KR100424796B1 - 열안정성이 우수한 항균성 펩타이드를 생산하는 미생물 및 그를 이용한 항균성 펩타이드의 제조방법 - Google Patents

열안정성이 우수한 항균성 펩타이드를 생산하는 미생물 및 그를 이용한 항균성 펩타이드의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 열안정성이 우수한 항균성 펩타이드를 생산하는 신규 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주, 특히 바실러스 서브틸리스 CAU131(KCCM 10257) 및 그의 변이주, 특히 바실러스 서브틸리스 LC12(KCCM 10256), 및 그를 배양하여 그 배양물로부터 상기 항균성 펩타이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

열안정성이 우수한 항균성 펩타이드를 생산하는 미생물 및 그를 이용한 항균성 펩타이드의 제조방법{Microorganism producing a thermostable antibiotic peptide and process for preparing the antibiotic peptide using the same}
본 발명은 항균성 펩타이드를 생산하는 미생물 및 그를 이용한 항균성 펩타이드의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 열안정성이 우수한 항균성 펩타이드를 생산하는 신규 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주 및 그의 변이주, 및 그를 이용하여 상기 항균성 펩타이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.
현재 식품산업에서는 식품의 장기간 보존과 위생적 제조를 위한 천연보존제의 개발이 주요 문제로 제시되고 있다. 수 년전까지만 해도 저온저장을 통한 식품저장 및 유통이 최선책인 것으로 알려져 있었다. 그러나, 저온성 병원균인 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 등의 발견으로 인하여, 저온저장이 식품저장을 위한 완전한 수단이 아닌 것으로 밝혀졌다. 이에 따라, 식품의 위생학적 안전성을 보장하기 위한 수단으로서, 저온저장 이외에도 리스테리아와 같은 식중독균 및 식품오염 미생물과 변패 미생물에 대해 항균효과가 큰 식품보존제의 개발이 활발히 이루어지고 있다. 식품보존제는 주로 화학적 합성 보존제가 널리 사용되고 있으며, 현재 한국에서도 나프톨 유도체 등을 포함한 14 종의 화합물들이 식품에 사용할 수 있는 것으로 허용되고 있다. 그밖에도, 테트라사이클린(tetracycline)과 같은 일부 항생물질들을 식품에 사용하는 것이 검토되고 있으나, 이들 화학 식품보존제나 독성이 큰 항생물질의 사용은 소비자가 원하지 않고 있다. 따라서, 인체에 무해하고 식품과 함께 섭취시 소화효소에 의해 쉽게 분해되는 항균성 펩타이드 계열의 천연보존제에 대한 관심이 증대되고 있다. 예를들면, 니신(nisin)과 같은 항균성 펩타이드는 현재 47 개국에서 식품에 사용가능한 것으로 허용되고 있다.
발효 미생물의 항균효과는 발효시 미생물이 성장하면서 생성하는 대사물질에 의한 것으로서, 항생제, 박테리오신(bacteriocin), 디아세틸, 아세트산, 젖산 등이 주요물질이다. 그밖에도, 과산화수소(H2O2)는 호기성 또는 혐기성 세균의 대사과정중 형성될 수 있는 물질로서, 주로 효소활동을 방해하며 세균을 사멸시킨다. 항균성 펩타이드 생산 균주로는 락토바실러스(Lactobacillus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 페디오코커스(Pediococcus), 류코노스톡 (Leuconostoc), 엔테로코커스(Enterococcus), 코리네박테리움(Corynebacterium) 및 할로박테리움(Halobacterium) 등이 있다. 이들이 생산하는 항균성 펩타이드들은 항균물질 생산균주 자신과 계통 분류학적으로 근접한 균종으로 제한되거나 광범위한 항균 스펙트럼을 나타낸다. 현재 이들은 일부 제품화되어 상용되고 있으며, 우유제품, 육제품, 사료제품, 곡류 등 여러 가지 식품 및 사료의 저장성 향상 및 위생화제 제조과정에도 사용될 수 있다.
