CN115671143A - 使用乳酸菌菌株的培养物来抑制口腔病原菌生长和预防和/或治疗与口腔病原菌有关的疾病 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用乳酸菌菌株的培养物来抑制口腔病原菌生长和预防和/或治疗与口腔病原菌有关的疾病。本发明揭示乳酸菌菌株的培养物可被用来抑制口腔病原菌的生长。本发明亦揭示乳酸菌菌株的培养物可被用来预防和/或治疗与口腔病原菌有关联的疾病。

Description

使用乳酸菌菌株的培养物来抑制口腔病原菌生长和预防和/ 或治疗与口腔病原菌有关的疾病
技术领域
本发明涉及使用乳酸菌菌株的培养物来抑制口腔病原菌生长，以及使用乳酸菌菌株的培养物来预防和/或治疗与口腔病原菌有关联的疾病。
背景技术
口腔病原菌(oral pathogenic bacteria)是一群存在于人类口腔中且定殖(colonize)于人类牙齿表面的细菌，常见的口腔病原菌包含有变种链球菌(Streptococcusmutans)，以及卟琳单胞菌(Porphyromonas)、梭杆菌属(Fusobacterium)与放线菌门(Actinobacteria)的厌氧细菌。
这些口腔病原菌会在牙齿表面以及人工假体上[例如牙冠 (dentures)和牙桥(bridges)]上生长，而造成多种口腔感染性疾病。常见与口腔病原菌有关联的疾病(oralpathogenic bacteria-associated disorders)包括：口臭(halitosis)、龋齿 (dentalcaries)、齿结石(dental calculus)，以及牙周病 (periodontal diseases)[包括牙龈炎(gingivitis)和牙周炎 (periodontitis)]。
目前用于防治口腔病原菌感染的方法主要包括物理性清洁(包括刷牙、使用牙线)，使用含氟牙膏或抗菌漱口水，以及抗生素 (antibiotic)治疗。然而，这些防治方法在对抗口腔病原菌上的效果仍不尽理想，主要的原因包括：清洁不当、口腔病原菌所展现出的抗生素耐性(antibiotic resistance)，以及抗生素带来的严重副作用 (side effect)与不良反应(adverse effect)。因此，本领域的相关研究人员皆致力于开发可以有效地预防和/或治疗口腔病原菌感染并且不会产生非所欲的副作用的药物。
乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)是属于一般被公认为安全的(generallyrecognized as safe,GRAS)并且是为人所熟悉与广泛使用的益生菌(probiotics)。常见的乳酸菌包括：乳酸杆菌属 (Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、片球菌属(Pediococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属 (Streptococcus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、芽孢杆菌属 (Bacillus)以及明串珠菌属(Leuconostoc)等。
目前已有研究是有关于乳酸菌菌株在抗口腔病原菌上的应用。例如，在R.Teanpaisan et al.(2011),Lett.Appl.Microbiol., 53(4):452-9中，R.Teanpaisan等人对来自于10种乳杆菌属菌种的不同分离株进行对于口腔病原菌的抑制活性的测定，而结果显示，部分副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、胚芽乳杆菌 (Lactobacillusplantarum)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)以及干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)的菌株对于变种链球菌、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)以及放线共生聚集杆菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)显示出抑制活性。然而，该研究结果显示，相同菌种中的不同分离株所具有的口腔病原菌抑制能力之间可能存在极大差异。
