CN115671144A - 使用乳酸菌菌株的培养物来抑制肠道病原菌生长和预防和/或治疗与肠道病原菌有关的疾病 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用乳酸菌菌株的培养物来抑制肠道病原菌生长和预防和/或治疗与肠道病原菌有关的疾病。本发明揭示乳酸菌菌株的培养物可被用来抑制肠道病原菌的生长。本发明亦揭示乳酸菌菌株的培养物可被用来预防和/或治疗与肠道病原菌有关联的疾病。

Description

使用乳酸菌菌株的培养物来抑制肠道病原菌生长和预防和/ 或治疗与肠道病原菌有关的疾病
技术领域
本发明涉及使用乳酸菌菌株的培养物来抑制肠道病原菌生长，以及使用乳酸菌菌株的培养物来预防和/或治疗与肠道病原菌有关联的疾病。
背景技术
肠道病原菌(enteric pathogenic bacteria)是一群存在于人类与动物的肠道、水以及腐败的食物中的细菌，常见的肠道病原菌包含有肠道沙门氏菌(Salmonellaenterica)、李斯特单胞菌(Listeria monocytogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)以及肠炎弧菌(Vibrio parahaemolyticus)。与肠道病原菌有关联的疾病(enteric pathogenicbacterium-associated disorder)包括：腹泻(diarrhea)、胃肠炎(gastroenteritis)[例如，胃炎(gastritis)与肠炎 (enteritis)]、溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)、伤寒热 (typhoid fever)以及菌血症(bacteremia)等。
目前大多使用抗生素来治疗与肠道病原菌有关联的疾病，然而，抗生素会使得肠道病原菌产生抗生素耐性(antibiotic resistance)，并且会导致严重副作用(sideeffect)与不良反应(adverse effect)。因此，本领域的相关研究人员皆致力于开发可以有效地预防和/或治疗肠道病原菌感染并且不会产生非所欲的副作用的药物。
乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)是属于一般被公认为安全的(generallyrecognized as safe,GRAS)并且为人所熟悉与广泛使用的益生菌(probiotics)。常见的乳酸菌包括：乳酸杆菌属 (Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、片球菌属(Pediococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)以及明串珠菌属 (Leuconostoc)等。
目前已有研究是关于乳酸菌菌株在抗肠道病原菌上的应用。例如，CN 102604854B揭示鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)MP108 以及副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)MP137能对抗肠道病原菌。在该专利案的实施例中，鼠李糖乳杆菌MP108以及副干酪乳杆菌MP137分别被证实能够通过抑制或代替肠道沙门氏菌肠道亚种 (Salmonellaenterica subsp.enterica)(BCRC 10744)以及大肠杆菌(Escherichia coli)(BCRC15372)吸附于肠道上来达到抗肠道病原菌感染的效用。
虽然已存在有上述文献报导，本领域中仍然存在有一需要去开发可以直接抑制肠道病原菌生长且更有效地预防和/或治疗与肠道病原菌有关联的疾病的乳酸菌以供产业界之用。
发明内容
于本发明中，申请人发现，组合使用鼠李糖乳杆菌 (Lactobacillus rhamnosus)MP108(CGMCC No.21225)以及副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)MP137(CGMCCNo.21224)的培养物(包括含有菌体的培养物以及不含有菌体的培养上清液)皆具有抗肠道病原菌(enteric pathogenic bacteria)的效用。此外，这些乳酸菌的组合在经热灭活处理(heat-inactivation treatment)(于 100℃下进行加热历时1小时)后仍具类似的效用(数据未显示)。
