WO2018225910A1 - 바이셀라 사이베리아 균주를 포함하는 충치 예방 또는 개선용 조성물 - Google Patents
바이셀라 사이베리아 균주를 포함하는 충치 예방 또는 개선용 조성물 Download PDFInfo
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Definitions
- 1 is a view showing the result of confirming the inhibition of biofilm formation by the caries-causing bacteria of one or a mixture of W. cibaria strain of one aspect of the present invention.
- the caries-causing bacteria may include, but is not limited to, Streptococcus mutans .
- the vitamin B may be included in an amount of preferably 0.3 to 0.8 wt%, more preferably 0.5 to 0.7 wt% based on the total weight of the composition.
- the vitamin D preferably based on the total weight of the composition, may be included in 0.01 to 0.07% by weight, more preferably 0.03 to 0.05% by weight. In one embodiment, the vitamin D may be vitamin D 3 .
- the vitamin B 6 may be included in an amount of 0.01 to 0.1% by weight, preferably, 0.01 to 0.05% by weight based on the total weight of the composition.
- the dosage of the active ingredient is within the level of those skilled in the art, and the daily dosage of the drug depends on various factors such as less progression, onset, age, health condition, complications, etc. of the subject to be administered.
- the composition 1 to 500 mg / kg, preferably 30 to 200 mg / kg may be administered in divided doses once or twice a day.
- mutans was inoculated with 100 ⁇ l ( ⁇ 5 x 10 6 CFU / ml), the test group ( ⁇ 5 100 ⁇ l S. mutans culture x 10 6 CFU / ml) and W. cibaria culture supernatant were inoculated in 100 ⁇ l each.
- the inoculated plate was incubated at 37 ° C. for 24 hours, and then the absorbance was measured at 600 nm using a microplate reader to measure the growth concentration of S. mutans .
- the preparation of W. cibaria culture supernatants was as follows. 100 ⁇ l of W. cibaria was inoculated into 30 ml of MRS broth and incubated at 37 ° C. for 24 hours.
- Subjects were asked to refrain from oral activities (eating, drinking, chewing, wiping, and mouth brushing) for at least 2 hours prior to oral examination, and they performed plaque index test and saliva mutans test.
- Ingestion method was to take one tablet before going to bed after brushing in the evening to eat slowly dissolve without swallowing.
- oral care was to brush your teeth as usual, but not to use gargle.
- the subjects were tested from the first day, the product was consumed for 4 weeks, and the survey, oral test, and bacterial count were measured every two weeks.
- the plaque and saliva were tested every two weeks for four weeks after stopping the test food, and the W. cibaria CMU (oraCMU TM ) group the saliva was measured W. cibaria CMU bacteria to assess the additional oral settled into force of W. cibaria CMU.
- the m-PHP index (modified patient hygiene performance index) was used to measure oral hygiene. Measured areas were maxillary right canine and second premolar, maxillary left first molar, mandibular left incisor and first molar, and mandibular right first premolar. It was divided into equal parts (gingival, center, cutting, mesial, and centrifugal) to make one point when the bacterial membrane was attached and zero when not attached. In other words, the m-PHP index is based on 12 teeth of 6 teeth, 1 tooth surface is divided into 5 equal parts and evaluated for the attachment of the bacterial plaque. The value was set.
- the base sequence of the primer used in the experiment is as described in Table A.
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Abstract
본 명세서에는 바이셀라 사이베리아 균주를 유효성분으로 포함하는 충치 예방 또는 개선용 조성물이 개시된다. 본 발명의 일 측면인, 바이셀라 사이베리아 균주, 그 배양물, 그 파쇄물 또는 그 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은, 충치 유발균의 생장 및 바이오필름 형성을 억제하여, 충치를 효과적으로 예방 또는 개선할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 프로바이오틱스를 사용하기 때문에 인체에 무해하다는 장점이 있다.
Description
본 명세서에는 바이셀라 사이베리아 균주를 유효성분으로 포함하는 충치 예방 또는 개선용 조성물이 개시된다.
오늘날 가장 일반적으로 이용되고 있는 생균제는 유산균(lactic acid bacteria)으로서, 유산균은 5개 속으로 구분할 수 있는데, 스트렙토코커스(Streptococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 루코노스탁(Leuconostoc), 비피도박테리아(Bifidobacteria), 그리고 페디오코커스(Pediococcus)로 나뉜다.
유산균은 유제품, 김치류, 양조식품 등의 식품 제조에 이용되고 있으며, 포유류의 장내에 서식하여 잡균에 의한 이상발효를 방지하여 정장제로도 이용되는 중요한 세균이다. 유산균은 숙주의 면역 기능을 증강시키고 장내에서 콜레스테롤의 흡수를 억제하여 심혈관 질환 예방의 가능성도 보고되고 있고, 조류 독감 바이러스에 대한 항바이러스력을 가지는 균주도 발견되었다. 이러한 결과를 바탕으로 유산균은 섭취가 용이하고, 식품 첨가제로서의 응용이 용이하여 생균제(probiotics)로서의 개발이 주목받고 있다.
한편, 사람의 구강 내에는 약 700종류의 세균이 번식하고 있으며, 그 균수는 100억개에 달하고 있다. 치아의 맨 바깥 층은 법랑질이라고 하는 단단한 물질로 이루어져 있는데, 충치균에 의해 설탕 등의 당류가 분해 되면서 생기는 산에 의해 치아의 법랑질이 손상되는 것을 충치(치아우식증)라고 한다. 충치를 일으키는 원인 중 가장 중요한 것은 치태이다. 치태에는 여러 세균이 섞여 있는데, 특히 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans)가 주요 충치균으로 알려져 있다.
현재 충치 예방 방법으로는 치약을 이용한 칫솔질이 가장 흔하게 사용되고 있는데, 치약 조성물에 포함되어 있는 불소 화합물이나 그 밖의 합성 화학물질은, 불소 침투층이 치아표면에서 깊이 침투하지 못하고 쉽게 소실되는 한계성을 가지고, 불소 자체의 독성으로 인한 문제가 야기되고 있다.
