JP2015188406A - ワイセラ属乳酸菌 - Google Patents
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Abstract
【課題】健康増進、とりわけ、口腔内の疾病の予防または治療に有効な乳酸菌の提供を課題とする。
【解決手段】本願発明者らは健康増進、とりわけ、口腔内の疾病の予防または治療に有効な乳酸菌の探索を行い、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ（ワイセラ）属乳酸菌、とりわけ、ワイセラ属乳酸菌Ｗ３（寄託番号 ＮＩＴＥ ＢＰ−０１７８９）が口腔内の疾病の予防または治療する効果を有することを見出した。
【選択図】なし
【解決手段】本願発明者らは健康増進、とりわけ、口腔内の疾病の予防または治療に有効な乳酸菌の探索を行い、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ（ワイセラ）属乳酸菌、とりわけ、ワイセラ属乳酸菌Ｗ３（寄託番号 ＮＩＴＥ ＢＰ−０１７８９）が口腔内の疾病の予防または治療する効果を有することを見出した。
【選択図】なし
Description
健康増進のための微生物の利用に関する。
宿主に有益な作用をもたらす微生物として、腸内フローラのバランスを改善する乳酸菌（例えばＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、やＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）が知られ、これらの微生物を食品等により取り込むことがなされていた。
一方、近年では、腸内に留まらず、口腔内の健康増進のための、微生物の利用が注目されている。例えば、国内では乳酸菌であるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉを含むヨーグルトが、むし歯菌であるミュータンス連鎖球菌の増殖を阻害するとし、実際、ヒト試験において唾液中のミュータンス連鎖球菌の数を減少させた例が報告されている（非特許文献１）。
一方、近年では、腸内に留まらず、口腔内の健康増進のための、微生物の利用が注目されている。例えば、国内では乳酸菌であるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉを含むヨーグルトが、むし歯菌であるミュータンス連鎖球菌の増殖を阻害するとし、実際、ヒト試験において唾液中のミュータンス連鎖球菌の数を減少させた例が報告されている（非特許文献１）。
Ｉｎｔ．Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９５，ｐｐ．２１９−２３（２００４）
腸内細菌学雑誌２１，ｐｐ．１２９−１４２（２００７））
Ｃａｒｉｅｓ Ｒｅｓ．４０，ｐｐ．４１８−２５（２００６）
Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５２，ｐｐ．１４１−８（２００２）
本発明は、健康増進、とりわけ、口腔内の疾病の予防または治療に有効な乳酸菌の提供を課題とする。
本願発明者らは健康増進、とりわけ、口腔内の疾病の予防または治療に有効な乳酸菌の探索を行い、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ（ワイセラ）属乳酸菌、とりわけ、ワイセラ属乳酸菌Ｗ３（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｓｐ．（ｗ３）：寄託番号 ＮＩＴＥ ＢＰ−０１７８９）が口腔内の疾病の予防または治療する効果を有することを見出した。
ワイセラ属乳酸菌、とりわけ、ワイセラ属乳酸菌Ｗ３はＳ．ミュータンスのバイオフィルム形成を抑制し、口腔内の疾病の予防または治療に有効である。また、ワイセラ属乳酸菌はキシロースと組み合わせると口腔内の疾病の予防または治療に有効である。キシロースはＳ．ミュータンスに代謝されにくいことから、ワイセラ属乳酸菌、とりわけ、ワイセラ属乳酸菌Ｗ３と組み合わせて、口腔内の疾病の予防または治療に有効である。