TW I639389B中揭示经分离的嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)F-1、唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivarius) AP-32、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)GL-104、副干酪乳杆菌GL-156与ET-66、瑞士乳酸杆菌(Lactobacillushelveticus) RE-78，以及鼠李糖乳杆菌CT-53对于不同的口腔病原菌具有不等的抑制活性，例如，副干酪乳杆菌GL-156对于具核梭杆菌多形亚种 (Fusobacterium nucleatumsubsp.polymorphum)具有高达96.93％的抑制活性，但对于变种链球菌则完全不具有抑制效果。
虽然已存在有上述文献报导，本领域中仍然存在有一需要去筛选出可以有效预防和/或治疗与口腔病原菌有关联的疾病的乳酸菌以供产业界之用。
发明内容
于本发明中，申请人发现单独使用或组合使用鼠李糖乳杆菌 (Lactobacillusrhamnosus)MP108(CGMCC No.21225)以及副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)MP137(CGMCC No.21224)的培养物[包括包含有菌体的培养物、不含有菌体的培养上清液以及经热灭活的(heat-inactivated)培养物]皆具有抗口腔病原菌(oral pathogenic bacteria)的效用。
于是，在第一个方面，本发明提供一种乳酸菌菌株的培养物供应用于制备一用来抑制口腔病原菌生长的组合物的用途，其中该乳酸菌菌株是选自于由下列所构成的群组：鼠李糖乳杆菌MP108、副干酪乳杆菌MP137，以及它们的组合。
在第二个方面，本发明提供一种乳酸菌菌株的培养物供应用于制备一用来预防和/或治疗与口腔病原菌有关联的疾病的组合物的用途，其中该乳酸菌菌株是选自于由下列所构成的群组：鼠李糖乳杆菌 MP108、副干酪乳杆菌MP137，以及它们的组合。
较佳地，其中该组合物包含有鼠李糖乳杆菌MP108的培养物以及副干酪乳杆菌MP137的培养物。
较佳地，其中该培养物是液态培养物。
较佳地，其中在该组合物中，鼠李糖乳杆菌MP108与副干酪乳杆菌MP137的菌数比落在1：0.43至1：2.33的范围内。
较佳地，其中该液态培养物是经热灭活处理的。
较佳地，其中该液态培养物实质上不含有菌体。
较佳地，其中在该组合物中，鼠李糖乳杆菌MP108的液态培养物与副干酪乳杆菌MP137的液态培养物的体积比落在1：0.43至1：2.33 的范围内。
较佳地，其中该口腔病原菌是选自于由下列所构成的群组中的菌种：变种链球菌(Streptococcus mutans)、牙龈卟啉单胞菌 (Porphyromonas gingivalis)、具核梭杆菌多形亚种(Fusobacterium nucleatum subsp.polymorphum)、放线共生聚集杆菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)、齿垢密螺旋体 (Treponema denticola)、中间普雷沃氏菌(Prevotella intermedia)、 Parvimonas micra、直肠弯曲菌(Campylobacter rectus)、啮蚀艾肯氏菌(Eikenella corrodens)，以及它们的组合。
较佳地，其中该组合物是一食品组合物或一药学组合物。
具体实施方式
为了本说明书的目的，将被清楚地了解的是：文字“包含有 (comprising)”意指“包含但不限于”，以及文字“包括 (comprises)”具有一对应的意义。
除非另外有所定义，在本文中所使用的所有技术性与科学术语具有本领域技术人员所共同了解的意义。一本领域技术人员会认知到许多与那些被描述于本文中者相似或等效的方法和材料，它们可被用于实施本发明。当然，本发明决不受到所描述的方法和材料的限制。
本发明提供一种乳酸菌菌株的培养物供应用于制备一用来抑制口腔病原菌生长的组合物的用途，其中该乳酸菌菌株是选自于由下列所构成的群组：鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)MP108 (CGMCC No.21225)、副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)MP137 (CGMCC No.21224)，以及它们的组合。
依据本发明，该口腔病原菌是选自于由下列所构成的群组中的菌种：变种链球菌(Streptococcus mutans)、牙龈卟啉单胞菌 (Porphyromonas gingivalis)、具核梭杆菌多形亚种(Fusobacterium nucleatum subsp.polymorphum)、放线共生聚集杆菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)、齿垢密螺旋体 (Treponema denticola)、中间普雷沃氏菌(Prevotella intermedia)、 Parvimonas micra、直肠弯曲菌(Campylobacter rectus)、啮蚀艾肯氏菌(Eikenella corrodens)，以及它们的组合。
