい、これらの例は、当該技術分野で用い ることが知られているホスホロチオエートおよび他の硫黄含有種である。若干の 好ましい実施態様により、オリゴヌクレオチドの少なくともいくつかのホスホジ エステル結合は、活性が変調されるべきＲＮＡが位！している細胞の領域に貫入 する組成物の能力を増大させるように機能する構造で置換された。このような置 換は、ホスホロチオエート結合、メチルホスホチオエート結合または短鎖アルキ ル若しくはシクロアルキル構造を含むのが好ましい、好ましい実施態様により、 基形態を含む種を挙げることができる０例えば、天然に通常見出されるもの以外 のプリンおよびピリジンをそのように用いることができる。同様に、ヌクレオチ ドサブユニットのシクロフラノース部分の変更は、本発明の本質的な見解に固執 する限りにおいて生じてもよい。

このような類似体は、天然のオリゴヌクレオチド（または天然の系統に沿ったし て、そのＲＮＡの機能を阻害するように機能する限りにおいて、本発明によつし ている。

本発明のオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体は、乳頭腫ウィル ス属のメツセンジャーＲＮＡとハイブリッド形成するように設計される。このよ うなハイブリダイゼーションは、達成された場合、メツセンジャーＲＮＡの通常 の機能を妨害して、ウィルスに対するその有用性を失わせる。妨害されるメツセ ンジャーＲＮＡの機能としては、全生体機能、例えば、タンパク質問状のための 位置へのＲＮＡの転座、ＲＮＡからのタンパク質の実際の翻訳、およびＲＮＡが 携わることができるおそらく全く独立した触媒活性がある。ＲＮＡ機能をこのよ うに妨害する全体の効果は、乳頭腫ウィルス属にそのＲＮＡの利点を失わせ、そ して全体として、ウィルスゲノムの発現に関する妨害を経験させることである。

このような妨害は、概して致命的である。

本発明により、ウィルスに対する代謝の重要性が増大したと決定されたメツセン ジャーＲＮＡを妨害するように設計されたオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌク レオチド類似体を提供することが好ましい、Ｔ＃記で説明したように、Ｅｌ、Ｅ ２、ＥｌまなはＥ６−７乳頭腫ウィルスｍＲＮＡ５が好ましい標的である。

更に、ウシ乳頭腫ウィルス−ｌゲノムの２４４３から３０８０までまたは８９か ら３０４１でのヌクレオチドに実質的に同等のヌクレオチドによつてコードされ たＲＮＡを妨害することは、それらが必須のタンパク質を導く多数のＲＮＡ５を コードすると考えられる場合に、これらが攻撃に対して特に攻撃を受けやすい位 置を表わすと考えられるので好ましい、興なる乳頭腫ウィルス属は、ウシ乳頭腫 ウィルス−１とはある程度興なる構造を有するが、本質的に類似の部分を日常的 な方法で決定することができることは理解される。

図３、図４および図５に、ウシ乳頭腫ウィルス−１ゲノムでのこれらの部分をは いずれも、このような乳頭腫ウィルス属の作用を妨害する場合に特別な有用性を 有すると考えられる。ウシ乳頭腫ウィルス−１の８２ｍＲＮＡで標的とされた典 型的なオリゴヌクレオチドを表２に示す。

轟旦 ＢＰＶ−１，Ｅ２アンチセンスオリゴヌクレオチドｏｏ５（Ｌｃｏｏｓ、ｘ＋ｎ ）　ＡＡＡＴＧＣＧＴＣＣＡＧＣＡＣＣににＣＣＡＴＧＧＴＧＣＡＧＴ　ｌ−ラ ンスリグレツサー出発点 ００６（ＬＣＯＯ６，ＡＢｌ）　ＡＧＣＡＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＴ　トランスリ グレッサー０１４（ＬＣ０１４，入ａｘ）　ＧＧＡＣＡＧＴＣＡＣＣＣＣＴＴ　 ５　’　コード釘口或ｏ１ｓ（Ｌｃｏ１！ｉ、ＡＪＩ４）　ＴＧＴＡＣＡＡＡＴ ＴＧＣＴＧＴＭ；ＡＣＡＧＴＧＴ入ＣＣＡＣ？中間コード領；或０１６　（ＬＣ Ｏ１６，ＡＥｌ）αゴＧＴＡＧＡＣＡにＴＧＴＡ　中間コード領域０１７（ＬＣ Ｏ１７，ＡＢｌ）　ＧＴＧＣＧＡＧＣＧＡＧＧＡＣＣＧＴＣＣＣＧＴＡＣＣＣＭ ＣＣ３’　：７−ドＷ７Ｉ域０１Ｂ（ＬＣＯｌＢ、ＡＢｌ）Ｇ（：ＡＣＣＧＴＣ ＣＣ（：ＴＡＣＣ３’　コード釘０或０１９（Ｉ、ＣＯ１９，ＡＢｌ）’！Ｔｒ ＡＡＣＡＧＧＴＧＧＡＡＴＣＣＡＴＣＡＴｒＧＧＴにＧＴＧ　５’　：７−ド９ Ｒ域０２０（ＬＣＯ２０，ＡＢｌ）ＧＧ鮎ＴｃｃｘＴｃＡＴＴｃｃ　５’　コー ド饋ｊ或ＨＰＶ−１１の翻訳開始コドンを標的とした典型的なオリゴヌクレオチ ドを表ＨＰＶ−１１の翻訳開始コドンを標的としたアンチセンスオリゴヌクレオ チド ［ヒ＃！ｔ８＋１番号　５′　−−−−−一−−−−−−−−−３’識別配列し たがって、前記に示した２００種類オリゴヌクレオチド（またはそれらの類似体 ）のいずれか、または当業者が、前記で論及したように、乳頭腫ウィルス属ゲノ ムのＥ２０Ｒ，Ｆのそれぞれの好ましい領域についての知識から製造することが できる類似のオリゴヌクレオチド（または類似体）のいずれかを用いるのが好ま しい、類似の表を、これらのそれぞれの領域の配列についての知識から、乳頭腫 ウィルス属の他の好ましい０ＲＦｔ’！的、Ｅｌ、ＥｌおよびＥ６−７について 作成することができる。

オリゴヌクレオチドまたは類似体が、前述の表で記載したように正確に−または 乳頭腫ウィルス属ゲノムの地図についての独創性に欠ける解釈によって必要とさ れるように正確にある必要はない、むしろ、本発明の精神は、ゲノム構造に対し て厳密に固執することからある程度外れることを許し、それを文字通りオリゴヌ クレオチドに「翻訳」する、このような構造の変更は、オリゴヌクレオチドおよ びそれらの類似体の本質的なハイブリッド形成機能が生じる限りにおいて行うこ とができる。

