KR100845034B1 - 충치균 성장을 억제하는 항균제를 생성하는 락토바실루스파라플란타룸 ｋｎｕｃ25로부터 제조된 충치균 항균제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 충치균 성장을 억제하는 항균제를 생성하는 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25로부터 제조된 충치균 항균제에 관한 것으로, 김치 유래 신규 유산균인 락토바실루스 파라플란타룸(Lactobacillus paraplantarum) KNUC25에 의해 생성되는 배양액 및 그 배양액의 농축액은 충치균에 대해 특이적이고 우수한 항균력을 보였다. 따라서 이를 활용할 경우 충치의 치료에 있어서 항생제 처리 등에 의해서 발생하는 문제점과 부작용을 최소화할 수 있을 것이다. 또한 김치에서 유래한 유산균과 그 생산물은 건강 보조식품 또는 식품의 형태로 안전하게 장기간 섭취할 수 있으므로 충치의 예방 및 치료하는데 효과적인 것으로 주목된다. 그리고 식품 이외에도 발효제품, 의약품, 의약외품 등에 응용가능하다.

락토바실루스 파라플란타룸, 유산균, 충치균

Description

충치균 성장을 억제하는 항균제를 생성하는 락토바실루스 파라플란타룸 ＫＮＵＣ25로부터 제조된 충치균 항균제{Antibacterial activity of Lactobacillus sp. KNUC25 isolated from Kimchi}

도 1은 본 발명에 따른 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25의 주사전자현미경사진이다.

도 2는 본 발명에 따른 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25가 생산하는 항균 물질의 항균 작용을 보이는 사진으로서, (가)는 1% Lactic acid 첨가시, (나)는 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25 농축 배양 상등액 첨가시, (다)는 pH를 7.0으로 조정한 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25 농축 배양 상등액 첨가시, (라)는 1 × PBS buffer 첨가시, 그리고 (마)는 Nisin (1 mg/250 ㎕ 0.02 M HCl)첨가시를 나타낸다.

도 3은 주사전자현미경 사진들로서, (a)는 본 발명의 실험 대상균인 스트렙토코쿠스 뮤탄스 KCTC3065의 주사전자현미경사진(배율: 45k)이고, (b)는 본 발명에 따른 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25 배양 농축 상등액의 스트렙토코쿠스 뮤탄스 KCTC3065에 대한 항균 작용 주사전자현미경 사진(배율: 45k)이고, (c)는 본 발명에 따른 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25의 배양 농축 상등액을 pH 7.0으로 조정한 후 스트렙토코쿠스 뮤탄스 KCTC3065에 대한 항균 작용 주사전자현미경 사진( 배율: 45k)이다.

도 4는 본 발명에 따른 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25의 스트렙토코쿠스 뮤탄스 KCTC3065 생육 단계에 따른 항균 활성의 변화를 도시한 그래프이다.

본 발명은 락토바실루스(Lactobacillus)속의 새로운 유산균인 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25에 관한 것으로, 보다 상세하게는 김치에서 분리되었고, 충치균 성장을 억제하는 항균제를 생성하는 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25 및 이로부터 제조된 충치균 항균제에 관한 것이다.

김치는 한국의 전통 발효 식품으로 주원료인 절임 배추에 여러 가지 양념류(고춧가루, 마늘, 생강, 파 및 무 등)를 혼합하여 제품의 보존성과 숙성도를 확보하기 위하여 저온에서 젖산 생성을 통해 발효된 식품을 말한다. 김치에서 발견되는 유산균에는 류코노스톡속, 락토바실루트속, 그리고 바이쎌라속 등이 있다.

유산균은 젖산 발효에 의해 생성되는 젖산에 의해서 병원균과 유해 세균의 생육이 저지되는 성질을 유제품, 김치류, 양조식품 등의 식품 제조에 이용되고 있다. 또, 포유류의 장내에 서식하여 잡균에 의한 이상발효를 방지하여 정장제로도 이용되는 중요한 세균으로 숙주의 면역 기능을 증강시키고 장내에서 콜레스테롤의 흡수를 억제하여 심혈관 질환 예방의 가능성도 보고되고 있고, 최근에는 김치에서 분리된 유산균 중 조류 독감 바이러스에 대한 항바이러스력을 가지는 균주도 발견되었다. 이러한 결과를 바탕으로 김치에서 발견되는 유산균은 섭취의 용이성과 식품 첨가제 응용의 용이함으로 생균제(probiotic)로서의 개발이 주목받고 있다.