미생물 유래 항균성 펩타이드는 인체에 섭취시 소화효소에 의하여 분해되므로 인체에 무독하고 잔류성이 없으므로, 새로운 생물학적 보존제 또는 발효식품의생물제어제로서 그 가치가 크다. 상기 항균성 펩타이드중 스트렙토코커스 락티스(Streptococcus lactis)가 생산하는 니신은 광범위한 항균력 때문에 세계 각국에서 이미 오래전부터 식품보존제 및 항균제로 사용이 허용되어 있으며, 미국에서도 1988 년부터 FDA가 GRAS(Generally Recognized As Safe) 식품첨가제로 인정하고 있다. 그밖에도, 미생물 유래 항균성 펩타이드로는 스타필로코커스(Staphylococcus)가 생산하는 란티바이오틱(lantibiotics), 펩5(pep5), 에피더민(epidermin), 스타필로코신(staphylococin) 1580 및 갈리더민(gallidermin) 등이 알려져 있다.
본 발명자들은 식품발효 스타터(starter) 또는 유해균의 생육억제를 위한 식품첨가제로 안전하게 사용될 수 있는 새로운 항균성 펩타이드를 얻고자, 상기와 같은 항균성 펩타이드를 생산하는 신규 균주를 분리해내고, 상기 원균주로부터 항균성 펩타이드를 보다 대량으로 생산해낼 수 있는 변이주를 개발해내기 위하여, 지속적인 연구를 수행하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 균주 및 그의 변이주가 상기 목적에 부합하는 항균성 펩타이드를 대량으로 생산해낼 수 있다는 놀라운 사실을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명의 목적은 열안정성이 우수한 항균성 펩타이드를 생산하는 신규 바실러스 서브틸리스 균주 및 그의 변이주, 및 그를 이용하여 항균성 펩타이드를 제조하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
도 1은 바실러스 서브틸리스 CAU131의 성장 및 항균성 펩타이드 생산을 나타내는 그래프;
도 2a 내지 도 2c는 바실러스 서브틸리스 CAU131이 생산하는 항균성 펩타이드의 크로마토그래피 결과를 나타내는 도면;
도 3은 바실러스 서브틸리스 CAU131로부터 정제된 항균성 펩타이드의 SDS-PAGE 결과를 나타내는 도면;
도 4는 바실러스 서브틸리스 CAU131로부터 정제된 항균성 펩타이드의 분자량 측정을 나타내는 그래프;
도 5는 바실러스 서브틸리스 CAU131로부터 정제된 항균성 펩타이드의 열안정성을 나타내는 그래프;
도 6은 바실러스 서브틸리스 LC12의 성장 및 항균성 펩타이드 생산을 나타내는 그래프;
도 7은 바실러스 서브틸리스 LC12의 온도별 생육을 나타내는 그래프; 및,
도 8은 15 ℃에서 바실러스 서브틸리스 LC12의 생육 및 그에 대한 염의 영향을 나타내는 그래프.
첫째, 본 발명은 하기 (a) 내지 (d)의 특징을 갖는 항균성 펩타이드를 생산하는 바실러스 서브틸리스에 관한 것이다:
(a) 바실러스 종(Bacillusspp.), 대장균 O157:H7 및 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium)에 대해 항균력을 나타냄;
(b) 항균력을 나타내는 최적 pH 4∼7;
(c) pH 4∼7 및 80 ℃에서 2 시간동안, pH 4∼7 및 90∼100 ℃에서 1 시간동안 항균력 유지;
(d) 분자량 6,000 Da.
본 발명에 있어서, 상기 균주는 바람직하게는 바실러스 서브틸리스 CAU131(KCCM 10257) 또는 그의 변이주, 보다 바람직하게는 바실러스 서브틸리스 LC12(KCCM 10256)이다.