于是，在第一个方面，本发明提供一种乳酸菌菌株的培养物供应用于制备一用来抑制肠道病原菌生长的组合物的用途，其中该乳酸菌菌株是一含有鼠李糖乳杆菌MP108以及副干酪乳杆菌MP137的组合。
在第二个方面，本发明提供一种乳酸菌菌株的培养物供应用于制备一用来预防和/或治疗与肠道病原菌有关联的疾病的组合物的用途，其中该乳酸菌菌株是一含有鼠李糖乳杆菌MP108以及副干酪乳杆菌MP137的组合。
较佳地，其中该培养物是液态培养物。
较佳地，其中在该组合物中，鼠李糖乳杆菌MP108与副干酪乳杆菌MP137的菌数比落在1：0.43至1：2.33的范围内。
较佳地，其中该液态培养物是经热灭活处理的。
较佳地，其中该液态培养物实质上不含有菌体。
较佳地，其中在该组合物中，鼠李糖乳杆菌MP108的液态培养物与副干酪乳杆菌MP137的液态培养物的体积比落在1：0.43至1：
2.33的范围内。
较佳地，其中该肠道病原菌是选自于由下列所构成的群组中的菌种：肠道沙门氏菌肠道亚种(Salmonella enterica subsp. enterica)、李斯特单胞菌(Listeriamonocytogenes)、大肠杆菌 (Escherichia coli)、肠炎弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、痢疾杆菌(Shigella boydii)、痢疾志贺杆菌(Shigella dysenteriae)、克雷伯氏肺炎杆菌 (Klebsiella pneumoniae)、小肠大肠炎耶氏杆菌(Yersinia enterocolitica)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)，以及它们的组合。
较佳地，其中该组合物是一食品组合物或一药学组合物。
更佳地，其中该药学组合物呈一供口服投药或供局部投药的剂型。
具体实施方式
为了本说明书的目的，将被清楚地了解的是：文字“包含有 (comprising)”意指“包含但不限于”，以及文字“包括 (comprises)”具有一对应的意义。
除非另外有所定义，在本文中所使用的所有技术性与科学术语具有本领域技术人员所共同了解的意义。本领域技术人员会认知到许多与那些被描述于本文中者相似或等效的方法和材料，它们可被用于实施本发明。当然，本发明决不受到所描述的方法和材料的限制。
本发明提供一种乳酸菌菌株的培养物供应用于制备一用来抑制肠道病原菌生长的组合物的用途，其中该乳酸菌菌株是一含有鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)MP108(CGMCC No.21225)以及副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)MP137(CGMCCNo.21224) 的组合。
依据本发明，该肠道病原菌是选自于由下列所构成的群组中的菌种：肠道沙门氏菌肠道亚种(Salmonella enterica subsp.enterica)、李斯特单胞菌(Listeriamonocytogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、肠炎弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)、痢疾杆菌(Shigella boydii)、痢疾志贺杆菌(Shigella dysenteriae)、克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)、小肠大肠炎耶氏杆菌(Yersinia enterocolitica)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)，以及它们的组合。
依据本发明，该乳酸菌菌株的培养物可通过将具有一范围落在 106至1010CFU/mL内的细菌浓度的这些乳酸菌菌株培养于一适于生长的培养基中而被获得。在本发明的一个较佳具体例中，这些乳酸菌菌株具有一范围落在107至109CFU/mL内的细菌浓度。
