KR19990086509A - 인체 구강내 혐기성 세균을 억제하는 유산균 - Google Patents

인체 구강내 혐기성 세균을 억제하는 유산균 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인체 구강내 치은염(gingivitis)과/또는 치주염(periodontitis) 및 그에 따른 구취(halitosis, malodor)를 발생시키는 혐기성 세균을 억제하는 신규한 유산균 락토바실러스속 V20(Lactobacillus spp.V20) 균주와 과산화수소를 생성하는 유산균 및 이 유산균을 함유하는 식품과 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 인체 구강내 치은염과/또는 치주염 및 그에 따른 구취를 발생시키는 혐기성 세균의 성장을 강력하게 억제하는 스트렙토코쿠스속 균주와 인체에서 분리, 동정한 신규한 유산균 락토바실러스속 V20 균주를 각종 식품에 첨가하여 구강내 치은염과/또는 치주염 및 그에 따른 구취를 억제하는 식품 및 약학적 조성물을 제공하는 효과가 있다.

Description

인체 구강내 혐기성 세균을 억제하는 유산균
본 발명은 인체 구강내 치은염 (gingivitis)과/또는 치주염 (periodontitis) 및 그에 따른 구취 (halitosis, malodor)를 발생시키는 혐기성 세균을 억제하는 유산균에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 인체에서 정상적으로 존재하는 미생물 중 과산화수소 (H2O2)를 생산하여 구강내 치은염과/또는 치주염을 일으키는 모든 혐기성 세균을 억제하는 신규한 락토바실러스속 (Lactobacillus spp.)균주와 과산화수소를 생산하는 스트렙토코쿠스속에 속하는 유산균 및 이 유산균을 함유한 식품에 관한 것이다.
유산균은 보통 젖산균이라고도 칭하는데 탄수화물을 발효하여 최종 대사산물로 유산을 생산하는 세균을 일컫는다. 유산균은 인간과 동물의 구강 및 소화관이나 김치, 유제품과 같은 발효식품에 존재한다. 인간은 오래 전부터 발효유, 치즈, 발효빵과 같은 식품제조에 유산균을 이용하였고 의약품과 같은 생물학적 활성물질의 생산에도 이들을 이용하여 왔다. 유산균에 속하는 세균들로는 구균으로 스트렙토코쿠스속 (Streptococcus spp.), 엔테로코쿠스속 (Enterococcus spp.), 락토코쿠스속 (Lactococcus spp.), 간균으로 락토바실러스속 (Lactobacillus spp.), 비피도박테리움속 (Bifidobacterium spp.) 등이 있다. 이중에서 식품에 이용되는 대표적인 유산균으로는 스트렙토 서머필러스 (Str. thermophilus), 엔테로 파에칼리스 (E. faecalis), 엔테로 두란스 (E. durans), 락토코쿠스 락티스 (Lactococcus lactis), 락토바실러스 애시도필러스 (Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 불가리쿠스 (Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 카세이 (Lactobacillus casei), 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) 등이 있다. 이들 유산균은 그람 양성균으로서 동물의 장내에 서식하면서 사람이나 동물이 섭취한 탄수화물을 분해하여 유산 및 항생물질을 생산하여 장내 유해균의 발육을 억제함으로써 장내의 건강 유지에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
치은염과 치주염은 구강내 혐기성 세균에 의하여 치은조직과 치주조직에 염증이 일어나는 것이다. 치은염이 진행되어 심해지면 치주염이 되며, 두가지 모두 그람 양성 혐기성 세균에 의하여 주로 일어난다. 치은염을 일으키는데는 많은 종류의 혐기성 세균이 관여하지만 가장 중요한 혐기성 세균은 프레보텔라 인터메디아 (Prevotella intermedia)와 푸조박테리움 누크레아툼 (Fusobacterium nucleatum)이며, 치주염을 일으키는데도 많은 종류의 혐기성 세균이 관여하나 가장 중요한 혐기성 세균은 포피로모나스 진지발리스 (Porphyromonas gingivalis), 악티노바실러스 악티노마이세템코미탄스 (Actinobacillus actinomycetemcomitans), 프레보텔라 인터메디아, 푸조박테리움 누크레아툼 등이 있다 (Contemporary Oral Microbiology and Immunology, Mosby-Year Book, St. Louis, 1992). 이러한 혐기성 세균들은 또한 황화수소 (hydrogen sulphide)와 메틸 메르카프탄 (methyl mercaptan) 등과 같은 휘발성 유황 혼합물 (volatile sulfur compound)을 생산함에 따라 구취가 발생하게 된다 (Persson, S., et al., 1990). 치은염의 경우에는 스케일링에 의하여 염증 조직을 제거할 수 있으나, 치주조직 깊숙히 염증이 일어난 치주염의 경우에는 수술을 하여 염증 부위를 제거하여 치료한다.