同様に、種々の乳頭腫ウィルス属の間で種の変化が生じることは理解される。

種々のＩＦ！域、例えば、Ｅ２、Ｅｌ等は種毎に極めて似ているが、若干の相違 が生じる。これらの変１ヒを説明するオリゴヌクレオチドおよび類似体の変化は 、本発明によって具体的に考えられる。

本発明で用いられるオリゴヌクレオチドおよび類似体は、固相合成の周知の技法 によって便宜上且つ日常的に製造することができる。このような合成のための装 置は、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ−ｓｙｓｔｅｍ ｓ）などのいくつかの発売元によって販売されている。しかしながら、このよう な合成のための任意の他の手段も用いることができる。有用なオリゴヌクレオチ ドは発酵法によって好都合に得ることができ、これは、多量の物質が望まれる場 合に好適であることができる。オリゴヌクレオチドの実際の合成は、日常的な従 事者の手腕の範囲内で十分である。

更に、類似の技法を用いて他のオリゴヌクレオチド類似体、例えば、ホスホチオ エートおよびアルキル化誘導体を製造することが知られている。

Ｅ２発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドに持具的なＥ２の能力を試 験するのに好ましい検定法は、Ｅ２の十分に実証されたトランスアクテイベーシ ョンの性質に基づいた。スバルツホルツら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、６１．２１２８ 〜２１３７　＜１９８７＞、リポータ−プラスミド（Ｅ２ＲＥＣＡＴ）は、Ｅ２ 依存エンハンサ−として櫟能するＥ２反応性要素を含むように構成された。

Ｅ２ＲＥＣＡＴは、更に、ＳＶ４０初期プロモーター、初期ポリアデニル化シグ ナルおよびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ） を含む、このプラスミドの前後関係において、ＣＡＴ発現はＥ２の発現に依存す る。Ｅ２の存在に対するＣＡＴ発現の依存関係は、このプラスミドを、ＢＰＶ− １で形質転換したＣ１２７細胞、非感染Ｃ１２７細胞および、Ｅ２ＲＦ、ＣＡＴ およびＥ２発現ベクターでコトランスフエクトした１２７Ｍ胞中にトランスフェ クションすることによって試験された。

アンチセンスオリゴヌクレオチドは、主要なＥ２２トランスアクテイベーターＲ ＮＡ　（図６）を標的にして設計された。標的としては、制限されないが、ｍＲ ＮＡ　ＣＡＰ領域、翻訳開始コドン、翻訳終結コドンおよびポリアデニル化シグ ナルがあった。Ｎ々の標的に相補的な１５残基または３０残基オリゴヌクレオチ ドは、野生型ホスホジエステルのヌクレオシド間結合または変性ホスホロチオエ ートのヌクレオシド間結合を用いて合成した。ｍＲＮＡ　ＣＡＰ領域を標的とし たオリゴヌクレオチド（１１７５１）およびＥ２トランスアクティベーターのた めの翻訳コドン（１１７５３）は、予備スクリーンにおいて１マイクロモル濃度 でＥ２トランスアクティベーションを減少させることが分かった（図７）、Ｅ２ トランスリプレッサーの翻訳開始コドンを標的としたオリゴヌクレオチド１１７ ５６（図６）は、ＣＡＴ活性によって実証され且つそれを増加させるトランスリ プレッションの部分的除去を与えることができた（図７）、同様の長さおよび塩 基組成を有するが、Ｅ２ｍＲＮＡの他の部分並びに他の非感覚制御を標的とした 他のオリゴヌクレオチドは、アンチセンス作用を与えることができなかった。概 して、ホスホロチオエートのヌクレオシド間結合一時変異を有するオリゴヌクレ オチドは、天然のホスホジエステルのヌクレオシド間結合を有する同一配列のオ リゴヌクレオチドよりも効果的であった。おそらく、これは、血清中および細胞 内に含まれた核酸分解酵素に対するホスホロチオエートの抵抗性が増加したこと によるものである。用量反応曲線は、１１７５３の５０％阻害濃度（ＩＣ５ｏ） は５０〜１００ナノモルの範囲であるが、１１．７５１のＩＣ５ｏは１０倍を越 える５００ナノモルの範囲であることを示す（図８）、Ｅ２のトランスアクティ ベーターおよびトランスリプレッサーの翻訳開始コドンを成功したアンチセンス 標的として同定した後、追加の組のホスホロチオエートを、その領域を一層注意 深く精査するように設計した（図９）、これらのデータにより、適切なＡＵＧを 覆った１５〜２０マーのオリゴヌクレオチドは、Ｅ２のトランスアクテイベーシ ョンかまたはトランスリプレッションを阻害することができることが示された（ 図１０および図４１）。

ＢＰＶ−１の生物学上、現場でＥ２トランスアクティベーターの減少の結果を確 認するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、Ｃ１２７細胞のＢＰＶ−１ 形質転換を阻害するまたは減少させる能力について試験した（図１２）、１１７ ５１および１１７５３についての用量反応曲線により、１１７５３のＩ　Ｃｃｉ 　。

は１０ナノモルの範囲であるが、１１７５１のＩ　Ｃｓ　ｏは１００ナノモルの 範囲であることが示されたが（図１３）、この検定でのこれらの２種類の化合物 のＩ　Ｃｓ　ｏのこの１０倍の差は、翻訳開始コドンが一層優れた標的であるこ とを示唆するトランスアクティベーターンの阻害の検定で観察されたのと同様で ある。

ＢＰＶ−１をゲノムに複製するその能力に対するＥ２を標的としたアンチセンス オリゴヌクレオチドの作用を試験するために、ＢＰＶ−１によって安定に形質転 換されたｌ−３８細胞をＩ　１７５１および１１７５３で処理し、ウィルスＤＮ Ａを定量した（図１４＞、１マイクロモルで処理して４８時間後に、ＩＡＩ胞当 り塩基に対するウィルスＤＮＡコピー数を、およそ３の因子で減少させた。この 検定の軽過中に、細胞は２回〜３回分裂した。このデータは、ウィルスＤＮＡが 細胞のＤＮＡと同時進行によって複製することができなかったことを示唆して１ する。

