JP2008182931A - 歯周病原因菌の除菌用微生物及び当該微生物を含有する歯周病予防又は治療のための医薬組成物、食品又は食品添加物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ビタミンK要求性のビフィズス菌を用いて、P. gingivalisの生育因子であるビタミンKを競合させることにより、P. gingivalisの生育を抑制することができることを見出した。本願発明は、ビタミンK要求性のビフィズス菌を有効成分として含有する微生物を有効成分として含有する歯周病予防剤又は歯周病治療剤、及びビタミンK要求性のビフィズス菌を有効成分として含有する歯周病予防又は歯周病治療のための食品又は食品添加物を提供する。
【選択図】なし
Description
本願発明者等は、歯周病菌に対する抑制効果を有する菌を、歯周病菌と必須栄養素の競合する菌から見出そうとした。そこで、まず、正常な健康人と歯周病患者の口内細菌叢を解明、比較した。次に、歯周病の一因である微生物の中に、Porphyromonas属およびPrevotella属に属する菌種が知られており、それらの大半がビタミンK要求性の菌株であることから、ビフィズス菌によるビタミンKの競合の抑制を調べることとした。
従来から、若い健常人には、StreptococcusとVeillonella ssp.が、歯周病患者よりも高く検出されると報告されている(Kumar, P. S., Griffen, A. L., Moeschberger, M. L. and Leys, E. J., Identification of candidate periodontal pathogens and beneficial species by quantitative 16S clonal analysis. J. Clin. Microbiol., 43, 3944-3955(2005))。
本願発明者等は、若い健常者の口腔内で歯周病患者よりもビフィズス菌種が豊富なこと、歯周病患者のビフィズス菌数が最も少ないことなどから、ビフィズス菌が口腔内の有用菌ではないかと考えた。そして、主要な歯周病菌であるP. gingivalis(ジンジバリス菌)の増殖促進因子であるビタミンKを、ビフィドバクテリウム属に属する微生物が競合して消費することで、P. gingivalisの生育を抑制できるとの仮説を立てて実験的に検討した。
(1)寄託機関名: 独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
(2)連絡先: 〒292-0818 千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8
電話番号0438-20-5580
(3)受領番号: NITE AP-294
(4)受託番号: NITE P-294
(5)識別のための表示:Bifidobacterium adolescentis OLB6398
(6)寄託日(受領日): 平成18年12月22日
本願発明者等の歯周病予防剤及び治療剤はビタミンK要求性のビフィズス菌を含有することを特徴とする。ビタミンK要求性のビフィズス菌としては、例えば、B. adolescentis、B. longum、B. breve、B. bifidum、B. urinalis及びB. lactisが挙げられる。更に、以下、「6.歯周病の予防又は治療に有用な微生物のスクリーニング方法」に説明するスクリーニング方法により選ばれたビフィズス菌が挙げられ、好適には、B. adolescentis、B. longum、及びB. bifidumが挙げられる。具体的には、例えば、上記したBifidobacterium adolescentis OLB6398(NITE P-294)が挙げられる。
本願発明のビタミンK要求性のビフィズス菌を有効成分とする歯周病予防用又は治療用の食品は、固体状(粉末、顆粒状など)、ペースト状、液状ないし懸濁状のいずれでもよく、また、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤など、適宜の剤形のサプリメントとすることもできる。本願発明は、歯周病予防用食品、治療用食品、特別用途食品又は栄養補助食品を調製するための食品添加剤とすることもできる。
本願発明は、更に、歯周病の予防又は治療に有用なビフィズス菌のスクリーニング方法を包含する。具体的には、本願発明には、ビタミンK、キノン類又はナフタレン類を10-6M〜10-2Mで培地に添加した場合と、ビタミンK、キノン類又はナフタレン類を培地に添加しない場合について、菌数を比較することでビタミンK要求性のビフィズス菌株を選抜する、歯周病の予防又は治療に有用な微生物のスクリーニング方法が包含される。ここで、菌数の比較は、実施に顕微鏡で菌数を計数して比較することもできるが、波長600nm程度の吸光度の差により計測することもできる。
