KR20020064871A

KR20020064871A - 락토바실러스 스피시스 에이치와이1213

Info

Publication number: KR20020064871A
Application number: KR1020020041625A
Authority: KR
Inventors: 오세종; 신정걸; 김경태; 백영진
Original assignee: 주식회사 한국야쿠르트
Priority date: 2002-07-16
Filing date: 2002-07-16
Publication date: 2002-08-10
Also published as: KR100481790B1

Abstract

본 발명은 락토바실러스(Lactobacillus)속의 새로운 유산균인 락토바실러스 스피시스 HY1213(기탁기관 : 한국미생물보존센터, 기탁일자 : 2002년3월7일, 수탁번호 : KCCM-10360)에 관한 것으로, 보다 상세하게는 내산성을 가지며, 충치원인균 및 화농균의 생육을 억제시키는 것을 특징으로 하는 새로운 유산균에 관한 것이다. 또한 본 발명은 락토바실러스 스피시스 HY1213에 의해 생성되는 항균물질과, 락토바실러스 스피시스 HY1213와 그 배양물을 포함하는 발효제품에 관한 것이다.

이러한 본 발명은 락토바실러스 스피시스 HY1213와, 락토바실러스 스피시스 HY1213에 의해 생성된 물질 및 배양물을 포함하는 제품은 내산성이 있어 인간의 위를 통과할때 사멸되지 않아, 장까지 도달하며, 장관점막에서 일시적으로 집락을 형성하여 병원성세균의 생장을 억제하고 장의 투과성을 안정화시키는 효과가 있다.

Description

락토바실러스 스피시스 에이치와이1213{LACTOBACILLUS sp. HY1213}

유산균은 자연계에 널리 존재하며 유당과 같은 탄수화물을 이용하여 젖산을 생산하는 미생물이며, 오래전부터 유산균은 직접 혹은 간접적으로 식품에 이용되어 왔다. 유산균을 이용한 식품은 대사산물인 젖산에 의하여 식품의 저장성을 향상시키며, 식품의 향미와 조직을 개선하는 장점이 있다. 발효식품을 통하여 섭취된 젖산균은 장내로 유입된 후 장내 상피세포에 착생하게 되어 병원성 미생물의 저해 및 길항작용, 면역활성의 증진, 암 발생률의 감소, 그리고 발암원인성 효소의 감소 등 숙주 동물에 많은 도움을 준다. 따라서 젖산균은 동서양을 막론하고 유제품, 육제품, 침채류 및 각종 젓갈류의 가공에 유용한 보조 수단 뿐만 아니라 생균제(probiotics)로도 이용되고 있다.

박테리오신(Bacteriocin)은 여러 종의 미생물이 생산하는 천연의 항균성 단백질(antimicrobial peptide) 또는, 단백질 계의 물질로서 일반적으로 박테리오신을 생산하는 미생물과 형태, 계통학적으로 유사한 균종에 대하여 살균(bactericidal) 기작 갖는 물질을 말한다.

박테리오신은 단백질로 이루어져 있어 인체에 섭취되는 즉시 소화기관의 단백질 가수분해 효소에 의해 분해됨으로써 인체에 무독성이고 잔류성이 없기 때문에 새로운 생물학적 보존제(biopreservative) 내지는 발효식품의 생물제어제(bioregulator)로 그 효용이 기대되고 있다.

발명자들은 유산균에 관해 연구해 오던 중 종래의 유산균에 비하여 생리적 효능이 우수하고 박테리오신을 생산하는 균주를 분리해내는데 성공하였으며, 분리한 균주인 락토바실러스 스피시스 HY1213(기탁기관 : 한국미생물보존센터, 기탁일자 : 2002년3월7일, 수탁번호 : KCCM-10360)를 제공하고자 하는 것을 그 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 락토바실러스 스피시스 HY1213에 의해 생성되는 항균물질과, 락토바실러스 스피시스 HY1213와 그 배양물을 포함하는 발효제품을 제공하는 것이다.

도1a는 본 발명에 따른 락토바실러스 스피시스 HY1213의 주사전자현미경 사진a.

도1b는 본 발명에 따른 락토바실러스 스피시스 HY1213의 주사전자현미경 사진b.