따라서, 프로바이오틱스, 그 중에서도 인체에 큰 부작용을 일으키지 않는 유익균인 유산균을 이용하여 충치 질환을 예방하거나 개선하는 방법에 대한 연구가 필요하다.
[선행기술 문헌]
(특허문헌 1) KR 10-1062779 B1
일 측면에서, 본 발명의 목적은, 바이셀라 사이베리아 균주의 충치 유발균 생장 억제 용도를 제공하는 것이다.
일 측면에서, 본 발명의 목적은, 바이셀라 사이베리아 균주를 이용하여 충치 유발균의 바이오필름 생성을 억제하는 것이다.
일 측면에서, 본 발명의 목적은, 바이오 물질인 프로바이오틱스를 유효성분으로 함유하는 충치 예방 또는 개선용 조성물을 제공하는 것이다.
일 측면에서, 본 발명의 목적은, 인체에 무해한 충치 예방 또는 개선용 조성물을 제공하는 것이다.
일 측면에서, 본 발명은, 하기 수학식 1로 표현되는 충치 유발균의 바이오필름 형성 억제능이 65% 이상인 바이셀라 사이베리아(Weissella cibaria) 균주, 그 배양물, 그 파쇄물 또는 그 추출물을 유효성분으로 포함하는, 충치 예방 또는 개선용 조성물을 제공한다:
<수학식 1>
충치 유발균의 바이오필름 형성 억제능(%)=100×[0.5% 자당이 첨가된 Tryptic soy broth(TSB-S)와 0.5% 자당이 첨가된 MRS broth(MRS-S)가 동량 섞인 배지에 충치 유발균만을 5.0×106 CFU/ml씩 접종하고, 37℃에서 24시간 배양한 후 측정한 바이오필름 농도(OD595)-충치 유발균과 바이셀라 사이베리아를 TSB-S와 MRS-S가 동량 섞인 배지에 각각 5.0×106 CFU/ml씩 접종하고, 37℃에서 24시간 배양한 후 측정한 바이오필름 농도(OD595)]/TSB-B와 MRS-S가 동량 섞인 배지에 충치 유발균만을 5.0×106 CFU/ml씩 접종하고, 37℃에서 24시간 배양한 후 측정한 바이오필름 농도(OD595).
본 발명의 일 측면인, 바이셀라 사이베리아 균주, 그 배양물, 그 파쇄물 또는 그 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은, 충치 유발균의 생장 및 바이오필름 형성을 억제하여, 충치를 효과적으로 예방 또는 개선할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 프로바이오틱스를 사용하기 때문에 인체에 무해하다는 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 일 측면인 W. cibaria 균주의 단독 또는 그 혼합물의 충치 유발균에 의한 바이오필름 형성 억제능 확인 결과를 보이는 도이다.
도 2는, 본 발명의 일 측면인 W. cibaria 균주의 충치 유발균에 대한 생장 억제능 확인 결과를 보이는 도이다. 도 2에서, U는 W. cibaria CMU를, 1은 W. cibaria CMS1를, 2는 W. cibaria CMS2를, 3은 W. cibaria CMS3를 의미하고, Original은, 어떠한 처리도 되지 않은 배지, Organic acid는, proteinase K와 catalase가 처리된 배지, H2O2 는, pH를 중화시키고, proteinase K가 처리된 배지, BLC(bacteriocin-like compound)는, pH를 중화시키고, catalase가 처리된 배지에서 배양된 것을 의미한다.
도 3은, CMU 균주를 포함하는 조성물을 처리할 경우 m-PHP 지수 변화를 보이는 도이다.
도 4는, CMU 균주를 포함하는 조성물을 처리할 경우 충치 유발균 생장 억제능을 임상실험한 결과를 보이는 도이다.
도 5는, CMU 균주를 포함하는 조성물을 처리할 경우, 시간의 경과에 따른 CMU 균주의 정착능을 확인한 도이다.
도 6은 본 발명의 균주들의 기탁증이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 산업통상자원부와 한국산업기술진흥원의 "R&D재발견프로젝트"의 지원을 받아 수행된 연구결과(과제번호: N0002203, 과제명: 구취 억제 oral probiotics의 식약처 건강기능식품 개별인정을 위한 기능성 평가와 보건식품개발, 연구기간: 2016.11.01.~2017.12.31.)이다.
일 측면에서, 본 발명은, 하기 수학식 1로 표현되는 충치 유발균의 바이오필름 형성 억제능이 65% 이상인 바이셀라 사이베리아(Weissella cibaria) 균주, 그 배양물, 그 파쇄물 또는 그 추출물을 유효성분으로 포함하는, 충치 예방 또는 개선용 조성물이다:
<수학식 1>
충치 유발균의 바이오필름 형성 억제능(%)=100×[0.5% 자당이 첨가된 Tryptic soy broth(TSB-S)와 0.5% 자당이 첨가된 MRS broth(MRS-S)가 동량 섞인 배지에 충치 유발균만을 5.0×106 CFU/ml씩 접종하고, 37℃에서 24시간 배양한 후 측정한 바이오필름 농도(OD595)-충치 유발균과 바이셀라 사이베리아를 TSB-S와 MRS-S가 동량 섞인 배지에 각각 5.0×106 CFU/ml씩 접종하고, 37℃에서 24시간 배양한 후 측정한 바이오필름 농도(OD595)]/TSB-B와 MRS-S가 동량 섞인 배지에 충치 유발균만을 5.0×106 CFU/ml씩 접종하고, 37℃에서 24시간 배양한 후 측정한 바이오필름 농도(OD595).