依据本发明，该乳酸菌菌株的培养物可通过将具有一范围落在 106至1010CFU/mL内的细菌浓度的这些乳酸菌菌株培养于一适于生长的培养基中而被获得。在本发明的一个较佳具体例中，这些乳酸菌菌株具有一范围落在107至109CFU/mL内的细菌浓度。
如本文中所使用的，术语“培养(culturing)”、“发酵 (fermentation)”以及“培育(cultivation)”可被交换地使用。
有关培养的操作过程与参数条件等落在本领域技术人员的专业素养与例行技术范畴内。在此方面，可以参考，例如，Hsieh P.S.et al.(2013),New Microbiol.,36:167-179。
依据本发明，适用于培养这些乳酸菌菌株的培养基可以是本领域技术人员自行配制的，或者是商业上可购得的产品，这包括，但不限于：MRS肉汤培养基(MRS broth)以及添加有半胱氨酸(cysteine)的 MRS肉汤培养基。在本发明的一个较佳具体例中，适用于培养这些乳酸菌菌株的培养基是添加有半胱氨酸(BD Biociences,Difco)的MRS 肉汤培养基(BD Biociences,Difco)。
依据本发明，该乳酸菌菌株的培养物是一液态培养物，并且可具有一范围落在106至1010CFU/mL内的细菌浓度。在本发明的一个较佳具体例中，该乳酸菌菌株的培养物具有一为109CFU/mL的细菌浓度。
依据本发明，该组合物可包含有鼠李糖乳杆菌MP108的培养物以及副干酪乳杆菌MP137的培养物。
较佳地，在该组合物中，鼠李糖乳杆菌MP108与副干酪乳杆菌 MP137的菌数比落在1：0.43至1：2.33的范围内。在本发明的一个较佳具体例中，鼠李糖乳杆菌MP108与副干酪乳杆菌MP137的菌数比是1：1。
依据本发明，该乳酸菌菌株的培养物或液态培养物可以是经热灭活处理(heat-inactivation treatment)的。
有关热灭活处理的操作过程与参数条件等是落在本领域技术人员的专业素养与例行技术范畴内。在此方面，可以参考，例如，Y.T. Chen et al.(2020),Lett.Appl.Microbiol.,70(4):310-317。
依据本发明，该热灭活处理可以通过在100℃下加热历时30分钟至1小时来进行。在本发明的一个较佳具体例中，该热灭活处理是在 100℃下加热历时1小时来进行。
依据本发明，该乳酸菌菌株的液态培养物可以经固液分离处理而实质上不含有菌体。
当该液态培养物实质上不含有菌体时，较佳地，在该组合物中，鼠李糖乳杆菌MP108的液态培养物与副干酪乳杆菌MP137的液态培养物的体积比落在1：0.43至1：2.33的范围内。在本发明的一个较佳具体例中，鼠李糖乳杆菌MP108的液态培养物与副干酪乳杆菌MP137 的液态培养物的体积比是1：1。
如本文中所使用的，术语“实质上不含有(substantially free of)”意指一被具体指明的组分缺少有意义的含量。较佳地，该组分的含量对于该乳酸菌菌株的液态培养物的性质不具有可测量的影响 (measurable effect)。更佳地，该乳酸菌菌株的液态培养物完全不含有该组分。
该固液分离处理是选自于由下列所构成的群组：离心处理 (centrifugationtreatment)[例如，多级离心处理(Multi-stage centrifugation treatment)]、过滤处理(filtration treatment)、固液分离器处理(solid-liquid separator treatment)，以及它们的组合。在本发明的一个较佳具体例中，该固液分离处理是离心处理。
本发明亦提供一种如上所述的乳酸菌菌株培养物供应用于制备一用来预防和/或治疗与口腔病原菌有关联的疾病的组合物的用途。
依据本发明，该与口腔病原菌有关联的疾病是选自于由下列所构成的群组中的口腔疾病：口臭(halitosis)、龋齿(dental caries)、牙龈炎(gingivitis)、急性坏死溃疡性牙龈炎(acute necrotizing ulcerative gingivitis,ANUG)[又称为战壕口炎(trenchmouth)或文生氏病(Vincent’s disease)]以及牙周炎(periodontitis)。
如本文中所使用的，术语“预防(preventing)”或“预防 (prevention)”与口腔病原菌有关联的疾病意指一个体在还没有被诊断具有该疾病时，消除(eliminate)或减少(reduce)该疾病的发生率(incidence)，以及减缓(slow)、延迟(delay)、控制(control)或减少(decrease)该疾病的可能性(likelihood)或机率 (probability)。
