KR19990023039A - 인체 구강내 치태형성을 억제하는 신규한 유산균 - Google Patents

인체 구강내 치태형성을 억제하는 신규한 유산균 Download PDF

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Abstract

본 발명은 글루칸(glucan) 및 치태(plaque) 형성 억제용 신규한 세균에 관한 것이다. 글루칸 또는 치태형성을 억제하는 신규한 세균은 탄수화물을 분해하는 유산균중에서 분리동정한 Enterococcus속 1357 (KCTC 0360BP), Lactobacillus속 V20 (KCTC 0361BP) 및 Lactococcus속 1370 (KCTC 0415BP)으로 명명되었다.
이들 신규한 균주는 일회용 큐벧과 교정용 와이어를 이용한 실험에서 글루칸억제효과와 치태형성 억제효과가 현저히 높은 것으로 나타났다. 또, 실제 임상적 실험결과 치태형성이 현저히 억제되었다.

Description

인체 구강내 치태형성을 억제하는 신규한 유산균
본 발명은 인체 구강내 치태(plaque)의 주성분인 글루칸(glucan)의 형성을 억제하는 신규한 세균에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는 본 발명은 사람의 구강내에 정상적으로 존재하는 미생물중에서 분리한 신규한 유산균에 관한 것이다. 이들 유산균은 글루코스 전이효소(glucosyltransferase)의 활성을 억제하거나 또는 글루칸 형성에 관여하는 세균에 길항성이 있는 신규한 엔토로코커스(Enterococcus, 장구균)속, 락토바실루스(Lactobacillus, 유산간균)속, 락토코거스 (Lactococcus, 유산구균)속의 유산균에 관한 것이다.
유산균은 탄수화물을 발효하여 최종 대사산물로서 유산(lactic acid)을 생산하는 세균을 말한다. 유산균은 인간과 동물의 구강 및 소화관에 존재하며 통상적으로 김치 또는 요구르트 등 발효식품의 제조과정에 활용되고 있다. 이 밖에도 의약품과 같은 생물학적 활성물질의 생산에도 이용되고 있다. 이들 유산균에 속하는 세균들로는 구균으로 Streptococcus속, Enterococcus속, Lactococcus속, 간균으로 Lactobacillus속, Bifidobacterium속과 Micrococcus속 등이 있다. 이중에서 식품에 이용하는 유산균으로는 Str. thermophilus, E. faecalis, E. durans, Lactococcus lactis, L. lactis, L. acidophilus, L. bulgaricus, L. thermophilus, L. casei, L. plantarum 등이 있다. 이들 유산균은 그람 양성균으로써 동물의 장내에 서식하면서 사람이나 동물이 섭취한 탄수화물을 분해하여 유산 및 항생물질을 생산하여 장내 유해균의 발육을 억제함으로 장내의 건강 유지에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
종래에도 치태의 주성분인 글루칸을 분해하여 구강위생을 도모하기 위하여 글루칸에 작용하는 효소들을 분리한 바있다. 우선 덱스트란(dextran)에 작용하는 덱스트란네이스(dextranase; α-1,6 glucan hydrolase)를 정제하여 동물시험과 인체를 대상으로 실험한 바 있다(Staat R.H Schachtete C.F, 1975; Raster, A.G Brown, L.R, 1983). 또한 글루칸 형성에 중요한 성분인 뮤탄(mutan)을 분해하는 뮤탄네이스(mutanase, endo-α-1,3 glucanase)의 분리정제와 치태형성 억제연구도 보고된 바 있다 (Guggenheim B.et al., 1972; Takehara et al., 1981). 그러나 위와 같은 글루칸 형성억제 효소의 사용에 관한 동물실험 연구들은 인체실험 결과에는 큰 효과가 없는 것으로 나타났고 분리된 뮤탄네이스의 경우는 치태분해효과가 미약하고 시간이 오래 걸리며 이러한 효소분리정제에도 엄청난 노력과 시간이 소모되므로 그의 경제적 및 실용적 사용은 곤란한 것으로 판명되었다.