충치는 치아에서 가장 흔히 볼 수 있는 대표적인 질환의 하나로 치아우식증이라고 한다. 구강 내 음식물이 내산성 연쇄상 구균과 유산균에 의해 부패되고 산에 의해 치아의 성분이 파괴되는 감염성 세균성 질환이다. 우리나라에서는 영구 치아의 충치 이환율이 약 80%에 이르고, 한 사람이 평균 2-3개의 충치를 가지고 있는 것으로 보고되고 있다.

충치를 일으키는 원인은 여러 가지가 복합적으로 작용하고 있는 것으로 밝혀져 있지만 가장 중요한 것은 치태이다. 치태에는 여러 세균이 섞여 있는데, 특히 내산성 연쇄상 구균과 유산균이 많고 그 중에서 스트렙토코쿠스 뮤탄스가 주요 충치균으로 알려져 있다. 이같은 스트렙토코쿠스 뮤탄스는 치아의 표면에 부착하여 성장하면서 음식물 내의 당을 이용하여 산을 생성하여 치아를 부식시키고 동시에 치아 골세포에 침입하여 각종 치조 골 부식과 잇몸병을 발생시킨다.

한편, 치아는 한 번 파괴되면 다시 재생되지 않기 때문에 충치는 치아를 대신하는 재료로 밀봉하여 치료하고 있다. 현재 충치 예방 방법으로 칫솔질과 적절한 식이 요법을 통해 당분의 섭취를 줄이거나 자일리톨을 이용하여 충치균에 의한 산의 생성을 방지하는 방법이 있다. 또한 불소를 이용하여 산에 잘 녹지 않는 물질을 형성시키는 방법이 있다. 이 방법은 충치는 예방되지만 불소 침투층이 치아표면에서 깊이 침투하지 못하고 쉽게 소실되는 한계성을 가진다. 결과적으로 이와 같은 방법은 근본적으로 충치 유발균의 사멸이나 골세포 침입 방지의 효과는 없다.

이에 본 발명은 김치 유래로 인체에 무해하고 섭취가 용이하며 경제적으로 충치 유발균의 생육을 효과적으로 저해할 수 있는 안정한 물성의 새로운 천연 항균성 물질을 생산하는 균주인 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25에 의해 생성된 충치를 예방하고 치료할 수 있는 조성물(항균제)을 식품, 발효제품, 의약품, 의약외품으로써 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

본 발명에 의한 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25는 김치에서부터 분리되어 충치를 유발하는 스트렙토코쿠스 뮤탄스의 생육을 억제시키고 중성 pH에서 안정한 항균 활성을 나타내는 배양액을 생성하는 새로운 유산균이다.

본 발명에 따른 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25 균주는 도 1과 같이 막대 형으로 운동성이 없고, 집락의 색깔은 유백색이다.

이에, 본 발명은 항균 활성을 갖는 신규 유산균인 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25의 분리 및 동정, 나아가 본 발명에 따른 신규 유산균의 충치 유발균에 대한 항균 활성 테스트로 구성된다.

본 발명에서 사용된 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25 균주는 2006년 6월 9일자로 대한민국 특허균주 기탁기관인 한국과학기술연구소 생명공학연구소 내 유전자원센타에 기탁하여 기탁번호 KCTC 10958BP를 부여받은 바 있다.

이와같이, 충치 유발균인 분리된 스트렙토코쿠스 뮤탄스에 대한 신규 유산균의 항균 활성을 알아보기 위해 spot-on-the-lawn 테스트를 수행하였다. BHI 한천 배지에 스트렙토코쿠스 뮤탄스의 배양액을 도말하고, 그 위에 본 발명에 따른 신규 유산균인 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25 배양액의 농축상등액을 취해 접종하였다.

이를 배양하면서 스트렙토코쿠스 뮤탄스의 억제 구역 (inhibition zone) 형성을 관찰하였다. 이로써 김치 유산균 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25의 항균 활성에 의해 스트렙토코쿠스 뮤탄스의 초기 생육이 저해되는 것을 알 수 있었다.

한편, pH를 7.0으로 조정한 김치 유산균 상등액의 경우에서 그의 항균 활성 이 다소 감소하는 것을 관찰할 수 있었으나, 여전히 스트렙토코쿠스 뮤탄스의 초기 생장을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.

이때 pH 7.0인 농축상등액에서 항균 활성이 감소한 것은 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25의 항균 활성에 적합한 최적 pH가 아닌 환경이기 때문으로 사료된다.

식품, 식품 첨가물, 음료, 의약품, 의약외품의 경우도 본 발명에 의한 천연 항균제를 투입하여 항균력을 부여할 수 있다.

<실시예>

이하 실시예를 들어 본 발명을 상세히 설명한다. 하기 실시예 등은 본 발명에서 설명하고자하는 예시적인 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 사상의 범위가 변질되거나 축소되는 것은 아니고 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 사용된 시료 및 사용 균주

본 발명에서 사용된 균주는 스트렙토코쿠스 뮤탄스 표준균주 (KCTC3065)를 사용하였고, 스트렙토코쿠스 뮤탄스에 대해 항균 작용을 가지는 유산균은 김치에서 분리한 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25를 사용하였다.

