KR20160138180A - 바이셀라속 유산균 - Google Patents

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뎃페이 도이
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Abstract

건강 증진, 특히, 구강 내의 질병의 예방 또는 치료에 유효한 유산균의 제공을 과제로 한다. 본원 발명자들은 건강 증진, 특히, 구강 내의 질병의 예방 또는 치료에 유효한 유산균의 탐색을 실시하여, Weissella (바이셀라) 속 유산균, 특히, 바이셀라속 유산균 W3 (기탁 번호 NITE BP-01789) 이 구강 내의 질병의 예방 또는 치료하는 효과를 갖는 것을 알아내었다.

Description

바이셀라속 유산균 {LACTIC ACID BACTERIUM BELONGING TO GENUS WEISSELLA}
건강 증진을 위한 미생물의 이용에 관한 것이다.
숙주에게 유익한 작용을 가져오는 미생물로서, 장 내 플로라의 밸런스를 개선하는 유산균 (예를 들어 Lactobacillus 나 Bifidobacterium) 이 알려져 있고, 이들 미생물을 식품 등에 의해 도입하는 것이 행해졌다.
한편, 최근에는, 장 내에 그치지 않고, 구강 내의 건강 증진을 위한 미생물의 이용이 주목받고 있다. 예를 들어, 국내에서는 유산균인 Lactobacillus reuteri 를 함유하는 요구르트가 충치균인 뮤탄스 연쇄 구균의 증식을 저해한다고 하여, 실제, 인간 시험에 있어서 타액 중의 뮤탄스 연쇄 구균의 수를 감소시킨 예가 보고되어 있다 (비특허문헌 1).
한국 등록 특허 공보 제10-0995357호
Int.J.Food Microbiol.95, pp.219-23 (2004) 장 내 세균학 잡지 21, pp.129-142 (2007) Caries Res.40, pp.418-25 (2006) Int.J.Syst.Evol.Microbiol., 52, pp.141-8 (2002)
본 발명은, 건강 증진, 특히, 구강 내의 질병의 예방 또는 치료에 유효한 유산균의 제공을 과제로 한다.
본원 발명자들은 건강 증진, 특히, 구강 내의 질병의 예방 또는 치료에 유효한 유산균의 탐색을 실시하여, Weissella (바이셀라) 속 유산균, 특히, 바이셀라속 유산균 W3 (Weissella sp. (w3):기탁 번호 NITE BP-01789) 이 구강 내의 질병의 예방 또는 치료하는 효과를 갖는 것을 알아내었다.
바이셀라속 유산균, 특히, 바이셀라속 유산균 W3 은 S.뮤탄스 (S. mutans) 의 바이오 필름 형성을 억제하여, 구강 내의 질병의 예방 또는 치료에 유효하다. 또, 바이셀라속 유산균은 자일로오스와 조합하면 구강 내의 질병의 예방 또는 치료에 유효하다. 자일로오스는 S.뮤탄스에게 잘 대사되지 않는 점에서, 바이셀라속 유산균, 특히, 바이셀라속 유산균 W3 과 조합하여, 구강 내의 질병의 예방 또는 치료에 유효하다.
도 1a 는, W1 ∼ W20 주 (株), 및 대상인 S.뮤탄스 바이오 필름 형성 억제 효과를 확인한 실험의 결과를 나타내고, 실험에서 관찰된 염색된 바이오 필름의 색의 정도를 나타낸다. 본 도면에 나타나는 실험은 n = 8 로 실시한 결과이다.
도 1b 는, W1 ∼ W20 주, 및 대상인 S.뮤탄스 바이오 필름 형성 억제 효과를 확인한 실험의 결과를 나타내고, 도 1a 를 수치화한 흡광도를 지표로 하여 나타낸다. 본 도면에 나타나는 실험은 n = 8 로 실시한 결과이다.
도 2 는, S.뮤탄스에 의한 여러 가지 당의 대사시의 pH 를 나타낸다.
도 3 은, 바이셀라속 유산균 W3 의 증식 곡선을 나타낸다.