일 측면에서, 상기 충치 유발균은, 바람직하게 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 측면에서, 상기 조성물은 충치 유발균의 치면(surface of tooth) 상의 바이오필름 형성을 억제하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 바이오 필름은, 미생물 막을 의미할 수 있으며, 이는 표면상에 미생물들이 서로 들러붙어서 형성한 막을 의미할 수 있다.
일 측면에서, 상기 조성물은, 비타민 또는 그 유도체를 더 포함할 수 있고, 상기 조성물은, 조성물 총 중량을 기준으로, 바이셀라 사이베리아 균주, 그 배양물, 그 파쇄물 또는 그 추출물을 1~10 중량%로 포함할 수 있으며, 비타민 또는 그 유도체를, 1~7 중량%로 포함할 수 있다.
상기 바이셀라 사이베리아 균주, 그 배양물, 그 파쇄물 또는 그 추출물은 조성물 총 중량을 기준으로, 바람직하게, 4~6 중량%로 포함될 수 있다.
또한, 상기 비타민 또는 그 유도체는, 바람직하게는, 3~6 중량%, 더욱 바람직하게는, 4~6 중량%로 포함될 수 있다.
일 측면에서, 상기 비타민은, 조성물 총 중량을 기준으로, 0.1~1 중량%의 비타민 B; 2~5 중량% 비타민 C, 및 0.01~0.1 중량%의 비타민 D를 포함할 수 있다.
상기 비타민 B는 조성물 총 중량을 기준으로, 바람직하게는 0.3~0.8 중량%, 더욱 바람직하게는, 0.5~0.7 중량%로 포함될 수 있다.
또한, 상기 비타민 C는, 조성물 총 중량을 기준으로, 바람직하게는 3~5 중량%, 더욱 바람직하게는 3~4 중량%로 포함될 수 있다.
또한, 상기 비타민 D는, 조성물 총 중량을 기준으로, 바람직하게는 0.01~0.07 중량%, 더욱 바람직하게는 0.03~0.05 중량%로 포함될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 비타민 D는 비타민 D3 일 수 있다.
일 측면에서, 상기 비타민 B는 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B5 및 비타민 B6를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 비타민 B5의 유도체인 판토텐산 칼슘을 포함할 수 있다.
상기와 같은 측면에서, 상기 비타민 B1과 비타민 B2는 각각 조성물 총 중량을 기준으로, 0.01~0.1 중량%로 포함될 수 있고, 바람직하게는, 각각 0.01~0.05 중량%로 포함될 수 있다.
또한, 상기 비타민 B3는 조성물 총 중량을 기준으로, 0.1~0.6 중량%로 포함될 수 있고, 바람직하게는 0.1~0.4 중량%, 더욱 바람직하게는, 0.2~0.4 중량%로 포함될 수 있다.
또한, 상기 비타민 B5는 조성물 총 중량을 기준으로, 0.05~0.2 중량%로 포함될 수 있으며, 바람직하게는, 0.08~0.2 중량%, 더욱 바람직하게는, 0.1~0.15 중량%로 포함될 수 있다.
또한, 상기 비타민 B6는 조성물 총 중량을 기준으로, 0.01~0.1 중량%로 포함될 수 있고, 바람직하게는, 0.01~0.05 중량%로 포함될 수 있다.
일 측면에서, 상기 조성물은, 코마룸 파루스트레(Comarum palustre) 추출물을 더 포함할 수 있다. 상기 조성물은 코마룸 파루스트레 추출물을 더 포함함으로써, 충치 개선 효과를 더욱 향상시킬 수 있다.
일 측면에서, 상기 조성물은 바이셀라 사이베리아 균주, 그 배양물, 그 파쇄물 또는 그 추출물과 코마룸 파루스트레 추출물을 1:0.5~1:2의 중량비로 포함할 수 있다. 상기 바이셀라 사이베리아 균주 등과 코마룸 파루스트레 추출물은 바람직하게, 1:0.8~1:1.2의 중량비로 포함될 수 있다. 상기 조합비에서, 현저히 향상된 충치 개선 효과를 기대할 수 있다.
상기 코마룸 파루스트레 추출물의 제조방법은, 당업계에 널리 알려져 있는 추출방법에 의한 것일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 추출물은 50~70℃의 메탄올을 추출용매로 하여 추출된 것일 수 있다.
일 측면에서, 상기 코마룸 파루스트레 추출물은, 조성물 총 중량을 기준으로, 0.5~20 중량%로 포함될 수 있고, 바람직하게는, 1~10 중량%, 더욱 바람직하게는 3~7 중량%로 포함될 수 있다.
일 측면에서, 상기 바이셀라 사이베리아 균주는, 바이셀라 사이베리아 CMU(수탁번호: KCTC 10650BP), 바이셀라 사이베리아 CMS-1(수탁번호: KCTC 10678BP), 바이셀라 사이베리아 CMS-2(수탁번호: KCTC 10679BP), 및 바이셀라 사이베리아 CMS-3(수탁번호: KCTC 10680BP)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
이 균주들은 2004년 6월 4일과 8월 6일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁되었다(바이셀라 사이베리아 CMU 수탁번호: KCTC 10650BP, 바이셀라 사이베리아 CMS-1 수탁번호: KCTC 10678BP, 바이셀라 사이베리아 CMS-2 수탁번호: KCTC 10679BP, 바이셀라 사이베리아 CMS-3 수탁번호: KCTC 10680BP).
일 측면에서, 상기 조성물은, 식품 또는 약학 조성물일 수 있다.
상기 식품 조성물은 건강식품 조성물을 포함할 수 있고, 제형이 특별히 한정되지 않으나, 예를 들어, 정제, 과립제, 드링크제, 카라멜, 다이어트바 등으로 제형화될 수 있다. 각 제형의 건강식품 조성물은 유효 성분 이외에 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 성분들을 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승 효과가 일어날 수 있다.
