KR20060056996A

KR20060056996A - 구취를 억제하는 유산균

Info

Publication number: KR20060056996A
Application number: KR1020067003472A
Authority: KR
Inventors: 오종석
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2004-08-25
Filing date: 2005-04-12
Publication date: 2006-05-25
Also published as: WO2006022471A1; KR100605992B1; US20060045870A1; US7250162B2

Abstract

본 발명은 구취(halitosis, oral malodor)를 억제하는 신규한 유산균에 관한 것으로, 휘발성 유황화합물을 생성하는 혐기성세균과 결합하여 호기성 및 혐기성 상태에서 과산화수소를 생성함으로써 혐기성세균을 억제하는 신규한 웨이쎌라속 (genus Weissella)의 유산균에 관한 것이며, 이러한 신규한 세균은 구강에 자연적으로 존재하는 유산균중에서 분리, 동정하여 웨이쎌라 시바리아 (Weissella cibaria) CMU (수탁번호: KCTC 10650BP), 웨이쎌라 시바리아 CMS-1 (수탁번호: KCTC 10678BP), 웨이쎌라 시바리아 CMS-2 (수탁번호: KCTC 10679BP), 웨이쎌라 시바리아 CMS-3 (수탁번호: KCTC 10680BP)로 명명되어 기탁되었다. 이와 같은 웨이쎌라속 시바리아 균주를 통하여 치아에 부식을 일으키지 않으면서 구취 발생 혐기성세균을 효과적으로 억제시킬 수 있는 유산균 및 이를 이용한 식품을 제공할 수 있게 되었다.

구취, 유산균, 혐기성세균, 휘발성 유황화합물, 웨이쎌라 시바리아

Description

구취를 억제하는 유산균{Lactic acid bacteria inhibiting halitosis}

본 발명은 인체 구강으로부터 구취를 억제하는 신규한 세균에 관한 것이다. 더욱 구체적으로 본 발명은 사람의 구강 등에 정상적으로 존재하는 미생물중에서 분리한 신규한 유산균에 관한 것이다. 이들 유산균은 휘발성 유황화합물을 생성하는 대표적인 혐기성세균과 결합하고 호기성 및 혐기성 상태에서 과산화수소를 생성하여 혐기성세균을 억제하는 신규한 웨이쎌라속(genus Weissella)의 유산균에 관한 것이다.

구취는 구강 및 인접기관으로부터 유래되는 냄새를 말하며 많은 사람들이 구취로 일상 생활에 불편을 호소하고 있다. 구취의 85-90%가 구강에서 유래하며 특히 혀의 뒷쪽에서 유래하고 있다. 구취의 주요 성분은 휘발성 유황화합물인데 휘발성 유황화합물의 전체양중 90%가 시스테인으로부터 만들어지는 황화수소 (hydrogen sulfide)와 메치오닌으로부터 만들어지는 메틸머캡탄(methyl mercaptan)이다. 이러한 성분들은 혐기성세균에 의해 생성되며, 혀의 뒷쪽이 가장 중요한 서식지가 된다. 이 부위는 타액에 의해 세정작용이 잘 되지않고 많은 작은 함몰이 있어 세균이 지속적으로 살아가는 장소가 된다. 혐기성세균에 의한 휘발성 유황화합물 생성이 구취의 원인으로 가장 중요하지만, 그 외 충치와 치주염 등과 같은 구강 질환에 의해서도 발생한다. 시스테인으로부터 황화수소를 만드는 세균은 펩토스트렙토코커스(Peptostreptococcus)속, 유박테리움(Eubacterium)속, 세레노모나스(Selenomonas)속, 센티페다(Centipeda)속, 박테로이드스(Bacteroides)속, 푸소박테리움 (Fusobacterium)속이며, 메치오닌으로부터 메틸머캡탄을 만드는 세균은 푸소박테리움속, 박테로이드스속, 포피로모나스(Porphyromonas)속, 유박테리움속이 있다. 특히 구취 환자의 구강에서 많이 발견되는 세균은 푸소박테리움 뉴크레아툼(Fusobacterium nucleatum), 프레보텔라 인터미디아(Prevotella intermedia), 포피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)이다. 전에는 박테로이드스속과 포피로모나스속은 프레보텔라(Prevotella)속과 함께 같은 속으로 알려질 정도로 비슷한 세균들이다. 구취를 발생시키는데 많은 종류의 혐기성세균이 관여하지만, 구취 발생의 대표적인 세균은 푸소박테리움 뉴크레아툼과 포피로모나스 진지발리스이다.