도2는 본 발명에 따른 락토바실러스 스피시스 HY1213가 생산하는 항균물질의 항균작용.

도3은 본 발명에 따른 락토바실러스 스피시스 HY1213가 생산하는 항균항균물질의 활성 변화.

(가) 대조구 효소 미첨가

(나) 트립신 10ml(1mg/ml) 첨가

(다) 키모트립신 10ml(1mg/ml) 첨가

(라) 프로나제 E 10ml(1mg/ml) 첨가

도4는 본 발명에 따른 락토바실러스 스피시스 HY1213가 생산하는 박테리오신의 전기영동.

본 발명에 의한 락토바실러스 스피시스 HY1213(기탁기관 : 한국미생물보존센터, 기탁일자 : 2002년3월7일, 수탁번호 : KCCM-10360)은, 내산성을 가지며, 스트렙토코커스 뮤탄스, 스트렙토코커스 미티스, 스트렙토코커스 소브리누스, 스트렙토코커스 안지노수스, 스트렙토코커스 파이오제네스, 스타필로코커스 오레우스, 스타필로코커스 에피더미디스, 락토바실러스 훠멘텀와 같은 충치원인균 및 화농균의 생육을 억제시키는 새로운 유산균이다.

본 발명에 따른 락토바실루스 스피시스 HY1213 균주는 도1a 및 도1b와 같이 막대형으로 운동성은 없으며, 집락의 색깔은 유백색이다.

또한 락토바실루스 스피시스 HY1213 균주의 생육 최적온도는 37℃였으며, 그람염색에 양성반응, 카탈라제에 음성반응을 나타냈으며, 산소영향에 대해서는 편성 혐기성 반응을 보였다.

락토바실루스 스피시스 HY1213 균주의 당 발효 특성은 다음 표1과 같다.

[표 1]당발효성 테스트

-----------------------------

Glycerol+

Erythritol-

D-Arabinose-

L-Arabinose-

Ribose+

D-Xylose-

L-xylose-

Adonitol-

b-methyl-xyloside-

Galactose+

D-glucose+

D-fructose+

D-manose+

L-sorbose-

Rhamnose-

Dulcitol-

Inositol-

Mannitol+

Sorbitol+

a-Methyl-D-mannoside-

a-Methyl-D-glucoside-

N-Acethyl glucosamine+

Amygdaline+

Arbutine+

Esculine+

Salicine+

Cellobiose+

Maltose+

Lactose+

Melibiose+

Saccharose+

Trehalose+

Inuline-

Melezitose+

D-Raffinose+

Amidon-

Glycogene-

Xylitol-

b-Gentibiose+

D-Turanose+

D-Lyxose-

D-Tagatose+

D-fucose-

L-Fucose-

D-Arabitol-

L-Arabitol-

Gluconate+

2-ceto-gluconate-

5-ceto-gluconate-

---------------------------------

이상의 결과를 근거로 동정한 결과, 락토바실러스 스피시스 HY1213균주는 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus)로 동정되었다.

(1) 내산성

본 발명의 락토바실러스 스피시스 HY1213를 10ml 엠알에스 액체배지에 접종하여 37℃에서 18시간 배양한 후, 이 배양액의 일정량을 다시 pH 2.0의 완충 용액에 접종하여 60분 동안 배양하였다. 배양액의 일정량을 취하여 희석용 완충용액에 일정비율로 희석하였다. 엠알에스 한천배지에 상기의 희석액을 일정량 접종한 후 37℃에서 48 시간동안 배양하여 성장한 집락수를 계수하였다. 그 결과 50% 이상의 생존율을 보였다.

(2) 충치균에 대한 생육억제 능력

㈜한국야쿠르트 중앙연구소에 보관중인 충치균과 유전자은행(KCTC)에서 분양받은 충치균 및 병원성 미생물에 대한 생육억제 능력을 알아보기 위해, 본 발명의 락토바실러스 스피시스HY1213 배양액 20 마이크로리터를 엠알에스 고체배지에 점적한후 지시균을 중층하여 생육억제 여부를 관찰한 결과, 이들 미생물의 사멸을 관찰 할 수 있었다.