如本文中所使用的，术语“治疗(treating)”或“治疗 (treatment)”与口腔病原菌有关联的疾病意指该疾病的严重性 (severity)或该疾病的症状(symptom)被减少(reduced)，或是该疾病被部分地(partially)或完全地(entirely)消除(eliminated)。
依据本发明，该与口腔病原菌有关联的疾病的治疗和/或预防可包括下列至少一者：抑制和/或防止口腔病原菌的生长(growth)、抑制和/或防止口腔病原菌的定殖(colonization)，以及抑制和/或防止口腔病原菌的生物膜形成(biofilm formation)。
依据本发明，该组合物可以是一食品组合物(food composition)，例如，呈一食品添加物(food additive)的形式，其可以被添加至一可食性材料(edible material)中以制备一供人类或动物食用的食品产品。依据本发明，该食物产品的种类可包括，但不限于：奶粉(milk powder)、发酵乳(fermented milk)、优格(yogurt)、乳酪(butter)、饮料(beverages)(例如，茶、咖啡)、机能性饮料(functional beverages)、面制品(flourproduct)、烘焙食品(baked foods)、甜点(confectionery)、糖果(candies)、发酵食品(fermented foods)、动物饲料(animal feeds)、保健食品(health foods)、婴儿食品(infant food)，以及膳食补充品(dietary supplements)。
依据本发明，该组合物可以是一口腔卫生组合物(oral hygiene composition)，例如，呈一添加物(additive)的形式，其可以被添加至一供人类或动物使用的口腔卫生产品。依据本发明，该口腔卫生产品的种类可包括，但不限于：漱口水(mouthwash)、口腔润洗剂(mouth rinse)、假牙浸洗液(dental soak)、牙膏(dental paste)、洁牙剂(dentifrices)、洁牙粉(dental powder)、洁牙凝胶(dental gel)、口腔喷剂(oralspray)、口嚼片(chewing tablet)、口香糖(chewing gum)、口含锭(lozenge)、口颊锭(buccal tablet)、牙线(dental floss)、洁牙带(dental tapes)，以及牙签(toothpick)。
依据本发明，该组合物可以是一药学组合物(pharmaceutical composition)。
依据本发明，该药学组合物可呈一适合于非经肠道投药 (parenteraladministration)、口服投药(oral administration)或局部投药(topicaladministration)的剂型(dosage form)。
依据本发明，该药学组合物可进一步包含有一被广泛地使用于药物制造技术的药学上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，该药学上可接受的载剂可包含一种或多种选自于下列的试剂：溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegrating agent)、分散剂(dispersing agent)、粘结剂 (binding agent)、赋形剂(excipient)、稳定剂(stabilizing agent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gelling agent)、防腐剂(preservative)、润湿剂(wetting agent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorption delaying agent)、脂质体 (liposome)以及类似物。有关这些试剂的选用与数量落在本领域技术人员的专业素养与例行技术范畴内。
依据本发明，该药学组合物可利用本领域技术人员所详知的技术而被制造成一适合于非经肠道投药的剂型。较佳地，该药学组合物被制造成适于以舌下投药(sublingualadministration)而被投药的剂型。
依据本发明，该药学组合物可利用本领域技术人员所详知的技术而被制造成一适合于口服投药的剂型，这包括，但不限于：无菌的粉末、锭剂(tablet)、片剂(troche)、口含锭、持续性膜衣锭(sustained film-coated tablet)、口内膏(oral ointment)、丸剂(pellet)、胶囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或细颗粒(granule)、溶液、悬浮液(suspension)、乳剂(emulsion)、糖浆(syrup)、酏剂 (elixir)、浓浆(slurry)、喷雾(spray)、滴剂(drop)，以及类似物。