本発明は、ワイセラ属乳酸菌Ｗ３（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｓｐ．（ｗ３）：受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０１７８９）もしくはその変異体、又はそれらの形質転換体を提供する。なお、本明細書中、ワイセラ属乳酸菌Ｗ３を、ワイセラ乳酸菌Ｗ３，ワイセラＷ３あるいは、単にＷ３等と表記する場合がある。
なお、変異体とは、培養を続けるうちに、性質あるいは表現型、遺伝子配列等に若干の変化が及んだものであるが、本発明の課題である、口腔内の疾病の予防または治療に効果を有する限り、変異したワイセラ属乳酸菌Ｗ３は本発明に含まれる。また、形質転換体とは、本発明の乳酸菌を、工業的、あるいは、医療を目的として、プラスミド、あるいはウィルス、その他の遺伝子工学の手法によって、人為的に遺伝子に改変を加えたものをいうが、本発明の課題である、口腔内の疾病の予防または治療に効果を有する限り、形質転換したワイセラ属乳酸菌Ｗ３は本発明に含まれる。
なお、変異体とは、培養を続けるうちに、性質あるいは表現型、遺伝子配列等に若干の変化が及んだものであるが、本発明の課題である、口腔内の疾病の予防または治療に効果を有する限り、変異したワイセラ属乳酸菌Ｗ３は本発明に含まれる。また、形質転換体とは、本発明の乳酸菌を、工業的、あるいは、医療を目的として、プラスミド、あるいはウィルス、その他の遺伝子工学の手法によって、人為的に遺伝子に改変を加えたものをいうが、本発明の課題である、口腔内の疾病の予防または治療に効果を有する限り、形質転換したワイセラ属乳酸菌Ｗ３は本発明に含まれる。
また、本発明はワイセラ属乳酸菌とキシロースからなる口腔内の疾病の予防または治療のための口腔組成物を提供する。この口腔組成物において、ワイセラ属乳酸菌として、特に好ましくはワイセラ属乳酸菌Ｗ３である。
又、本発明は、ワイセラ属Ｗ３乳酸菌株もしくはその変異体、又はそれらの形質転換体あるいは、上記口腔組成物を含むことを特徴とする飲食品を提供する。
又、本発明は、ワイセラ属Ｗ３乳酸菌株もしくはその変異体、又はそれらの形質転換体あるいは、上記口腔組成物を含むことを特徴とする飲食品を提供する。
また、本発明は、ワイセラ属乳酸菌とキシロースからなる口腔内の疾病の予防または治療のための口腔組成物を提供する。
口腔内の疾病とは、齲蝕、歯周病などを指す。
さらには、本発明は、ワイセラ属乳酸菌Ｗ３とキシロースからなる口腔内の疾病の予防または治療のための口腔組成物を提供する。
また、さらには、本発明は、ワイセラ属乳酸菌Ｗ３、あるいは上記口腔組成物を含むことを特徴とする飲食品を提供する。飲食品は特に限定されることなく、例としては、菓子、冷菓、乳製品、肉類、魚類、野菜類、それらの加工食品、清涼飲料、酒類、水、さらには家畜やペットの飼料などを挙げることができる。
以下に、本発明の一例を実施例により示すが、本願発明は実施例に限定されるものではない。
口腔内の疾病とは、齲蝕、歯周病などを指す。
さらには、本発明は、ワイセラ属乳酸菌Ｗ３とキシロースからなる口腔内の疾病の予防または治療のための口腔組成物を提供する。
また、さらには、本発明は、ワイセラ属乳酸菌Ｗ３、あるいは上記口腔組成物を含むことを特徴とする飲食品を提供する。飲食品は特に限定されることなく、例としては、菓子、冷菓、乳製品、肉類、魚類、野菜類、それらの加工食品、清涼飲料、酒類、水、さらには家畜やペットの飼料などを挙げることができる。
以下に、本発明の一例を実施例により示すが、本願発明は実施例に限定されるものではない。
＜培養方法及び試験方法＞
はじめに、実施例で用いた培養方法や試験方法などの方法の詳細を説明する。
はじめに、実施例で用いた培養方法や試験方法などの方法の詳細を説明する。
１．Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ ｍｕｔａｎｓ ＵＡ１５９および乳酸菌の培養