도 4a 는, 바이셀라속 유산균 W3 의 S.뮤탄스 바이오 필름 형성 억제 효과 에 있어서의 수크로오스 농도의 영향 및 자일로오스의 영향을 나타내고, 실험에서 관찰된 염색된 바이오 필름의 색의 정도를 나타낸다.
도 4b 는, 바이셀라속 유산균 W3 의 S.뮤탄스 바이오 필름 형성 억제 효과에 있어서의 수크로오스 농도의 영향 및 자일로오스의 영향을 나타내고, 도 4a 를 수치화한 흡광도를 지표로 하여 나타낸다.
도 5a 는, 바이셀라속 유산균 W3 의 S.뮤탄스 바이오 필름 형성 억제 효과의 자일로오스 농도 의존성을 나타내고, 실험에서 관찰된 염색된 바이오 필름의 색의 정도를 나타낸다. 본 도면에 나타나는 실험은 n = 8 로 실시한 결과이다.
도 5b 는, 바이셀라속 유산균 W3 의 S.뮤탄스 바이오 필름 형성 억제 효과의 자일로오스 농도 의존성을 나타내고, 도 5a 를 수치화한 흡광도를 지표로 하여 나타낸다. 본 도면에 나타나는 실험은 n = 8 로 실시한 결과이다.
도 6 은, 바이셀라속 유산균 W3 을 그램 염색한 현미경 관찰 사진이다.
본 발명은, 바이셀라속 유산균 W3 (Weissella sp. (w3):수탁 번호 NITE BP-01789) 혹은 그 변이체, 또는 그것들의 형질 전환체를 제공한다. 또한, 본 명세서 중, 바이셀라속 유산균 W3 을, 바이셀라 유산균 W3, 바이셀라 W3 혹은, 간단히 W3 등으로 표기하는 경우가 있다.
또한, 변이체란, 배양을 계속하는 동안에, 성질 혹은 표현형, 유전자 배열 등에 약간의 변화가 미친 것이지만, 본 발명의 과제인, 구강 내의 질병의 예방 또는 치료에 효과를 갖는 한, 변이된 바이셀라속 유산균 W3 은 본 발명에 포함된다. 또, 형질 전환체란, 본 발명의 유산균을, 공업적, 혹은, 의료를 목적으로 하여, 플라스미드, 혹은 바이러스, 그 밖의 유전자 공학의 수법에 의해, 인위적으로 유전자에 개변을 더한 것을 말하는데, 본 발명의 과제인, 구강 내의 질병의 예방 또는 치료에 효과를 갖는 한, 형질 전환된 바이셀라속 유산균 W3 은 본 발명에 포함된다.
또, 본 발명은 바이셀라속 유산균과 자일로오스로 이루어지는 구강 내의 질병의 예방 또는 치료를 위한 구강 조성물을 제공한다. 이 구강 조성물에 있어서, 바이셀라속 유산균으로서 특히 바람직하게는 바이셀라속 유산균 W3 이다.
또, 본 발명은, 바이셀라속 W3 유산균주 혹은 그 변이체, 또는 그것들의 형질 전환체 혹은, 상기 구강 조성물을 함유하는 것을 특징으로 하는 음식품을 제공한다.
또, 본 발명은, 바이셀라속 유산균과 자일로오스로 이루어지는 구강 내의 질병의 예방 또는 치료를 위한 구강 조성물을 제공한다.
구강 내의 질병이란, 우식, 치주병 등을 가리킨다.
나아가서는, 본 발명은, 바이셀라속 유산균 W3 과 자일로오스로 이루어지는 구강 내의 질병의 예방 또는 치료를 위한 구강 조성물을 제공한다.
또, 나아가서는, 본 발명은, 바이셀라속 유산균 W3, 혹은 상기 구강 조성물을 함유하는 것을 특징으로 하는 음식품을 제공한다. 음식품은 특별히 한정되지 않고, 예로는, 과자, 빙과, 유제품, 육류, 어류, 야채류, 그것들의 가공 식품, 청량 음료, 주류, 물, 나아가서는 가축이나 애완 동물의 사료 등을 들 수 있다.
이하에, 본 발명의 일례를 실시예에 의해 나타내지만, 본원 발명은 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
<배양 방법 및 시험 방법>
처음으로, 실시예에서 사용한 배양 방법이나 시험 방법 등의 방법의 상세를 설명한다.