구취를 억제하기 위해서는 구취의 주성분인 휘발성 유황화합물을 생성하는 혐기성세균의 증식을 억제하는 것이 가장 효과적이기 때문에, 종래에는 혀로부터 세균의 증식기질을 제거하기 위해 혀 세정기(tongue scraper)를 사용하여 설태를 제거하거나, 혐기성세균의 증식이나 혐기성세균에 의한 휘발성 유황화합물 생성을 억제하기 위하여 염화아연(zinc chloride)과 같은 금속염 또는 알콜이나 클로르헤시딘 (chlorhexidine)과 같은 소독제를 사용하였다. 그러나, 이러한 금속염이나 소독제는 구취를 발생시키는 혐기성세균뿐만 아니라 구강내 다른 미생물까지도 발생을 억제하며, 이러한 물질은 식도로 삼키지 않기 때문에 구취 발생에 있어서 중요한 장소인 혀의 뒷쪽까지 가지 못하고 구강 앞쪽에서 주로 가글링되고 입밖으로 뱉어내어 진다. 그래서, 구취 발생 혐기성 세균의 주요한 증식 장소인 혀 뒤쪽까지는 소독할 수 없다는 문제점이 있다. 또한, 이러한 물질은 타액에 의해서 희석되고 타액과 함께 식도로 삼켜져 구강에서의 효과는 20분 내지 2시간 정도뿐이고, 그 후 구강에는 미생물이 다시 증식하여 구취가 발생하게 된다. 따라서, 구취를 감소시키기 위하여 사용되고 있는 금속염이나 소독제는 그 효과가 단기간에 불과하다.

그래서, 최근에는 유산균을 이용하여 실험관에서 혐기성 셰균의 증식을 억제하고자 하는 시도가 있었다. 유산균은 탄수화물을 발효하여 최종 대사산물로 유산을 생산하는 세균을 말하는바, 유산균은 인간과 동물의 구강 및 소화관에 존재하며 통상적으로 김치 또는 요구르트 등 발효식품의 제조과정에 활용되고 있는 것이다. 식품에 활용되는 유산균으로는 엔테로코커스(Enterococcus)속, 락토버실러스 (Lactobacillus)속, 락토코커스(Lactococcus)속, 류코노스톡(Leuconostoc)속, 스트렙토코커스(Streptococcus)속, 웨이쎌라속 등이 있다. 그러나, 이러한 유산균은 상기 유산균을 구강에 투여하면 금속염이나 소독제와 같이 타액에 의해 희석이 되면서 식도로 바로 삼켜져 구강에 잔류하기가 어렵다는 문제점이 있다. 또한, 락토버실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토버실러스 카세이 (Lactobacillus casei), 락토버실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius)와 같은 유산균은 강산을 만들어 실험관에서 혐기성세균의 증식을 억제할 수 있으나, 정상인의 구강에서는 타액의 완충작용으로 유산균이 만든 강산이 중화되어 다른 세균의 증식을 억제하기 어렵다. 더구나 강산은 치아 우식증을 일으키기 때문에 이러한 세균을 구강에 장기간 투여하면 구강 위생에 좋지 않다는 문제점이 있다.

본 발명자는 상기와 같은 문제점을 해결하고자, 구취를 발생하는 혐기성세균을 억제하는 유산균을 구강에 정착케 하고자 하였다. 본 발명은 호기성상태 및 혐기성상태에서 휘발성 유황화물을 생성하는 혐기성 세균과 결합하여 과산화수소를 생성하도록 하는 유산균을 제조하고자 하였다.

이제까지는 유산균이 구강에 있게 되면 유산을 생산하여 치아를 부식케 하기 때문에 그 역할이 부정적으로 생각하였다. 그러나 본 발명에 따른 유산균은 유산을 적게 생성하여 산도가 높지 않아 치아에 부식을 일으키지 않으면서도 구취 발생 혐기성세균을 억제하여 구취를 억제할 수 있기 때문에, 금속염이나 소독제와는 완전히 다른 작용 기전으로 구취를 발생하는 혐기성 세균을 억제하고자 하는 데에 목적이 있다. 뿐만 아니라 본 발명에 따른 유산균을 식품용 유산균제제로 제조하여 마시거나 먹게함으로써, 구강의 뒷부분을 통과하기 때문에 혀의 뒷쪽에도 정착하여 증식하면서 구취 발생 혐기성세균의 증식을 억제할 수 있게 하고자 함이다.

본 발명은 이와 같은 목적을 달성하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명에 따른 유산균은 카탈레이스(catalase) 생성 음성이고, 25^oC 내지 42^oC에서 자라며, 휘발성 유황화물을 생성하는 혐기성 세균과 결합하여 호기성상태 및 혐기성상태에서 과산화수소를 생성하는 웨이쎌라 시바리아(Weissella cibaria)균에 관한 것이다.

자세하게, 본 발명에 따른 상기 웨이쎌라 시바리아균은 유산을 적게 생성하여 산도가 높지 않아 치아에 부식을 일으키지 않으면서, 구취 발생 혐기성 세균과 결합하는 것을 특징으로 하는 웨이쎌라 시바리아 유산균이다. 또한, 본 발명은 구취를 발생하는 혐기성세균과 결합하고 호기성 및 혐기성 상태에서 과산화수소를 발생시키는 웨이쎌라속 유산균인 웨이쎌라 시바리아 CMU KCTC 10650BP에 관한 것임을 특징으로 한다. 이외에, 본 발명에 따른 다른 웨이쎌라 시바리아 유산균은 웨이쎌라 시바리아 CMS-1 KCTC 10678BP이거나 웨이쎌라 시바리아 CMS-2 KCTC 10679BP 또는 웨이쎌라 시바리아 CMS-3 KCTC 10680BP에 관한 것이다.