따라서, 본 발명자는 이러한 사실들에 착안하여 유산균을 직접 사람의 구강에서 채취, 분리하고 글루칸 억제효과 및 치태형성 억제효과 그리고 실제임상학적실험등 다수의 실험을 통하여 몇가지 유산균이 치태 형성을 현저히 억제한다는 사실을 확인하므로써 달성하였다. 본 발명에서 치태형성을 억제하는 유산생성균주 중 특히 중요한 균주를 엔테로코커스속(Enterococcus spp.) 1357, 락토바실루스속(Lactobacillus spp.) V20, 락토코커스속(Lactococcus spp.) 1370 균주로 각각 명명하고 이들 균주를 1997년 7월 30일자와 12월 11일자로 한국과학기술연구원 생명공학연구소 유전자원센터 유전자은행에 각각 기탁하였다.(엔테로코커스속 1357 수탁번호: KCTC0360BP, 락토바실루스속 V20 수탁번호: KCTC 0361BP, 락토코커스속 1370 수탁번호: KCTC 0415BP)
인체 구강내 치태의 주성분은 탄수화물의 복합체인 글루칸이다. 글루칸은 수용성인 텍스트란과 비수용성인 뮤탄으로 구분할 수 있는데 글루칸은 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)가 분비하는 글루코스 전이효소에 의해 자당(sucrose으로 부터 합성된다. 뮤탄은 α-1,3 결합을 갖고 있어 비수용성으로서 구강내 치태의 주성분이 되는 것이다. 일반적으로 치태는 치아표면에 스트렙토코커스 뮤탄스 외에도 다른 세균들의 증식이 촉진되고 음식찌꺼기 등 여러 물질이 부착하게 되어 치아우식증과 치주질환의 원인이 되고 있다. 따라서, 본 발명의 다른 목적은 유산균이 구강내에서 글루칸 형성을 억제함으로써 치아에 치태 형성을 억제하여 구강내 청결을 유지토록 하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 이들 유산균을 이용한 신규한 음료나 식품을 제공하는데 있다. 즉 글루칸 형성을 직접 억제하거나 글루칸을 형성하는 미생물에 길항성이 있는 유산균이 함유된 식품을 직접 식용화하게 하므로써 치태 형성을 억제하고 더 나아가 치아우식중과 치주질환을 예방할 수 있는 것이다.
이하 본 발명의 구체적인 구성과 작용을 설명한다.
도 1a-1c는 본원 발명 유산균의 일회용 큐벧에서 비수용성 글루칸 형성을 억제하는 것을 보여주는 사진도이다.
도 2a-2c는 본원 발명 유산균이 교정용 와이어를 이용한 인공치태 형성을 억제하는 것을 보여주는 사진도이다.
도 3a-3c는 본원 발명 유산균의 인체 구강내에서 치태 형성 억제용도를 보여주는 사진도이다.
따라서, 본 발명은 사람의 구강에서 유산균 시료를 채취하여 브레인 하트 인퓨젼 한천배지 (Brain heart infusion agar)에 도말한 다음 항온기에서 37℃로 16시간 배양한 후 분리한 세균들을 스트렙토코커스 뮤탄스가 생성하는 비수용성 글루칸 형성의 억제여부를 실험하고 동정하였다. 0.5% 효모추출액과 5% 자당을 첨가한 브래인 하트 인퓨젼 배지 3㎖를 일회용 큐벧(cuvette)에 넣고 0.1㎖의 스트렙토코커스 뮤탄스와 상기에서 분리한 세균 배양액 0.1㎖를 접종하였다. 이때 대조군(control)으로 효모추출액과 자당을 첨가한 브레인 하트 인퓨젼 한천배지에 스트럽토코커스 뮤탄스만을 접종하였다. 일회용 큐벧을 배양기 안에 수평면에 대해 30°각도로 설치하고 37℃에서 3일간 배양하여 스트렙토코커스 뮤탄스로 하여금 비수용성 글루칸을 형성토록 하였다. 배양액을 제거하고 4㎖의 증류수로 세척한 후 3㎖의 증류수를 가하여 분광광도계(spectrophotometer)의 550㎚ 파장에서 흡광도(absorbance;OD)를 측정하였다. 대조군의 비수용성 글루칸 생성량에 비교하여 현저히 적은 글루칸이 형성되면 분광광도계에서의 흡광도는 현저히 작아지며 이러한 세균은 치태 형성 억제 유산균으로 분리하였다. 분리된 유산균주에 대하여 몇가지 형태학적, 생리학적 등 미생물학적 특성과 당분해능을 조사하였다(표 1,2).