본 발명자들은 인체로부터 분리한 유산균이 과산화수소 (H2O2)를 생성하여 치은염과/또는 치주염 및 그에 따른 구취를 일으키는 혐기성 세균을 억제하므로써 치은염과 치주염을 개선하거나 예방할 뿐만 아니라, 그에 따른 구취를 감소시킴을 발견하였다. 과산화수소는 소독제로 사용되고 있는데, 그 작용 기전은 효소의 기능을 나타내는 -SH기를 산화된 -S-S- 형태로 전환시킴으로서 효소를 불활화시켜 세균을 죽이게 하는 것이다. 과산화수소를 생성하는 스트렙토코쿠스속에는 스트렙토코쿠스 오랄리스 (Streptococcus oralis), 스트렙토코쿠스 미티어 (Streptococcus mitior), 스트렙토코쿠스 미티스 (Streptococcus mitis), 스트렙토코쿠스 산구이스 (Streptococcus sanguis) 등이 해당되며 유산을 만들기 때문에 유산균 범주에 넣고 있다 (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology vol. 2: Williams & Wilkins, Baltimore, London, Los Angeles, Sydney, 1986).
따라서 본 발명의 목적은 상기와 같은 사실을 감안하여 안출한 것으로 과산화수소 (H2O2)를 생성하여 치은염과/또는 치주염 및 그에 따른 구취를 일으키는 혐기성 세균을 억제하여 치은염과/또는 치주염 및 그에 따른 구취를 개선하거나 또는 예방하는 신규한 유산균을 제공함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 과산화수소 (H2O2)를 생성하여 치은염과/또는 치주염 및 그에 따른 구취를 일으키는 혐기성 세균을 억제하여 치은염과/또는 치주염 및 그에 따른 구취를 개선하거나 또는 예방하는 신규한 유산균이 함유된 식품 및 약학적 조성물을 제공함에 있다.
본 발명의 상기 목적은 과산화수소를 생성하는 유산균을 인체로부터 분리, 동정하고 균학적 특성을 조사한 후 분리, 동정한 상기 신규한 유산균과 과산화수소를 발생한다고 보고된 스트렙토코쿠스속 균주가 치은염과/또는 치주염 및 그에 따른 구취를 일으키는 혐기성 세균의 증식을 억제하는지를 조사하였다. 이어서, 분리, 동정한 신규한 유산균을 요구르트, 김치, 버터, 치이즈, 아이스크림, 껌, 쇼트닝, 및 마가린 등의 식품에 첨가하거나 냉동 건조시켜 패널테스트를 실시하므로써 달성하였다.
이하, 본 발명의 구성 및 작용을 상세히 설명하고자 한다.
본 발명은 인체에서 유산균 시료를 채취하여 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 디하이드로크로라이드 (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine dihydrochloride)와 호스라디쉬 퍼옥시다아제 (horseradish peroxidase)가 함유된 배지에서 배양하여 과산화수소를 생성하는 유산균 분리단계; 분리한 유산균을 동정하고 형태학적 및 생화학적 특성을 조사한 후 락토바실러스속 V20 (Lactobacillus spp.V20)으로 명명하는 단계; 신규 유산균 락토바실러스속 V20을 치은염과/또는 치주염 및 그에 따른 구취을 일으키는 혐기성세균과 함께 혼합 배양하면서 혐기성 세균의 증식억제 효과를 조사하는 단계; 상기 유산균 락토바실러스속 V20 균주와 같은 방법으로 과산화수소를 생성하는 스트렙토코쿠스속 균주의 혐기성 세균증식 억제효과를 조사하는 단계 및; 신규 유산균 락토바실러스속 V20을 요구르트, 김치, 버터, 치이즈, 김치, 아이스크림, 껌, 쇼트닝 및 마가린에 각각 첨가하거나 냉동 건조시켜 패널테스트를 실시하는 단계로 구성된다.