依据本发明，该药学组合物亦可利用本领域技术人员所详知的技术而被制造成一适合于局部地施用于皮肤或黏膜上的制剂 (preparation)，这包括，但不限于：乳剂(emulsion)、凝胶(gel)、软膏(ointment)、乳霜(cream)、贴片(patch)、擦剂(liniment)、粉末(powder)、气溶胶(aerosol)、喷雾(spray)、乳液(lotion)、乳浆 (serum)、糊剂(paste)、泡沫(foam)、气溶胶(aerosol)、喷雾、滴剂、悬浮液(suspension)、油膏(salve)以及绷带(bandage)。
本发明亦提供一种用于预防和/或治疗与口腔病原菌有关联的疾病的方法，其包括对一有此需要的个体投予一如上所述的乳酸菌菌株的培养物。
如本文中所使用的，术语“投予(administering)”以及“投药 (administration)”可被交换地使用，并且意指通过任何合适的途径来对一个体导入(introducing)、提供(providing)或递送 (delivering)一预定的活性成分以执行其预期的效用。
如本文中所使用的，术语“个体(subject)”意指任何感兴趣的哺乳类动物，诸如人(humans)、猴子(monkeys)、牛(cows)、绵羊 (sheeps)、马(horses)、猪(pigs)、山羊(goats)、狗(dogs)、猫(cats)、小鼠(mice)以及大鼠(rats)。
依据本发明，该乳酸菌菌株的培养物的投药剂量与投药次数会视下列因素而变化：要被改善的疾病的严重性，投药途径，以及要被改善的个体的体重、年龄、身体状况与反应。一般而言，该乳酸菌菌株的培养物可呈单一剂量或是分成数个剂量的形式而被口服地、局部地或非经肠道地投药。
本发明亦提供一种用于抑制口腔病原菌生长的方法，其包含将一如上所述的组合物施用于一物件上。
依据本发明，该物件可以是医疗装置、医疗仪器、食品制备的台面、食品包装的台面、生产的台面、消费品、水处理系统，或者输水系统。
较佳地，该物件选自于由下列所构成的群组：假牙、口护套(mouth guard)、乳制品管线、水管、可粘性绷带(adhesive bandage)、水处理设备的组件、医疗仪器、牙科仪器、食品工业加工仪器、医院的桌与床、动物饮水盘、洗衣机、洗碗机、毛巾、碟子、盘子、碗、器皿、杯子、玻璃杯、砧板、盘子沥干架、水槽、厕所、马桶、食品与饮料的生产线、食品储藏容器、饮料储藏容器、叉子、刀子，以及勺子。
本发明将就下面的实施例来做进一步说明，但应了解的是，这些实施例只是供例示说明用，而不应被解释为本发明的实施上的限制。
<实施例>
一般实验材料：
1.乳酸菌菌株：
在下面实施例中拿来进行功效评估的乳酸菌菌株已被公开于CN 102604854B中，并且已有依据布达佩斯条约(the Budapest Treaty) 的规定被保藏于德国微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,DSMZ)，而已为公众可获得。另外，这些菌株亦有被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)。为表清楚，各个乳酸菌菌株的相关信息(包括：学名、保藏编号以及保藏日期等)已被整合于下面表1中。
表1.各个乳酸菌菌株的相关信息
Figure RE-GDA0003337281690000101
为供比较，亦有使用下列乳酸菌菌株：申请人自行从健康人类母乳中分离出的鼠李糖乳杆菌L-68以及从健康人体肠道中分离出的副干酪乳杆菌L-30。
2.乳酸菌菌株的培养物的制备：
首先，将上面第1项当中所述的4种乳酸菌菌株分别接种至补充有0.05％半胱氨酸(cysteine)的MRS肉汤培养基(MRS broth)(Difco, Cat.No.288130)中，并在培养箱(37℃、5％CO2)中进行培养历时24 小时，以活化菌株。之后，以MRS肉汤培养基将所形成的培养物的细菌浓度调整为1×109CFU/mL。
3.口腔病原菌菌株(oral pathogenic bacteria strains)：
在下面的实施例中所使用的口腔病原菌菌株皆是购自于中国台湾的食品工业发展研究所(FIRDI)的生物资源保存及研究中心 (BCRC)(300新竹市食品路331号，中国台湾)。为表清楚，各个口腔病原菌菌株的相关信息(包括：学名以及保藏编号)已被整合于下面表 2中。
表2.各个口腔病原菌株的相关信息
Figure RE-GDA0003337281690000102
4.口腔病原菌菌液的制备：