둘째, 본 발명은 상기 바실러스 서브틸리스를 배양하여 그 배양물로부터 상기 항균성 펩타이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서는 한국 충청남도 논산시 강경읍에서 구입한 새우젓 샘플을 멸균증류수에 현탁 및 희석하여 세균 배양용 배지에서 배양한후, 세균 집락을 순수 분리하여 검정균주에 대해 강한 항균력을 나타내는 항생물질을 생산하는 균주를 분리하였다. 분리된 균주는 그 형태학적, 배양학적 및 생리학적 특성을 종합하여, 바실러스 서브틸리스인 것으로 판명되었다. 따라서, 상기 균주를 바실러스 서브틸리스 CAU131이라 명명하고, 부다페스트 조약에 의거하여 한국미생물보존센터에 2001년 4월 9일자로 기탁을 완료하고 수탁번호 제KCCM 10257호를 부여받았다.
상기 균주가 생산하는 항균물질은 파파인(papain), 프로나제(pronase)와 같은 단백질 분해효소로 처리하는 경우 그 활성을 상실한다. 프로나제는 비특이적 단백질 분해활성을 갖는 엑소 또는 엔도펩타다제로 이 효소에 의해 활성이 없어지는 것으로 보아 이 물질을 펩타이드로 결론내렸다.
상기 균주가 생산하는 항균성 펩타이드는 동일 계열의 바실러스 종에 강한 항균력을 나타내며, 병원성 식중독균인 대장균 O157:H7, 살모넬라 타이피무리움 등에 대해서도 항균력을 나타낸다.
본 발명에서는, 정제된 항균성 펩타이드를 얻기 위하여, 바실러스 서브틸리스 CAU131의 배양여액을 모노큐(Mono-Q) 이온교환 크로마토그래피에 의해 1 차 및 2 차 정제한후, C18역상 크로마토그래피에 의해 최종 정제하였다. 그 결과, SDS-PAGE에서 단일 밴드를 나타내는 분자량 약 6,000 Da의 순수 항균성 펩타이드를 얻을 수 있었다.
이렇게 정제된 항균성 펩타이드는 80 ℃ 이하에서는 2 시간까지 항균력을 유지하고 90 ℃ 및 100 ℃에서도 1 시간까지는 항균력을 유지할 수 있으므로, 매우 높은 열안정성을 그 특징으로 한다. 또한, pH 4∼7에서는 항균성 펩타이드의 항균력이 그대로 유지되며, pH 3 이하에서는 약간 감소하고, pH 8부터 항균력이 감소하기 시작하여 pH 9 이상에서는 30% 이상 항균력이 감소한다.
나아가, 본 발명에서는 상기 균주로부터 항균성 펩타이드를 대량으로 생산하는 변이주를 개발해내기 위하여, 원균주에 대해 자외선 조사에 의한 1 차 돌연변이를 수행하고, N-메틸-N'-니트로소-구아니딘(NTG) 처리에 의한 2 차 돌연변이를 수행하였다. 그 결과, 원균주보다 항균성 펩타이드를 약 3 배 증가된 양으로 생산하는 변이주를 최종 선발하였다. 이 변이주가 원균주와 동일한 형태학적, 배양학적 및 생리학적 특성을 갖는 것으로 확인됨에 따라, 바실러스 서브틸리스 LC12라 명명하고, 부다페스트 조약에 의거하여 한국미생물보존센터에 2001년 4월 9일자로 기탁을 완료하고, 수탁번호 제KCCM 10256호를 부여받았다.
바실러스 서브틸리스 LC12는 20∼40 ℃에서 생육가능하고, 37 ℃에서 최적의 생육을 나타내며, 40 ℃ 이상에서는 생육이 저하된다. 또한, 저온(15 ℃)에서도 생육가능하나, 이 경우 성장이 지연되는 경향을 나타낸다. 저온 생육시 염(0∼8% NaCl)의 첨가는 균주의 생육을 감소시키나, 5% 이하의 첨가시에는 생육가능하다. 이 균주가 생산하는 항균성 펩타이드의 항균 스펙트럼 분석, 정제, 순도 및 분자량 측정, 및 열안정성 및 pH 안정성 조사결과, 원균주가 생산하는 물질과 동일한 물질인 것으로 확인되었다.