이하 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 인체로부터 과산화수소를 생성하는 유산균 분리
인체에서 유산균 시료를 채취하여 브레인 하트 인퓨젼 한천배지 (Brain Heart Infusion agar)에 도말한 다음 항온기에서 37℃로 16시간 배양한 후 분리한 세균들의 과산화수소 생성 여부를 검사하였다. 브레인 하트 인퓨젼 한천배지에는 0.25mg/mL의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 디하이드로크로라이드(3,3',5,5'- tetramethylbenzidine dihydrochloride; Sigma. St Louis, IL, USA)와 0.01mg/mL의 호세라디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase; Sigma. St Louis, IL, USA)를 첨가하였고 여기에 분리한 유산균을 접종하여 37oC 탄산가스 배양기에서 18시간 배양한 후, 관찰하였다. 실험결과, 과산화수소를 생성하는 세균의 집락은 푸른색을 나타냈고 이 균주를 선발하여 분리하였다.
실시예 2: 분리 유산균의 동정
상기 실시예 1에서 분리한 유산균을 다양한 온도에서 배양하면서 생화학적 및 형태학적 특성을 조사하고 당분해능이 있는지를 조사하였다. 실험결과, 표 1에는 분리한 유산균의 동정결과를 정리하였고 표 2에는 당분해능을 정리하였다.
신규 유산균의 형태 및 생리적 성질
특 성 락토바실러스 속 V20
형태 간균, 연쇄상
그람염색 양성
포자 형성능 -
카탈레이즈 유무 -
배양온도 10℃ -
배양온도 45℃ +
pH 9.6 -
40% 담즙산 -
6.5% NaCl -
엠알에스 배지에서 증식 +
신규한 유산균 균주의 당분해능
탄수화물(당)의 종류 락토바실러스속 V20
아라비노스(Arabinose) -
아미그달린(Amygdalin) -
셀로비오스(Cellobiose) +
에스쿨린(Esculin) +
과당(Fructose) +
갈락토스(Galactose) +
포도당(Glucose) +
유당(Lactose) +
말토스(Maltose) +
만니톨(Mannintol) -
만노스(Mannose) +
멜레지토스(Melezitose) -
라피노스(Raffinose) -
람노스(Rhamnose) -
살리신(Salicin) -
솔비톨(sorbitol) -
트레할로스(Trehalose) +
본 발명자들은 동정한 상기 유산균을 락토바실러스속 V20 (Lactobacillus spp. V20)으로 명명하고 한국과학기술연구원 생명공학연구소 유전자원센터 유전자은행에 1997년 7월 30일자로 기탁번호 KCTC 0361BP로 기탁하였다.