Ｅ２２タンパク質成に対する１１７５３の作用を試験するために、ｌ−３８４１ 胞を代謝的に標識し且つＥ２特異性単クローン性抗体を用いて免疫沈殿させた。

オリゴヌクレオチドに暴露されなかった細胞またはセンス（ｓｅｎｓｅ）若しく は不適切なオリゴヌクレオチドで処理された細胞には、４６ｋｄのＥ２タンパク 質が存在している（図１５＞、Ｅ２を標的としたオリゴヌクレオチドで処理され た細胞では、４６ｋｄバンドが欠けており、オリゴヌクレオチドを翻訳の）１イ ブリダイセーシヨン阻止によって操作していることを示唆する。

本発明のオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体は、診断、治療で 、そして研究試薬およびキットとして用いることができる。治療の使用に対して は、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を、乳頭腫ウィルス属 感染、例えば、手のいぼ、足のいぼ、喉頭のいぼ、尖圭コンジローム、ゆうぜい 状表皮発育異常症、偏平頚部いぼ、頚部上皮肉新形成、または乳頭腫ライｌレス 属に関係する任意の他の感染に苦しむ動物に対して投与する。ＩＩして、本発明 による治療剤を局所的にまたは病変内に適用するのが好ましい、経皮またＧ、に 筋内内によるなどの他の投与形態も有用であることができる。坐剤中に混入する こと番よ、現在、おそらく極めて有用であると考えられる９本発明のオリゴヌク レオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体の予防法での使用も有用であると考え られる。このようなものは、例えば、薬剤をコンドームのコーティング等として 提供することによって達成することができる。薬理学的に許容し得る担体の使用 番よ、い（つかの実施Ｗｓ様に好適である。

本発明は、更に、診断においておよび研究において有用である０本発明のオリゴ ヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体は乳頭腫ウィルス属に対してハイ ブリッド形成するので、サンドイツチ法および他の検定法は、この事を利用する ように容易に組み立てることができる。オリゴヌクレオチドまたは類似体と。

乳頭腫ウィルス属を含むと疑われる試料中に存在する乳頭腫ウィルス属とのハイ ブリダイゼーシヨンを検出するための手段を有する設備は日常的に得ることがで きる。このような設備として、酵素抱合、放射性標識または任意の他の適当な検 出システムを挙げることができる。乳頭腫ウィルス属の存在または不在を検出す るためのキットも好適であることができる。

実施例１　アンチセンスオリゴヌクレオチドによるＢＰＶ−ＩＥ２の発現の阻害 ＢＰＶ−１で形質転換したＣ１２７４１１！胞を１２ウエルプレートに入れる。

Ｅ２ＲＥＩによるトランスフェクションの２４時間前に、アンチセンスオリゴヌ クレオチドを最終濃度５．１５および３０ミリモルで増殖培地に加えることによ って細胞を前処理する。翌日、細胞を、Ｂ２ＲＥＩＣＡＴを１０μｇ用いてリン 酸カルシウム沈殿によってトランスフェクトする。Ｅ２ＲＥＩＣＡＴを１０μｇ および担体ＤＮＡ　（ＰＵＣ１９）１０μｇを、最終容量２５０μｌのＨ２Ｏ中 、２モて室温で３０分間インキュベートする。この溶液１００μｌを各試験ウェ ルに加え、３７℃で４時間インキュベートする。インキュベーション後、細胞に 、リセロールを用いて室温で１分間グリセロールショックを与える。ショックを 与えた後、細胞を血清不合ＤＭＥＭで２回洗浄し、１０％ウシ胎児血清および元 の濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むＤＭＥＭを再供給した。トラン スフェクションして４８時間後に細胞を採取し且っＣＡＴ活性について検定する 。

ＣＡＴ活性を決定するために、細胞をリンＭＭ＊溶液で２回洗浄し、かき落とし て採取する。細胞を２５０ミリモルトリスＨＣ１，ｐＨ８，０，１００μｍ中に 再懸濁させ、凍結−解凍を３回行うことによって破壊する。４ｆｔ胞抽出物２４ μｌを各検定に用いる。各検定に対して、下記、ナなおち、ｍ胞抽出物２５μｍ 。

４ミリモルアセチル補酵素Ａ５μｌ、Ｈ２Ｏ１８μＩおよび１４Ｃ−クロラムフ ェニコール１μｍ、４０〜６０ｍＣ１／ミリモルを１．５ｍｌのエツベンドルフ チューブ中で一緒に混合し且つ３７℃で１時間インキュベートする。インキュベ ーション後、クロラムフェニコール（アセチル化形態および非アセチル化形態） を酢酸エチルで抽出し且つ蒸発乾固させる。試料を酢酸エチル２５μｍに再懸濁 させ、薄層クロマトグラフィープレート上にスポットし、そしてクロロホルム： メタノール（１９：１）でクロマトグラフィーを行う、薄層クロマトグラフィー はオートラジオグラフィーによって分析される。アセチル化および非アセチル化 １４Ｃ−クロラムフエニコールに対応するスポットを薄層クロマトグラフィープ レートから摘出し、ＣＡＴ活性の定量用の液体シンチレーションによって計数す る。用量依存様式でＣＡＴ活性を低下させるアンチセンスオリゴヌクレオチドは 陽性と考えられる。

実施例２　アンチセンスオリゴヌクレオチドによる）ｆＰＶ　Ｅ２発現の阻害ア ンチセンスオリゴヌクレオチドによるＨＰＶ　Ｅ２の阻害についての検定は、Ｂ ＰＶ−ＩＥ２のそれと本質的に同一である。ＨＰＶ検定に対しては、適当なＨＰ Ｖｓを、前記に記載したリン酸カルシウム法を用いて、ＣＶ−１かまたはＡ４３ １細胞中にＰＳＶ２ＮＥＯ細胞と一緒に同時にトランスフェクトする。ＤＮＡを 取り込んだ細胞は、抗生物質０４１８を含む培地中で培養することによって選択 される９次に、０４１８Ｉｔ性細胞をＨＰＶのＤＮＡおよびＲＮＡについて分析 する。Ｅ２を発現する細胞をアンチセンス研究用の標的細胞として用いる。各ア ンチセンスオリゴヌクレオチドに対して、細胞を前記のように前処理した後、Ｅ ２ＲＥＩＣＡＴによるトランスフェクションを行い、そして前記のようにＣＡＴ 活性の分析を行う、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、それらが用量依存様式 でＣＡＴ活性を低下させることができる場合、陽性の作用を有すると考えられる 。