분리된 치태 형성 억제 유산균의 미생물학적 특성을 기술하면 다음과 같다.
표 1은 분리된 유산균주의 동정결과 형태학 및 생리학적 성질을 기술하였다. 표 2는 동세균의 당분해능의 조사결과를 보이고 있다.
[표 1]
본 발명 유산균 균주의 형태 및 생리적 성질
이상 설명한 바와같이 본 발명은 치태 형성억제를 위한 신규한 유산균을 분리 동정하는 공정과 분리된 세균을 대조군과 비교하여 실험실내 실험(in vitro)공정 및 실제 임상실험공정으로 구성된다.
이하, 본 발명 글루칸 또는 치태형성 억제용 신규한 유산균에 대하여 실시예와 사용예를 통하여 상세히 설명하면 다음과 같다.
실시예1 : 일회용 큐벧에서의 비수용성 글루칸 형성 억제실험
엠 17(M17) 배지와 엠알에스(MRS) 배지를 동량 혼합하고 0.5% 효모추출액과 5% 자당을 첨가한 후 0.2M 티이에스 완충용액(TES buffer, pH 8.5)을 배지량의 삼분지 일을 가한 다음 그의 3㎖를 일회용 큐벧에 넣고 75㎕의 스트렙토코커스 뮤탄스 배양액을 접종하였다. 이것을 배양기 안에 수평면에 대하여 30°각도로 설치하고 37℃에서 1일간 배양하였다. 내용물을 제거하고 4㎖의 증류수로 세척하여 사진을 찍은 다음(도 1a, 도 1b, 도 1c) 큐벧에 3㎖의 증류수를 가하여 분광광도계 550㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다. 이것을 3회 반복하여 평균을 구하였다(표 3). 큐벧의 사진도 1a(A), 도 1b(A) 및 도 1c(A)는 스트렙토코커스 뮤탄스만 배양한 대조군이고 도 1a(B)는 스트렙토코커스 뮤탄스와 엔테로코커스속 1357을 함께 배양한 것이며 도 1a(C)는 엔테로코커스속 1357만 배양한 것이다. 도 1b(B')는 스트렙토코커스 뮤탄스와 락토바실루스속 V20 균주와 공서배양한 것이고 도 1b(C')는 락토바실루스속 V20을 단독 배양한 것이다. 또, 도 1c(B)는 스트렙토코커스 뮤탄스와 락토코커스속 1370 균주와 공서배양한 것이고 도 1c(C)는 락토코커스속 1370을 단독 배양한 것이다.
표3-A에서는 스트렙토코커스 뮤탄스만 접종한 대조군의 흡광도는 2.122임에 대하여 엔테로코커스속 1357과 함께 접종한 실험군Ⅱ의 흡광도는 0.713으로 떨어졌고 락토바실루스속 V20를 함께 접종한 실험군IV의 흡광도는 1.154로 떨어졌다. 따라서 스트렙토코커스 뮤탄스에 의한 글루칸 형성을 엔테로코커스속 1357과 락토바실루스속 V20이 각각 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 엔테로코커스속 1357균주를 단독 접종한 실험군Ⅰ 및 락토바실루스속 V20균주를 단독접종한 실험군Ⅲ에서의 흡광도가 각각 0.434, 0.506으로 나타나 있어 이 균주들의 글루칸 형성억제 효과가 매우 큰 것을 알 수 있었다. 표3-B에서는 스트렙토코커스 뮤탄스만 접종한 대조군의 흡광도는 1.765임에 대하여 락토코커스속 1370를 함께 접종한 실험군VI의 흡광도는 0.848으로 떨어졌고 락토코커스속 1370균주를 단독접종한 실험군V에서의 글루칸 형성억제효과는 흡광도가 0.479로 나타나 있어 이 균주도 치태 형성억제 효과가 있는 것을 알 수 있었다.