본 발명에 따른 균주가 생산하는 항균성 펩타이드는 식품 분야뿐만 아니라 의약 분야를 비롯한 항균력을 필요로 하는 다양한 분야에도 적용가능하며, 상기 항균성 펩타이드를 식품 분야를 제외한 의약 분야 등의 타 분야에 전용하는 것은 당업자가 용이하게 실시할 수 있는 것이므로, 이 또한 본 발명의 범위내에 속하는 것으로 보아야 한다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 보다 상세히 설명하나, 이들은 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 이들에 의해 본 발명을 범위가 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 항균성 펩타이드를 생산하는 미생물의 분리
한국 충청남도 논산시 강경읍에서 구입한 새우젓 샘플 1.0 g을 10 ㎖의 멸균증류수에 현탁 및 희석하였다. 상기 희석액을 세균 배양용 배지인 LB(Luria-Bertani), BHI(Brain Heart Infusion), MRS 또는 TPY 평판배지에 0.1 ㎖씩 분주 및 도말하여 37 ℃에서 2 일간 배양하였다. 상기 LB, BHI, MRS 또는 TPY 한천배지는 121 ℃에서 15 분간 멸균하여 사용하였으며, 그 조성은 표 1과 같다.
상기 방법으로 얻어진 세균 집락을 순수 분리하고, 검정균주, 즉 대장균(ATCC 43984 O157:H7), 바실러스 서브틸리스(ATCC 6633), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)(ATCC 11778), 바실러스 메가테리움(Bacillusmegaterium)(ATCC 9885), 살모넬라 타이피무리움(KCTC 1925) 등에 대해 강한 항균력을 나타내는 항생물질을 생산하는 균주를 분리하였다. 분리된 균주는 막대형 간균으로서, 그의 배양학적 특성은 표 2에 나타낸 바와 같다.
(-: 음성, 불가능; +: 양성, 가능)
이같은 균주의 형태학적, 배양학적 및 생리학적 특성을 종합하여, 상기 균주를 바실러스 서브틸리스인 것으로 판단하였다. 따라서, 상기 균주를 바실러스 서브틸리스 CAU131이라 명명하고, 한국미생물보존센터에 2001년 4월 9일자로 기탁을 완료하고 수탁번호 제KCCM 10257호를 부여받았다.
실시예 2: 바실러스 서브틸리스 CAU131의 성장 및 항균력 측정
250 ㎖ 삼각플라스크에 LB 및 BHI 액체배지 50 ㎖를 가하여 실시예 1의 바실러스 서브틸리스 CAU131 균주를 1%로 접종하여 37 ℃에서 진탕배양(180 rpm)한후, 600 nm에서 배양액의 탁도를 측정하여 생육을 측정하였다. 또한, 검정균주가 도말된 LB 고체배지에 배양여액이 점적된 여지를 올려놓고 배양한후 생성되는 생육저해환의 크기를 측정하여 항균력을 측정하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.
또한, 배양여액을 여러 가지 효소로 처리하였을 때 항균물질에 영향을 미치는 효소는 파파인, 프로나제와 같은 단백질 분해효소였다. 프로나제는 비특이적 단백질 분해활성을 갖는 엑소 또는 엔도펩티다제로 이 효소에 의해 활성이 없어지는 것으로부터 상기 균주가 생산하는 항균물질이 펩타이드인 것으로 결론내렸다. 한편, α,β-아밀라제(α,β-amylase), 풀룰라나제(pullulanase) 및 라이소자임(lysozyme)으로 처리한 경우에는 활성이 그대로 유지되어 상기 항균물질에는 당의 결합이 크게 영향을 미치지 않는 것으로 추측할 수 있었다.
실시예 3: 바실러스 서브틸리스 CAU131이 생산하는 항균성 펩타이드의 항균 스펙트럼 분석
실시예 1에서 얻은 바실러스 서브틸리스 CAU131이 생산하는 항균성 펩타이드의 항균 스펙트럼을 조사하고, 그 결과를 표 3에 나타내었다.