본 발명의 다른 특징으로는 이와 같은 웨이쎌라속 시바리아 유산균을 단독 또는 혼합 사용하여, 휘발성 유합화물을 생성하는 혐기성 세균을 억제하도록 유산균 제재로 제조하여 마시거나 먹게된 형태일 수 있고, 이는 상기 유산균이 구강의 뒷부분을 통과하기 때문에 혀의 뒷쪽에도 정착하여 증식하면서 구취 발생 혐기성 세균의 증식을 억제하도록 제조된 식품이다.

또한, 본 발명은 위와 같은 웨이쎌라속 시바리아 유산균을 구취발생에 중요한 혐기성세균과의 결합 여부 및 과산화수소 생성 여부를 검사하고, 구취를 억제하는 유산균을 분리, 동정하는 방법에 관한 것임을 특징으로 한다. 이와 같은 방법은 유산균 시료를 엠알에스(MRS) 배지에 1일간 배양하고 원심분리(6,000 rpm, 10min, 4^oC)하여, 0.85% 식염수에 1회 세척한 후 부유하는 단계, 시험관에 부유액 1 ml씩 가하여 10초간 섞고 37^oC, 110 rpm으로 30분간 교반한 후, 3분간 실온에 방치하는 단계, 상기 방치한 시험관 중에서 상청액이 투명한 유산균을 선택하는 단계, 상기 선택된 유산균중 과산화수소를 생성하는 균주를 분리하기 위하여, 엠알에스 고체 배지에 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(tetramethylbenzidine) 0.25 mg/ml와 퍼옥시데이즈(peroxidase) 0.01 mg/ml를 첨가하여 만든 배지에 유산균 배양액 3 μl씩 접종하여 파란 집락 형성 여부를 검사하는 단계, 혐기성 상태와 호기성 상태에서 과산화수소를 생성하는 유산균을 분리하는 단계 및 상기 분리된 유산균주를 16S rRNA 유전자 분석으로 동정하는 단계를 거치는 것으로 하여 웨이쎌라 시바리아 유산균을 분리, 동정하는 방법이다.

본 발명자들은 사람의 구강에 자연적으로 존재하는 유산균을 채취, 분리하여 혐기성세균에 대한 억제효과 실험 및 실제 임상학적 실험을 통하여 연구한 결과, 웨이쎌라 시바리아 유산균이 구취를 현저히 억제한다는 사실을 확인하였다. 본 발명에서 구취 발생을 억제하는 균주를 웨이쎌라 시바리아 CMU, 웨이쎌라 시바리아 CMS-1, 웨이쎌라 시바리아 CMS-2, 웨이쎌라 시바리아 CMS-3로 명명하고 이 균주들을 2004년 6월 4일과 8월 6일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였다(웨이쎌라 시바리아 CMU 수탁번호: KCTC 10650BP, 웨이쎌라 시바리아 CMS-1 수탁번호: KCTC 10678BP, 웨이쎌라 시바리아 CMS-2 수탁번호: KCTC 10679BP, 웨이쎌라 시바리아 CMS-3 수탁번호: KCTC 10680BP).

본 발명에 따른 유산균은 대표적인 구취 발생 혐기성세균인 푸소박테리움 뉴크레아툼이나 포피로모나스 진지발리스와 같은 세균과 결합이 바로 일어나기 때문에, 본 발명의 유산균을 구강에 투여하면 푸소박테리움 뉴크레아툼이나 포피로모나스 진지발리스와 같은 세균과 결합이 일어나면서 호기성상태 뿐만 아니라 혐기성상태에서도 과산화수소를 생성하여 결합된 혐기성세균을 억제할 수 있다. 특히 혐기성세균은 혐기성 상태에서 증식하고 대사활동이 일어나므로 혐기성 상태에서의 과산화수소 생성이 이러한 혐기성세균을 억제하는데 있어서 중요하다.

본 발명에 따른 유산균의 균주의 형태 및 생리학적 특징을 기술하면 다음과 같다. 본 발명에 따라 구취 발생을 억제하는 유산균 균주인 웨이쎌라 시바리아 CMU, 웨이쎌라 시바리아 CMS-1, 웨이쎌라 시바리아 CMS-2 및 웨이쎌라 시바리아 CMS-3는 유산균중 웨이쎌라속에 속하는 것으로, 엠알에스 배지에서 증식되고 그람 양성 단간균이다. 카탈레이스(catalase) 생성 음성이고, 25^oC, 35^oC, 42^oC에서 자라며, 휘발성 유황화물을 생성하는데 주요한 혐기성 세균과 결합하여 호기성상태 및 혐기성상태에서 과산화수소를 생성하여 파란 집락을 형성하였다. 또한, 본 발명에 따른 유산균들은 아라비노스(L-arabinose), 아미그달린(amygdalin), 셀로비오스(cellobiose), 에스쿨린(esculin), 과당(fructose), 갈락토스(galactose), 젠티오비오스(gentiobiose), 그루코네이트(gluconate), 그루코스아민(N-acetyl-glucosamine), 포도당(glucose), 말토스(maltose), 만노스(mannose), 살리신(salicin), 자당(sucrose), 자이로스(D-xylose)와 같은 탄수화물을 분해할 수 있는 분해능을 가지고 있다.