実施例３　アンチセンスオリゴヌクレオチドによるＨＰＶ　Ｅ７発現の阻害ＨＰ Ｖ−１６のＥｌは、Ａｄ　Ｅ２プロモーターをトランスアクティベートすること ができることが分かった［フェルプス・ダブりニー・シー（Ｐｈｅｌｐｓ。

Ｗ、Ｃ，）、イー・シー・エル、ムンガー・ゲイ（Ｍｕｎｇｅｒ、に、）および ハウシー・ビー・エム、１９８８、アデノウィルスＥＩＡと同様のトランスアク ティベーシヨンおよび形質転換機能をコードするヒト乳頭腫ウィルス１６型Ｅ７ 遺伝子（Ｔｈｅ　Ｈｕｍａｎ　Ｐａｐｉ［Ｉｏｍａｖｉｒｕｓ　Ｔｙｐｅ　１６ Ｅ７　Ｇｅｎｅ　Ｅｎｃｏｄｅｓ　Ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ａｎｄＴ ｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ　５１ｍ１ｌａｒ　ｔ。

Ｔｈｏｓｅ　ｏｆ　Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ　ＥＩＡ）、Ｃｅ１ｌ、５ユニ５３９ 〜５４７］、この活性を監視するために、Ａｄ　Ｅ２プロモーター（ＡｄＥ２Ｃ ＡＴ）の制御下でクロラムフェニコール転移酵素遺伝子を含んだプラスミドを構 築する。この検定条件下では、ＣＡＴ発現はＨＶＰ　Ｅｌの発現に依存する。こ の検定に対して、細胞系は、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下でＨＰＶＥ７を 含むように生じさせる。各アンチセンスオリゴヌクレオチドに対して、細胞を前 記のように前処理した後、ＡｄＥ２ＣＡＴによるトランスフェクションを行い、 そして前記のようにＣＡＴ活性の分析を行う。

実施例４　アンチセンスオリゴヌクレオチドによるＢＰＶ−Ｉ　Ｅｌの発現の阻 害 ＢＰＶ−１のＥｌは、ウィルスゲノム複製のレギュレーターであることが分かっ た。アンチセンスオリゴヌクレオチドのウィルス複製に対する作用を試験するた めに、Ｃ１２７細胞ＢＰＶ−１に感染させ、オリゴヌクレオチドを最終濃度５． １５および３０マイクロモルで増殖培地に加えることによって、Ｅ１特興性アン って評価される。更に、アンチセンスオリゴヌクレオチドのウィルスゲノムコピ ー数に対する作用は、全ゲノムＤＮＡに対するサザン法によって決定される。

実施例５　実験的に誘発したウシ線維乳頭腫に対するＢＰＶ−１アンチセンスオ あったオリゴヌクレオチド並びに対照で処理する。線維乳頭腫の後退を誘発する エム、１９８５、多数の形質転換遺伝子を含むウシ乳頭腫ウィルス（Ｂｏｖｉｎ ｅ　ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ　ｃｏｎｔａｉｎｓ−ルー３−オン−１，１ −ジオキシドを用いて各カップリング後に硫化を行った［アイアー・アール・ビ ー（Ｉｙｅｒ、Ｒ，Ｐ、）、フィリップス・エル・アール（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ、 Ｌ、Ｒ，＞、イーガン・ダブリュー（Ｅｇａｎ、Ｗ、）、シーガン・ジェイ（Ｒ ｅｇａｎ、Ｊ、）およびビューケージ・ニス・エル（Ｂｅａｕｃａｇｅ、Ｓ、Ｌ 、）、１９９０．３Ｈ−１，２−ペンツジチオール−３−オン−１，１−ジオキ シドを硫黄転位試薬として用いる硫黄含有オリゴデオキシリボヌクレオチドの自 動合成（Ｔｈｅ　ＡｕｔｏｍａｔｅｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｓｕｌｆｕｒ −Ｃｏｎｔａｉｎｌｎｇ　０１１ｇ。

ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　Ｕｓｉｎｇ　３Ｈ−１，２−Ｂｅ ｎｓｏｄｉｔｈｉｏｌ−３−ｏｎｅ　１．１−Ｄｉｏｘｉｄｅｓ　ａｓ　ａＳｕ ｌｆｕｒ−Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｒｅａｇｅｎｔ）、Ｊ、Ｏｒ　、Ｃｈｅｍ。

、１旦：４６９３〜４６９９］　、完全なチオ化を確実にするために、増大する オリゴヌクレオチドを、各硫化段階の後にキャップした０合成マトリックスから の開裂、脱保護およびデトリイレーシゴン（ｄｅｔｒｉｙｌａｔｌｏｎ＞の後、 オリゴヌクレオチドをＮａＣ１から２回エタノール沈殿させ且つ水に懸濁させた 。

オリゴヌクレオチドの濃度は、２６０ｎｍでの光学濃度によって決定した。４１ 胞培養検定で用いるために、オリゴヌクレオチドを日常的な方法で稀釈して１０ ０マイクロモルストックにし且つ使用するまで８０℃で貯蔵した。オリゴヌクレ オチド調製試料の純度、完全さおよび量は、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ） らによって記載されたように製造した２０％アクリルアミド７モル尿素ゲル（４ ０ｃｍＸ２０ｃｍＸＯ，７５ｃｍ＞上の電気泳動によって決定した［マニアティ ス・ティー　（Ｍａｎｉ　ａｔ　ｉ　ｓ、Ｔ、）　、フリッチュ・イー・エフ（ Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ、Ｆ、）およびサムプルツク・ジェイ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ。

Ｊ、、）、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：実験室マニュアル（ＡＬａｂ ｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）：コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラト リ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；ニュー ヨー°り、１９８２］、電気泳動したオリゴヌクレオチドは、シグマ（Ｓｉｇｍ ａ）から購入したＥ−９３７９のｌ−エチル−２［３−（１−エチルナプトル［ １，２−ｄ］−チアゾリン−２−イリデン）−２−メチル−１０ベニル［ナグト ル［１，２−ｄ］−チアゾリウム臭化物である「スティング・オール」で染色す ることによってゲル中で視覚化された［ダールバーグ・エイ・イー（Ｄａｈｌｂ ｅｒｇ、Ａ、Ｅ、）、ディグマン・シー・ダブリュー（Ｄｉ　ｇｍａｎ、Ｃ，Ｗ 、）およびピーコック・エイ・シー（Ｐｅａｃｏｃｋ。