이상과 같은 결과를 통해 락토바실러스 스피시스HY1213은 내산성과 병원성 미생물의 생육억제력을 가진 새로운 유산간균임을 알 수 있었다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적인 목적일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

[실시예1] 내산성 균주의 분리

김치, 발효유제품, 우유, 신생아 분변, 및 성인분변 등 다양한 원천에서 시료를 채취하여 잘 혼합한 후 2.5∼5.0g을 10배 부피의 pH 3.0 완충용액에 넣어 잘 혼합하고, HCl 원액으로 pH를 2.3으로 보정하였다. 37℃에서 2시간 동안 정치시킨 후 시료를 채취하여 희석용 완충용액으로 희석하여 락토바실러스균의 선택배지인 LBS 한천평판배지에 도말하고 37℃에서 48 시간동안 배양하였다.

배양 후 나타난 집락이 그람양성, 카탈레이즈 음성, 포자를 형성하지 않는 막대기 모양의 간균임을 확인하여 내산성을 지닌 락토바실러스로 분리하였다. 분리된 락토바실러스를 버기스메뉴얼과 탄수화물 분해실험등에 의한 동정을 통해 락토바실러스 스피시스 HY1213로 명명하였다.

[실시예2] 내산성 확인

본 발명의 락토바실러스 스피시스 HY1213을 10ml MRS 액체배지에 일정량 접종하여 37℃에서 하룻밤 동안 배양한 후, 배양액의 일정량을 pH 4.0, 3.0 및 2.0 완충용액에 각각 107 cfu/ml 정도의 초기 접종농도로 접종하였다. 37℃에서 1시간 동안 정치시킨 후 1ml를 취해 각각 희석용 생리식염수에서 희석하였다. 일정량의 희석액을 엠알에스 한천평판배지에 도말하여 37℃에서 48 시간동안 배양하여 나타난 집락수를 계수, 비교하였다. 그 결과는 다음의 표2와 같다.

[표 2]락토바실러스 스피시스 HY1213의 내산성 확인 실험

[실시예3] 병원성 미생물 생육억제 능력

본 발명의 락토바실러스 스피시스 HY1213에 의해 충치원인균으로 알려진 스트렙토코커스 뮤탄스 균의 생육억제 정도를 다음과 같은 방법을 통해 알아 보았다.

락토바실러스 스피시스 HY1213를 앰알에스 액체배지에서 37℃ 항온수조에서 18시간 배양한 다음, 원심분리 (6000 g, 30분, 4℃)를 하여 셀을 제거한 다음 pH를 7.0으로 조정하였다. 이를 0.45 마이크론 필터를 이용하여 여과시켜 얻어진 상징액을 앰알에스 고체배지와 티에스 고체배지에 각각 10 마이크로리터식 분주하여 각 충치균들을 중층하였다. 충치균이 중층된 고체배지는 각각 37℃에서 24시간 동안 배양하여 억제환 생성여부를 관찰하였다.

표3은 충치균 및 화농균들의 생육활성을 나타낸 것이다.

[표 3] 항균 활성 스펙트럼

락토바실러스 스피시스 HY1213이 생산하는 항균물질은 충치원인균 뿐만 아니라 피부화농을 일으키는 스타필로코커스 오레우스, 스타필로코커스 에피더미디스 그리고 스트렙토코커스 파이오제네스의 생육을 억제하는 것으로 나타났다.

[실시예 4] 항균물질의 특성 규명

락토바실러스 스피시스 HY1213가 생산하는 항균물질이 박테리오신임을 확인하기 위하여 단백질 분해효소로 처리하여 보았다. 도2는 락토바실러스 스피시스 HY1213을 MRS 고체배지에 접종한 후 37℃에서 24시간 배양한 후 우측상단에 프로테아제 K(1mg/ml) 1ml를 점적 한 다음 1시간 37℃에서 반응시켰다. 그 다음 충치균을 중층하여 37℃ 24시간 배양한 다음 억제환을 관찰 하였다. 도2에서 보는 바와 같이 프로테아제를 처리한 결과 우측상단부분이 분해되어 항균활성이 소실되는것을 관찰 할 수 있었다.