상기 유효 성분의 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 약물의 1일 투여 용량은 투여하고자 하는 대상의 미만 진행 정도, 발병 시기, 연령, 건강상태, 합병증 등의 다양한 요인에 따라 달라지지만, 성인을 기준으로 할 때 일반적으로는 상기 조성물 1 내지 500 mg/kg, 바람직하게는 30 내지 200 mg/kg을 1일 1 내지 2회 분할하여 투여할 수 있다.
또한, 약학 조성물은 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 약제학적 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 함유할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 다양한 경구 투여제 또는 비경구 투여제 형태로 제형화할 수 있다.
상기 경구 투여제는 예를 들면, 정제, 환제, 경질 및 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 분제, 산제, 세립제, 과립제, 펠렛제 등이 있으며, 이들 제형은 유효성분 이외에 계면 활성제, 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로오즈 및 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및 폴리에틸렌 글리콜)를 함유할 수 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로오즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로오즈 및 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제 등의 약제학적 첨가제를 함유할 수 있다. 상기 정제는 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.
또한, 상기 활성성분의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있다. 일반적인 투여량은 0.001 mg/kg/일 내지 2000 mg/kg/일, 보다 구체적으로는 0.5 mg/kg/일 내지 2.5 mg/kg/일이다.
이하, 실시예 및 시험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 시험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 하기 예에 의해 제한되는 것은 아니다.
[제조예] 충치 개선 조성물(실시예 1)의 제조
하기 표 1에 기대되어 있는 조성으로 충치 개선 조성물을 제조하였다.
| NO | 원료명 | 배합비율(중량 %) |
| 1 | 이소말트 | 37.7 |
| 2 | 에리스리톨 | 44 |
| 3 | 비타민C | 3.69 |
| 4 | 비타민B1 | 0.03 |
| 5 | 비타민B2 | 0.03 |
| 6 | 니코틴산 아미드 | 0.34 |
| 7 | 판토텐산 칼슘 | 0.13 |
| 8 | 비타민 B6 | 0.036 |
| 9 | 비타민 D3 | 0.044 |
| 10 | 민트향 | 7 |
| 11 | 스테아린산마그네슘 | 2 |
| 12 | W. cibaria CMU | 5 |
| 총합 | 100 |
[실험예 1]
[실험예 1-1] in vitro에서, 조성물의 충치 개선 효과 확인(바이오필름 형성 억제력 확인)
치아우식 억제능이 우수한 W. cibaria를 선발하기 위하여 ㈜오라덴틱스에서 제공받은 균주 W. cibaria CMU, CMS1, CMS2, CMS3 4종을 대상으로 실험하였다. 실험방법은 Microtiter plate biofilm production assay(Coffey & Anderson, 2014)를 이용하였으며, 실험 대조군으로는 치아우식 유발균인 Streptococcus mutans Ingbritt를 이용하였다. 실험군으로는 W. cibaria CMU, CMS1, CMS2, CMS3 단독 또는 CMU+CMS1, CMU+CMS2, CMU+CMS3 2종 혼합, CMU+CMS1+CMS2, CMU+CMS1+CMS3, CMU+CMS2+CMS3 3종 혼합, CMU+CMS1+CMS2+CMS3 4종 혼합군을 사용하였으며, 3회 반복 실험 진행하였다.
S. mutans 를 overnight culture하고 5% sucrose가 첨가된 tryptic soy broth(TSB) (이하 TSB-S)로 OD600=0.5(~5 x 108 CFU/ml)가 되도록 맞추고 이를 다시 TSB-S에 10배 희석(~5 x 107 CFU/ml)하여 준비하였다. W. cibaria 4종은 overnight culture하고 5% sucrose가 첨가된 MRS broth(이하 MRS-S)배지로 OD600=0.05(~5 x 107 CFU/ml)가 되도록 맞추어 준비하였다. 대조군(S. mutans control)은 96 well plate에 배지 MRS-S 100 ㎕를 준비한 후, S. mutans 100 ㎕(~5 x 106 CFU/ml)를 접종하였으며, 실험군은 S. mutans 배양액 100 ㎕(~5 x 106 CFU/ml)와 W. cibaria 단독 또는 혼합군을 동량으로 각각 100 ㎕(~5 x 106 CFU/ml) 접종하였다. 접종한 plate는 37℃ 에서 24시간 배양한 후, 배양액을 버리고 증류수 200 ㎕로 2회 세척하여 plate를 뚜껑 열고 실온에 약 5분간 방치하여 건조시킨 후, 0.3 % crystal violet 50 ㎕를 넣고 15분간 염색하였다. 염색액을 제거한 후 증류수 200 ㎕로 2회 세척한 후, 99% 에탄올 200 ㎕로 용해시켜서 microplate reader를 이용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하여 바이오필름 농도를 측정하였다.
그 결과, ㈜오라덴틱스에서 제공한 W. cibaria 균주 4종 중에 치아우식 억제능이 우수한 균주를 선발하기 위하여 치아우식 유발균인 S. mutans의 바이오필름 형성 억제능을 비교한 결과, 4종 모두 통계적으로 S. mutans 바이오필름을 유의하게 억제하였으며, W. cibaria CMS1을 제외하고 CMU, CMS2, CMS3는 단독으로 이용하였을 때 유사하게 치아우식 억제능이 우수하였다(p < 0.005). 또한, 혼합 2종, 3종, 4종 사용하였을 때에도 단독으로 사용했을 때와 유사하게 통계적으로 S. mutans 바이오필름을 유의하게 억제하였다(p < 0.005) (도 1).