[표 3a]
글루칸 형성 억제효과
[표 3b]
글루칸 형성 억제효과
실시예 2 : 교정용 와이어를 이용한 인공치태 형성억제 실험
엠 17(M17) 배지와 엠알에스 (MRS) 배지를 동량 혼합한 다음 0.5% 효모추출액과 5% 자당을 첨가하고 0.2M 티이에스 완충용액(TES buffer, pH 8.5)을 배지량의 삼분지 일을 가한 다음 그의 150㎖를 취하여 비이커에 넣었다. 여기에 약 45㎎의 0.016인치 스테인레스 스틸(stainless steel) 교정용 와이어(wire)를 준비하여 배양액에 잠기도록 비커에 매달았다. 배지 1㎖당 2.5 ×106개의 스트렙토코커스 뮤탄스를 접종하고 순수 분리한 본 발명 유산균 균주를 각각 스트렙토코커스 뮤탄스 세균 숫자의 10배를 첨가하고 흔들면서(shaking) 37℃ 탄산가스 배양기에서 6시간 반 배양하였다. 와이어를 새로운 비이커에 옮기고 사진을 찍었다 (도 2a-2c). 도 2a(A) , 도 2b(A) 및 2c(A)는 스트렙토코커스 뮤탄스를 단독 배양한 것이고 도 2a(B)는 스트렙토코커스 뮤탄스와 엔테로코커스속 1357균주를 공서 배양한 것이다. 또, 도 2b(B)는 스트렙토코커스 뮤탄스와 락토바실루스속 V20균주를, 도 2c(B)는 스트렙토코커스 뮤탄스와 락토코커스속 1370균주를 공서배양한 결과이다. 와이어 상에 생긴 인공치태의 무게를 측정하여 와이어만의 무게를 빼내 배양시 와이어상에 생기 인공치태의 무게를 계산한 결과는 표 4와 같았다. 스트렙토코커스 뮤탄스만 접종한 대조군에서 인공치태 생성량은 75.4㎎인데, 엔테로코커스속 1357를 함께 접종한 실험군Ⅰ에서와 락토코커스속 1370균주와 함께 접종한 실험군Ⅲ에서는 인공치태가 형성되지 않았으며 락토바실루스속 V20균주와 함께 접종한 실험군 Ⅱ에서는 인공치태 생성량이 30.9㎎으로 떨어졌다. 이와같은 실험결과로 보아 스트렙토코커스 뮤탄스의 인공치태 형성을 본 발명 신규한 유산균인 엔테로코커스속 1357, 락토바실루스속 V20, 락토코거스속 1370균주가 각각 억제하는 것을 알 수 있었다.
[표 4]
인공치태 형성 억제효과
실시예 3 : 인체 구강에서의 치태 형성 억제 용도 실험
본 발명 신규한 유산균 균주가 치태 형성 억제효과를 얼마나 강력하게 나타내는가를 실험하기 위하여 동일한 사람에게 동일한 실험을 일정한 날짜를 간격으로 실험하였다.