(被験者)
被験者は、実験の主旨に同意して頂いた、(1)19歳から27歳で口腔内衛生が良好な若い健常者16名(男性6名、女性10名)(以下、健常者群)、(2)37歳から70歳で歯周病患者16名(男性6名、女性10名)(以下、歯周病患者群)、(3)47歳から76歳で歯周病の治療後の元歯周病患者14名(男性4名、女性10名)(以下、メインテナンス群)とした。各被験者は、少なくとも試験1ヶ月以上前から抗生物質の投与を受けておらず、発酵乳や漬物などの乳酸桿菌やビフィズス菌(ビフィドバクテリウム)を含むような食品を摂取しないように指示された。各被験者について口腔の所見(歯垢付着量、歯肉の腫れ、歯周ポケットの深さなど)を、歯科医師により確認したところ、健常者群とメインテナンス群に比較して歯周病患者群で著しく悪く、健常者群とメインテナンス群で差はなかった。
朝の朝食前で歯磨き前に唾液を採取し、GAMブロス(日水製薬社)で適宜、希釈した。希釈液を乳酸桿菌の選択培地(LBS agar, BBL)、ビフィズス菌の選択培地(Beerens agar)に接種し、これらの培地を嫌気性のグローブボックス内(N2: CO2: O2 = 8: 1: 1)にて37℃、2日間で嫌気培養した。培養した後に、培地上に発育したコロニーを釣菌し、BL agar(日水製薬社)にて継代培養した。このようにして純粋培養した菌株について、グラム染色性、コロニーと菌体の形態を観察した後に、種特異的プライマーを用いたPCR法(Song, Y., Kato, N., Liu, C., Matsumiya, Y., Kato, H., and Watanabe, K., Rapid identification of 11 human intestinal Lactobacillus species by multiplex PCR assays using group - and species - specific primers derived from the 16S-23S rRNA intergenic spacer region and its flanking 23S rRNA. FEMS Micro biol. Lett., 187, 167-173(2000)とMatsuki, T., Watanabe, K., Tanaka, R., Fukuda, M., Takada, T. and Oyaizu, H., Distribution of bifidobacterial species in human intestinal microfrola examined with 16S rRNA - gene - targeted species - specific primers. Appl. Environ. Microbiol., 65, 4506-4512(1999)の方法)、又は16SrDNAの相同性解析により、菌種を同定した。なお、各分離株の16SrDNAの配列は、DNA Data Bank of Japanに登録してある菌種の配列と比較して、98%以上の類似性を有するものを同一種として同定した。
各群の乳酸桿菌とビフィズス菌について菌種の構成を、それぞれ表1と表2に示す。表1に示した通り、ヒト口腔内から11菌種の乳酸桿菌が検出された。そして、ラクトバチルス属に属する微生物では、L. salivarius、L. gasseri、L. fermentumの3菌種で検出率が大きかったが、いずれの菌種(3菌種)でも、若い健常人群と歯周病患者群で菌数や検出者数に大きな違いはなかった。つまり、健常者群、歯周病患者群、メインテナンス群で特異的な菌種は見出せなかった。
ベイヨネラ菌(Veillonella parvula ATCC 17745)を、Brain Heart Infusion (BBL)にて37℃、24時間で嫌気培養した。この培養物を遠心分離した後に、上清を0.45μmのフィルターにて濾過除菌し、ベイヨネラ菌の培養上清を得た。なお、これらの菌株名にATCCと記載された菌株は、細胞・微生物・遺伝子バンクである American Type Culture Collection (ATCC)から入手した基準株である。
ベイヨネラ菌は、P. gingivalisにビタミンKを供給する微生物だと考えられており、ベイヨネラ菌の産生する主なビタミンKは、メナキノン-7(MK-7)である。そこで、前述した内容を検証するために、Number 1培地にMK-7(和光純薬社)を0〜10.0μg/ml(0〜1.5×10-4M(mol/l))で添加して、ビフィズス菌を培養し、その増殖(O.D.)を比較した。なお、賦活培養として、ビフィズス菌はGAM培地を用いて、37℃、18時間で嫌気培養し、試験系へ適宜、0.1〜1重量%で摂取した。特に断りのない限り、他の実施例でも同様に、ビフィズス菌を賦活培養した。今回の実験では、実施例2で用いたビフィドバクテリウム属に属する微生物(ビフィズス菌)から、作業の便宜上、B. adolescentis OLB6398(NITE P-294)のみを選抜した。また、ビフィズス菌の対照となる乳酸桿菌としてL. paracasei JCM 1181、歯周病菌としてP. gingivalis ATCC33277を用いた。なお、これらの菌株名にJCMと記載された菌株は、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターの微生物材料開発室から入手した基準株である。