首先，将上面第3项当中所述的变种链球菌、牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌多形亚种以及放线共生聚集杆菌以表3当中所示的适用的培养基与培养条件来进行培养，其中，将变种链球菌予以培养历时20 小时，而牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌多形亚种以及放线共生聚集杆菌则是培养历时72小时，以活化菌株，借此而得到细菌浓度约为 1×107至1×109CFU/mL的各个口腔病原菌的菌液。
表3.各个口腔病原菌株的培养基与培养条件
Figure RE-GDA0003337281690000111
一般实验方法：
1.数据分析(data analysis)：
在下面的实施例中，各组的实验被重复3次，而实验数据是以“平均值(mean)”来表示。
实施例1.乳酸菌菌株的培养物在抗口腔病原菌上的效用评估
实验材料：
1.MRS琼脂培养板(MRS agar plate)：
将1.5％(w/v)的琼脂粉末(agar powder)添加到MRS肉汤培养基中，并依据本领域技术人员所详知且惯用的技术来制备MRS琼脂培养板以供后续实验之用。
2.上层琼脂培养基(top agar medium)：
将1.5％(w/v)的琼脂粉末分别添加到如上面表3所示的TSB培养基、添加有5％绵羊血液的TSB培养基以及添加有5％绵羊血液的BHI 培养基中，继而于121℃下进行灭菌处理历时15分钟。之后，将经融化的TSB琼脂培养基、添加有5％绵羊血液的TSB琼脂培养基以及添加有5％绵羊血液的BHI琼脂培养基置于45℃的水浴槽中，以供在后续实验中作为上层琼脂培养基之用。
实验方法：
在本实施例中，大体上参考Y.T.Chen et al.(2020),Lett.Appl. Microbiol.,70(4):310-317当中所述的方法来进行双层琼脂覆盖法 (double agar overlay method)，以评估各个乳酸菌菌株的培养物在抑制口腔病原菌生长上的效用。
首先，将上面“一般实验材料”的第2项当中所得到的各个乳酸菌菌株的培养物依照下面表4所示分为2个单菌实验组(亦即，单菌实验组1至2)、2个单菌比较组(亦即，单菌比较组1至2)，以及将鼠李糖乳杆菌MP108与副干酪乳杆菌MP137的培养物依照下面表5所示的体积比来予以混合，而得到复合菌实验组1至5的经混合的培养物，各组的总细菌浓度皆为1×109CFU/mL。
表4.各个单菌组所使用的乳酸菌菌株
组别 鼠李糖乳杆菌 副干酪乳杆菌
单菌实验组1 MP108 -
单菌实验组2 - MP137
单菌比较组1 L-68 -
单菌比较组2 - L-30
表5.各个复合菌组所使用的乳酸菌菌株的混合比例
Figure RE-GDA0003337281690000131
接着，以经灭菌处理的棉棒分别沾取各组的乳酸菌培养物(约1 mL)，继而于MRS琼脂培养板沿着直径划一条约2cm宽的线，继而在 37℃、半厌氧条件下进行培养历时48小时，而使得各组乳酸菌在MRS 琼脂培养基表面形成一条约2cm宽的乳酸菌生长区(growthzone)。另外，以不含有任何乳酸菌的MRS肉汤培养基于一MRS琼脂培养板上画线来作为空白对照组。
将经融化的TSB琼脂培养基(即上层琼脂培养基)倒入各组的培养板并均匀覆盖于MRS琼脂培养基上，待TSB琼脂培养基凝固后，以经灭菌处理的棉棒沾取上面“一般实验材料”的第4项当中所得到的变种链球菌菌液，并均匀涂抹于各组的TSB琼脂培养基表面，继而在培养箱(37℃、5％CO2)中进一步进行培养历时48小时。各组乳酸菌菌液在抑制变种链球菌生长上的效用是通过测量于各组在双层琼脂培养基表面上所形成的抑制区(inhibitionzone)的宽度而被评估。
各组乳酸菌菌液对于牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌多形亚种以及放线共生聚集杆菌的抑制效用大体上参照上面针对变种链球菌所描述的方式来进行评估，不同之处在于：分别以牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌多形亚种以及放线共生聚集杆菌菌液来代替变种链球菌菌液，并且以各个口腔病原菌菌株所适用的经融化的TSB琼脂培养基、添加有5％绵羊血液的TSB琼脂培养基以及添加有5％绵羊血液的BHI琼脂培养基来作为上层琼脂培养基。
之后，依照上面“一般实验方法”的第1项“数据分析”当中所述的方法来分析所得到的实验数据。
结果：
各组乳酸菌培养物所形成的口腔病原菌的抑制区宽度是如下面表6所示。
表6.各组乳酸菌培养物所形成的口腔病原菌的抑制区宽度
Figure RE-GDA0003337281690000141
由表6可见，对于不同的口腔病原菌，各个实验组皆形成有明显的抑制区，其中，各个单菌实验组所形成的抑制区宽度皆明显大于各个单菌比较组所具者，这表示：鼠李糖乳杆菌MP108与副干酪乳杆菌 MP137的培养物皆能够有效地抑制口腔病原菌生长，并且其抑制效用是明显优于相同菌种的不同分离株的所具者。