실시예 3: 락토바실러스속 V20 균주의 혐기성 세균 증식억제효과 조사
신규 유산균 락토바실러스속 V20 균주는 엠알에스 액체배지에서 24시간 배양하고; 치은염과/또는 치주염의 원인 세균인 포피로모나스 진지발리스, 프레보텔라 인터메디아, 푸조박테리움 누크레아툼은 각각 혐기성 세균 배양 액체배지 (1ℓ당 브레인 하트 인퓨젼 배지 18.5g, 효모추출물 5.0g, 헤민용액 10mL <1mL의 1N 소디움 하이드록시 용액에 50mg 헤민을 녹이고 100mL 되도록 증류수 첨가>, 비타민 K 용액 0.2mL <0.15mL 비타민 K 용액을 30mL의 95% 에타놀과 혼합>)에 접종하고 혐기성 배양기에서 36시간 배양하고; 악티노바실러스 악티노마이세템코미탄스 균주는 티에스비브이 (TSBV) 배지 (1ℓ당 트립틱 소이 브로스 (Tryptic Soy Broth) 30g, 효모추출물 1.0g, 말혈청 100mL, 75mg의 바시트라신 (Bacitracin), 5mg의 반코마이신 (Vancomycin))에 접종하고 혐기성 배양기에서 36시간 배양하였다. mL당 1.4 X 108농도의 신규 유산균 락토바실러스속 V20 균주 배양액과 각 혐기성 세균 배양액 0.1mL를 3.7mL의 혐기성 세균 배양 배지나 티에스비브이 배지와 0.3mL의 엠알에스 액체배지을 합한 배지에 각각 또는 혼합 접종하여 36시간 혐기성 배양기에서 배양하였다. 배양 후, 배양액을 희석하여 엠알에스 한천배지와 혐기성 세균 배양 한천배지나 티에스비브이 한천배지상에 접종하였다. 이때, 혐기성 세균 배양 한천배지는 혐기성 세균 배양 액체배지에 1.5% 한천과 3% 양혈액을 첨가하였고 이 배지에 포피로모나스 진지발리스, 프레보텔라 인터메디아, 푸조박테리움 누크레아툼을 접종하였으며 티에스비브이 한천배지는 티에스비브이 배지에 1.5% 한천을 첨가하여 악티노바실러스 악티노마이세템코미탄스를 접종하였다. 접종 72시간 후, 락토바실러스속 V20 균주의 생균수와 각 혐기성 세균의 생균수를 검사하였다. 실험결과, 락토바실러스속 V20 균주와 각 혐기성 세균을 단독 배양한 경우에는 집락의 숫자가 모두 증가하였으나, 락토바실러스속 V20 균주와 각 혐기성 세균 혼합 배양한 경우에는 각 혐기성 세균의 집락이 전혀 형성되지 않았다. 이때 대조군으로 과산화수소를 생성치 않은 락토바실러스 카세이 (Lactobacillus casei)를 혐기성 세균과 혼합 배양한 경우에는 혐기성 세균의 집락수 감소가 크지 않았다. 이를 표 3에 정리하였다.
신규 유산균 락토바실러스속 V20 균주와 혐기성 세균과의 혼합 배양시 생균수
접 종 세 균 배양 후락토바실러스 생균수( /mL) 배양 후혐기성세균 생균수( /mL)
락토바실러스속 V20 8.2 x 108
락토바실러스 카세이 9.0 x 108
포피로모나스 진지발리스 1.9 x 108
악티노바실러스 악티노마이세템코미탄스 2.0 x 108
프레보텔라 인터메디아 1.8 x 108
푸조박테리움 누크레아툼 1.8 x 108
락토바실러스속 V20 +포피로모나스 진지발리스 8.0 x 108 0
락토바실러스속 V20 +악티노바실러스 악티노마이세템코미탄스 8.8 x 108 0
락토바실러스속 V20 +프레보텔라 인터메디아 8.9 x 108 0
락토바실러스속 V20 +푸조박테리움 누크레아툼 7.8 x 108 0
락토바실러스 카세이 +포피로모나스 진지발리스 9.1 x 108 1.5 x 108
락토바실러스 카세이 +악티노바실러스 악티노마이세스세템코미탄스 9.3 x 108 1.8 x 108
락토바실러스 카세이 +프레보텔라 인터메디아 8.9 x 108 1.6 x 108
락토바실러스 카세이 +푸조박테리움 누크레아툼 9.8 x 108 1.6 x 108
실시예 4: 과산화수소 생성 스트렙토코쿠스속의 혐기성 세균 증식억제효과 조사
과산화수소 생성 스트렙토코쿠스속 균주들은 M17 액체배지에서 24시간 배양하고 치은염과/또는 치주염의 원인 세균인 포피로모나스 진지발리스, 프레보텔라 인터메디아, 푸조박테리움 누크레아툼은 각각 혐기성 세균 배양 액체배지에 접종하고, 악티노바실러스 악티노마이세템코미탄스 균주는 티에스비브이 배지에 접종하고 혐기성 배양기에서 36시간 배양하였다. 실시예 3과 같이 혼합배지를 만들어 과산화수소 생성 스트렙토코쿠스속 배양액과 혐기성 세균 배양액을 단독 또는 혼합 접종하여 36시간 혐기성 배양기에서 배양하였다. 배양 후, 혐기성 세균 배양 한천배지와 티에스비브이 한천배지상에 접종하여 72시간 배양하였다. 과산화수소 생성 스트렙토코쿠스속과 각 혐기성 세균 혼합 배양한 경우에는 각 혐기성 세균의 집락이 전혀 형성되지 않았다.