如本文中所使用的，术语“培养(culturing)”、“发酵 (fermentation)”以及“培育(cultivation)”可被交换地使用。
有关培养的操作过程与参数条件等落在本领域技术人员的专业素养与例行技术范畴内。在此方面，可以参考，例如，Hsieh P.S.et al.(2013),New Microbiol.,36:167-179。
依据本发明，适用于培养这些乳酸菌菌株的培养基可以是本领域技术人员自行配制的，或者是商业上可购得的产品，这包括，但不限于：MRS肉汤培养基(MRS broth)以及添加有半胱氨酸(cysteine)的 MRS肉汤培养基。
依据本发明，该乳酸菌菌株的培养物是一液态培养物，并且可具有一范围落在106至1010CFU/mL内的细菌浓度。在本发明的一个较佳具体例中，该乳酸菌菌株的培养物具有一范围落在107至109CFU/mL 的细菌浓度。
依据本发明，在该组合物中，鼠李糖乳杆菌MP108与副干酪乳杆菌MP137的菌数比落在1：0.43至1：2.33的范围内。在本发明的一个较佳具体例中，鼠李糖乳杆菌MP108与副干酪乳杆菌MP137的菌数比是1：1。
依据本发明，该乳酸菌菌株的培养物或液态培养物可以是经热灭活处理(heat-inactivation treatment)的。
依据本发明，该热灭活处理可以通过在100℃下加热历时30分钟至1小时来进行。在本发明的一个较佳具体例中，该乳酸菌的热灭活在100℃下加热历时1小时来进行。
依据本发明，该乳酸菌菌株的液态培养物可以经固液分离处理而实质上不含有菌体。
当该液态培养物不含有菌体时，较佳地，在该组合物中，鼠李糖乳杆菌MP108的液态培养物与副干酪乳杆菌MP137的液态培养物的体积比落在1：0.43至1：2.33的范围内。在本发明的一个较佳具体例中，鼠李糖乳杆菌MP108的液态培养物与副干酪乳杆菌MP137的液态培养物的体积比是1：1。
如本文中所使用的，术语“实质上不含有(substantially free of)”意指一被具体指明的组分缺少有意义的含量。较佳地，该组分的含量对于该乳酸菌菌株的液态培养物的性质不具有可测量的影响 (measurable effect)。更佳地，该乳酸菌菌株的液态培养物完全不含有该组分。
该固液分离处理是选自于由下列所构成的群组：离心处理 (centrifugationtreatment)[例如，多级离心处理(Multi-stage centrifugation treatment)]、过滤处理(filtration treatment)，以及它们的组合。在本发明的一个较佳具体例中，该固液分离处理是离心处理。
本发明也提供一种如上所述的乳酸菌菌株的培养物供应用于制备一用来预防和/或治疗与肠道病原菌有关联的疾病的组合物的用途。
依据本发明，该与肠道病原菌有关联的疾病是选自于由下列所构成的群组中的肠道疾病：腹泻(diarrhea)[例如,感染性腹泻 (infectious diarrhea)与旅行性腹泻(traveler’s diarrhea)]、胃肠炎(gastroenteritis)[例如，胃炎(gastritis)与肠炎(enteritis)]、溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)、伤寒热 (typhoid fever)、菌血症(bacteremia)、坏死性小肠结肠炎 (necrotizing enterocolitis)以及赤痢(dysentery)。
如本文中所使用的，术语“预防(preventing)”或“预防 (prevention)”与肠道病原菌有关联的疾病意指一个体在还没有被诊断具有该疾病时，消除(eliminate)或减少(reduce)该疾病的发生率(incidence)，以及减缓(slow)、延迟(delay)、控制(control)或减少(decrease)该疾病的可能性(likelihood)或机率(probability)。
如本文中所使用的，术语“治疗(treating)”或“治疗 (treatment)”与肠道病原菌有关联的疾病意指该疾病的严重性 (severity)或该疾病的症状(symptom)被减少(reduced)，或该疾病被部分地(partially)或完全地(entirely)消除(eliminated)。