Ａ、Ｃ，）、　１９６９、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、４１：３９コ。

実施例７　分子構築物 本研究で用いたＥ２クロラムフェニコールアセチル転移酵素（ＣＡＴ）リポータ −プラスミドは以前に記載された［スバルツホルツ・ビー・エイ、バーン・ジエ イ・シーおよびハウシー・ビー・エム、１９８８、ウシ乳ＨＩｌウィルス１型の Ｅ２トランス−レギュレーションでのＥ２結合部位間の共同性の実証（Ｅｖｉｄ ｅｎｃｅ　ｆｏｒ　Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｉｔｙ　ｂｅｔｗｅｅｎＥ２　Ｂｉｎ ｄｉｎｇ　５ｉｔｅｓ　ｉｎ　Ｅ２　ｔｒａｎｓ−ｒｅｇｕｌａｔｆｏｎ　ｏｆ 　Ｂｏｖｉｎｅ　ＰａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓＴ’ｙＰｅ　１）、Ｊ、Ｖｌｒ ｏｌｌ、６２：３１４３〜３１５０１．簡潔に、ＢＰＶ−１の８２反応性要素で あるＥ２ＲＥ１　（ｎｔ７６１１〜７８０６）は、オリゴヌクレオチドを用いて 再構築され、ＳＶ４０エンハンサ−であるＳｐｈ、１断片が欠失したｐｓＶＺｃ ＡＴ中にクローン化された。このプラスミドからのＣＡＴの発現は、完全な長さ のＥ２に依存することが分かった。プラスミドＣ５９は、ＳＶ４０プロモーター およびエンハンサ−から発現されたＥ２ｃＤＮＡを含み、他のところで詳細に記 載された［ヤン・ケイ・シー、オカヤマ・エイチおよびハウシー・ビー・エム、 １９８５、多数の形質転換遺伝子を含むウシ乳頭腫ウィルス（Ｂｏｖｉｎｅ　ｐ ａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ　ｃｏｎｔａｉｎｓｍｕｌｔｆｐｌｅ　ｔｒａｎｓ ｆｏｒｍｌｎｇ　ｇｅｎｅｓ）、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８２：１０３０〜１０３４］、２種類の ＨＰＶ−１１の完全な長さのＥ２発現構築物が製造された。ＩＰＶ１１５は、フ ァーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）から購入しなｐＭｓＧ（カタログ番号２７− ４５０６＞のＳｍａＩ部位にクローン化されたＨＰＶ−１１（ｎｔ２６６５〜４ ９８８）のＸｍｎｌ１１片を含み、ＴＰＶ１１８は、ｐＳＶＬ　（７７？シア、 カタログ番号２７−４５０９）のＳｍａ１部位にクローン化された同一のＨＰＶ 〜１１のＸｍ口■断片を含む。

実施例８　細胞系 マウスＣ１２７細胞［ドボレツキ・アイ（Ｄｖｏｒｅｔｚｋｙ、１．）、スコバ ー・アール（Ｓｃｈｏｂｅｒ、Ｒ，）およびローライ・ディー、１９８０、ウシ 乳頭腫ウィルス１型のマウス細胞でのフォーカス検定（ＦｏｃｕｓＡｓｓａｙ　 ｉｎ　Ｍｏｕｓｅ　Ｃｅ１ｌｓ　ｆｏｒ　ＢｏｖｉｎｅＰａｐＨｌｏｍａｖｉｒ ｕｓ　ｔｙｐ、１）、Ｖ土ｒｏ土旦盈工、Ｌ　Ｏ３：３６９〜３７５コを、１０ ％ウシ胎児血清、ペニシリン＜１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン＜１１０ ０ｕ／ｍｌ）およびＬ−グルタミン（４ミリモル）を補足したダルベツコモディ ファイドイーグル培地中で増殖させた。ｌ−３８細胞系は、精製されたＢＰＶ− １によって形質転換されたＣ１２７ｍ胞の単一フォーカスに由来した［カラサー ト・エル・エム（Ｃｏｗｓｅｒｔ、Ｌ、Ｍ、）、レイク・ビー（Ｌａｋｅ、Ｐ、 ）およびジェンマン・エイ・ビー（Ｊｅｎｓｏｎ、Ａ。

Ｂ、）、１９８７、単クローン性抗体によって規定されたウシ乳頭腫ウィルス１ 型の構造の輪郭およびコンホーメーション上のエピトープ（Ｔｏｐｏｇｒａｐｈ ｉｃａｌ　ａｎｄ　ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌＥｐｌｔｏｐｅｓ　ｏｆ　Ｂ ｏｖｉｎｅ　Ｐａｐｌｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｔｙｐｅ　Ｉ　Ｄｅｆｉｎｅｄ　ｂ ｙ　ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、ＪＮＣＩ、７９：１０５３ −１０５７］。

実施例９　Ｅ２依存トランスアクテイベーション検定のオリゴヌクレオチド阻害 Ｅ２のトランスアクテイベーションまたはトランスリプレッションを阻害するラ ハム（Ｇｒａｈａｍ）らによって記載されたように、リン酸カルシウム沈殿法に よってトランスフェクトさせ［グラハム・エフ・エル（Ｇｒａｈａｍ、Ｆ。

Ｌ、）およびファン・デア・ニブ・エイ・ジエイ（ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ　Ａ。

Ｊ、）、１９７３、ヒトアデノウィルス５ＤＮＡの感染性検定用の新規の技法（ Ａ　Ｎｅｗ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ａｓ５ａｙ　ｏｆＩｎｆｅ ｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ　５　ＤＮＡ）、Ｖ 上ｒｏ工立ｌΣ、５２：４５６〜４６１Ｌ沈＠１ｍＬ中の２０μｇ全部がＤＮＡ であった。６０ｍｍの皿それぞれで、ＤＮＡを４マイクトゲラム含む沈殿２００ マイクロリツトルが得られた。沈殿したＤＮＡを加えて４時間後に、上澄みを吸 引し、細胞を１５％グリセロールで処理したしフロスト・イー（Ｆｒｏｓｔ、Ｅ 、）およびウィリアムス・ジエイ（Ｗｉ　Ｉ　Ｉ　ｉａｍｓ、Ｊ、）、１９７８ 、マーカー保護によるアデノウィルス５型の地図で示す温度感受性および宿主域 変異（Ｍａｐｐｉｎｇ　Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−３ｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｄ　 ｈｏｓｔ−ｒａｎｇｅ　ｍｕｔａｉｏｎ　ｏｆＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ 　５　ｂｙ　Ｍａｒｋｅｒ　Ｒｅ５ｃｕｅ）、ヱ上二立１旦旦ヱ、立工：３９〜 ５０］、洗浄後、細胞にオリゴヌクレオチドを元の濃度で含む培地を再供給し、 ４８時間インキュベートした。