양치질하고 6시간 후 치태 염색제인 디스크로싱 솔루션(disclosing solution)을 치아 전면에 바른후 물로 헹구고 사진을 찍어 두었다(사진 도3a). 동일한 사람에게 2일이 지난후 양치질시키고 엔테로코커스속 1357을 skim milk에 배양한 유산균 음료 50㎖를 마시우고 6시간 후에 상기 디스크로싱 솔루션을 다시 바르고 물로 헹군후 사진을 찍었다(사진도 3b). 다시 동일한 사람에게 13일후 양치질시키고 락토마실루스속 V20을 skim milk에 배양한 유산균 음료 50㎖를 마시우고 6시간 후 상기 디스크로싱 솔루션을 바르고 물로 헹군후 사진을 찍었다. 그 결과는 도 3c와 같았다. 사진도 3a에서 보듯이 치태 또는 글루칸이 치아 표면에도 다량 생성되어 있음을 확인할 수 있는데 비하여 본 발명 유산균을 사용하여 제조한 유산균 음료를 마시운 경우에는 사진도 3b와 3c에서 보는 바와 같이 치태 형성 억제효과가 현저히 높은 것을 알 수 있다. 따라서 본 발명 유산균균주를 계속적으로 사용하는 경우에는 치태 형성 억제효과가 상승적으로 높아질 것으로 기대된다.
실시예 4 : 치태지수 감소 실험
본 발명 신규한 유산균 균주의 치태 형성 억제효과를 예방치의학적으로 증명하기 위하여 38명의 자원자에게 동일한 실험을 실시하여 Quigley and Hein의 치태지수(plaque index)에 의거하여 치태 점수(plaque score)를 매겨 치태 지수 감소 정도를 검사하였다.
38명의 자원자에 대해 스켈링을 시행하였다. 스켈링 시행 1주에 치면세마를각각 10분간 실시한 후, 음식 등은 평상시와 같이 먹도록 하면서 양치질만 못하도록 제한한 다음, 24시간 후 디스크로싱 솔루션을 바르고 물로 헹구었다. 이때 제3대구치를 제외한 전체 치아의 협면(buccal side)과 설면(lingual side)에 형성된 치태 형성 정도를 예방치의학을 전공하고 있는 패널리스트가 Quigley and Hein의 치태지수에 의거하여 치태점수를 매기도록 하여 제3대구치를 제외한 전체 치아에 대한 치태점수를 개인별로 평균하고 38명의 자원자를 2그룹으로 나누어 다시 각 그룹별로 평균하여 기초치태점수 평균을 얻었다. 동일한 사람들에 치면세마를 실시하고 19명의 한그룹에는 락토코커스속 1370을, 19명의 다른 그룹에는 락토바실루스속 V20을 skim milk에 배양한 유산균 음료 20㎖ (109CFU/ml)로 입안을 2분간 헹구도록 하였다. 이런 헹굼을 하루 3차례 즉 치면세마 후, 아침식사와 점심식사 후에 실시하면서 양치질을 못하도록 제한하고 음식 등은 평상시와 같이 먹도록 하게한 다음, 24시간 후 디스크로싱 솔루션을 바르고 물로 헹구었다. 이때도 제3대구치를 제외한 전체 치아의 협면과 설면에 형성된 치태 형성 정도를 동일한 패널리스트가 Quigley and Hein의 치태지수에 의거하여 치태점수를 매기도록 하여 제3대구치를 제외한 전체 치아의 치태점수를 개인별로 평균하고 다시 각 그룹별로 평균하였다. 그 결과는 표5에서와 같은데, 락토코커스속 1370을 배양한 유산균 음료로 헹군 그룹의 치태 점수는 1.20으로 나와 유산균 음료를 가하지 않았을 때의 치태 점수 2.17에 비하여 치태점수가 0.97이 감소하였으며, 락토바실루스속 V20을 배양한 유산균 음료로 헹군 그룹의 치태 점수는 1.60으로 나와 유산균 음료를 가하지 않았을 때의 치태 점수 2.15에 비하여 치태점수가 0.55가 감소하여 사용한 유산균 모두 치태 형성을 감소시켰다. 그리고 유산균을 사용한 두그룹 모두에서 통계학적으로 의의있게 (p0.05) 치태 형성을 억제하는 것으로 나타나 본 발명 유산균균주의 치태 형성 억제효과가 높은 것이 학문적으로 증명되었다.