依据本发明，该与肠道病原菌有关联的疾病的治疗和/或预防可包括下列至少一者：抑制和/或防止肠道病原菌的生长(growth)、抑制和/或防止肠道病原菌的定殖(colonization)，以及抑制和/或防止肠道病原菌的生物膜形成(biofilm formation)。
依据本发明，该组合物可以是一食品组合物(food composition)，例如，呈一食品添加物(food additive)的形式，其可以被添加至一可食性材料(edible material)中以制备一供人类或动物食用的食品产品。依据本发明，该食物产品的种类可包括，但不限于：奶粉(milk powder)、发酵乳(fermented milk)、优格(yogurt)、奶酪(butter)、饮料(beverages)(例如，茶、咖啡)、机能性饮料(functional beverages)、面制品(flourproduct)、烘焙食品(baked foods)、甜点(confectionery)、糖果(candies)、发酵食品(fermented foods)、动物饲料(animal feeds)、保健食品(health foods)、婴儿食品(infant food)，以及膳食补充品(dietary supplements)。
依据本发明，该组合物可以是一药学组合物(pharmaceutical composition)。
依据本发明，该药学组合物可呈一适合于非经肠道投药 (parenteraladministration)、口服投药(oral administration)或局部投药(topicaladministration)的剂型(dosage form)。
依据本发明，该药学组合物可进一步包含有一被广泛地使用于药物制造技术的药学上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，该药学上可接受的载剂可包含一种或多种选自于下列的试剂：溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegrating agent)、分散剂(dispersing agent)、粘结剂 (binding agent)、赋形剂(excipient)、稳定剂(stabilizing agent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gelling agent)、防腐剂(preservative)、润湿剂(wetting agent)、润滑剂 (lubricant)、吸收延迟剂(absorption delaying agent)、脂质体 (liposome)以及类似物。有关这些试剂的选用与数量落在本领域技术人员的专业素养与例行技术范畴内。
依据本发明，该药学组合物可利用本领域技术人员所详知的技术而被制造成一适合于非经肠道投药的剂型[包括注射品(injection)，例如，无菌的水性溶液(sterileaqueous solution)或分散液 (dispersion)]，且以一选自于由下列所构成的群组中的途径来投药：腹膜内注射(intraperitoneal injection)、胸膜内注射 (intrapleuralinjection)、肌肉内注射(intramuscular injection)、静脉内注射(intravenousinjection)、动脉内注射(intraarterial injection)、关节内注射(intraarticularinjection)、滑液内注射 (intrasynovial injection)、椎管内注射(intrathecalinjection)、颅内注射(intracranial injection)、表皮内注射(intraepidermalinjection)、皮下注射(subcutaneous injection)、皮内注射 (intradermal injection)、病灶内注射(intralesional injection)、以及舌下投药(sublingual administration)。较佳地，该药学组合物被制造成适于以病灶内注射而被投药的剂型。