1. Streptococcu mutans UA159 및 유산균의 배양
Streptococcu mutans (본 명세서 중에서 S.mutans, S.뮤탄스 혹은 S.m 으로 기재하는 경우가 있다) 로서 Streptococcus mutans UA159 를 사용하여, BHI (Brain Heart Infusion, 일본 BD) 배지에서 37 ℃ 에서 혐기 배양하였다. 유산균은 MRS (일본 BD) 액체 배지, 또는 이것에 1.5 % 한천을 더한 평판 배지에서 37 ℃ 에서 혐기적으로 배양하였다.
2. 16S rRNA 유전자 배열 해석에 의한 균종 동정 방법
16S rRNA 유전자의 상류 약 500 bp 영역의 DNA 단편을 증폭시키기 위해, 8 UA 포워드 프라이머 (3'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-5' (배열 번호 1)) 및 519B 리버스 프라이머 (3'-ATTACCGC (C/G) GCTGCTG-5' (배열 번호 2)) (비특허문헌 2) 를 사용하여, 유산균으로부터 조제한 게놈 DNA 를 주형으로 하여 PCR 하였다. 반응의 온도 조건은, 95 ℃ 에서 5 분간 인큐베이트한 후, 95 ℃ 에서 30 초, 55 ℃ 에서 30 초, 72 ℃ 에서 30 초의 인큐베이트를 25 사이클 반복하였다. 마지막으로 72 ℃ 에서 7 분간 인큐베이트하였다. PCR 산물을 8UA 포워드 프라이머에 의해 다이렉트 시퀀스하였다. 얻어진 DNA 의 염기 배열을 유전자 데이터베이스 (DDBJ:니혼 DNA 데이터 뱅크) 로 염기 배열의 상동성 검색하고, 균종을 추정하였다.
3. S.뮤탄스. 바이오 필름의 형성 및, S.뮤탄스. 바이오 필름 형성 억제 활성 평가
96 웰 마이크로 플레이트에 0.25 % ∼ 2 % 스크로오스를 함유하는 TSB (Tripticase soy broth, 일본 BD) 를 더하고, 추가로 미리 BHI 배지에서 배양한 S.뮤탄스의 배양액을 OD660 이 약 0.3 으로 희석하여 20 ㎕ 접종하였다 (배양액의 전체량은 300 ㎕). 배양은 혐기적으로 37 ℃ 에서 16 시간 실시하고, 그 후 배양 상청을 버리고 마이크로 플레이트의 바닥에 형성된 바이오 필름을 생리 식염수로 2 회 느리게 세정하였다. 다음으로, 0.3 % 크리스탈 바이올렛 용액으로 바이오 필름을 10 분간 염색한 후, 생리 식염수로 2 회 느리게 세정하였다. 가만히 정지시키고, 건조시킨 후 마이크로 플레이트 리더 (SH-1000 Lab, 코로나 전기 (주)) 로 OD570 을 측정하고, 이것을 바이오 필름량으로 하였다.
유산균의 S.뮤탄스 바이오 필름 형성 억제를 평가할 때에는, 유산균을 107 ∼ 108 개/㎖ 가 되도록 배양액에 첨가하였다. 또, 자일로오스의 효과를 확인하기 위해서, 일부의 측정에서는, 배양액에 적절히 자일로오스를 첨가하였다.
4. 유산균의 당자화성 평가
유산균의 당자화성에 대해서는 API50 CHL kit (bioMerieux 프랑스) 를 사용하여 평가하였다. 즉 MRS 한천 배지에서 배양하여 형성한 콜로니를 취하여, 균액 접종용 배지 종용 배지 (API 50 CHB/CHE 미디엄) 에 현탁하고, 맥팔랜드 탁도 2 가 되도록 조제하였다. 그 현탁액을 49 종류의 당 대사 판정의 웰에 접종하고, 미네랄 오일을 중층하여 24 시간 배양하였다. 지시약의 색의 변화에 따라 대사가 양성인지 음성인지를 판정하였다.