본 발명자들은 사람의 구강에 자연적으로 존재하는 유산균을 채취, 분리하여 혐기성세균에 대한 억제효과 실험 및 실제 임상학적 실험을 통하여 연구한 결과, 웨이쎌라 시바리아 유산균이 구취를 현저히 억제한다는 사실을 확인하였다. 본 발명에서 구취 발생을 억제하는 균주를 웨이쎌라 시바리아 CMU, 웨이쎌라 시바리아 CMS-1, 웨이쎌라 시바리아 CMS-2, 웨이쎌라 시바리아 CMS-3로 명명하고 이 균주들을 2004년 6월 4일과 8월 6일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였다(웨이쎌라 시바리아 CMU 수탁번호: KCTC 10650BP, 웨이쎌라 시바리아 CMS-1 수탁번호: KCTC 10678BP, 웨이쎌라 시바리아 CMS-2 수탁번호: KCTC 10679BP, 웨이쎌라 시 바리아 CMS-3 수탁번호: KCTC 10680BP).

본 발명에 따른 유산균의 균주의 형태 및 생리학적 특징을 기술하면 다음과 같다. 본 발명에 따라 구취 발생을 억제하는 유산균 균주인 웨이쎌라 시바리아 CMU, 웨이쎌라 시바리아 CMS-1, 웨이쎌라 시바리아 CMS-2 및 웨이쎌라 시바리아 CMS-3는 유산균중 웨이쎌라속에 속하는 것으로, 엠알에스 배지에서 증식되고 그람 양성 단간균이다. 카탈레이스(catalase) 생성 음성이고, 25^oC, 35^oC, 42^oC에서 자라며, 휘발성 유황화물을 생성하는데 주요한 혐기성 세균과 결합하여 호기성상태 및 혐기성상태에서 과산화수소를 생성하여 파란 집락을 형성하였다. 또한, 본 발명에 따른 유산균들은 아라비노스(L-arabinose), 아미그달린(amygdalin), 셀로비오스(cellobiose), 에스쿨린(esculin), 과당(fructose), 갈락토스(galactose), 젠티오 비오스(gentiobiose), 그루코네이트(gluconate), 그루코스아민(N-acetyl-glucosamine), 포도당(glucose), 말토스(maltose), 만노스(mannose), 살리신(salicin), 자당(sucrose), 자이로스(D-xylose)와 같은 탄수화물을 분해할 수 있는 분해능을 가지고 있다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 구취 발생억제를 위한 신규한 유산균을 분리 동정하는 공정과 분리된 세균의 실제 임상실험공정으로 구성된다. 이하, 본 발명 구취 억제용 신규한 유산균에 대하여 실시예와 사용예를 통하여 상세히 설명하면 다음과 같다. 본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예1 : 본 발명에 따른 유산균의 분리, 동정

먼저, 본 발명자들은 사람의 구강으로부터 유산균 시료를 3,000주를 채취하여 혐기성세균인 푸소박테리움 뉴크레아툼과의 결합되는 정도를 보기 위하여, 유산균을 엠알에스(MRS) 배지에, 그리고 푸소박테리움 뉴크레아툼 ATCC 10953은 1% 효모추출물, 5 μg/ml 헤민 (hemin), 1 μg/ml 비타민 K₁이 첨가된 브레인 하트 인퓨전(brain heart infusion) 배지에 각각 1일간 배양하고 원심분리하여(6,000 rpm, 10min, 4^oC), 0.85% 식염수에 1회 세척한 후 부유하였다. 그리고, 시험관에 부유액 1 ml씩을 가하여 10초간 섞고 37^oC, 110 rpm으로 30분간 교반한 후, 3분간 실온에 방치하였다. 이렇게 검사한 유산균중 상청액이 투명한 유산균을 선택하였다. 상기 선택된 유산균 중에서 과산화수소를 생성하는 균주를 분리하기 위하여 엠알에스 고체배지에 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(tetramethylbenzidine) 0.25 mg/ml과 퍼옥시데이즈(peroxidase) 0.01 mg/ml를 첨가하여 만든 배지에 유산균 배양액 3 μl씩 접종하여 파란 집락 형성 여부를 검사하였다. 이어서, 푸소박테리움 뉴크레아툼과 결합이 즉시 일어나며 혐기성 상태와 호기성 상태에서 과산화수소를 생성하는 유산균 4주를 분리하였다. 분리된 유산균 4주에 대한 동정은 16S rRNA 유전자 분석으로 하였는데, 유산균 4주 모두 웨이쎌라 시바리아로 동정되었다.