依据本发明，该药学组合物可利用本领域技术人员所详知的技术而被制造成一适合于口服投药的剂型，这包括，但不限于：无菌的粉末、锭剂(tablet)、片剂(troche)、口含锭、持续性膜衣锭(sustained film-coated tablet)、口内膏(oral ointment)、丸剂(pellet)、胶囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或细颗粒(granule)、溶液、悬浮液(suspension)、乳剂(emulsion)、糖浆(syrup)、酏剂 (elixir)、浓浆(slurry)以及类似物。
依据本发明，该药学组合物亦可利用本领域技术人员所详知的技术而被制造成一适合于局部地施用于皮肤上的外部制剂(external preparation)，这包括，但不限于：乳剂(emulsion)、凝胶(gel)、软膏(ointment)、乳霜(cream)、贴片(patch)、擦剂(liniment)、粉末(powder)、气溶胶(aerosol)、喷雾(spray)、乳液(lotion)、乳浆(serum)、糊剂(paste)、泡沫(foam)、滴剂(drop)、悬浮液 (suspension)、油膏(salve)以及绷带(bandage)。
本发明亦提供一种用于预防和/或治疗与肠道病原菌有关联的疾病的方法，其包括对一有此需要的个体投予一如上所述的乳酸菌菌株的培养物。
如本文中所使用的，术语“投予(administering)”以及“投药 (administration)”可被交换地使用，并且意指通过任何合适的途径来对一个体导入(introducing)、提供(providing)或递送 (delivering)一预定的活性成分以执行其预期的效用。
如本文中所使用的，术语“个体(subject)”意指任何感兴趣的哺乳类动物，诸如人(humans)、猴子(monkeys)、牛(cows)、绵羊 (sheeps)、马(horses)、猪(pigs)、山羊(goats)、狗(dogs)、猫(cats)、小鼠(mice)以及大鼠(rats)。
依据本发明，该乳酸菌菌株的培养物的投药剂量与投药次数会视下列因素而变化：要被改善的疾病的严重性，投药途径，以及要被改善的个体的体重、年龄、身体状况与反应。一般而言，该乳酸菌菌株的培养物可呈单一剂量或分成多个剂量的形式而被口服地、局部地或非经肠地道投药。
本发明亦提供一种用于抑制肠道病原菌生长的方法，其包含将一如上所述的组合物施用于一物件(object)上。
依据本发明，该物件可以是医疗装置、医疗仪器、食品制备的台面、食品包装的台面、生产的台面、消费品、水处理系统，或者输水系统。
较佳地，该物件选自于由下列所构成的群组：假牙(denture)、口护套(mouthguard)、乳制品管线、水管、可黏性绷带(adhesive bandage)、水处理设备的组件、医疗仪器、牙科仪器、食品工业加工仪器、医院的桌与床、动物饮水盘、洗衣机、洗碗机、毛巾、碟子、盘子、碗、器皿、杯子、玻璃杯、砧板、盘子沥干架、水槽、厕所、马桶、食品与饮料的生产线、食品储藏容器、饮料储藏容器、叉子、刀子，以及勺子。
本发明将就下面的实施例来做进一步说明，但应了解的是，这些实施例只是供例示说明用，而不应被解释为本发明的实施上的限制。
<实施例>
一般实验材料：
1.乳酸菌菌株：
在下面实施例中拿来进行功效评估的乳酸菌菌株已被公开于CN 102604854B中，并且已有依据布达佩斯条约(the Budapest Treaty) 的规定被保藏于德国微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,DSMZ)，而已为公众可获得。另外，这些菌株亦有被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)。为表清楚，各个乳酸菌菌株的相关信息(包括：学名、保藏编号以及保藏日期等)已被整合于下面表1中。
表1.各个乳酸菌菌株的相关信息
Figure BDA0003181642010000091
为供比较，亦有使用下列乳酸菌菌株：申请人自行从健康人类母乳中分离出的鼠李糖乳杆菌L-68以及从健康人体肠道中分离出的副干酪乳杆菌L-30。
2.乳酸菌菌株的培养物的制备：