多数の具体的な実ａ態様を示したが、本発明は、下記の請求の範囲によってのみ 制限されるものである。

配列表 （１）一般情報： （１）出願人：クルーク・スタンシー・ティー（Ｃｒｏｏｋｅ。

５ｔａｎ、１ｅｙ　Ｔ暑、ミラベリ・クリストファー・ケイ＜Ｍｉｒａｂｅｌｌ ｉ、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ　Ｋ、）、エラカー・デビーｙド、ジェイ（Ｅｃｋ ｅｒ、Ｄａｖｉｄ　Ｊ、）、コスワート・レックス・エム（Ｃｏｓｗｅｒｔ、Ｌ ｅｘ　Ｍ、） （ｉｔ）発明の名称：乳頭腫ウィルス属のアンチセンスオリゴヌクレオチド抑Ｉ Ｉ （ｉｉｉ）配列の数：６ （１ｖ）宛先： （Ａ）住所：ウッドコック・ウォシュバーン・カーラ・マツキーヴイ′〉・アン ド・ノリス（Ｗｏｏｄｃｏｃｋ　Ｗａｓｈｂｕｒｎ　ＫｕｒｔｚＭａｃｋｉｅｗ ｉｃｚ　＆　Ｎｏｒｒｉｓ）（Ｂ）地区：ワン・リバティ・ルイス（Ｏｎｅ　Ｌ ｉｂｅｒｔｙＰｌａｃｅ＞　４６ｔｌｌ （Ｃ）車名：フィラデルフィア （Ｄ）州名：ペンシルバニア （Ｅ）国名：米国 （Ｆ）郵便番号：１９１０３ （Ｖ）コンピューター読取り形式： （Ａ）中型：小型ディスク、３．５インチ、記憶装２１．４４Ｍｂ（Ｂ）コンピ ューター：ＩＢＭ　ＰＳ／２（Ｃ）操作システム：　ＰＣ−ＤＯＳ （Ｄ＞ソフトウェア：ワードパーフェクト（Ｗｏｒｄｐｅｒｆｅｃｔ）５．０ （ｖｉ）最近の出願資料： （Ａ）出願番号：　ＰＣＴ／ＵＳ９０１０７０６７（Ｂ）出願臼：１９９０年１ ２月３日 （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先行出願資料： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出顧日： （ｗｉｊｔ）弁理士／代理人情報： （Ａ）氏名：ジェイン・マシー・ライカタ（Ｊａｎｅ　ＭａｓｓｅｙＬｌｃａｔ ａ） （Ｂ）登録番号：３２，２５７ （Ｃ）照会／事件整理番号、ｒｓＩｓ−００３３（ｉｘ）通信情報： ’　（Ａ）を話：　（２１５）５６８−３１００（Ｂ）ファクシミリ：　（２１ ５）５６８−３４３９（２）配列識別番号：１の情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：１５ （Ｂ）種類：核酸 ＧＣＴＴＣＣＡＴＣＴ　ＴＣＣＴＣ１５（２ン配列識別番号：２の情報： （ｉ）配列の特徴 ＜Ａ）長さ：１６ （Ｂ）種類：核酸 （ｘｌ）配列種類：配列識別番号：２：ＧＣＴＴＣＣ：ＡＴＣＴ　ＴＣＣＴＣＧ 　１６（２）配列識別番号：３の情報： （１）配列の特徴 （Ａ）長さ＝１７ （Ｂ）種Ｍ：核酸 （ｘｉ）配列種類：配列識別番号：３：ＴＧＣＴＴＣＣＡＴＣＴＴＣＣＴＣＧ　 １７（２）配列識別番号＝４の情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：１８ （Ｂ）！！１類：核酸 （ｘｉ）配列種類：配列識別番号＝４：ＴＧＣＴＴＣＣＡＴＣＴＴＣＣＴＣＧＴ 　１８（２）配列識別番号＝５の情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：１９ ＣＢＩＮ票＝核酸 （ｘｉ）配列種類：配列識別番号＝５：ＴＴＧＣＴＴＣＣＡＴ　ＣＴＴＣＣＴＣ ＧＴ　１９（２）配列識別番号＝６の情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：２０ （Ｂ）種類二様酸 （ｘｉ＞配列Ｍ類：配列識別番号：６：ＴＴＧＣＴＴＣＣＡＴ　ＣＴＴＣＣＴＣ ＧＴＣ２０Ｍ　？　ｔｏ　ｒ−ｃｏ　ＣＩ’ｌ　Ｏｒ４　ｔｎ　ｔ、ｏへｎ　？ 　Ｉｎ００　ｍ　ｎ　Ｍ　Ｍ　ｆ　？　ＯＯ’ｆ　？　？　？ＦＩＧ、１２ ０ＵＴＣ口１７５１　巴１７５３ −Ｌヶ・１４ ＦＩＧ、　１５ ｒ＋ｕ＋　ｌ　ｌ 要約書 乳頭腫ウイルスノメッセンシャーＲＮＡとアンチセンスの関係であることができ るオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体が提供される。そのよう なオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体は研究目的と同様に診断 および治療に使用できる。本発明の好適な態様によれば乳頭腫ウィルスのメツセ ンジャーＲＮＡがハイブリダイズするオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオ チド類似体が提供される。このオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類 似体はＲＮＡの機能を阻害でき、従って例えば乳頭腫ウィルスによる感染の治療 に有用である。好適な態様によれば乳頭腫ウィルスの部分はアンチセンス攻撃の 標的である。このようにＥ２．Ｅｌ、ＥＴまたはＥ６−７メツセンジーＲＮＡ５ とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが好ましく提供される。

補正書の翻訳文提比嘗 （特許法第１８４条の８） 平成　４年　６月　４日 特許庁長官　深　沢　亘　殿　イ仏 １、特許出願の表示 ２、発明の名称 乳頭腫ウィルス属のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害ファラデイ・アベニュ ー　２２８０ 名　称　アイシス・ファーマシューティカ失８インコーボシーテッド新大手町ビ ル　２０６区 ５、補正書の提８日 請求の範囲 １．　乳ｕＩｌウィルス属由来のＥ２、Ｅｌ、ＥｌまなはＥ６−７メツセンジヤ ーＲＮＡとハイブリッド形成しうる、８個〜５０個の塩基を含むオリゴヌクレオ チドまたはオリゴヌクレオチド類似体であって、前記のメツセンジャーＲ，ＮＡ の機能を、それとハイブリッド形成した場合に阻害する前記のオリゴヌクレオチ ドまたはオリゴヌクレオチド類似体。