[실험예 1-2] in vitro에서, 조성물의 충치 개선 효과 확인(생장 억제력 확인)
W. cibaria의 치아우식균에 대한 생장 억제력을 확인하기 위하여 ㈜오라덴틱스에서 제공받은 균주 W. cibaria CMU, CMS1, CMS2, CMS3 4종을 대상으로 실험하였다. 실험방법은 다음과 같다. S. mutans Ingbritt를 overnight culture하고 tryptic soy broth(TSB)로 OD600=0.5(~5 x 108 CFU/ml)가 되도록 맞추고 이를 다시 TSB로 10배 희석(~5 x 107 CFU/ml)하여 준비하였다. 대조군(S. mutans control)은 96 well plate에 배지 MRS 100 ㎕를 준비한 후, S. mutans 100 ㎕(~5 x 106 CFU/ml)를 접종하였으며, 실험군은 S. mutans 배양액 100 ㎕(~5 x 106 CFU/ml)와 W. cibaria 배양 상청액을 동량으로 각각 100 ㎕씩 접종하였다. 접종한 plate는 37℃ 에서 24시간 배양한 후 microplate reader를 이용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하여 S. mutans의 성장 농도를 측정하였다. W. cibaria 배양 상청액의 준비는 다음과 같다. W. cibaria를 MRS broth 30 ml에 100 ㎕ 접종하여 37 ℃에서 24시간 배양한 후 원심분리(5,000 g, 20 min, 4)하여 얻은 상청액을 여과멸균(0.45 ㎛)하여 준비하였다. W. cibaria의 항균작용이 유기산, 과산화수소, 박테리오신 중에서 어떤 물질이 작용하는지 알아보기 위하여 상청액을 다음과 같이 각각 처리하였다. W. cibaria의 유기산에 대한 효과인지를 알아보기 위하여 배양 상청액에 존재하는 과산화수소와 단백질을 제거하기 위하여, 상청액에 catalase(0.5 mg/ml)와 proteinase K(0.1 mg/ml)를 각각 처리하여 37℃ 에서 1시간 동안 반응시킨 후 냉장보관하여 준비하였다. W. cibaria의 과산화수소에 대한 효과인지를 알아보기 위하여 배양 상청액에 존재하는 유기산 효과와 단백질을 제거하기 위하여, 상청액을 1 N NaOH를 이용하여 pH를 6.5로 중화시킨 후 proteinase K(0.1 mg/ml)를 처리하여 37℃ 에서 1시간 동안 반응시킨 후 냉장보관하여 준비하였다. W. cibaria의 박테리오신 유사물질에 대한 효과인지를 알아보기 위하여 배양 상청액에 존재하는 유기산 효과와 과산화수소를 제거하기 위하여, 상청액을 1 N NaOH를 이용하여 pH를 6.5로 중화시킨 후 catalase(0.5 mg/ml)를 처리하여 37℃ 에서 1시간 동안 반응시킨 후 냉장보관하여 준비하였다. 상기에서 처리한 모든 배양상청액은 최종적으로 여과(0.45 ㎛)를 시켜 균을 완전히 제거하였다. 실험 결과, 전혀 처리하지 않은 W. cibaria 배양 상청액 균주 4종 모두 S. mutans 의 성장을 약 99% 이상 억제하였다. 또한, W. cibaria이 만드는 유기산이 S. mutans에 대해 약 98% 억제 효과를 보였고, W. cibaria가 분비하는 과산화수소는 W. cibaria CMU가 67.1%, CMS1이 60%, CMS2가 64.4%, CMS3가 62% 억제 효과를 보였으며, W. cibaria이 만들어 내는 박테리오신 유사물질에 대한 효과는 CMU, CMS1, CMS2, CMS3가 각각 60.7%, 52.7%, 58.1%, 59% 유의하게 억제하였다(p < 0.05)
생장 억제력은 하기 수학식 2에 의해 수치화하였다.
<수학식 2>
충치 유발균 생장 억제능(%)=100×[BHI 배지에 충치 유발균만을 5.0×106 CFU/ml 접종하여 37℃ 에서 24시간 호기배양한 후 측정한 충치 유발균의 농도(OD600) - 바이셀라 사이베리아를 MRS 배지에 접종하고 37℃에서 24시간 배양하여 원심분리(5,000 g, 20 min, 4)한 후 여과(0.45 ㎛)하여 얻은 상청액을 BHI 배지와 동량으로 혼합한 배지에 충치 유발균만을 5.0×106 CFU/ml 접종하여 37℃ 에서 24시간 호기배양한 후 측정한 충치 유발균의 농도(OD600)] / BHI 배지에 충치 유발균만을 5.0×106 CFU/ml 접종하여 37℃ 에서 24시간 호기배양한 후 측정한 충치 유발균의 농도(OD600).
그 결과, 본 발명의 균주를 처리한 경우, 충치 유발균의 생장을 효과적으로 억제함을 알 수 있었고, 구체적으로 균주를 처리하지 않은 경우에 비하여, 충치 유발균의 생장 억제능이 약 65% 이상임을 확인할 수 있었다(도 2).
[실험예 1-3] 임상평가
연구대상자는 광주광역시 여대생 총 90명을 연구대상으로 하며, 연구대상자는 모두 연구 목적의 설문지 조사에 관하여 설명을 들은 후 자발적으로 동의서에 서명하고 설문지를 작성하였다. 본 연구는 무작위, 이중맹검, 위약대조군 연구로 설계하였으며, 의학연구 윤리에 대한 헬싱키 선언을 준수하여 광주여자대학교 생명윤리위원회(IRB)의 승인을 받아 진행되었다(IRB 심의번호: 1041485-201608-HR- 001-02).
무작위로 실험군 30명[W. cibaria CMU(oraCMUTM 함유 시제품, A 그룹], 대조군 30명(W. cibaria CMU를 제거한 시제품, B 그룹), 타사 제품을 사용한 양성대조군 30명(BioGaia Prodentis 제품, C 그룹)으로서 총 90명을 세 그룹으로 나누어 4주 동안 섭취하도록 지시하였으며, 이중 맹검법을 적용하여 실험자와 피실험자 모두 제공되는 제품이 시험제품인지 대조제품인지 여부를 모르는 상태로 진행하였다. 임상에 사용된 제품은 모양과 색이 동일하게 제조된 정제(tablet)로서, W. cibaria CMU (1x108 CFU/tablet)의 포함 유무에 따라 실험군(A 그룹)과 대조군(B 그룹)으로 분류하며, 비교 실험군으로서 타사제품 BioGaia Prodentis(Lactobacillus reuteri 8x108 CFU/tablet, 일본)(C 그룹)를 이용하였다.