5. S.뮤탄스에 의한 당질의 자화성 평가
BHI 배지에서 OD660 이 약 0.5 가 될 때까지 배양한 S.뮤탄스의 배양액을 글루코오스, 수크로오스, 자일로오스, 자일로올리고당 또는 프락토올리고당을 5 % 함유하는 HI 배지 5 ㎖ 에 50 ㎕ 접종하고, 37 ℃ 에서 18 시간 혐기 배양하였다. 배양액의 pH 를 측정하고, 치아 (에나멜질) 로부터 칼슘 및 인산이 용출되기 시작하는 pH 인 5.7 을 상회했는지의 여부를 평가하였다.
6. 유산균의 증식 곡선의 평가
유산균을 MRS 배지에서 OD660 이 약 0.5 가 될 때까지 37 ℃ 에서 혐기 배양하고, 그 배양액을 당을 함유하지 않은 Heart Infusion (HI 배지, 일본 BD) 배지 5 ㎖ 에 50 ㎕ 접종하였다. 37 ℃ 에서 혐기적으로 배양하고, 1 시간 간격으로 OD660 을 측정하였다. 또, 수크로오스, 자일로오스, 자일로올리고당 또는 프락토올리고당의 자화성을 평가하는 경우에는, 각각의 당을 1.5 % 가 되도록 HI 배지에 첨가하여 동일한 조작을 실시하였다.
<실험 및 결과>
이하에 본 실시예에서 실시한 구체적인 실험 및 결과를 기재한다.
1. S.뮤탄스 바이오 필름 형성 억제 효과를 갖는 유산균의 탐색
본원 발명자들은, 처음에, 김치 유래의 유산균을 조사하여, 바이셀라속의 유산균이 S.뮤탄스의 바이오 필름 형성을 강력하게 억제하는 것을 확인하였다. 이 결과는 M.S.Kang 등의 보고 (비특허문헌 3) 나 특허문헌 1 에 있어서 이미 나타나 있어, 그들의 결과와 일치했다고 할 수 있다.
본 발명에서는, 바이셀라속의 유산균 중에서도, 특히 바이오 필름 형성 억제 효과가 높은 바이셀라속 유산균주를 얻는 것을 목표로 하였다. 그래서, 본원 발명자들은, 다시, 김치의 일부를 MRS 배지에 도포하여 배양하고, 새롭게 복수의 유산균주를 단리하였다. 이들 유산균주를 각각 그램 염색하여 형태를 관찰하고, Weissella cibaria JCM12495 (기준주) 를 대조로 관찰을 실시하여, 바이셀라속이라고 생각되는 주를 선발하였다. 추가로 각각의 주의 16 SrRNA 유전자의 상류 영역 약 500 bp 의 DNA 단편의 배열 해석을 실시하고, 유전자 데이터베이스 (DDBJ:니혼 DNA 데이터 뱅크) 로 염기 배열의 상동성 검색을 실시하고, 바이셀라속 유산균주로 동정되는 것을 선택하여, 최종적으로 20 종류의 바이셀라속 유산균주를 얻었다. 이것들을 W1 내지 W20 으로 명명하였다.
2. 바이셀라속 유산균의 바이오 필름 형성 억제 활성 비교
바이셀라속 유산균 W1 내지 W20 주와의 바이오 필름 형성 억제 효과를 평가하였다. 비교 대상으로서 이미 알려진 충치 예방 유산균으로서 알려진 Lactobacillus reuteri 및 Lactobacillus salivarius 를 사용하였다. 결과를 도 1 에 나타낸다. 바이셀라속 유산균 W3 이 가장 바이오 필름 형성 억제 효과가 있는 것을 알 수 있었다.
3. 이미 알려진 바이셀라속 유산균과 바이셀라속 유산균 W3 의 당자화성 비교
바이셀라속 유산균 W3 의 당자화성을 조사하였다. 결과를 표 1 에 나타낸다.
Figure pct00001
바이셀라속 유산균 W3 의 자화성은, W.confusa 및 W.cibaria 의 기준주의 자화성과 상이했다. 또, 특허문헌 1 에서 개시된 바이셀라속 유산균과도 상이한 성질을 나타냈다. 따라서, W3 은 이미 알려진 바이셀라속 유산균과는 상이한, 새로운 주로 시사되었다 (표 2).