실시예2 : 휘발성 유황화합물을 생성하는 혐기성세균과 본 발명에 따른 유산균 및 표준 유산균의 상호결합과 과산화수소 생성 실험

표준 유산균인 엔테로코거스 피칼리스(Enterococcus faecalis ATCC 29212), 락토버실러스 카세이(Lactobacillus casei ATCC 334), 락토버실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus ATCC 4356), 락토버실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum ATCC 14931), 락토버실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius ATCC 11742), 스트렙토코커스 오랄리스(Streptococcus oralis ATCC 35037), 스트렙토코커스 살리바리우스, 웨이쎌라 콘푸사(Weissella confusa ATCC 10881), 웨이쎌라 김치(Weissella kimchi CHJ3), 웨이쎌라 시바리아(Weissella cibaria CCUG41967) 및 본 발명에 따라 상기 실시예1에서 분리, 동정된 유산균 4주와 휘발성 유황화합물을 생성하는 구강내 주요 혐기성 세균인 푸소박테리움 뉴크레아툼과 포피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis A7A1-28)와의 결합되는 정도를 알아보기 위한 실험을 진행하였다. 먼저, 푸소박테리움 뉴크레아툼은 1% 효모추출물, 5 μg/ml 헤민, 1 μg/ml 비타민 K₁이 첨가된 브레인 하트 인퓨전 배지에 1일간 배양하였고, 포피로모나스 진지발리스는 0.5% 효모추출물, 5 μg/ml 헤민, 1 μg/ml 비타민 K₁이 첨가된 브레인 하트 인퓨전 배지에 2일간 배양하였으며, 유산균은 엠알에스 배지 또는 브레인 하트 인퓨전 배지에 1일간 배양하여, 이를 원심분리하고(6,000 rpm, 10min, 4^oC), 1회 세척한 후 타액과 성분이 비슷한 완충액(0.021 M Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, 36 mM NaCl, 0.96 mM CaCl₂, pH 7.3)에 부유하였다. 그리고, 시험관에 상기 유산균 및 혐기성세균 부유액을 각각 1 ml씩 단독 또는 병합으로 가하여 10초간 섞고 37^oC, 110 rpm으로 30분간 교반한 후, 3분간 실온에 방치하였다.

여기서, 30분간 교반하기 전과 교반한 후의 상청액 0.5 ml를 취하였고, 분광광도계(spectrophotometer) 660nm 파장에서 배지의 흡광도(absorbance; optical density)를 측정하였다. 혐기성 상태 및 호기성 상태에서의 과산화수소 생성 여부를 보기 위하여 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘과 퍼옥시데이즈를 첨가하여 만든 배지에 유산균 배양액 3 μl씩 접종하여 파란 집락 형성 여부를 검사하였다.

하기 표 1은 표준 유산균 및 본 발명 유산균과 주요 휘발성 유황화합물 생성 혐기성세균과의 상호결합 및 과산화수소 생성 실험의 결과를 나타낸 것이다.

유 산 균	FN ^* 과의 결합시 흡광도 ____________________ 0분 30분	PG ^ 와의 결합시 흡광도** ____________________ 0분 30분	과산화수소 생성 __________________ 혐기상태 호기상태
엔테로코커스 피칼리스	1.238 0.707	0.963 0.485	- -
락토버실러스 카세이	1.883 1.103	1.857 0.681	- -
락토버실러스 애시도필러스	1.829 1.485	1.713 1.368	- -
락토버실러스 퍼멘툼	1.717 1.608	1.565 1.233	- -
락토버실러스 살리바리우스	1.974 0.547	2.028 1.430	- +
스트렙토코커스 오랄리스	1.340 0.489	1.441 1.176	- +
스트렙토코커스 살리바리우스	1.531 0.192	1.608 0.238	- -
웨이쎌라 콘푸사	1.824 1.017	1.532 1.338	- -
웨이쎌라 김치	1.817 1.652	1.689 1.434	- +
웨이쎌라 시바리아 CCUG 41967	1.790 1.517	1.680 1.368	+ +
웨이쎌라 시바리아 CMU	1.854 0.363	1.783 0.067	+ +
웨이쎌라 시바리아 CMS-1	1.861 0.382	1.731 0.808	+ +
웨이쎌라 시바리아 CMS-2	1.864 0.308	1.781 0.154	+ +
웨이쎌라 시바리아 CMS-3	1.871 0.418	1.707 0.725	+ +

^*FN : 푸소박테리움 뉴크레아툼

^**PG : 포피로모나스 진지발리스

상기의 표 1에서와 같이 유산균과 혐기성세균과의 상호결합 실험 및 과산화수소 생성 실험에서, 표준 유산균 모두 혐기성 상태에서는 과산화수소를 생성하지 못하였으나, 웨이쎌라 시바리아만 혐기성 및 호기성 상태에서 과산화수소를 생성한 것으로 확인되었다. 그러나, 웨이쎌라 시바리아 표준균주인 웨이쎌라 시바리아 CCUG 41967는 본 발명 유산균에 비하여 푸소박테리움 뉴크레아툼이나 포피로모나스 진지발리스와 상호결합이 일어나지 않아 30분간 교반한 후 상청액 흡광도는 1.517과 1.368로 높았다. 본 발명에 따른 유산균과 푸소박테리움 뉴크레아툼 병합시 상청액 흡광도는 1.854, 1.861, 1.864, 1.871에서 30분간 교반한 후 0.363, 0.382, 0.308, 0.418로 감소하였고, 본 발명에 따른 유산균과 포피로모나스 진지발리스를 병합시 상청액 흡광도는 1.783, 1.731, 1.781, 1.707에서 30분간 교반한 후 0.067, 0.808, 0.154, 0.725로 감소하여, 웨이쎌라 시바리아 표준균주인 웨이쎌라 시바리아 CCUG 41967은 본 발명에 따른 유산균 4주와 차이를 보였다. 본 발명에 따른 유산균 4주만이 혐기성 및 호기성 상태에서 과산화수소를 생성하고 주요 휘발성 유황화합물 생성 혐기성세균과 상호결합이 잘 일어남을 알 수 있다.