연구 대상자는 구강 검사를 위하여 최소 2시간 전부터는 구강 활동(먹기, 마시기, 씹기, 닦기, 구강 양치)을 자제하도록 지시하였으며, 치태지수 검사 및 타액내 뮤탄스균 검사를 실시하였다. 섭취방법은 저녁에 양치 후 취침 전 1정을 입안에 넣어 삼키지 않고 서서히 녹여서 먹도록 하여 하루 1회 섭취하도록 하였다. 한편, 구강관리는 평소대로 칫솔질로만 양치하도록 하고 가글액은 사용하지 못하게 하였다. 연구대상자는 첫날부터 본 검사를 실시하였으며, 4주 동안 제품을 섭취하도록 하였으며, 2주마다 설문조사 및 구강검사, 균수를 측정하였다. 또한, 시험식품 섭취 중단 후에도 치태지수 감소 효과, 타액내 뮤탄스균의 변화를 측정하기 위하여 시험식품을 중단 후 4주 동안 2주마다 치태지수 및 타액 검사를 하고, W. cibaria CMU(oraCMUTM)그룹에서는 추가로 W. cibaria CMU의 구강 내 정착력을 평가하기 위하여 타액내 W. cibaria CMU균수를 측정하였다.
[치면세균막 지수 평가]
본 연구에서는 구강 위생 상태를 측정하기 위해 m-PHP index(개량구강위생관리능력검사, modified patient hygiene performance index)를 따랐다. 측정부위는 상악 우측 견치와 제2소구치, 상악 좌측 제1대구치, 하악 좌측 측절치와 제 1대구치, 하악 우측 제1소구치이며, 치태 침착 정도는 양 치면(협-설)을 검사하고 한 치면을 5등분(치은, 중앙, 절단, 근심, 원심)하여 세균막 부착시 1점, 미부착시 0점으로 하였다. 즉, m-PHP index는 6개 치아의 12개 치면을 대상으로, 1개 치면을 5등분하여 치면세균막 부착여부를 평가 후 이들의 합을 산출하여 절대값으로 표기하였으며, 최소 0에서 최대 60으로 값을 정하였다.
치면세균막지수 = 각 치면의 점수 합
개량구강위생관리능력 치면세균막 부착률(%) = 치면세균막지수/60 * 100
그 결과, 세 그룹사이에는 2주부터 유의하게 감소하는 패턴의 결과를 나타냈으며(p < 0.05), 이는 A 그룹과 B 그룹간에 통계적으로 유의한 차이를 나타냈다(p < 0.05). 또한, A 그룹과 C 그룹을 비교한 결과, 통계적으로 유의한 차이를 나타냈다(p < 0.05). 사후분석 결과에서도 2주에 실험군(그룹 A)과 위약대조군(그룹 B) 사이에 유의한 차이를 나타냈다(p < 0.05)(도 3).
[S. mutans의 생장 억제력 평가]
구강내 충치를 유발하는 S. mutans를 측정하기 위해 real-time PCR 정량법으로 확인하였다. 본 연구에서는 real-time PCR에서 측정된 값들은 cell number/saliva 1 ml로 환산하여 통계분석 하였다.
Screening strip(Orion Diagnostica, Dentocult-SM, Espoo, Finland)을 조사 대상자의 혀 위에 올리고 입을 가볍게 다물게 하고 전체 면에 타액이 잘 묻도록 10초간 위치시킨 후 꺼내 배양액 마개에 꽂아서 37℃ 항온배양기에서 48시간 동안 배양하고 세균수를 계측하였다. 배양 후 판정은 제작회사의 판정표를 이용하여 각 시료들을 우식활성도 음성(negative: 0), 경도(mild: 1), 중등도(moderate: 2) 및 고도(severe: 3)로 점수화한다. 또한, 타액 내 S. mutans 수의 변화를 측정하기 위하여 특정 primer와 Syber green을 이용하여 Real-time PCR(RotorGene Q, Qiagen)로 S. mutans 농도를 측정하였으며, 이 때 S. mutans 표준균주 농도는 균 배양액의 DNA를 이용하여 10계단씩 희석하고, copy number는 dsDNA 양 (ng) × 아보가드로수(6.0221) × 1023 (molecules/mole)/((dsDNA 길이 × 1 bp dsDNA 평균질량(660 g/mole)) × 1 × 109 ng/g의 공식으로 산출하였다.
실험에 사용된 프라이머의 염기서열은 표 A에 기재된 바와 같다.
측정방법은 다음과 같다. 타액 1 ml를 취하여 microcentrifuge tube로 옮긴 후 원심 분리(12,000 g, 2 min, 4)하여 상층액을 제거하고 pellet을 모은 다음 G-spin Genomic DAN extraction kit(iNtRON Biotechnology Inc, South Korea)을 이용하여 세균의 DNA를 추출하였다. Real-time PCR은 Rotor-Gene Q system(QIAGEN, Germany)을 이용하고, Syber green PCR kit(QIAGEN), primer, DNA를 혼합해서 측정하였다.
2주차 임상시험결과, A 그룹은 B그룹와 C그룹에 비해 Real-time PCR 결과 S. mutans copy number가 적음을 확인할 수 있었다. 그리고 4주차까지도 A그룹은 구강 내 S. mutans 양이 B, C 그룹에 비해 현저하게 낮게 유지됨을 알 수 있었다. 또한, 본 시험제품을 섭취 중단 후 2주, 4주, 6주, 8주에도 A그룹은 B, C 그룹에 비해 S. mutans 수가 현저하게 낮게 유지됨을 알 수 있었다(도 4).