Figure pct00002
4. 바이셀라속 유산균 W3 의 16s RNA 유전자의 해석
바이셀라속 유산균 W3 의 16s RNA 유전자의 염기 배열 (상류 영역의 약 500 bp) 의 해석 결과는 다음과 같았다.
Figure pct00003
데이터베이스 검색의 결과, 상기의 배열로부터는, 바이셀라속 유산균 W3 은, Weissella confusa (바이셀라 콘푸사) 로 추정되었다. 그러나, 당자화성에 있어서는, 바이셀라속 유산균 W3 은 Weissella confusa 의 기준주와 상이하다.
비특허문헌 4 에 있어서, 저자들은, Weissella confusa 의 16 SrRNA 유전자의 염기 배열은, Weissella cibaria (바이셀라 시바리아) 의 그것과 89.2 % ∼ 99.2 % 의 상동성을 나타내는 등, 바이셀라속의 유산균에 관해서는 16 SrRNA 의 유전 정보로부터 종까지를 특정하는 것은 곤란하다고 하고 있다. 이것들을 종합적으로 해석하여, 바이셀라속 유산균 W3 은 이미 알려진 균주와는 상이한 새로운 주라고 인정하고, Weissella sp. (w3) 로서, 독립 행정법인 제품 평가 기술 기판 기구 특허 미생물 기탁 센터에, 2014년 1월 21일에 기탁하였다. 수탁 번호는 NITE BP-01789 이다.
5. 구강 내에서 바이셀라속 유산균과 조합에 적절한 당류의 검색
유산균을 구강 내의 질병 예방 또는 치료에 사용할 것을 고려하면, 유산균의 영양원이 되는 당은, 일반적인 세균, 특히 우식의 원인인 S.뮤탄스에게는 잘 대사되지 않고, 유산균만을 증식·활성화하는 당이 바람직하다. 상기 관점에서, 자일로오스에 주목하였다.
S. 뮤탄스에 의한 당질의 자화성 평가의 결과 (도 2), S.뮤탄스는 5 % 의 자일로오스를 함유하는 배지에서 배양해도 pH 5.7 을 상회하였다. 이것은 자일로오스가 S.뮤탄스에게 잘 대사되지 않는 것, 또, 자일로오스가 충치의 원인이 잘 되지 않는 것을 나타내고 있다.
한편, 배지에 함유되는 당의 종류를 한정하여 바이셀라속 유산균 W3 을 배양하고, 증식 곡선을 평가한 결과, 도 3 에 나타내는 바와 같이, 바이셀라속 유산균 W3 은 자일로오스, 수크로오스, 자일로올리고당, 프락토올리고당의 어느 당에서도, HI 배지와 비교하여 증식이 촉진되고, 그 중에서도 자일로오스와 자일로올리고당은 증식을 보다 촉진시켰다. 이들 당은 바이셀라속 유산균 W3 에 있어서의 대사가 빠른 것이라고 생각된다.
이상으로부터, 자일로오스는 구강 내의 질병 예방 또는 치료에 사용하기 위해서, 바이셀라속 유산균과 조합하는 당으로서 유효한 것으로 생각된다.
6. 바이셀라속 유산균 W3 의 S.뮤탄스의 바이오 필름 형성 억제 효과에 있어서의 수크로오스 농도 의존성
S.뮤탄스 바이오 필름 형성 억제 활성 평가의 결과, 바이셀라속 유산균 W3 은 0.25 % ∼ 2 % 수크로오스 첨가 배지의 어느 조건에 있어서도 바이오 필름 형성을 억제하였다 (도 4a 및 4b, S.뮤탄스 + 바이셀라속 유산균 W3). 또한 자일로오스 1.5 % 존재 하에서, S.뮤탄스 바이오 필름 형성 억제 활성 평가를 실시한 결과, 1 ∼ 2 % 로 고농도의 수크로오스 존재 하에 있어서는, 바이셀라속 유산균 W3 과 함께 자일로오스 1.5 % 를 첨가하자, 바이셀라속 유산균 W3 만 첨가한 경우와 비교하여 바이오 필름 형성 억제 효과를 유의하게 높였다 (p < 0.05) (도 4a 및 4b, S.뮤탄스 + 바이셀라속 유산균 W3 + 자일로오스).