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ ｍｕｔａｎｓ（本明細書中でＳ．ｍｕｔａｎｓ、Ｓ．ミュータンスあるいはＳ．ｍと記載する場合がある）としてＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ＵＡ１５９を用い、ＢＨＩ（Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ，日本ＢＤ）培地にて３７℃で嫌気培養した。乳酸菌はＭＲＳ（日本ＢＤ）液体培地、またはこれに１．５％寒天を加えた平板培地にて３７℃で嫌気的に培養した。
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ ｍｕｔａｎｓ（本明細書中でＳ．ｍｕｔａｎｓ、Ｓ．ミュータンスあるいはＳ．ｍと記載する場合がある）としてＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ＵＡ１５９を用い、ＢＨＩ（Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ，日本ＢＤ）培地にて３７℃で嫌気培養した。乳酸菌はＭＲＳ（日本ＢＤ）液体培地、またはこれに１．５％寒天を加えた平板培地にて３７℃で嫌気的に培養した。
２．１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列解析による菌種同定方法
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の上流約５００ｂｐ領域のＤＮＡ断片を増幅するため、８ＵＡフォワードプライマ（３’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−５’（配列番号１））および５１９Ｂリバースプライマー（３’−ＡＴＴＡＣＣＧＣ（Ｃ／Ｇ）ＧＣＴＧＣＴＧ−５’（配列番号２））（非特許文献２）を用いて、乳酸菌から調製したゲノムＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲした。反応の温度条件は、９５℃で５分間インキュベートした後、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃Ｃで３０秒のインキュベートを２５サイクル繰り返した。最後に７２℃で７分間インキュベートした。ＰＣＲ産物を８ＵＡフォワードプライマにてダイレクトシーケンスした。得られたＤＮＡの塩基配列を遺伝子データベース（ＤＤＢＪ：日本ＤＮＡデータバンク）にて塩基配列の相同性検索し、菌種を推定した。
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の上流約５００ｂｐ領域のＤＮＡ断片を増幅するため、８ＵＡフォワードプライマ（３’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−５’（配列番号１））および５１９Ｂリバースプライマー（３’−ＡＴＴＡＣＣＧＣ（Ｃ／Ｇ）ＧＣＴＧＣＴＧ−５’（配列番号２））（非特許文献２）を用いて、乳酸菌から調製したゲノムＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲした。反応の温度条件は、９５℃で５分間インキュベートした後、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃Ｃで３０秒のインキュベートを２５サイクル繰り返した。最後に７２℃で７分間インキュベートした。ＰＣＲ産物を８ＵＡフォワードプライマにてダイレクトシーケンスした。得られたＤＮＡの塩基配列を遺伝子データベース（ＤＤＢＪ：日本ＤＮＡデータバンク）にて塩基配列の相同性検索し、菌種を推定した。
３．Ｓ．ミュータンス．バイオフィルムの形成および、Ｓ．ミュータンス．バイオフィルム形成抑制活性評価
９６ウェルマイクロプレートに０．２５％〜２％スクローを含むＴＳＢ（Ｔｒｉｐｔｉｃａｓｅ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ，日本ＢＤ）を加え、さらに予めＢＨＩ培地にて培養したＳ．ミュータンスの培養液をＯＤ６６０が約０．３に希釈して２０μｌ接種した（培養液の全量は３００μｌ）。培養は嫌気的に３７℃で１６時間行い、その後培養上清を捨てマイクロプレートの底に形成されたバイオフィルムを生理食塩水で２回緩やかに洗浄した。次に、０．３％クリスタルバイオレット溶液でバイオフィルムを１０分間染色した後、生理食塩水で２回緩やかに洗浄した。静置し、乾燥させた後マイクロプレートリーダー（ＳＨ−１０００ Ｌａｂ、コロナ電気（株））にてＯＤ５７０を測定し、これをバイオフィルム量とした。