<표 A>
[W. cibaria의 정착력 평가]
S. mutans의 생장 억제력 평가와 동일한 방법으로 상기 조성물을 섭취한 후의 W. cibaria의 수를 카운팅하여 W. cibaria의 정착력을 확인하였다. 실험에 사용된 프라이머의 염기서열은 표 A에 기재된 바와 같다.
Real-time PCR 정량법을 이용하여 타액에 존재하는 W. cibaria CMU 균수를 측정함으로써 구강정착력을 시험한 결과, W. cibaria CMU 섭취 4주 동안 통계적으로 유의하게 W. cibaria CMU균수가 증가하였으며, 또한, W. cibaria CMU의 섭취를 중단 후 W. cibaria 균수가 감소하기 시작하였으나, 섭취 전 균 수보다 통계적으로 50% 이상 유의하게 높게 유지됨을 확인함으로써 구강내 정착력이 있음을 증명하였다(도 5).
한편, W. cibaria CMU를 섭취하는 동안 S. mutans 생육이 유의하게 저해 되었으며, W. cibaria CMU 섭취 중단한 기간 동안에도 효과적으로 S. mutans 생육이 억제됨을 확인하였다(도 5).
한편, 상기 W. cibaria CMU 외 W. cibaria CMS1, CMS2, CMS3 균주에 대하여도 동일한 실험을 하였으나, W. cibaria CMU와 거의 동일한 결과를 얻었다.
[실험예 2] 조성물 내 성분의 함량에 따른 효과 비교
하기 표 2~표 8 에 기재된 바와 같이 각 성분들의 함량을 조절하여, 실험예 1-1에서 수행한 실험과 동일한 방법에 의하여 조성물의 충치 개선 효과를 확인하였다. 그 결과, 각 비타민들의 함량 범위 내외에서 충치 유발균의 생장 억제능이 크게 변화함을 알 수 있었다.
[실험예 2-1] 균주의 함량에 따른 효과 비교
| 비교예 1 | 비교예 2 | 실시예 1 | 비교예 3 | 비교예 4 | 비교예 5 | |
| 균주 함량 | 0.9 중량% | 1 중량% | 5 중량% | 10 중량% | 10.5 중량% | 15 중량% |
| OD595 | 약 2.7 | 약 1.0 | 약 0.5 | 약 0.5 | 약 1.8 | 약 2.5 |
[실험예 2-2] 비타민 B1 및 B2 의 함량에 따른 효과 비교
| 비교예 6 | 비교예 7 | 비교예 8 | 비교예 8 | 비교예 9 | 비교예 10 | 실시예 1 | |
| 비타민 B1 | 0.005중량% | 0.15중량% | 0.03중량% | 0.03중량% | 0.0005중량% | 0.15 중량% | 0.03 중량% |
| 비타민 B2 | 0.03중량% | 0.03중량% | 0.005중량% | 0.15중량% | 0.0005중량% | 0.15 중량% | 0.03 중량% |
| OD595 | 약 1.8 | 약 1.8 | 약 2.0 | 약 1.8 | 약 1.8 | 약 0.5 | 약 0.5 |
[실험예 2-3] 비타민 B3 의 함량에 따른 효과 비교
| 비교예 11 | 비교예 12 | 비교예 13 | 비교예 14 | 비교예 15 | 비교예 16 | 실시예 1 | |
| 비타민 B3 | 0.05 중량% | 0.1 중량% | 0.4 중량% | 0.6 중량% | 0.65 중량% | 1.0 중량% | 약 0.34 중량% |
| OD595 | 약 2.7 | 약 1.0 | 약 0.4 | 약 0.4 | 약 1.7 | 약 2.5 | 약 0.5 |
[실험예 2-4] 비타민 B5 의 함량에 따른 효과 비교
| 비교예 17 | 비교예 18 | 비교예 19 | 비교예 20 | 비교예 21 | 비교예 22 | 실시예 1 | |
| 비타민 B5 | 0.03 중량% | 0.05 중량% | 0.1 중량% | 0.2 중량% | 0.21 중량% | 0.5 중량% | 약 0.13중량% |
| OD595 | 약 3.0 | 약 1.0 | 약 0.5 | 약 1.1 | 약 1.7 | 약 2.3 | 약 0.5 |
[실험예 2-5] 비타민 B6 의 함량에 따른 효과 비교
| 비교예 23 | 비교예 24 | 비교예 25 | 비교예 26 | 비교예 27 | 비교예 28 | 실시예 1 | |
| 비타민 B5 | 0.005 중량% | 0.01 중량% | 0.03 중량% | 0.05 중량% | 0.1 중량% | 0.15 중량% | 약 0.036중량% |
| OD595 | 약 2.7 | 약 1.2 | 약 0.7 | 약 1.1 | 약 1.2 | 약 2.2 | 약 0.5 |
[실험예 2-6] 비타민 C의 함량에 따른 효과 비교
| 비교예 29 | 비교예 30 | 비교예 31 | 비교예 32 | 비교예 33 | 실시예 1 | |
| 비타민 C | 1.8중량% | 2중량% | 5중량% | 5.2중량% | 7중량% | 약 3.7 중량% |
| OD595 | 약 2.4 | 약 0.8 | 약 0.5 | 약 1.9 | 약 2.8 | 약 0.5 |
[실험예 2-7] 비타민 D의 함량에 따른 효과 비교
| 비교예 34 | 비교예 35 | 비교예 36 | 비교예 37 | 비교예 38 | 실시예 1 | |
| 비타민 C | 1.8중량% | 2중량% | 5중량% | 5.2중량% | 7중량% | 약 3.7 중량% |
| OD595 | 약 2.4 | 약 0.8 | 약 0.5 | 약 1.9 | 약 2.8 | 약 0.5 |
[실험예 3] 코마룸 파루스트레와의 병용에 따른 충치 개선 효과 확인
코마룸 파루스트레의 줄기를 건조하여, 약 60℃의 메탄올을 이용하여 추출물을 수득하였다. 상기 조성물과 코마룸 파루스트레의 병용에 따른 시너지 효과를 확인하기 위하여, 코마룸 파루스트레 추출물의 함량을 변화시켜가며, 실험예 1과 동일한 실험을 하였다.