首先，将上面第1项当中所述的4种乳酸菌菌株分别接种至补充有0.05％半胱氨酸(cysteine)的MRS肉汤培养基(MRS broth)(Difco, Cat.No.288130)中，并在培养箱(37℃、5％CO2)中进行培养历时24 小时，用来活化菌株。接着，将经活化的菌株分别以一为2％(v/v) 的接种量接种至MRS肉汤培养基中，并在培养箱(37℃、5％CO2)中进行继代培养(subculture)历时24小时。之后，以MRS肉汤培养基将所形成的培养物调整为具有一为1×109CFU/mL的细菌浓度。
3.肠道病原菌菌株(enteric pathogenic bacteria strains)：
在下面的实施例中所使用的肠道病原菌菌株皆购自于中国台湾的食品工业发展研究所(FIRDI)的生物资源保存及研究中心 (BCRC)(300新竹市食品路331号，中国台湾)。为表清楚，各个肠道病原菌菌株的相关信息(包括：学名以及保藏编号)已被整合于下面表2中。
表2.各个肠道病原菌菌株的相关信息
Figure BDA0003181642010000101
4.肠道病原菌菌液的制备：
首先，将上面第3项当中所述的肠道沙门氏菌肠道亚种、李斯特单胞菌、大肠杆菌以及肠炎弧菌以表3当中所示的适用培养基与培养条件来进行培养历时20小时，用来活化菌株。接着，将经活化的菌株分别以一为2％(v/v)的接种量并以表3所示的培养基与培养条件进行继代培养，借此得到细菌浓度约为1×107至9×107CFU/mL的各个肠道病原菌的菌液。
表3.各个肠道病原菌菌株的培养基与培养条件
Figure BDA0003181642010000111
一般实验方法：
1.数据分析(data analysis)：
在下面的实施例中，各组的实验被重复3次，而实验数据以“平均值(mean)”来表示。
实施例1.乳酸菌菌株的培养物在抗肠道病原菌效用上的评估：
实验材料：
1.MRS琼脂培养板(MRS agar plate)：
将1.5％(w/v)的琼脂粉末(agar powder)添加到MRS肉汤培养基中，并依据本领域技术人员所详知且惯用的技术来制备MRS琼脂培养板以供后续实验之用。
2.上层琼脂培养基(top agar medium)：
将1.5％(w/v)的琼脂粉末分别添加到如上面表3所示的NB培养基、BHI培养基以及添加有2.5％氯化钠的TSB培养基中，继而于121℃下进行灭菌处理历时15分钟。之后，将经融化的NB琼脂培养基、BHI 琼脂培养基以及添加有2.5％氯化钠的TSB琼脂培养基置于45℃的水浴槽中，以供在后续实验中作为上层琼脂培养基之用。
实验方法：
在本实施例中，大体上参考Y.T.Chen et al.(2020),Lett.Appl. Microbiol.,70(4):310-317当中所述的方法来进行双层琼脂覆盖法 (double agar overlay method)，用来评估各个乳酸菌菌株的培养物在抑制肠道病原菌生长上的效用。
首先，将上面“一般实验材料”的第2项当中所得到的各个乳酸菌菌株的培养物依照下面表4所示分为4个单菌比较组(亦即，单菌比较组1至4，以及依照下面表5所示的体积比来相互混合鼠李糖乳杆菌MP108与副干酪乳杆菌MP137的培养物，而制得复合菌实验组1至5的经混合的培养物，各组的总细菌浓度皆为1×109CFU/mL。
表4.各个单菌比较组所处理的乳酸菌菌株
组别 鼠李糖乳杆菌 副干酪乳杆菌
单菌比较组1 MP108 -
单菌比较组2 - MP137
单菌比较组3 L-68 -
单菌比较组4 - L-30
表5.各个复合菌实验组所处理的乳酸菌菌株的混合比例
Figure BDA0003181642010000131
接着，以经灭菌处理的棉棒分别沾取各组乳酸菌培养物(约1mL)，继而于MRS琼脂培养板沿着直径划一条约2cm宽的线，继而在37℃下进行培养历时48小时，而使得各组乳酸菌在MRS琼脂培养基表面形成一条约2cm宽的乳酸菌生长区(growth zone)。另外，以不含有任何乳酸菌的MRS培养基于一MRS琼脂培养板上画线来作为空白对照组。
将经融化的NB琼脂培养基(即上层琼脂培养基)倒入各组的培养板并均匀覆盖于MRS琼脂培养基上，待NB琼脂培养基凝固后，以经灭菌处理的棉棒沾取上面“一般实验材料”的第4项当中所得到的肠道沙门氏菌肠道亚种菌液，并均匀涂抹于各组的NB琼脂培养基表面，继而在培养箱(37℃、5％CO2)中进一步进行培养历时24小时。各组乳酸菌菌液在抑制肠道沙门氏菌肠道亚种生长上的效用通过测量于各组在双层琼脂培养基表面上所形成的抑制区(inhibition zone)的宽度而被评估。