[표 5]
신규 유산균에 의한 치태점수 감소효과
*p0.01 by paired t test
이하, 본 발명의 신규한 유산균 균주를 식품에 적용하여 인체 구강내 치태 형성 억제의 사용예를 설명한다.
사용예 1 : 요구르트 제품
요구르트 제조회사에 의뢰하여 통상적으로 제조되는 요구르트 제조과정에서 본 발명 유산균주 배양물을 발효직전 0.1부피% 첨가하여 기존 균주와 혼합발효시켜 요구르트를 제조하여 패널리스트 10명에게 시음한 결과 기존제품(대조군)과 향미의 차이를 발견할 수 없다고 응답하였다. 또, 요구르트 제조과정의 밀봉전에 본 발명 유산균주를 0.2부피%를 첨가하여 밀봉제품화한 실험군과 본 발명 유산균주를 첨가하지 않은 대조군제품을 패널리스트 10명에게 시음시킨 결과 양제품간의 향미의 차이가 없다고 응답하였다.
사용예 2 : 김치제품
배추 5포기를 4-5㎝로 썰어서 소금물에 절인후 세척하고 탈수하였다. 여기에 파, 생강, 마늘, 고춧가루, 젓갈 등 양념재료를 별도로 제조한 양념을 첨가한 후 숙성온도 20℃에서 3일간 숙성하였다. 자연 숙성된 상기 김치에 본 발명 유산균 균주 배양물 각 0.2 중량%를 첨가한 군과 무첨가군(대조군)을 각각 식탁에 제공하여 패널리스트 10명에게 시식시킨 결과 김치 향미의 차이를 느끼지 못한다고 응답하였다.
사용예 3 : 버터제품
통상의 방법으로 제조한 버터제품의 포장전에 본 발명 유산균 균주 동결건조품 0.2중량%를 혼합한 후 포장제품화하여 시식에 제공하였다.
사용예 4 : 치이즈제품
통상의 방법으로 제조한 치이즈제품의 포장전에 본 발명 유산균 균주 동결건조품 0.2중량%를 혼합한 후 포장 제품화하여 시식에 사용하였다. 본 발명의 사용예는 명세서에 기재된 식품외에도 껌, 쇼트닝, 아이스크림, 마가린 등 어떠한 식품에도 적용하였으며 본 발명의 권리범위는 이들 식품에만 한정되지 않는다.
이상 일회용 큐벧을 통하여 글루칸 형성 억제실험과 교정용 와이어를 통한 인공 치태 형성 억제실험 및 인체 구강내에서의 치태 형성 억제용도 실험으로 본 발명 신규한 유산균 균주는 강력하고 지속적인 글루칸 또는 치태 형성 억제효과가 있는 세균임을 알 수 있어 치의약 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.
이밖에도, 본 발명의 신규한 유산균 균주를 식품에 활용하여 식용으로 할 수 있으므로 본 발명은 식품산업 및 장 건강의학상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (5)

  1. 인체의 구강내 글루칸(glucan) 또는 치태(plaque) 형성 억제용 신규한 유산균
  2. 제 1항에 있어서, 상기 유산균이 글루코스 전이효소(glucosyltransferase)의 작용을 억제하거나 또는 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)와 같은 치태 형성 세균에 길항성이 있는 유산균.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 유산균은 인체 구강에서 분리한 Enterococcus속 1357 (KCTC 0360BP), Lactobacillus속 V20 (KCTC 0361BP) 또는 Lactococcus속 1370균주 (KCTC 0415BP).
  4. 탄수화물의 발효능이 있는 상기 1항 기재의 유산균을 단독 또는 혼합 사용하여 제조된 글루칸 또는 치태 형성 억제용 식품.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 식품은 김치, 요구르트, 버터, 치이즈, 아이스크림, 껌, 쇼트닝, 마가린임을 특징으로 하는 식품.
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