7. 바이셀라속 유산균 W3 의 바이오 필름 형성 억제 효과에 있어서의 자일로오스 농도 의존성
1 % 수크로오스를 함유하는 TSB 배지에서 S.뮤탄스와 함께 바이셀라속 유산균 W3 을 더하여 배양하여 바이오 필름을 형성시켰다. 배양시, 0.02 % 로부터 3.0 % 의 자일로오스를 더한 결과, 첨가한 자일로오스의 농도 의존적으로 바이오 필름 형성이 억제되었다 (도 5a 및 5b). 다넷트의 다중 비교에 의해 통계 해석한 결과, 자일로오스 무첨가의 경우와 비교하여, 0.19 % 이상의 자일로오스를 함유하는 배지에서 유의하게 바이오 필름을 감소시켰다 (p < 0.05).
8. 바이셀라속 유산균 W3 의 현미경 관찰
그램 염색한 바이셀라속 유산균 W3 의 형태 관찰 결과를 도 6 에 나타낸다.
이상, 본 실시예로부터, 바이셀라속 유산균 W3 은 S.뮤탄스의 바이오 필름 형성을 억제하여, 구강 내의 질병의 예방 또는 치료에 유효하다는 것을 알 수 있었다. 또, 바이셀라속 유산균은 자일로오스와 조합하면 그 억제 활성이 높아졌다. 자일로오스는 S.뮤탄스에게 잘 대사되지 않는 점에서, 바이셀라속 유산균, 특히, 바이셀라속 유산균 W3 과 조합하여, 구강 내의 질병의 예방 또는 치료에 유효하다는 것을 알 수 있었다.
이 출원은 2014년 3월 28일에 출원된 일본 특허출원 제2014-069383호로부터의 우선권을 주장하는 것으로, 그 내용을 인용하여 이 출원의 일부로 하는 것이다.
Patent Microorganism Depositary, National Institute of Technology and Evaluation NITEBP-01789 20140121
SEQUENCE LISTING <110> LOTTE CO., LTD <120> Weissella bacterium <130> LOTTE-163WO <150> JP 2014-069383 <151> 2014-03-28 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 2 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 attaccgcsg ctgctg 16 <210> 3 <211> 483 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Weissella w3 <400> 3 ctttgtggtt caactgattt gaagagcttg ctcagatatg acgatggaca ttgcaaagag 60 tggcgaacgg gtgagtaaca cgtgggaaac ctacctctta gcaggggata acatttggaa 120 acagatgcta ataccgtata acaatgacaa ccgcatggtt gttatttaaa agatggttct 180 gctatcacta agagatggtc ccgcggtgca ttagctagtt ggtaaggtaa tggcttacca 240 aggcgatgat gcatagccga gttgagagac tgatcggcca caatgggact gagacacggc 300 ccatactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccaca atgggcgaaa gcctgatgga 360 gcaacgccgc gtgtgtgatg aagggtttcg gctcgtaaaa cactgttgta agagaagaat 420 gacattgaga gtaactgttc aatgtgtgac ggtatcttac cagaaaggaa cggctaaata 480 cgt 483

Claims (5)

  1. 바이셀라속 유산균 W3 유산균 (Weissella sp. (W3):수탁 번호 NITE BP-01789) 혹은 그 변이체, 또는 그것들의 형질 전환체.
  2. 바이셀라속 유산균과 자일로오스로 이루어지는 구강 내의 질병의 예방 또는 치료를 위한 구강 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서,
    바이셀라속 유산균이 바이셀라속 유산균 W3 유산균 (Weissella sp. (W3):수탁 번호 NITE BP-01789) 혹은 그 변이체, 또는 그것들의 형질 전환체인 구강 조성물.
  4. 바이셀라속 유산균 W3 (Weissella sp. (W3):수탁 번호 NITE BP-01789) 혹은 그 변이체, 또는 그것들의 형질 전환체를 함유하는 것을 특징으로 하는 음식품.
  5. 제 2 항 또는 제 3 항의 구강 조성물을 함유하는 것을 특징으로 하는 음식품.
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