표 3에 나타낸 바와 같이, 바실러스 서브틸리스 CAU131이 생산하는 항균성 펩타이드는 동일 계열의 바실러스 종에 강한 항균력을 나타내었으며, 병원성 식중독균인 대장균 O157:H7, 살모넬라 타이피무리움 등에 대해서도 항균력을 나타내었다.
실시예 4: 바실러스 서브틸리스 CAU131이 생산하는 항균성 펩타이드의 정제
1 ℓ 삼각플라스크에 LB 액체배지 200 ㎖를 가하여 멸균한후, 50 ㎖ 삼각플라스크에 들어 있는 10 ㎖ LB 배지에서 24 시간동안 전배양된 바실러스 서브틸리스 CAU131을 1%로 접종하였다. 37 ℃에서 24 시간 진탕배양한후(180 rpm) 10,000 rpm으로 원심분리하여 배양여액을 제조하였다. 이 여액을 모노큐(Mono-Q) 이온교환 크로마토그래피 칼럼(1×10 cm, 파마시아 제품)을 통해 통과시켜 여액중의 항균성 펩타이드를 칼럼에 결합시켰다. 결합된 항균성 펩타이드를 50 mM 트리스 완충용액에 용해된 염화나트륨 용액을 0∼1 M의 농도구배로 칼럼에 통과시켜 분리하였다(도 2a 참조). 검정균주에 대해 항균력을 나타내는 분획을 모아 염화나트륨을 함유하지 않는 완충용액에 24 시간 투석하여 염화나트륨을 제거한후, 다시 모노큐 이온교환 크로마토그래피 칼럼을 통과시켜 동일한 방법으로 항균성 펩타이드를 분리하였다(도 2b 참조). 항균력을 나타내는 분획을 모아 감압농축한후 C18역상 크로마토그래피(0.5×30 cm, 수펠코사 제품)를 이용하여 항균성 펩타이드를 최종 정제하였다. C18칼럼에서의 분리를 위하여 0∼60%의 아세토니트릴 농도구배가 이용되었다. 이같은 정제과정을 통하여 항균성 펩타이드를 약 3,000 배로 정제하였다(도 2c 참조). 바실러스 서브틸리스 CAU131이 생산하는 항균성 펩타이드의 정제결과를 표 4에 나타내었다.
실시예 5: 정제된 항균성 펩타이드의 순도 및 분자량 측정
실시예 4에서 정제된 항균성 펩타이드를 지시 단백질들과 함께 20% SDS-PAGE시켜 순도와 겔상에서의 이동도를 조사하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도3에 나타낸 바와 같이, SDS-PAGE에서 정제된 단백질은 단일 밴드로 나타나 순수하게 정제되었음을 확인할 수 있었다. 도 4는 정제된 항균성 펩타이드의 분자량 측정 그래프이다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 정제된 항균성 펩타이드는 약 6,000 Da의 분자량을 갖는 것으로 확인되었다.
실시예 6: 정제된 항균성 펩타이드의 열안정성 조사
실시예 4에서 정제된 항균성 펩타이드를 각각 50, 60, 70, 80, 90, 100 및 121 ℃에서 방치하면서 10 분마다 5 ㎕씩을 검정균주가 도말된 LB 평판배지에 점적하여 잔존 항균력을 조사하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 바실러스 서브틸리스 CAU131이 생산하는 항균성 펩타이드는 매우 높은 열안정성을 나타내었다. 즉, 80 ℃까지는 2 시간까지 항균력이 유지되었으며, 90 ℃와 100 ℃에서는 1 시간 경과후 항균력이 급속히 감소하였다.