２、　前記のＥ２メツセンジャーＲＮＡが、乳頭腫ウィルス属ＲＮＡのＥ２トラ ンスアクティベータ一部分を含む請求項１に記載のオリゴヌクレオチドまたはオ リゴヌクレオチド類似体。

３、　表２の配列の少なくとも１種類による塩基配列を含むオリゴヌクレオチド またはオリゴヌクレオチド類似体。

４、　乳頭腫ウィルス属の発現を変調する方法であって、前記の乳頭腫ウィルス 属由来のメツセンジャーＲＮＡを、請求項１．２または３に記載のオリゴヌクレ オチドまたはオリゴヌクレオチド類似体と接触させることを含む前記の方法。

５、　動物での乳頭腫ウィルス属感染の作用を変調する方法であって、動物を、 請求項１．２まなは３に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類 似体と接触させることを含む前記の方法。

６、　乳頭腫ウィルス属を含むことが疑われる試料でのその存在または不在を検 出するための方法であって、その試料と、請求項１．２または３に記載のオリゴ ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体と接触させ：そしてハイブリダイ ゼーシヨンを検出することを含む前記の方法。

７、　乳頭腫ウィルス属を含むことが疑われる試料でのその存在または不在を検 出するためのキットであって、請求項１．２または３に記載のオリゴヌクレオチ ドまたは類似体：およびハイブリダイゼーションを検出するための手段を含む前 記のキット。

［アイアー・アール・ビー（Ｉｙｅｒ、Ｒ，Ｐ、）、フィリップス・エル・アー ル（Ｐｈｉ　Ｉ　１ｉｐｓ、Ｌ、Ｒ，）−イーガン・ダブリュー　（Ｅｇａｎ、 Ｗ、）、シーガン・ジエイ（Ｒｅｇａｎ、Ｊ、）およびビューケージ・ニス・エ ル（Ｂｅａｕｃａｇｅ、Ｓ、Ｌ、）、１９９０．３Ｈ−１，２−ペンヅジチオー ルー３−オン−１，１−ジオキシドを硫黄転位試薬として用いる硫黄含有オリゴ デオキシリボヌクレオチドの自動合成（Ｔｈｅ　ＡｕｔｏｍａｔｅｄＢｅｎｚｏ ｄｉｔｈｆｏｌ−３−ｏｎｅ　１，１−Ｄｉｏｘｉｄｅｓ　ａｓ　ａＳｕｌｆｕ ｒ−Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｒｅａｇｅｎｔ）、Ｊ、Ｏｒ　、Ｃｈｅｎｎ。

６０ｍｍの皿それぞれで、ＤＮＡを４マイクログラム含む沈殿２００マイクロリ ツトルが得られた。

ゴーし、ケｌし、６５９も ＦｔＧ、１２ ０ＩＪＴｃ　口１７５１　巴１７５３ −Ｌ々・１４ 国際調査報告 ｍｍａｌ　Ａ＄１’　４＊マロに−フ声

Claims (51)