此外，相较于单菌实验组1至2，复合菌实验组2至4的抑制区宽度大致上有呈现出增加的趋势，特别是复合菌实验组3更有显著的提升。这表示：以1：1的比例来组合使用鼠李糖乳杆菌MP108与副干酪乳杆菌MP137的培养物能够在抑制口腔病原菌的生长上展现出协同效应(synergistic effect)。
实施例2.乳酸菌菌株的培养上清液在抗口腔病原菌上的效用评估
实验材料：
1.乳酸菌菌株的培养上清液的制备：
将上面“一般实验材料”的第2项当中所得到的各个乳酸菌菌株的培养物于4℃下以4,000rpm来进行离心历时10分钟使菌体沉淀，继而收取上清液，而分别得到各个乳酸菌菌株的发酵培养上清液。
实验方法：
A、以乳酸菌菌株的培养上清液与口腔病原菌进行共培养：
首先，将各个乳酸菌菌株的培养上清液依照上面表4所示分为2 个单菌实验组(亦即，单菌实验组1至2)、2个单菌比较组(亦即，单菌比较组1至2)，以及将鼠李糖乳杆菌MP108与副干酪乳杆菌MP137 的培养上清液依照上面表5所示的体积比来予以混合，而得到复合菌实验组1至5的经混合的培养上清液。接着，对各组的培养上清液各取100μL并分别添加至4.8mL的TSB培养基中。另外，取100μL 的不含有任何乳酸菌的MRS培养基添加至4.8mL的TSB培养基中作为空白对照组。
取100μL的上面“一般实验材料”的第4项当中所得到的变种链球菌菌液(其细菌浓度为1×107CFU/mL)添加至各组培养上清液中，并在培养箱(37℃、5％CO2)中进行共培养历时20小时。
另外，参照上面的实验步骤来分别进行各个乳酸菌培养上清液与牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌多形亚种以及放线共生聚集杆菌的共培养，不同之处在于：分别以牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌多形亚种以及放线共生聚集杆菌菌液来代替变种链球菌菌液，以及使用上面表3 所示的适用的培养基来代替TSB培养基，并且进行共培养历时48至 72小时。
B、乳酸菌菌株的培养上清液对于口腔病原菌生长抑制率的测定：
依据共培养的口腔病原菌菌株的种类，使用上面表3所示的适用的培养基来对上面第A项当中所得到的各组的共培养产物分别进行10倍连续稀释(10-fold serialdilution)，借此而得到各组的共培养产物在不同稀释倍数(101至1010倍)下的稀释液。接着，对这些稀释液分别取出100μL并将其均匀涂布在针对各个口腔病原菌菌株的适用的琼脂培养板上，继而于培养箱(37℃、5％CO2)中进行培养历时 48至72小时。之后，挑选一适合的稀释倍数来计算各组培养板上所形成的口腔病原菌菌落数，而各组乳酸菌菌株的培养上清液对口腔病原菌的抑制率则是通过将在相同的稀释倍数下于各组培养板上所形成的口腔病原菌菌落数代入下列公式(I)而被计算出：
公式(I)：A＝[(B-C)/B]×100
其中：A＝抑制率(％)
B＝空白对照组的菌落数
C＝各组的菌落数
之后，依照上面“一般实验方法”的第1项“数据分析”当中所述的方法来分析所得到的实验数据。
结果：
各组乳酸菌菌株的培养上清液对于口腔病原菌的抑制率如下面表7所示。
表7.各组乳酸菌菌株的培养上清液对于口腔病原菌的抑制率
Figure RE-GDA0003337281690000161
由表7可见，对于不同的口腔病原菌，各个实验组的培养上清液皆具有明显的抑制效用，其中，各个单菌实验组对口腔病原菌的抑制率皆显著大于各个单菌比较组所具者，这表示：鼠李糖乳杆菌MP108 与副干酪乳杆菌MP137的培养上清液能够有效地抑制口腔病原菌生长，并且其抑制效用是明显优于相同菌种的不同分离株的所具者。
此外，相较于单菌实验组1至2，复合菌实验组2至4对于口腔病原菌的生长抑制率大致上有呈现出提升的趋势，特别是复合菌实验组3更有显著的升高。这表示：以1：1的比例来组合使用鼠李糖乳杆菌MP108与副干酪乳杆菌MP137的培养上清液能够在抑制口腔病原菌的生长上展现出协同效应。
实施例3.经热灭活(heat-inactivated)的乳酸菌菌株的培养物在抗口腔病原菌上的效用评估
实验材料：
1.经热灭活的乳酸菌菌株培养物的制备：
将上面“一般实验材料”的第2项当中所得到的各个乳酸菌菌株的培养物于100℃下进行加热历时1小时，而分别得到各个经热灭活的乳酸菌菌株培养物(仍具有一为1×109CFU/mL的细菌浓度)。
实验方法：
本实施例大体上是参考实施例2的第A项以及第B项当中所述的实验步骤来进行，以评估各个经热灭活的乳酸菌菌株培养物在抑制口腔病原菌生长上的效用。不同之处在于，以各个经热灭活的乳酸菌菌株培养物来代替各个乳酸菌菌株的培养上清液。
之后，依照上面“一般实验方法”的第1项“数据分析”当中所述的方法来分析所得到的实验数据。
结果：
各组经热灭活的乳酸菌菌株培养物对于口腔病原菌的抑制率是如下面表8所示。