乳酸菌のＳ．ミュータンスバイオフィルム形成抑制を評価する際は、乳酸菌を１０７〜１０８個／ｍｌになるよう培養液に加えた。また、キシロースの効果を確認するために、一部の測定では、培養液に適宜キシロースを加えた。
９６ウェルマイクロプレートに０．２５％〜２％スクローを含むＴＳＢ（Ｔｒｉｐｔｉｃａｓｅ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ，日本ＢＤ）を加え、さらに予めＢＨＩ培地にて培養したＳ．ミュータンスの培養液をＯＤ６６０が約０．３に希釈して２０μｌ接種した（培養液の全量は３００μｌ）。培養は嫌気的に３７℃で１６時間行い、その後培養上清を捨てマイクロプレートの底に形成されたバイオフィルムを生理食塩水で２回緩やかに洗浄した。次に、０．３％クリスタルバイオレット溶液でバイオフィルムを１０分間染色した後、生理食塩水で２回緩やかに洗浄した。静置し、乾燥させた後マイクロプレートリーダー（ＳＨ−１０００ Ｌａｂ、コロナ電気（株））にてＯＤ５７０を測定し、これをバイオフィルム量とした。
乳酸菌のＳ．ミュータンスバイオフィルム形成抑制を評価する際は、乳酸菌を１０７〜１０８個／ｍｌになるよう培養液に加えた。また、キシロースの効果を確認するために、一部の測定では、培養液に適宜キシロースを加えた。
４．乳酸菌の糖資化性評価
乳酸菌の糖資化性についてはＡＰＩ５０ ＣＨＬ ｋｉｔ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘフランス）を用いて評価した。すなわちＭＲＳ寒天培地で培養して形成したコロニーをとり、菌液接種用培地種用培地（ＡＰＩ ５０ ＣＨＢ／ＣＨＥメディウム）に懸濁し、マクファーランド濁度２となるように調製した。その懸濁液を４９種類の糖代謝判定のウェルに接種し、ミネラルオイルを重層して２４時間培養した。指示薬の色の変化によって代謝が陽性か陰性かを判定した。
乳酸菌の糖資化性についてはＡＰＩ５０ ＣＨＬ ｋｉｔ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘフランス）を用いて評価した。すなわちＭＲＳ寒天培地で培養して形成したコロニーをとり、菌液接種用培地種用培地（ＡＰＩ ５０ ＣＨＢ／ＣＨＥメディウム）に懸濁し、マクファーランド濁度２となるように調製した。その懸濁液を４９種類の糖代謝判定のウェルに接種し、ミネラルオイルを重層して２４時間培養した。指示薬の色の変化によって代謝が陽性か陰性かを判定した。
５．Ｓ．ミュータンスによる糖質の資化性評価
ＢＨＩ培地にてＯＤ６６０が約０．５となるまで培養したＳ．ミュータンスの培養液をグルコース、スクロース、キシロース、キシロオリゴ糖またはフラクトオリゴ糖を５％含むＨＩ培地５ｍｌに５０μｌ接種し、３７℃で１８時間嫌気培養した。培養液のｐＨを測定し、歯（エナメル質）からカルシウムおよびリン酸が溶出し始めるｐＨである５．７を上回ったかどうかを評価した。
ＢＨＩ培地にてＯＤ６６０が約０．５となるまで培養したＳ．ミュータンスの培養液をグルコース、スクロース、キシロース、キシロオリゴ糖またはフラクトオリゴ糖を５％含むＨＩ培地５ｍｌに５０μｌ接種し、３７℃で１８時間嫌気培養した。培養液のｐＨを測定し、歯（エナメル質）からカルシウムおよびリン酸が溶出し始めるｐＨである５．７を上回ったかどうかを評価した。
６．乳酸菌の増殖曲線の評価
乳酸菌をＭＲＳ培地にてＯＤ６６０が約０．５となるまで３７℃で嫌気培養し、その培養液を糖を含んでいないＨｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＨＩ培地，日本ＢＤ）培地５ｍｌに５０μｌ接種した。３７℃で嫌気的に培養し、１時間おきにＯＤ６６０を測定した。また、スクロース、キシロース、キシロオリゴ糖またはフラクトオリゴ糖の資化性を評価する場合には、それぞれの糖を１．５％となるようにＨＩ培地に加え、同様の操作を行った。