【特許請求の範囲】
1. １．乳頭腫ウイルス属由来のメッセンジャーＲＮＡとハイブリッド形成しうるオ リゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体であって、前記のメッセンジ ャーＲＮＡの機能を、それとハイブリッド形成した場合に阻害する前記のオリゴ ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体。
2. ２．前記のメッセンジャーＲＮＡが、乳頭腫ウイルス属Ｅ２ＲＮＡの少なくとも 一部分の配列を含む請求項１に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオ チド類似体。
3. ３．前記のメッセンジャーＲＮＡが、乳頭腫ウイルス属ＥｌＲＮＡの少なくとも 一部分の配列を含む請求項１に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオ チド類似体。
4. ４．前記のメッセンジャーＲＮＡが、乳頭腫ウイルス属Ｅ７ＲＮＡの少なくとも 一部分の配列を含む請求項１に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオ チド類似体。
5. ５．前記のメッセンジャーＲＮＡが、乳頭腫ウイルス属Ｅ６−７ＲＮＡの少なく とも一部分の配列を含む請求項１に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌク レオチド類似体。
6. ６．乳頭腫ウイルス属ＲＮＡのＥ２トランスアクティベーター部分の少なくとも 一部分と相補的である請求項１に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレ オチド類似体。
7. ７．前記のトランスアクティベーター部分が、ウシ乳頭腫ウイルス−１の２４４ ３から３０８０までのヌクレオチドに対応する請求項６に記載のオリゴヌクレオ チドまたはオリゴヌクレオチド類似体。
8. ８．乳頭腫ウイルス属ＲＮＡの５′非翻訳領域の少なくとも一部分と相補的であ る請求項１に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体。
9. ９．前記の５′非翻訳部分が、ウシ乳頭腫ウイルス−１の８９から３０４までの ヌクレオチドに対応する請求項８に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌク レオチド類似体。
10. １０．塩基単位約３個〜約５０個を含む請求項１に記載のオリゴヌクレオチドま たはオリゴヌクレオチド類似体。
11. １１．塩基単位約８個〜約２５個を含む請求項１に記載のオリゴヌクレオチドま たはオリゴヌクレオチド類似体。
12. １２．塩基準位約１２個〜約２０個を含む請求項１に記載のオリゴヌクレオチド またはオリゴヌクレオチド類似体。
13. １３．前記のメッセンジャーＲＮＡのタンパク質への翻訳を、それとハイブリッ ド形成した場合に阻害する請求項１に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌ クレオチド類似体。
14. １４．表２の配列の少なくとも１種類による塩基配列を含むオリゴヌクレオチド またはオリゴヌクレオチド類似体。
15. １５．乳頭腫ウイルス属の発現を変調する方法であって、前記の乳頭腫ウイルス 属由来のメッセンジャーＲＮＡを、乳頭腫ウイルス属由来のメッセンジャーＲＮ Ａとハイブリッド形成しうるオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似 体であって前記のメッセンジャーＲＮＡの機能を、それとハイブリッド形成した 場合に阻害する前記のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体と接 触させることを含む前記の方法。
16. １６．前記のメッセンジャーＲＮＡが、乳頭腫ウイルス属Ｅ２ＲＮＡの少なくと も一部分の配列を含む請求項１５に記載の方法。
17. １７．前記のメッセンジャーＲＮＡが、乳頭腫ウイルス属ＥｌＲＮＡの少なくと も一部分の配列を含む請求項１５に記載の方法。
18. １８．前記のメッセンジャーＲＮＡが、乳頭腫ウイルス属Ｅ７ＲＮＡの少なくと も一部分の配列を含む請求項１５に記載の方法。
19. １９．前記のメッセンジャーＲＮＡが、乳頭腫ウイルス属Ｅ６−７ＲＮＡの少な くとも一部分の配列を含む請求項１５に記載の方法。
20. ２０．前記のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が、乳頭腫ウ イルス属ＲＮＡのＥ２トランスアクティベーター部分の少なくとも一部分と相補 的である請求項１５に記載の方法。
21. ２１．前記のトランスアクティベーター部分が、ウシ乳頭腫ウイルス−１の２４ ４３から３０８０までのヌクレオチドに対応する請求項２０に記載の方法。
22. ２２．前記のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が、乳頭腫ウ イルス属ＲＮＡの５′非翻訳領域の少なくとも一部分と相補的である請求項１５ に記載の方法。
23. ２３．前記の５′非翻訳部分が、ウシ乳頭腫ウイルス−１の８９から３０４まで のヌクレオチドに対応する請求項２２に記載の方法。
24. ２４．前記のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が、塩基単位 約３個〜約５０個を含む請求項１５に記載の方法。
25. ２５．前記のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が、塩基単位 約８個〜約２５個を含む請求項１５に記載の方法。
26. ２６．前記のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が、塩基単位 約１２個〜約２０個を含む請求項１５に記載の方法。
27. ２７．前記のメッセンジャーＲＮＡのタンパク質への翻訳を阻害する請求項１５ に記載の方法。
28. ２８．前記のメッセンジャーＲＮＡの細胞質への転座を阻害する請求項１５に記 載の方法。
29. ２９．動物での乳頭腫ウイルス属感染の作用を変調する方法であって、該動物を 、乳頭腫ウイルス属由来のメッセンジャーＲＮＡとハイブリッド形成しうるオリ ゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体であって前記のメッセンジャー ＲＮＡの機能を、それとハイブリッド形成した場合に阻害する前記のオリゴヌク レオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体と接触させることを含む前記の方法。
30. ３０．前記のメッセンジャーＲＮＡが、乳頭腫ウイルス属Ｅ２ＲＮＡの少なくと も一部分の配列を含む請求項２９に記載の方法。
31. ３１．前記のメッセンジャーＲＮＡが、乳頭腫ウイルス属ＥｌＲＮＡの少なくと も一部分の配列を含む請求項２９に記載の方法。
32. ３２．前記のメッセンジャーＲＮＡが、乳頭腫ウイルス属Ｅ７ＲＮＡの少なくと も一部分の配列を含む請求項２９に記載の方法。
33. ３３．前記のメッセンジャーＲＮＡが、乳頭腫ウイルス属Ｅ６−７ＲＮＡの少な くとも一部分の配列を含む請求項２９に記載の方法。
34. ３４．前記のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が、乳頭腫ウ イルス属ＲＮＡのＥ２トランスアクティベーター部分の少なくとも一部分と相補 的である請求項２９に記載の方法。
35. ３５．前記のトランスアクティベーター部分が、ウシ乳頭腫ウイルス−１の２４ ４３から３０８０までのヌクレオチドに対応する請求項３４に記載の方法。
36. ３６．前記のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が、乳頭腫ウ イルス属ＲＮＡの５′非翻訳領域の少なくとも一部分と相補的である請求項２９ に記載の方法。
37. ３７．前記の５′非翻訳部分が、ウシ乳頭腫ウイルス−１の８９から３０４まで のヌクレオチドに対応する請求項３６に記載の方法。
38. ３８．前記のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が、塩基単位 約３個〜約５０個を含む請求項２９に記載の方法。
39. ３９．前記のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が、塩基単位 約８個〜約２５個を含む請求項２９に記載の方法。
40. ４０．前記のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が、塩基単位 約１２個〜約２０個を含む請求項２９に記載の方法。
41. ４１．前記のメッセンジャーＲＮＡのタンパク質への翻訳を阻害する請求項２９ に記載の方法。
42. ４２．前記の感染が、手のいぼ、足のいぼ、喉頭のいぼ、尖圭コンジローム、ゆ うぜい状表皮発育異常症、偏平頸部いぼまたは頭部上皮内新形成である請求項４ ２に記載の方法。
43. ４３．乳頭腫ウイルス属を含むことが疑われる試料でのその存在または不在を検 出するための方法であって、 その試料を、乳頭腫ウイルス属由来のメッセンジャーＲＮＡとハイブリッド形成 しうるオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体と接触させ、そして ハイブリダイゼーションを検出することを含む前記の方法。
44. ４４．前記のメッセンジャーＲＮＡが、乳頭腫ウイルス属Ｅ２、Ｅ１、Ｅ７およ びＥ６−７ＲＮＡｓの少なくとも１種類での配列の少なくとも一部分を含む請求 項４３に記載の方法。
45. ４５．前記のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体がる、乳頭腫 ウイルス属ＲＮＡのＥ２トランスアクティベーター部分の少なくとも一部分と相 補的である請求項４３に記載の方法。
46. ４６．前記のトランスアクティベーター部分が、ウシ乳頭腫ウイルス−１の２４ ４３から３０８０までのヌクレオチドに対応する請求項４５に記載の方法。
47. ４７．前記のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が、乳頭腫ウ イルス属ＲＮＡの５′非翻訳領域の少なくとも一部分と相補的である請求項４３ に記載の方法。
48. ４８．前記の５′非翻訳部分が、ウシ乳頭腫ウイルス−１の８９から３０４まで のヌクレオチドに対応する請求項４７に記載の方法。
49. ４９．前記の検出段階が、メッセンジャーＲＮＡによってコードした標識タンパ ク質の生成を検出することを含む請求項４３に記載の方法。
50. ５０．前記の検出段階が、メッセンジャーＲＮＡによってコードした標識タンパ ク質の作用を検出することを含む請求項４３に記載の方法。
51. ５１．乳頭腫ウイルス属を含むことが疑われる試料でのその存在または不在を検 出するためのキットであって、 乳頭腫ウイルス属由来のメッセンジャーＲＮＡとハイブリッド形成しうるオリゴ ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体およびハイブリダイゼーションを 検出するための手段を含む前記のキット。