Number 1培地にメナキノン-4(MK-4、和光純薬社)又はメナキノン-7(MK-7、和光純薬社)を5.0μg/mlになるように添加して、各種の菌株を培養し、培養上清のメナキノンの濃度を比較した。B. adolescentis OLB6398を含むビフィドバクテリウム属に属する微生物(B. adolescentisを61菌株、B. longumを9菌株、B. bifidumを1菌株)と、乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei JCM1181)を、前述した培地を用いて、37℃、18時間で嫌気培養した。培養した後に、培養上清に残存するビタミンKの濃度を測定し、各種の菌株で比較した。ビタミンKの濃度は、小嶋らの方法(Kojima et al., Acta. Paediatr. 93, 457-463(2004))に準じて、HPLCを用いて測定した。
実施例2〜4に示した微生物のスクリーニング法の適性を検討した。つまり、ビタミンK要求性又はビタミンK消費能力を有する菌株のスクリーニング法で選抜されたビフィズス菌が実際に歯周病菌(P. gingivalis)の増殖を抑制するかを確認した。
ベイヨネラ菌は口腔内の優勢菌群であり、P. gingivalisにビタミンKを供給する微生物だと考えられている。本願発明者等は、実施例2において実際に、ベイヨネラ菌(Veillonella parvula ATCC17745)の培養上清がビフィズス菌の増殖を促進することを明らかにした。今回の実験では、前述したスクリーニング法で選抜されたビフィズス菌が実際に歯周病菌(P. gingivalis)の増殖を抑制するかを、ヒト口腔内の微生物の生態系に近い条件で確認した。
Claims (9)
- ビタミンK要求性のビフィドバクテリウム属に属する微生物を有効成分として含有する歯周病予防剤又は歯周病治療剤。
- ビフィドバクテリウム属に属する微生物が、B. adolescentis、B. longum、B. breve、B. bifidum、B. urinalis及びB. lactisから選ばれる少なくとも一つを含有してなることを特徴とする請求項1記載の歯周病予防剤又は歯周病治療剤。
- ビフィドバクテリウム属に属する微生物が、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス(B. adolescentis) OLB6398(NITE P-294)である請求項1記載の歯周病予防剤又は歯周病治療剤。
- ビタミンK要求性のビフィドバクテリウム属に属する微生物を含有する歯周病予防又は歯周病治療のための食品又は食品添加物。
- ビフィドバクテリウム属に属する微生物が、B. adolescentis、B. longum、B. breve、B. bifidum、B. urinalis及びB. lactisから選ばれる少なくとも一つを含有してなることを特徴とする請求項4記載の食品又は食品添加物。
- ビフィドバクテリウム属に属する微生物が、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス(B. adolescentis) OLB6398(NITE P-294)である請求項4記載の食品又は食品添加物。
- ビタミンK、キノン類又はナフタレン類を10-6M〜10-2Mで培地に添加した場合と、ビタミンK、キノン類又はナフタレン類を培地に添加しない場合について、菌数を比較することでビタミンK要求性のビフィズス菌株を選抜する、歯周病の予防又は治療に有用な微生物のスクリーニング方法。
- ビタミンK、キノン類又はナフタレン類を10-6M〜10-2Mで培地に添加した場合と、ビタミンK、キノン類又はナフタレン類を培地に添加しない場合について、30〜45℃、12〜72時間で嫌気培養した後の菌数に差を示す歯周病の予防又は治療に有用なビタミンK要求性を示すビフィドバクテリウム属に属する微生物。
- ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス(Bifidobacterium adolescentis)OLB6398(NITE P-294)。
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