各组乳酸菌菌液对于大肠杆菌、李斯特单胞菌以及肠炎弧菌的抑制效用大体上参照上面针对肠道沙门氏菌肠道亚种所描述的方式来进行评估，不同之处在于：分别以大肠杆菌、李斯特单胞菌以及肠炎弧菌菌液来代替肠道沙门氏菌肠道亚种菌液，并且以经融化的NB琼脂培养基、BHI琼脂培养基以及添加有2.5％氯化钠的TSB琼脂培养基来作为上层琼脂培养基。
之后，依照上面“一般实验方法”的第1项“数据分析”当中所述的方法来分析所得到的实验数据。
结果：
各组乳酸菌培养物所形成的肠道病原菌的抑制区宽度如下面表6 所示。
表6.各组乳酸菌培养物所形成的肠道病原菌的抑制区宽度
Figure BDA0003181642010000141
由表6可见，对于不同的肠道病原菌，各个复合菌实验组皆形成有明显的抑制区并大于单菌比较组3与4所具者。特别地，相较于单菌比较组1至2，复合菌实验组2至4的抑制区宽度大致上呈现出增加的趋势，其中复合菌实验组3更具有显著的提升。这表示：以1：1 的比例来组合使用鼠李糖乳杆菌MP108与副干酪乳杆菌MP137的培养物能够在抑制肠道病原菌的生长上展现出协同效应(synergistic effect)。
实施例2.乳酸菌菌株的培养上清液(culture supernatant)在抗肠道病原菌效用上的评估：
实验材料：
1.乳酸菌菌株的培养上清液的制备：
将上面“一般实验材料”的第2项当中所得到的各个乳酸菌菌株的培养物于4℃下以4,000rpm来进行离心历时10分钟使菌体沉淀，继而收取上清液，而分别得到各个乳酸菌菌株的培养上清液。
实验方法：
A、使用乳酸菌菌株的培养上清液与肠道病原菌进行共培养：
首先，将各个乳酸菌菌株的培养上清液依照上面表4所示分为4 个单菌比较组(亦即，单菌比较组1至4)，以及依照上面表5所示的体积比来相互混合鼠李糖乳杆菌MP108与副干酪乳杆菌MP137的培养上清液，而制得复合菌实验组1至5的经混合的培养上清液。接着，对各组的培养上清液各取100μL并分别添加至4.8mL的NB培养基中。另外，取200μL的不含有任何乳酸菌的MRS培养基添加至4.8mL 的NB培养基中作为空白对照组。
取100μL的上面“一般实验材料”的第4项当中所得到的沙门氏菌肠道亚种菌液(细菌浓度为1×107CFU/mL)添加至各组培养上清液中，并在培养箱(37℃、5％CO2)中进行共培养历时20小时。
另外，参照上面的实验步骤来分别进行各组乳酸菌培养上清液与大肠杆菌、李斯特单胞菌以及肠炎弧菌的共培养，不同之处在于：分别以大肠杆菌、李斯特单胞菌以及肠炎弧菌菌液来代替肠道沙门氏菌肠道亚种菌液，以及使用上面表3所示的适用的培养基来代替NB培养基，并且进行共培养历时24小时，其中大肠杆菌进行共培养历时 48小时。
B、乳酸菌菌株的培养上清液对于肠道病原菌生长抑制率的测定：
依据共培养的肠道病原菌菌株的种类，使用上面表3所示的适用培养基来对上面第A项当中所得到的各组的共培养产物分别进行10 倍连续稀释(10-fold serialdilution)，借此而得到各组的共培养产物在不同稀释倍数(101至1010倍)下的稀释液。接着，对这些稀释液分别取出100μL并将其均匀涂布在针对各个肠道病原菌菌株的适用琼脂培养板上，继而于培养箱(37℃、5％CO2)中进行培养历时24-48 小时。之后，挑选一适合的稀释倍数来计算各组培养板上所形成的肠道病原菌菌落数，而各组乳酸菌菌株的培养上清液对肠道病原菌的抑制率(inhibition rate)通过将在相同的稀释倍数下于各组培养板上所形成的肠道病原菌菌落数代入下列公式(1)而被计算出：
公式(1)：A＝[(B-C)/B]×100
其中：A＝抑制率(％)
B＝空白对照组的菌落数
C＝各组的菌落数
之后，依照上面“一般实验方法”的第1项“数据分析”当中所述的方法来分析所得到的实验数据。
结果：
各组乳酸菌菌株的培养上清液对于肠道病原菌的抑制率如下面表7所示。
表7.各组乳酸菌菌株的培养上清液对于肠道病原菌的抑制率
Figure BDA0003181642010000161