表8.各组经热灭活的乳酸菌菌株培养物对于口腔病原菌的抑制率
Figure RE-GDA0003337281690000181
由表8可见，对于不同的口腔病原菌，各个实验组经热灭活的乳酸菌菌株培养物皆展现出明显的抑制效用，其中，各个单菌实验组对口腔病原菌的抑制率皆显著大于各个单菌比较组所具者，这表示：经热灭活的鼠李糖乳杆菌MP108与副干酪乳杆菌MP137能够有效地抑制口腔病原菌生长，并且其抑制效用是明显优于其他经热灭活的相同菌种的不同分离株的培养物的所具者。
此外，相较于单菌实验组1至2，复合菌实验组2至4对于口腔病原菌的抑制率大致上有呈现出提升的趋势，特别是复合菌实验组3 更有显著的升高(皆高于90％)。这表示：以1：1的比例来组合使用经热灭活的鼠李糖乳杆菌MP108与副干酪乳杆菌MP137的培养物能够在抑制口腔病原菌的生长上展现出协同效应。
综合以上的实验结果可知，无论是鼠李糖乳杆菌MP108与副干酪乳杆菌MP137的培养物、经热灭活的培养物还是不含有菌体的培养上清液，皆对于口腔病原菌的生长具有优异的抑制效用，并且在相互组合下还能进一步提升此效用，因而被预期可供用于制备一用来治疗和 /或预防与口腔病原菌有关联的疾病，特别是口腔疾病。
于本说明书中被引述的所有专利和文献以其整体被并入本申请作为参考资料。若有所冲突时，本申请详细说明(包含限定在内)将占上风。
虽然本发明已参考上述特定的具体例被描述，明显地在不背离本发明的范围和精神之下可作出很多的修改和变化。因此意欲的是，本发明仅受如随文检附的权利要求书所示者的限制。
生物材料保藏信息说明
保藏编号：CGMCC No.21224
分类命名：Lactobacillus paracasei
保藏日期：2020年11月23日
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏编号：CGMCC No.21225
分类命名：Lactobacillus rhamnosus
保藏日期：2020年11月23日
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

Claims (10)

1.一种乳酸菌菌株的培养物供应用于制备一用来抑制口腔病原菌生长的组合物的用途，其特征在于：所述乳酸菌菌株是选自于由下列所构成的群组：鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)MP108(CGMCC No.21225)、副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)MP137(CGMCC No.21224)，以及它们的组合。
2.一种乳酸菌菌株的培养物供应用于制备一用来预防和/或治疗与口腔病原菌有关联的疾病的组合物的用途，其特征在于：所述乳酸菌菌株是选自于由下列所构成的群组：鼠李糖乳杆菌MP108(CGMCC No.21225)、副干酪乳杆菌MP137(CGMCC No.21224)，以及它们的组合。
3.根据权利要求1或2的用途，其特征在于：所述组合物包含有鼠李糖乳杆菌MP108的培养物以及副干酪乳杆菌MP137的培养物。
4.根据权利要求3的用途，其特征在于：所述培养物是液态培养物。
5.根据权利要求4的用途，其特征在于：在所述组合物中，鼠李糖乳杆菌MP108与副干酪乳杆菌MP137的菌数比落在1：0.43至1：2.33的范围内。
6.根据权利要求4的用途，其特征在于：所述液态培养物是经热灭活处理的。
7.根据权利要求4的用途，其特征在于：所述液态培养物实质上不含有菌体。
8.根据权利要求7的用途，其特征在于：在所述组合物中，鼠李糖乳杆菌MP108的液态培养物与副干酪乳杆菌MP137的液态培养物的体积比落在1：0.43至1：2.33的范围内。
9.根据权利要求1或2的用途，其特征在于：所述口腔病原菌是选自于由下列所构成的群组中的菌种：变种链球菌(Streptococcus mutans)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)、具核梭杆菌多形亚种(Fusobacterium nucleatum subsp.polymorphum)、放线共生聚集杆菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)、齿垢密螺旋体(Treponemadenticola)、中间普雷沃氏菌(Prevotella intermedia)、Parvimonas micra、直肠弯曲菌(Campylobacter rectus)、啮蚀艾肯氏菌(Eikenella corrodens)，以及它们的组合。
10.根据权利要求1或2的用途，其特征在于：所述组合物是一食品组合物或一药学组合物。
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