[ 실시예 1] 김치 유산균의 배양액의 제조

항균 활성을 측정하기 위하여 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25균주의 배양액을 준비하였다. 250 ㎖의 MRS(Difco) 액체배지를 118℃에서 15분간 고압 멸균 후, 25℃에서 16시간 동안 배양한 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25 전배양액을 5% 접종하여 본배양하였다.

24시간 동안 정치배양한 배양액을 10,000 × g로 30분간 원심 분리한 후 pore size 0.22 μm 여과막을 이용하여 무균 상태로 준비하였다. 배양 상등액 농축의 경우 위에서 얻은 배양 상등액을 동결 건조한 후 1 × PBS buffer에 녹여 사용하였다.

또한, pH에 의한 효과를 배제하는 실험을 수행하기 위하여 동결 건조한 배양 상등액을 1 × PBS buffer와 3 M Tris buffer를 이용하여 최종 pH를 7.0으로 맞추어 농축 배양 상등액을 준비하였다.

[ 실시예 2] 충치균에 대한 농축 배양 상징액의 항균력 확인

전술한 실시예 1에 의해 얻어진 본 발명에 의한 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25의 배양 상등액에 의해 충치 원인균으로 알려진 스트렙토코쿠스 뮤탄스균의 항균력을 다음과 같은 방법을 통해 알아보았다.

(1) 대상 미생물 선정

항균력 측정을 위하여 스트렙토코쿠스 뮤탄스 KCTC3065 균주를 한국생명공학연구원 유전자은행실에서 분양 받았다. 대상균은 BHI 액체 배지에 접종하여 37℃에서 배양하여 사용하였다

(2) 대상균의 접종 및 항균력 분석

시험균주는 5 ㎖ BHI 액체 배지에 접종하여 37℃에서 하루 전배양하고 5 ㎖ BHI 액체 배지에 37℃에서 OD₆₀₀에서 0.2까지 본배양 한 후 BHI 고체 배지에 100 ㎕ 도말하였다. 도말한 고체 배지 상에 멸균 처리한 6 mm filter paper disk를 떨어뜨리고 disk위에 30배로 농축한 배양 상등액과 pH를 7.0으로 조정하고 30배로 농축한 배양 상등액 농축액을 10 ㎕씩 분주하여 37℃에서 배양하였다. Disk 주변에 나타난 억제환 생성 정도를 관찰하여 항균 활성을 알아보았다.

나이신은 스트렙토코쿠스 락티스의 발효산물로 식품이나 화장품을 부패시키는 일부 세균에 대한 항균 작용을 가지고 미국을 포함한 세계 각국에서 식품방부제로 안정성을 인정받아 널리 쓰이고 있는 박테리오신 물질이다. 본 실시예에서는 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25에 의한 항균 활성과 비교하기 위한 대조군으로 사용되었다.

도 2는 충치균의 생육 활성 억제를 나타낸 것이다. (가), (라), (마)는 각각 대조군으로서 (가)는 1% lactic acid를 분주한 것이고, (라)는 1 × PBS buffer를 분주한 상태, (마)는 Nisin(1 mg/250 ㎕ 0.02 M HCl)을 첨가한 상태이다. (나)와(다)는 각각 실험군으로서, (나)는 pH 4.5의 농축 배양 상등액이고 (다)는 pH 7.0으로 조정한 농축 배양 상등액이다.

도 2에서 보듯이, 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25가 생산하는 항균 물질은 충치원인균인 스트렙토 코쿠스의 생육을 억제하는 것으로 나타났다. pH를 7.0으로 조정한 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25의 농축 배양 상등액도 충치균의 생육을 억제하는 것으로 관찰되었다. 나이신도 충치균의 생육을 저해하는 것으로 나타났지만 그 항균 활성의 정도는 본 발명에 의한 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25의 활성보다 약하다.

한편, 도 3a는 충치균인 스트렙토코쿠스 뮤탄스 KCTC3065의 주사전자현미경 사진을 도시한 것으로, 본 발명에 의한 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25의 농축 배양 상등액에 의한 처리 전 모습이다.

도 3b는 OD₆₀₀에서 0.2까지 본배양한 스트렙토코쿠스 뮤탄스 KCTC3065에 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25의 농축 배양 상등액을 처리하고 37℃에서 4시간 동안 진탕 배양 시킨 후 세포를 고정하여 주사전자현미경으로 관찰한 결과이다.