실시예 5: 락토바실러스속 V20 균주를 첨가한 식품의 패널테스트
본 발명의 신규한 유산균 락토바실러스속 V20 균주를 다양한 종류의 식품에 적용한 후 각 식품을 패널리스트 10명이 시식하도록하여 패널테스트를 실시하였다.
실험예 1 : 요구르트 제품 패널테스트
요구르트 제조회사에 의뢰하여 통상적으로 제조되는 요구르트 제조과정에서 본 발명의 신규 유산균 락토바실러스속 V20 균주 배양물을 발효직전 0.1부피%의 양으로 첨가하고 기존 균주와 혼합발효시켜 요구르트를 제조하였다. 제조한 요구르트를 패널리스트 10명에게 시음시킨 결과 기존제품 (대조군)과 향미의 차이를 발견할 수 없다고 응답하였다. 또, 요구르트 제조과정중 밀봉전에 신규 유산균 락토바실러스속 V20 균주 배양물을 0.2부피%의 양으로 첨가하여 밀봉 제품화한 실험군과 본 발명 유산균 락토바실러스속 V20 균주 배양물을 첨가하지 않은 대조군 제품을 패널리스트 10명에게 시음시킨 결과 양제품간의 향미의 차이가 없다고 응답하였다.
실험예 2 : 버터제품 패널테스트
통상의 방법으로 제조한 버터제품의 포장전에 본 발명의 신규 유산균 락토바실러스속 V20 균주 배양물의 동결건조품 0.2중량%를 혼합한 후 포장 제품화하고 시식에 제공하여 패널리스트 10명에게 시식시킨 결과 기존의 버터와 향미의 차이를 느끼지 못한다고 응답하였다.
실험예 3 : 치이즈제품 패널테스트
통상의 방법으로 제조한 치이즈제품의 포장전에 본 발명 신규 유산균 락토바실러스속 V20 균주 배양물의 동결건조품 0.2중량%를 혼합한 후 포장제품화하고 시식에 제공하여 패널리스트 10명에게 시식시킨 결과 기존의 치이즈와 향미의 차이를 느끼지 못한다고 응답하였다.
실험예 4: 아이스크림 패널테스트
아이스트림 제조과정에서 본 발명의 신규 유산균 락토바실러스속 V20 균주 배양물의 동결건조품 0.2중량%를 포장 제품화하기 전에 아이스크림에 첨가하였다. 제조한 아이스크림을 패널리스트 10명에게 시식시킨 결과 기존 아이스크림 제품 (대조군)과 향미의 차이가 없다고 응답하였다.
실험예 5: 껌 패널테스트
껌 제조과정에서 본 발명의 신규 유산균 락토바실러스속 V20 균주 배양물을 재료 혼합시에 0.05부피%의 양으로 첨가하여 껌을 제조하였다. 제조한 껌을 패널리스트 10명에게 시식시킨 결과 기존제품 (대조군)과 향미의 차이가 없다고 응답하였다.
실험예 6: 쇼트닝 패널테스트
통상의 방법으로 제조한 쇼트닝에 본 발명의 신규 유산균 락토바실러스속 V20 균주 배양물을 0.2중량% 혼합한 후 포장 제품화하고 이 쇼트닝으로 음식물을 조리한 후 조리한 요리를 패널리스트 10명에게 시식시킨 결과 기존의 쇼트닝으로 조리한 요리와 향미의 차이가 없다고 응답하였다.