실시예3 : 본 발명에 따른 유산균 및 표준 유산균의 인체 구강에서의 구취억제 실험

실시예2에서 나타난 표준 유산균과 본 발명 유산균의 구취억제에 대한 임상학적인 효과를 확인하기 위하여 인체를 대상으로 구강의 휘발성 유황화합물, 특히 황화수소, 메틸머캡탄, 황화디메틸 (dimethyl sulfide)의 농도를 측정하는 오랄크로마(Oralchroma^(R) , 타가사고, 일본)를 사용하여 측정하였다. 각 개인에서 구강의 휘발성 유황화합물 농도는 양치질 여부, 식사시기, 시간, 스트레스 여부 등에 따라 많은 차이를 보이나, 새벽에는 대개 일정한 수치를 보여 이 수치를 대조군으로 삼았다. 먼저 평상시와 같이 아침에 일어나 음식이나 음료수를 섭취하거나 양치질을 하지 않고 오랄크로마로 구강의 휘발성 유황화합물 농도를 3일간 반복하여 측정, 평균하여 이를 대조군으로 삼았다. 구강 휘발성 유황화합물 생성에 대한 유산균의 억제 정도를 검사하기 위하여 점심 식사와 저녁 식사후 양치질하고 난 다음 30분 후에 증류수 15 ml에 부유된 10⁹개의 유산균주를 입안에 넣고 1분간 가글링하고 1분간 머금고 있다가 삼켰다. 다음날 아침 음식이나 음료수를 섭취하거나 양치질하지 않고 오랄크로마로 구강의 휘발성 유황화합물 농도를 세차례 반복하여 측정하였다. 다시 전날과 같이 점심 식사와 저녁 식사후 양치질을 한 다음 30분 후에 증류수 15 ml에 부유한 10⁹개의 분리균주를 입안에 넣고 1분간 가글링하고 1분간 머금고 있다가 삼켰다. 다음날 아침 음식이나 음료수를 섭취하거나 양치질을 하지 않고 오랄크로마로 구강의 휘발성 유황화합물 농도를 세차례 반복하여 측정하였다.

하기 표 2는 본 발명에 따른 유산균의 구강 투여시의 구취 억제효과를 나타낸 것이다.

투여균주	구취 억제율 (구취감소자/피검자) _________________________________________________ 투여 1일째 투여 2일째 합계
웨이쎌라 시바리아 CMU	52.9% (37/70) 17.1% (12/70) 70.0% (49/70)
웨이쎌라 시바리아 CMS-1	54.5% (6/11) 18.2% (2/11) 72.7% (8/11)
웨이쎌라 시바리아 CMS-2	50.0% (5/10) 10.0% (1/10) 60.0% (6/10)
웨이쎌라 시바리아 CMS-3	40.0% (4/10) 30.0% (3/10) 70.0% (7/10)

상기의 표 2에서와 같이 웨이쎌라 시바리아 CMU를 음용한 70명의 피검자중 휘발성 유황화합물 농도가 대조수치에서 1일만에 50% 이상 감소한 사람은 37명(52.9%)이었고, 2일만에 50% 이상 감소한 사람은 12명(17.1%) 으로 총 49명(70.0%)이 감소하였으며, 감소되지 않은 사람은 21명(30.0%)이었다. 웨이쎌라 시바리아 CMS-1을 음용한 11명의 피검자중 8명(72.7%), 웨이쎌라 시바리아 CMS-2을 음용한 10명의 피검자중 6명(60.0%),웨이쎌라 시바리아 CMS-3을 음용한 10명의 피검자중 7명(70.0%)에서 대조수치에서 50% 이상 감소하였다. 특히, 오랄크로마로 측정시 휘발성 유황화합물 농도가 1000 ppb 이상으로 구취가 심한 사람 11명에서 웨이쎌라 시바리아 CMU를 음용한 1일만에 50% 이상 감소한 사람은 8명이었고, 2일만에 50% 이상 구취가 감소한 사람은 2명으로 합계 10명(90.9%)에서 구취가 감소한 것으로 나타나, 본 발명 유산균 균주는 구취가 심한 사람에서 더욱 효과가 있었다. 그러나 표준 유산균을 각각 3명의 피검자에게서 검사한 결과, 모든 표준 유산균에서 구취 억제효과를 볼 수 없었다. 따라서 본 발명에 따른 유산균 4균주에서만이 임상적으로 구취 억제 효과가 있었다.

이하에서는 본 발명에 따른 신규한 유산균 균주를 식품에 적용하여 구취 발생억제제의 사용예를 설명한다.

사용예1 : 요구르트 제품

요구르트 제조회사에 의뢰하여 통상적으로 제조되는 요구르트 제조과정에서 본 발명 유산균주 배양물을 발효직전 0.1부피% 첨가하여 기존 균주와 혼합발효시켜 요구르트를 제조하여 패널리스트 10명에게 시음한 결과 기존제품(대조군)과 향미의 차이를 발견할 수 없다고 응답하였다. 또 요구르트 제조과정의 밀봉전에 본 발명 유산균주를 0.2부피%를 첨가하여 밀봉 제품화한 실험군과 본 발명 유산균주를 첨가하지 않은 대조군제품을 패널리스트 10명에게 시음시킨 결과 양제품간의 향미의 차이가 없다고 응답하였다.