由表7可见，对于不同的肠道病原菌，各个复合菌实验组的培养上清液皆具有抑制效用并大于单菌比较组3与4所具者。特别地，相较于单菌比较组1与2，复合菌实验组2至4对于肠道病原菌的生长抑制率大致上呈现出增加的趋势，其中复合菌实验组3更具有显著的提升。这表示：以1：1的比例来组合使用鼠李糖乳杆菌MP108与副干酪乳杆菌MP137的培养上清液能够在抑制肠道病原菌的生长上展现出协同效应。
综合以上的实验结果可知，组合使用鼠李糖乳杆菌MP108与副干酪乳杆菌MP137的培养物或不含有菌体的培养上清液，皆可对肠道病原菌的生长展现优异的抑制效用，因而被预期可供用于制备一用来治疗和/或预防与肠道病原菌有关联的疾病，特别是肠道疾病。
于本说明书中被引述的所有专利和文献以其整体被并入本申请作为参考数据。若有所冲突时，本申请详细说明(包含界定在内)将占上风。
虽然本发明已参考上述特定的具体例被描述，明显地在不背离本发明的范围和精神下可作出很多的修改和变化。因此意欲的是，本发明仅受如随文检附的权利要求书所示者的限制。
生物材料保藏信息说明
保藏编号：CGMCC No.21224
分类命名：副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)MP137
保藏日期：2020年11月23日
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏编号：CGMCC No.21225
分类命名：鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)MP108
保藏日期：2020年11月23日
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

Claims (10)

1.一种乳酸菌菌株的培养物供应用于制备用来抑制肠道病原菌生长的组合物的用途，其特征在于：所述乳酸菌菌株是含有鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)MP108(CGMCC No.21225)以及副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)MP137(CGMCCNo.21224)的组合。
2.一种乳酸菌菌株的培养物供应用于制备用来预防和/或治疗与肠道病原菌有关联的疾病的组合物的用途，其特征在于：所述乳酸菌菌株是含有鼠李糖乳杆菌MP108(CGMCCNo.21225)以及副干酪乳杆菌MP137(CGMCC No.21224)的组合。
3.根据权利要求1或2的用途，其特征在于：所述培养物是液态培养物。
4.根据权利要求3的用途，其特征在于：在所述组合物中，鼠李糖乳杆菌MP108与副干酪乳杆菌MP137的菌数比落在1：0.43至1：2.33的范围内。
5.根据权利要求4的用途，其特征在于：所述液态培养物是经热灭活处理的。
6.根据权利要求3的用途，其特征在于：所述液态培养物实质上不含有菌体。
7.根据权利要求6的用途，其特征在于：在所述组合物中，鼠李糖乳杆菌MP108的液态培养物与副干酪乳杆菌MP137的液态培养物的体积比落在1：0.43至1：2.33的范围内。
8.根据权利要求1或2的用途，其特征在于：所述肠道病原菌是选自于由下列所构成的群组中的菌种：肠道沙门氏菌肠道亚种(Salmonella enterica subsp.enterica)、李斯特单胞菌(Listeria monocytogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、肠炎弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、痢疾杆菌(Shigellaboydii)、痢疾志贺杆菌(Shigella dysenteriae)、克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiellapneumoniae)、小肠大肠炎耶氏杆菌(Yersinia enterocolitica)、普通变形杆菌(Proteusvulgaris)，以及它们的组合。
9.根据权利要求1或2的用途，其特征在于：所述组合物是食品组合物或药学组合物。
10.根据权利要求9的用途，其特征在于：所述药学组合物呈供口服投药或供局部投药的剂型。
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