이번에는 락토바실러스 스피시스 HY1213을 앰알에스 액체배지에 접종한 후37℃에서 24시간 배양한 다음 원심분리(6000 g, 30분, 4℃)를 하여 셀을 제거한 다음 pH를 7.0으로 조정하였다. 이를 각 100ml씩 분주하여 단백질 분해효소(미첨가, 트립신, 키모드립신, 프로나제 E)와 반응시킨 다음 충치균이 중층된 엠17 고체배지에 100ml씩 첨가하여 37℃에서 24시간 배양하였다. 24시간 경과후에, 도3과 같이 단백질 분해효소에 의하여 억제활성이 소실되는 것으로 보아 락토바실러스 스피시스 HY1213가 생산하는 항균물질은 단백질성임을 확인할 수 있었다. (가)는 대조구로서 효소 미첨가한 상태이며, (나)는 트립신 10ml(1mg/ml) 첨가한 상태, (다)는 키모트립신 10ml(1mg/ml) 첨가한 상태, (라)는 프로나제 E 10ml(1mg/ml) 첨가한 상태이다.

[실시예5] 박테리오신의 분자량 측정

10-20% 트라이신 그래디언트 겔을 제조하여 (tricine-gradient gel) 수행하였다. 영동은 125V(constant), 80mA의 조건으로 60분간 실시하였다. 영동이 끝난 후에 gel을 절단하여 일부는 0.1% 쿠마시 불루(coomassie brilliant R250)에 의해 염색한 다음 메탄올:초산:증류수가 3:1:6의 비율로 제조된 용액으로 탈색하였다. 나머지 일부는 증류수로 3시간 투석시킨 후 지시균이 접종된 soft MRS agar를 중층하여 박테리오신 활성을 평가하였다.

실험 결과는 도4와 같으며, 락토바실러스 스피시스 HY1213가 생산하는 항균물질은 분자량 3.4 kda의 크기를 지니는 펩타이드로 확인되었다.

이상과 같이 본 발명에 의하면, 락토바실러스 스피시스 HY1213와, 락토바실러스 스피시스 HY1213에 의해 생성된 물질 및 배양물을 포함하는 제품은 내산성이 있어 인간의 위를 통과할때 사멸되지 않아, 장까지 도달하며, 장관점막에서 일시적으로 집락을 형성하여 병원성세균의 생장을 억제하고 장의 투과성을 안정화시키는 효과가 있다.

Claims

락토바실러스 스피시스 에이치와이1213(기탁기관 : 한국미생물보존센터, 기탁일자 : 2002년3월7일, 수탁번호 : KCCM-10360).
제1항에 있어서,

내산성을 갖는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 스피시스 에이치와이1213(기탁기관 : 한국미생물보존센터, 기탁일자 : 2002년3월7일, 수탁번호 : KCCM-10360).
제1항 또는 제2항에 있어서,

충치원인균 및 화농균의 생육을 억제시키는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 스피시스 에이치와이1213(기탁기관 : 한국미생물보존센터, 기탁일자 : 2002년3월7일, 수탁번호 : KCCM-10360).
제3항에 있어서,

상기 충치원인균 및 화농균은 스트렙토코커스 뮤탄스, 스트렙토코커스 미티스, 스트렙토코커스 소브리누스, 스트렙토코커스 안지노수스, 스트렙토코커스 파이오제네스, 스타필로코커스 오레우스, 스타필로코커스 에피더미디스, 락토바실러스 훠멘텀인 것을 특징으로 하는 락토바실러스 스피시스 에이치와이1213(기탁기관 : 한국미생물보존센터, 기탁일자 : 2002년3월7일, 수탁번호 : KCCM-10360).
락토바실러스 스피시스 에이치와이1213(기탁기관 : 한국미생물보존센터, 기탁일자 : 2002년3월7일, 수탁번호 : KCCM-10360)에 의해 생성된 항균물질.
락토바실러스 스피시스 에이치와이1213(기탁기관 : 한국미생물보존센터, 기탁일자 : 2002년3월7일, 수탁번호 : KCCM-10360) 및/또는 그 배양물을 포함하는 발효제품.