사용예2 : 김치 제품

배추 5포기를 4-5cm로 썰어서 소금물에 절인 후 세척하고 탈수하였다. 여기에 양념을 첨가한 후 숙성온도 20^oC에서 3일간 숙성하였다. 자연 숙성된 상기 김치에 본 발명 유산균주 배양물 0.2중량% 첨가한 군과 무첨가군(대조군)을 각각 식탁에 제공하여 패널리스트 10명에게 시식시킨 결과 김치 향미의 차이를 느끼지 못한다고 응답하였다.

사용예3 : 버터 제품

통상의 방법으로 제조한 버터제품의 포장전에 본 발명 유산균 균주 동결건조품 0.2중량%를 혼합한 후 포장제품화하여 시식에 제공하였다. 패널리스트 10명에게 시식시킨 결과 버터 제품의 향미에는 차이가 없다고 응답하였다.

사용예4 : 껌 제품

통상의 방법으로 제조한 껌제품의 포장전에 본 발명 유산균 균주 동결건조품 0.2중량%를 혼합한 후 포장제품화하여 시식에 제공하였다. 패널리스트 10명에게 제공한 결과 껌 제품에서 향미의 차이를 느끼지 못한다고 응답하였다.

이와 같이, 본 발명에 따른 유산균을 이용한 신규한 음료나 식품을 직접 식용화하게 하므로써 혐기성 세균에 과산화수소를 발새하게 하여 휘발성 유황화물의 발생을 억제하고 더 나아가 구취발생을 예방할 수 있는 것이다.

본 발명의 사용예는 명세서에 기재된 식품외에도 치이즈, 쇼트닝, 아이스크림, 마가린 등 어떠한 식품에도 적용하였으며 본 발명의 권리 범위는 이들 식품에만 한정되지 않는다.

더불어서, 본 발명에 따른 구취 억제 유산균주 웨이쎌라 시바리아 CMU KCTC 10650BP, 웨이쎌라 시바리아 CMS-1 KCTC 10678BP, 웨이쎌라 시바리아 CMS-2 KCTC 10679BP 및 웨이쎌라 시바리아 CMS-3 KCTC 10680BP에 대하여 안정성 검사를 실시하였는바, 이하에서 설명한다.

본 발명에 따른 구취 억제 유산균주의 안정성 검사

본 발명에 따른 구취 억제 유산균주에 대하여 안전성 검사를 실시하였고, 먼저, 혈액 한천배지(blood agar)에 분리균주를 접종하고 37^oC에서 24시간 배양한 결과, 분리균주 모두 β-용혈을 보이지 않았다. 젤라틴 배지(gelatin media)를 만들어 분리균주를 접종하고 35^oC에서 6주간 배양한 결과에서도, 젤라틴은 액화되지 않았다.

다음으로, 본 발명에 따른 유산균주의 유해 대사산물 생산 여부를 검사하였는데, 먼저 암모니아 생성여부를 보기 위하여 유레아 한천배지(urea agar)에 분리균주를 접종하고 37^oC에서 12시간 배양한 결과 분리균주 모두 배지 색깔 변화가 없는 음성이었으며, 인돌 생성여부를 보기 위하여 트립토판 배지(tryptophan media)에 분리균주를 접종하고 37^oC에서 18시간 배양하고 코박스 용액(Kovac's reagent)를 5방울 가한 결과 분리균주 모두 배지 색깔 변화가 없는 음성이었고, 페닐알라닌(phenylalanine)으로부터 탈아민되어 페닐피루빅산(phenylpyruvic acid) 생성여부를 보기 위하여 페닐알라닌 한천배지(phenylalanine agar)에 분리균주를 접종하고 37^oC에서 24시간 배양하고 10% 염화 제이철 용액(ferric chloride)를 5방울 가한 결과 분리균주 모두 배지 색깔 변화가 없는 음성이었다.

이어서, 분리세균의 유해효소 생성 여부를 검사하였는데, 먼저 β-글루쿠로니드 분해효소(β-glucuronidase) 생성여부를 보기 위하여 0.1 M 인산완충용액(sodium phosphate buffer, pH 6.0)에 ρ-니트로페닐-β-D-글루쿠로니드(ρ-nitrophenyl-β-D-glucuronide)를 0.2% 되도록 녹인 것을 같은양의 분리세균 현탁액과 섞어 37^oC에서 16시간 반응시킨 결과 분리균주 배양액 모두 노랑색으로 변하지 않은 음성이었다. 7α-디하이드로실레이스(7α-dehydroxylase) 생성여부를 보기 위하여 0.1 M 인산완충용액에 콜릭산(cholic acid)와 케노디오식콜릭산(chenodeoxycholic acid)을 0.016% 되도록 녹인 것을 분리세균 현탁액에 첨가하여 37^oC에서 30분간 반응시키고 6 N 염산용액 3방울을 첨가하여 효소반응을 정지시킨 다음, 에틸 초산염(ethyl acetate)로 3번 추출하여 질소가스로 건조시킨 후, 박막 크로마토그라피(thin-layer chromatography, TLC)를 실시하였다. 박막 크로마토그라피는 TLC판 아래에 샘플당 20 μl씩 올려놓고 건조시킨 다음, 전개용액으로 전개시키고 40^oC에서 10분간 건조한 후, 50% 황산을 뿌리고 180^oC에서 2분간 처리하였는데, 분리균주 모두에서 콜릭산이 디옥시콜릭산(deoxycholic acid)으로, 케노디오식콜릭산이 리토콜릭산 (lithocholic acid)으로 전환되지 않았다. 니트로리덕테이스(nitroreductase) 생성여부를 보기 위하여 분쇄한 분리세균 상등액에 4-니트로안식향산(4-nitrobenzoic acid)과 삼염화초산(trichloroacetic acid)를 첨가하여 37^oC에서 한시간 반응시킨 결과 분리균주 모두 빨강색으로 변하지 않은 음성이었다. 혈소판 응집여부를 보기 위하여 혈소판이 많이 든 혈장에 분리세균과 혈소판 응집반응 촉발제인 ADP를 첨가하여 혈소판 응집 정도를 측정한 결과, 분리균주 모두 혈소판 응집반응 음성이었다.