실험예 7: 마가린 패널테스트
통상의 방법으로 제조한 마가린제품의 포장전에 본 발명의 신규 유산균 락토바실러스속 V20 균주 배양물의 동결건조품 0.2중량%를 혼합한 후 포장 제품화하고 시식에 제공하여 패널리스트 10명에게 시식시킨 결과 기존의 마가린과 향미의 차이를 없다고 응답하였다.
실험예 8 : 김치제품 패널테스트
배추 5포기를 4 ~ 5㎝로 썰어서 소금물에 절인후 세척하고 탈수하였다. 여기에 파, 생강, 마늘, 고춧가루, 젓갈 등의 양념재료로 별도 제조한 양념을 첨가한 후 숙성온도 20℃에서 3일간 숙성하였다. 자연 숙성된 상기 김치에 본 발명 신규 유산균 락토바실러스속 V20 균주 배양물 각 0.2 중량%를 첨가한 군과 무첨가군 (대조군)을 각각 식탁에 제공하여 패널리스트 10명에게 시식시킨 결과 김치 향미의 차이를 느끼지 못한다고 응답하였다.
실험예 9 : 냉동 건조 상태
본 발명 신규 유산균 락토바실러스속 V20 균주 배양물을 냉동 건조시켜 다른 냉동 건조된 균주나 물질을 혼합하여 캡슈물 (capsule), 정제 (tablet), 작은 포장 단위로 만들었다. 냉동 건조화하여 제품화한 실험군과 본 발명 유산균 락토바실러스속 V20 균주 배양물을 첨가하지 않은 대조군 제품을 패널리스트 10명에게 시음시킨 결과 양제품간의 향미의 차이가 없다고 응답하였다.
본 발명은 상기 실시예와 실험예를 통하여 설명한 바와 같이 인체로부터 분리한 과산화수소 생성 유산균과 스트렙토코쿠스 속 균주가 인체 구강내 치은염과/또는 치주염 및 그에 따른 구취를 발생시키는 혐기성 세균의 성장을 강력하게 억제하는 뛰어난 효과가 있고 또 신규 유산균 락토바실러스속 V20 균주를 각종 식품에 첨가하고 패널테스트한 결과 식품의 향미가 양호한 효과가 있으므로 인체 구강 보건위생상 및 식품산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (8)

  1. 인체 구강내 치은염 (gingivitis)과/또는 치주염 (periodontitis) 및 그에 따른 구취 발생 혐기성세균을 억제하는 유산균.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 인체 구강내 치은염 (gingivitis)과/또는 치주염 (periodontitis) 및 그에 따른 구취 발생 혐기성 세균을 과산화수소 (H2O2)를 생산하여 억제함을 특징으로 하는 유산균.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 인체 구강내 치은염과/또는 치주염 및 그에 따른 구취 발생 혐기성 세균을 억제하는 유산균이 락토바실러스속 V20(Lactobacillus spp. V20) 균주(KCTC 0361BP) 또는 스트렙토코쿠스속 균주임을 특징 하는 유산균.
  4. 유산균 락토바실러스속 V20 균주 또는 스트렙토코쿠스속 균주의 치은염과/또는 치주염 및 그에 따른 구취 발생 억제제로서의 용도.
  5. 유산균 락토바실러스속 V20 균주 또는 스트렙토코쿠스속 균주를 사용하여 제조한 치은염과/또는 치주염 및 그에 따른 구취발생 억제용 식품.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 치은염과/또는 치주염 및 구취 발생 억제용 식품이 요구르트, 버터, 치이즈, 아이스크림, 껌, 쇼트닝, 마가린, 김치임을 특징으로 하는 식품.
  7. 유산균 락토바실러스속 V20 균주 또는 스트렙토코쿠스속 균주를 사용하여 제조한 치은염과/또는 치주염 및 그에 따른 구취 발생 억제용 약제학적 조성물.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 유산균 락토바실러스속 V20 균주 또는 스트렙토코쿠스속 균주를 사용하여 제조한 치은염과/또는 치주염 및 구취 발생 억제용 약제적 조성물이 캡슐(Capsule), 정제(tablet), 작은 포장단위임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
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