乳酸菌をＭＲＳ培地にてＯＤ６６０が約０．５となるまで３７℃で嫌気培養し、その培養液を糖を含んでいないＨｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＨＩ培地，日本ＢＤ）培地５ｍｌに５０μｌ接種した。３７℃で嫌気的に培養し、１時間おきにＯＤ６６０を測定した。また、スクロース、キシロース、キシロオリゴ糖またはフラクトオリゴ糖の資化性を評価する場合には、それぞれの糖を１．５％となるようにＨＩ培地に加え、同様の操作を行った。
＜実験および結果＞
以下に本実施例で行った具体的な実験及び結果を記載する。
以下に本実施例で行った具体的な実験及び結果を記載する。
１．Ｓ．ミュータンスバイオフィルム形成抑制効果を有する乳酸菌の探索
本願発明者らは、はじめに、キムチ由来の乳酸菌を調べ、ワイセラ属の乳酸菌がＳ．ミュータンスのバイオフィルム形成を強力に抑制することを確認した。この結果はＭ．Ｓ．Ｋａｎｇらの報告（非特許文献３）や特許文献１において既に示されており、それらの結果と一致したといえる。
本発明では、ワイセラ属の乳酸菌の中でも、とりわけバイオフィルム形成抑制効果の高いワイセラ属乳酸菌株を得ることを目標とした。そこで、本願発明者らは、改めて、キムチの一部をＭＲＳ培地に塗布して培養し、新たに複数の乳酸菌株を単離した。これらの乳酸菌株をそれぞれグラム染色して形態を観察し、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｃｉｂａｒｉａ ＪＣＭ１２４９５（基準株）を対照に観察を行い、ワイセラ属と思われる株を選抜した。さらにそれぞれの株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の上流領域約５００ｂｐのＤＮＡ断片の配列解析を行い、遺伝子データベース（ＤＤＢＪ：日本ＤＮＡデータバンク）にて塩基配列の相同性検索を行い、ワイセラ属乳酸菌株と同定されるものを選び、最終的に２０種類のワイセラ属乳酸菌株を得た。これらをＷ１からＷ２０と名づけた。
本願発明者らは、はじめに、キムチ由来の乳酸菌を調べ、ワイセラ属の乳酸菌がＳ．ミュータンスのバイオフィルム形成を強力に抑制することを確認した。この結果はＭ．Ｓ．Ｋａｎｇらの報告（非特許文献３）や特許文献１において既に示されており、それらの結果と一致したといえる。
本発明では、ワイセラ属の乳酸菌の中でも、とりわけバイオフィルム形成抑制効果の高いワイセラ属乳酸菌株を得ることを目標とした。そこで、本願発明者らは、改めて、キムチの一部をＭＲＳ培地に塗布して培養し、新たに複数の乳酸菌株を単離した。これらの乳酸菌株をそれぞれグラム染色して形態を観察し、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｃｉｂａｒｉａ ＪＣＭ１２４９５（基準株）を対照に観察を行い、ワイセラ属と思われる株を選抜した。さらにそれぞれの株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の上流領域約５００ｂｐのＤＮＡ断片の配列解析を行い、遺伝子データベース（ＤＤＢＪ：日本ＤＮＡデータバンク）にて塩基配列の相同性検索を行い、ワイセラ属乳酸菌株と同定されるものを選び、最終的に２０種類のワイセラ属乳酸菌株を得た。これらをＷ１からＷ２０と名づけた。
２．ワイセラ属乳酸菌のバイオフィルム形成抑制活性比較
ワイセラ属乳酸菌Ｗ１からＷ２０株とのバイオフィルム形成抑制効果を評価した。比較対象として既知のむし歯予防乳酸菌として知られるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓを用いた。結果を図１に示す。ワイセラ属乳酸菌Ｗ３が最もバイオフィルム形成抑制効果があることが分かった。
ワイセラ属乳酸菌Ｗ１からＷ２０株とのバイオフィルム形成抑制効果を評価した。比較対象として既知のむし歯予防乳酸菌として知られるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓを用いた。結果を図１に示す。ワイセラ属乳酸菌Ｗ３が最もバイオフィルム形成抑制効果があることが分かった。