실시예 7: 정제된 항균성 펩타이드의 pH 안정성 조사
실시예 4에서 정제된 항균성 펩타이드를 50 mM 시트레이트 완충용액(pH 3, 4 및 5), 50 mM 인산 완충용액(pH 6 및 7) 및 50 mM 트리스 완충용액(pH 8, 9 및 10)과 혼합하여 실온에서 12 시간 방치한후, 검정균이 도말된 LB 평판배지에 점적하여 잔존 항균력을 조사하였다. 그 결과를 표 5에 나타내었다.
표 5에 나타낸 바와 같이, pH 4∼7에서는 항균성 펩타이드의 항균력이 그대로 유지되었으며 pH 3 이하에서는 약간 감소하였다. 또한, pH 8부터 항균력이 감소하기 시작하여 pH 9 이상에서는 30% 이상 항균력이 감소하였다.
실시예 8: 항균성 펩타이드를 대량으로 생산하는 변이주 개발
실시예 1에서 얻은 균주로부터 항균성 펩타이드를 대량으로 생산하는 변이주를 개발하기 위하여 하기와 같은 UV 돌연변이 과정을 수행하였다. 즉, 1 일간 전배양된 바실러스 서브틸리스 CAU131 균주를 10 배씩 희석한 용액(10-1∼10-5배)을 준비하고, 각각의 용액을 1 ㎖씩 LB 평판배지상에 분주하였다. 30 cm 거리에서 UV를 3 분까지 30 초단위로 조사하고, 37 ℃에서 24 시간 배양한후 초기 균수에서 1/10 이상 감소한 평판을 선택하였다. 생존한 콜로니로부터 변이주를 순수 분리하고 각각 37 ℃에서 24 시간 배양한후 배양액의 항균력을 측정하였다(표 6 참조).
1 차 돌연변이에서 가장 강한 항균력을 나타낸 변이주(UV-21)를 선택하여 하기와 같이 2 차 돌연변이를 실시하였다. 즉, 1 차 돌연변이에서 선택된 변이주 UV-21을 전배양한후 배양액에 0.1 M 아세트산 완충용액(pH 5.0)에 용해되어 있는 NTG를 20 ㎍/㎖로 첨가하여 30 분동안 배양하였다. 배양후 생존한 2 차 돌연변이주를 1 차 돌연변이시와 동일한 방법으로 액체배양하여 가장 높은 항균력을 나타내는 균주를 최종적으로 선발하였다(표 6 참조).
최종 선발된 균주는 원균주보다 약 3 배 증가된 항균성 펩타이드를 생산하는 것으로 나타났으며, 이는 실제로 대량생산시 높은 응용가치를 나타내는 것이다. 상기 변이주는 실시예 1의 바실러스 서브틸리스 CAU131과 동일한 형태학적, 배양학적 및 생리학적 특성을 갖는 것으로 확인되었다(표 2 참조). 따라서, 이 변이주를 바실러스 서브틸리스 LC12라 명명하고, 부다페스트 조약에 의거하여 한국미생물보존센터에 2001년 4월 9일자로 기탁을 완료하고, 수탁번호 제KCCM 10256호를 부여받았다.
실시예 9: 바실러스 서브틸리스 LC12의 성장 및 항균력 측정
실시예 1과 동일한 방법으로 바실러스 서브틸리스 LC12의 생육을 측정하고, 검정균주가 도말된 LB 고체배지에 2 배씩 희석된 배양여액이 점적된 여지를 올려놓고 배양한후 생육저해를 일으키는 최저 희석농도를 측정하여 항균력을 측정하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
실시예 10: 바실러스 서브틸리스 LC12의 온도별 생육특성 분석
실시예 8에서 얻은 바실러스 서브틸리스 LC12의 온도별 생육특성을 분석하고, 그 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 바실러스 서브틸리스 LC12는 20∼40 ℃에서 생육가능하고, 37 ℃에서 최적의 생육을 나타내며, 40 ℃ 이상에서는 생육이 저하되었다.