| 비교예 39 | 비교예 40 | 실시예 2 | 실시예 3 | 실시예 4 | 실시예5 | 실시예 6 | 실시예7 | 비교예 41 | 비교예 42 | 실시예 1 | |
| 코마룸 파루스트레 추출물 | 0.1 중량% | 0.4 중량% | 0.5 중량% | 2.5중량% | 5 중량% | 10 중량% | 15 중량% | 20 중량% | 21 중량% | 25 중량% | - |
| 균주 | 5 중량% | 5 중량% | 5 중량% | 5중량% | 5 중량% | 5 중량% | 5 중량% | 5 중량% | 5 중량% | 5 중량% | 5 중량% |
| OD595 | 약 0.6 | 약 0.5 | 약 0.2 | 약 0.1 | 약 0.01 | 약 0.2 | 약 0.3 | 약 0.3 | 약 0.7 | 약 1.0 | 약 0.5 |
상기 표 9를 보면, 코마룸 파루스트레 추출물을 0.5 중량% 이상으로 병용 투여할 때, 개선된 충치 개선 효과가 있음을 확인할 수 있었고, 특히, 균주와 동량인 5 중량%로 병용될 때, 균주만 사용하는 경우와 비교하여 약 50배 이상 우수한 충치 개선 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 다만, 추출물이 20 중량%를 초과하여 병용 시에는 시너지 효과가 거의 없고, 특히 25 중량%로 포함될 때는 오히려, 균주만 포함되는 조성물에 비하여 충치 개선 효과가 상대적으로 떨어짐을 확인할 수 있었다.
[수탁번호]
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC10650BP
수탁일자 : 20040604
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC10678BP
수탁일자 : 20040806
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC10679BP
수탁일자 : 20040806
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC10680BP
수탁일자:20040806
아래는 기탁증의 원문과 그 한글 번역문이다.
Claims (10)
- 하기 수학식 1로 표현되는 충치 유발균의 바이오필름 형성 억제능이 65% 이상인 바이셀라 사이베리아(Weissella cibaria) 균주, 그 배양물, 그 파쇄물 또는 그 추출물을 유효성분으로 포함하는, 충치 예방 또는 개선용 조성물:<수학식 1>충치 유발균의 바이오필름 형성 억제능(%)=100×[0.5% 자당이 첨가된 Tryptic soy broth(TSB-S)와 0.5% 자당이 첨가된 MRS broth(MRS-S)가 동량 섞인 배지에 충치 유발균만을 5.0×106 CFU/ml씩 접종하고, 37℃에서 24시간 배양한 후 측정한 바이오필름 농도(OD595)-충치 유발균과 바이셀라 사이베리아를 TSB-S와 MRS-S가 동량 섞인 배지에 각각 5.0×106 CFU/ml씩 접종하고, 37℃에서 24시간 배양한 후 측정한 바이오필름 농도(OD595)]/TSB-B와 MRS-S가 동량 섞인 배지에 충치 유발균만을 5.0×106 CFU/ml씩 접종하고, 37℃에서 24시간 배양한 후 측정한 바이오필름 농도(OD595).
- 제1항에 있어서,상기 충치 유발균은, 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)를 포함하는, 충치 예방 또는 개선용 조성물.
- 제1항에 있어서,상기 조성물은, 충치 유발균의 치면상의 바이오필름 형성을 억제하는 것인, 충치 예방 또는 개선용 조성물.
- 제1항에 있어서,상기 조성물은,비타민 또는 그 유도체를 더 포함하고,상기 조성물은, 조성물 총 중량을 기준으로,바이셀라 사이베리아 균주, 그 배양물, 그 파쇄물 또는 그 추출물을 1~10 중량%로 포함하고,비타민 또는 그 유도체를, 1~7 중량%로 포함하는, 충치 예방 또는 개선용 조성물.
- 제4항에 있어서,상기 비타민은, 조성물 총 중량을 기준으로,0.1~1 중량%의 비타민 B; 2~5 중량% 비타민 C, 및 0.01~0.1 중량%의 비타민 D를 포함하는, 충치 예방 또는 개선용 조성물.
- 제5항에 있어서,상기 비타민 B는 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B5 및 비타민 B6를 포함하고,상기 비타민 B1과 비타민 B2는 각각 조성물 총 중량을 기준으로, 0.01~0.1 중량%로 포함되고,상기 비타민 B3는 조성물 총 중량을 기준으로, 0.1~0.6 중량%로 포함되고,상기 비타민 B5는 조성물 총 중량을 기준으로, 0.05~0.2 중량%로 포함되며,상기 비타민 B6는 조성물 총 중량을 기준으로, 0.01~0.1 중량%로 포함되는, 충치 예방 또는 개선용 조성물.
- 제4항에 있어서,상기 조성물은, 코마룸 파루스트레(Comarum palustre) 추출물을 더 포함하는, 충치 예방 또는 개선용 조성물.
- 제7항에 있어서,상기 코마룸 파루스트레 추출물은,조성물 총 중량을 기준으로, 0.5~20 중량%로 포함되는, 충치 예방 또는 개선용 조성물.
- 제1항에 있어서,상기 바이셀라 사이베리아 균주는,바이셀라 사이베리아 CMU(수탁번호: KCTC 10650BP), 바이셀라 사이베리아 CMS-1(수탁번호: KCTC 10678BP), 바이셀라 사이베리아 CMS-2(수탁번호: KCTC 10679BP), 및 바이셀라 사이베리아 CMS-3(수탁번호: KCTC 10680BP)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는, 충치 예방 또는 개선용 조성물.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,상기 조성물은, 식품 또는 약학 조성물인, 충치 예방 또는 개선용 조성물.
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