이와 같이, 본 발명에 따른 구취 억제 유산균은 유해 대사산물 생산 여부 검사 및 분리세균의 유해효소 생성 여부 검사와 같은 안정성 검사에 있어서, 모두 음성으로 나타나 안전한 것으로 확인되었다.

이와 같이, 휘발성 유황화합물 생성 혐기성세균과의 상호 결합실험 및 인체 구강에서의 구취 억제 실험으로 확인된 본 발명에 따른 신규한 유산균 균주는 구취 억제 효과를 가지므로, 치의학 산업상 매우 유용한 것이다. 본 발명에 따르는 경우, 호기성상태 및 혐기성상태에서도 휘발성 유황화물을 생성하는 혐기성 세균과 결합하여 과산화수소를 생성하는 유산균을 제조하였고, 이를 통하여 구취 발생 혐기성세균을 억제하는 유산균을 구강에 정착케 할 수 있었다.

이러한 본 발명에 따른 유산균은 유산을 적게 생성하여 산도가 높지 않아 치아에 부식을 일으키지 않으면서도 구취 발생 혐기성세균을 억제하여 구취를 억제할 수 있는 것이다. 이밖에도, 본 발명에 따른 신규한 유산균 균주를 식품에 활용하여 마시거나 먹게함으로써, 구강의 뒷부분을 통과하기 때문에 혀의 뒷쪽에도 정착하여 증식하면서 구취 발생 혐기성세균의 증식을 억제할 수 있으므로 식품산업 및 건강의학상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

카탈레이스(catalase) 생성 음성이고, 25^oC 내지 42^oC에서 자라며, 휘발성 유황화물을 생성하는 혐기성 세균과 결합하여 호기성상태 및 혐기성상태에서 과산화수소를 생성하는 웨이쎌라 시바리아(Weissella cibaria)균.
제 1항에 있어서, 상기 웨이쎌라 시바리아균은 유산을 적게 생성하여 산도가 높지 않아 치아에 부식을 일으키지 않으면서, 구취 발생 혐기성 세균과 결합하는 것을 특징으로 하는 웨이쎌라 시바리아 유산균.
제 1항 또는 제2항에 있어서, 웨이쎌라 시바리아 유산균은 웨이쎌라 시바리아 CMU KCTC 10650BP, 웨이쎌라 시바리아 CMS-1 KCTC 10678BP, 웨이쎌라 시바리아 CMS-2 KCTC 10679BP 또는 웨이쎌라 시바리아 CMS-3 KCTC 10680BP인 것을 특징으로 하는 웨이쎌라 시바리아 유산균.
제 3항에 따른 웨이쎌라 시바리아 유산균을 식품용 유산균 제재로 제조하여 마시거나 먹게함으로써, 상기 유산균이 구강의 뒷부분을 통과하기 때문에 혀의 뒷쪽에도 정착하여 증식하면서 구취 발생 혐기성 세균의 증식을 억제하도록 제조된 식품.
유산균 시료를 엠알에스(MRS) 배지에 1일간 배양하고 원심분리(6,000 rpm, 10min, 4^oC)하여, 0.85% 식염수에 1회 세척한 후 부유하는 단계,

시험관에 부유액 1 ml씩 가하여 10초간 섞고 37^oC, 110 rpm으로 30분간 교반한 후, 3분간 실온에 방치하는 단계,

상기 방치한 시험관 중에서 상청액이 투명한 유산균을 선택하는 단계,

상기 선택된 유산균중 과산화수소를 생성하는 균주를 분리하기 위하여, 엠알에스 고체 배지에 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(tetramethylbenzidine) 0.25 mg/ml와 퍼옥시데이즈(peroxidase) 0.01 mg/ml를 첨가하여 만든 배지에 유산균 배양액 3 μl씩 접종하여 파란 집락 형성 여부를 검사하는 단계,

혐기성 상태와 호기성 상태에서 과산화수소를 생성하는 유산균을 분리하는 단계 및

상기 분리된 유산균주를 16S rRNA 유전자 분석으로 동정하는 단계,

를 거치어 제3항에 따른 웨이쎌라 시바리아 유산균을 분리, 동정하는 방법.