한편, 바실러스 서브틸리스 LC12의 저온(15 ℃)에서의 생육 및 저온 생육시염(0∼8% NaCl)이 균주의 생육에 미치는 영향을 조사하고, 그 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 바실러스 서브틸리스 LC12는 15 ℃의 저온에서도 생육이 가능하나, 이 경우 성장이 지연되는 경향을 나타내었다. 또한, 염의 첨가는 이 균주의 저온에서의 생육을 감소시키나, 5% 이하의 첨가시에는 생육가능한 것으로 나타났다.
실시예 11: 바실러스 서브틸리스 LC12가 생산하는 항균성 펩타이드의 항균 스펙트럼 분석
바실러스 서브틸리스 LC12가 생산하는 항균성 펩타이드의 항균 스펙트럼을 조사하고, 그 결과를 표 7에 나타내었다.
표 7에 나타낸 바와 같이, 바실러스 서브틸리스 LC12가 생산하는 항균성 펩타이드는 동일 계열의 바실러스 종에 강한 항균력을 나타내었으며, 병원성 식중독균인 대장균 O157:H7, 살모넬라 타이피무리움 등에 대해서도 항균력을 나타내었다.
또한, 10% 이하의 염 첨가시에도 바실러스 서브틸리스 LC12가 생산하는 항균성 펩타이드의 항균력에는 전혀 영향을 미치지 않았으며, 그 이상의 염 농도에서는 검정균주의 생육이 어려워 항균력에 대한 영향을 판단할 수 없었다.
한편, 이 균주가 생산하는 항균물질이 발효에 중요한 젖산균의 생육을 저해시키면, 이 균주를 발효식품에 사용하는 것이 불가능하다. 따라서, 이 균주가 생산하는 항균물질이 주요 젖산균의 생육을 저해하는지 여부를 조사하고, 그 결과를 표 8에 나타내었다.
표 8에 나타낸 바와 같이, 바실러스 서브틸리스 LC12가 생산하는 항균성 펩타이드는 발효식품에서 사용되는 주요 젖산균의 생육에 영향을 미치지 않았다. 이는 이 균주를 발효식품에 사용하여도 젖산균의 발효에는 전혀 영향을 미치지 않음을 의미하는 것이다.
실시예 12: 바실러스 서브틸리스 LC12의 정제, 순도 및 분자량 측정, 및 열안정성 및 pH 안정성 조사
바실러스 서브틸리스 LC12가 생산하는 항균성 펩타이드를 실시예 4과 동일한 방법으로 정제하고, 정제된 항균성 펩타이드의 순도 및 분자량을 실시예 5와 동일한 방법으로 측정하였으며, 열안정성 및 pH 안정성을 실시예 7과 동일한 방법으로 조사하였다. 그 결과, 상기 항균성 펩타이드가 바실러스 서브틸리스 CAU131이 생산하는 항균성 펩타이드와 동일한 물질인 것으로 확인되었다.
본 발명에 따른 균주를 이용하면, 식품발효 스타터 또는 유해균의 생육억제를 위한 식품첨가제로 안전하게 사용될 수 있는 항균성 펩타이드를 대량으로 얻을 수 있다.
[참고문헌]
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Claims (4)

  1. 하기 (a) 내지 (d)의 특징을 갖는 항균성 펩타이드를 생산하는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) CAU131(KCCM 10257):
    (a) 바실러스 종(Bacillusspp.), 대장균 O157:H7 및 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium)에 대해 항균력을 나타냄;
    (b) 항균력을 나타내는 최적 pH 4∼7;
    (c) pH 4∼7 및 80 ℃에서 2 시간동안, pH 4∼7 및 90∼100 ℃에서 1 시간동안 항균력 유지;
    (d) 분자량 6,000 Da.
  2. 삭제
  3. 제1항에 따른 항균성 펩타이드를 생산하고, 제1항에 따른 바실러스 서브틸리스 CAU131(KCCM 10257)의 변이주인, 바실러스 서브틸리스 LC12(KCCM 10256).
  4. 제1항 또는 제3항에 따른 바실러스 서브틸리스를 배양하여 그 배양물로부터 제1항에 따른 항균성 펩타이드를 제조하는 방법.
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