도면 3c는 뮤탄스 균주에 pH를 7.0으로 조정한 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25의 농축 배양 상등액을 분주한 후 도면 3b의 실험과 같은 방법으로 처리하고 관찰한 주사전자현미경 사진이다.

상기 도 3(a-c)에서도 확인할 수 있듯이, 본 발명에 의한 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25가 생성하는 항균 물질은 물성이 안정되고 충치균의 생장에 직접적인 항균 활성을 가지며 기존에 사용되고 있는 항균 물질인 나이신보다 충치 유발균의 생육을 우수하게 저해하는 것으로 확인되었다.

[ 실시예 3] 충치균의 생육 단계 변화에 따른 항균 능력 확인

본 발명의 락토바실러스 파라플란타룸 KNUC25에 의한 항균 활성이 충치 원인균인 스트렙토코커스 뮤탄스의 생육 단계에 따른 영향을 다음과 같은 방법을 통해 알아보았다.

락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25의 항균 물질은 상기에 설명한 [실시예 1]의 방법에 따라 준비하여 30배 농축 배양 상등액을 사용하였다. 96 well plate에 OD₆₀₀에서 0.2 값을 갖는 스트렙토코쿠스 뮤탄스 KCTC3065 본배양액을 각 well에 100 ㎕씩 분주하였다.

본 발명의 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25의 농축 배양 상등액을 충치균이 분주된 각 well에 10 ㎕씩 처리하였다.

상기와 같은 방법으로 준비된 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25의 배양 상등액을 3 M Tris buffer로 pH를 7.0으로 조정하고, 충치균 100 ㎕가 분주되어 있는 각 well에 각각 10 ㎕씩 첨가하였다. 일정량의 농축 배양 상등액이 첨가된 충치균이 담긴 96 well plate를 37℃에서 정치 배양시키며 1시간 간격으로 580 nm 파장에서 충치균의 배양액 탁도를 측정하였다.

그 결과로서, 시간 흐름에 따라 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25에 의한 충치균의 생육 활성 저해 결과를 도 4에 도시하였다.

도 4내에서 Control은 분주된 충치균에 아무것도 첨가하지 않은 대조군이고, 나이신은 널리 쓰이고 있는 항균 물질로서 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25의 배양 농축 상등액의 항균 활성과 비교하기 위해 대조군으로 처리되었다.

도 4에서 볼 수 있듯이, 전체적으로, 모든 실험군이 스트렙토코쿠스 뮤탄스 KCTC3065의 생육을 저해하는 것이 확인되었다. 특히 pH를 조정하지 않은 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25의 농축 배양 상등액은 나이신보다도 항균 활성이 우수할 뿐만 아니라 충치균의 생육을 초기 단계부터 억제하여 충치균에 대한 효과적인 항생 효과를 가지고 있음이 확인되었다.

이상과 같이 본 발명에 의하면, 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25에 의해 생성되는 배양액 및 그 배양액의 농축액은 충치균에 대해 특이적이고 우수한 항균력을 보였다. 따라서 이를 활용할 경우 충치의 치료에 있어서 항생제 처리 등에 의해서 발생하는 문제점과 부작용을 최소화할 수 있을 것이다. 또한 김치에서 유래한 유산균과 그 생산물은 건강 보조식품 또는 식품의 형태로 안전하게 장기간 섭취할 수 있으므로 충치의 예방 및 치료하는데 효과적인 것으로 주목된다. 그리고 식품 이외에도 발효제품, 의약품, 의약외품 등에 응용가능하다.

Claims (9)

1. 충치를 유발하는 스트렙토코쿠스 뮤탄스의 생육을 억제하는 활성을 나타내고 기탁번호 KCTC 10958BP를 갖는, 락토바실루스 파라플란타룸(Lactobacillus paraplantarum) KNUC25의 배양액
2. 삭제
3. 제1항의 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25의 배양액을 유효성분으로 함유하는 항균 조성물
4. 제1항의 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25의 배양액을 유효성분을 함유하는 스트렙토코쿠스 뮤탄스 생육 억제용 음료
5. 제1항의 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25의 배양액을 유효성분을 함유하는 스트렙토코쿠스 뮤탄스 생육 억제용 식품
6. 제1항의 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25의 배양액을 유효성분을 함유하는 스트렙토코쿠스 뮤탄스 생육 억제용 식품
7. 제1항의 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25의 배양액을 유효성분을 함유하는 스트렙토코쿠스 뮤탄스 생육 억제용 발효제품
8. 제1항의 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25의 배양액을 유효성분을 함유하는 스트렙토코쿠스 뮤탄스 생육 억제용 의약품
9. 제1항의 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25의 배양액을 유효성분을 함유하는 스트렙토코쿠스 뮤탄스 생육 억제용 의약외품

Images