３．既知ワイセラ属乳酸菌とワイセラ属乳酸菌Ｗ３の糖資化性比較
ワイセラ属乳酸菌Ｗ３の糖資化性を調べた。結果を表１に示す。
ワイセラ属乳酸菌Ｗ３の糖資化性を調べた。結果を表１に示す。
ワイセラ属乳酸菌Ｗ３の資化性は、Ｗ．ｃｏｎｆｕｓａおよびＷ．ｃｉｂａｒｉａの基準株の資化性と異なっていた。また、特許文献１で開示されたワイセラ属乳酸菌とも異なる性質を示した。したがって、Ｗ３は既知のワイセラ属乳酸菌とは異なる、新しい株と示唆された（表２）。
４．ワイセラ属乳酸菌Ｗ３の１６ｓＲＮＡ遺伝子の解析
ワイセラ属乳酸菌Ｗ３の１６ｓＲＮＡ遺伝子の塩基配列（上流領域の約５００ｂｐ）の解析結果は次のとおりであった。
ＣＴＴＴＧＴＧＧＴＴＣＡＡＣＴＧＡＴＴＴＧＡＡＧＡＧＣＴＴＧＣＴＣＡＧＡＴＡＴＧＡＣＧＡＴＧＧＡＣＡＴＴＧＣＡＡＡＧＡＧＴＧＧＣＧＡＡＣＧＧＧＴＧＡＧＴＡＡＣＡＣＧＴＧＧＧＡＡＡＣＣＴＡＣＣＴＣＴＴＡＧＣＡＧＧＧＧＡＴＡＡＣＡＴＴＴＧＧＡＡＡＣＡＧＡＴＧＣＴＡＡＴＡＣＣＧＴＡＴＡＡＣＡＡＴＧＡＣＡＡＣＣＧＣＡＴＧＧＴＴＧＴＴＡＴＴＴＡＡＡＡＧＡＴＧＧＴＴＣＴＧＣＴＡＴＣＡＣＴＡＡＧＡＧＡＴＧＧＴＣＣＣＧＣＧＧＴＧＣＡＴＴＡＧＣＴＡＧＴＴＧＧＴＡＡＧＧＴＡＡＴＧＧＣＴＴＡＣＣＡＡＧＧＣＧＡＴＧＡＴＧＣＡＴＡＧＣＣＧＡＧＴＴＧＡＧＡＧＡＣＴＧＡＴＣＧＧＣＣＡＣＡＡＴＧＧＧＡＣＴＧＡＧＡＣＡＣＧＧＣＣＣＡＴＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴＡＧＧＧＡＡＴＣＴＴＣＣＡＣＡＡＴＧＧＧＣＧＡＡＡＧＣＣＴＧＡＴＧＧＡＧＣＡＡＣＧＣＣＧＣＧＴＧＴＧＴＧＡＴＧＡＡＧＧＧＴＴＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＡＡＡＣＡＣＴＧＴＴＧＴＡＡＧＡＧＡＡＧＡＡＴＧＡＣＡＴＴＧＡＧＡＧＴＡＡＣＴＧＴＴＣＡＡＴＧＴＧＴＧＡＣＧＧＴＡＴＣＴＴＡＣＣＡＧＡＡＡＧＧＡＡＣＧＧＣＴＡＡＡＴＡＣＧＴ（配列番号３）
ワイセラ属乳酸菌Ｗ３の１６ｓＲＮＡ遺伝子の塩基配列（上流領域の約５００ｂｐ）の解析結果は次のとおりであった。
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データベース検索の結果、上記の配列からは、ワイセラ属乳酸菌Ｗ３は、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｃｏｎｆｕｓａ（ワイセラコンヒューサ）と推定された。しかし、糖資化性においては、ワイセラ属乳酸菌Ｗ３はＷｅｉｓｓｅｌｌａ ｃｏｎｆｕｓａの基準株と異なる。
非特許文献４において、著者らは、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｃｏｎｆｕｓａの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列は、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｃｉｂａｒｉａ（ワイセラチバリア）のそれと８９．２％〜９９．２％の相同性を示すなど、ワイセラ属の乳酸菌に関しては１６ＳｒＲＮＡの遺伝情報から種までを特定することは困難であると述べている。これらを総合的に解釈し、ワイセラ属乳酸菌Ｗ３は既知の菌株とは異なる新たな株と認定し、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｓｐ．（ｗ３）として、独立行政法人製品評価技術基板機構特許微生物寄託センターに、２０１４年１月２１日に寄託した。受託番号はＮＩＴＥ ＢＰ−０１７８９である。
非特許文献４において、著者らは、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｃｏｎｆｕｓａの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列は、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｃｉｂａｒｉａ（ワイセラチバリア）のそれと８９．２％〜９９．２％の相同性を示すなど、ワイセラ属の乳酸菌に関しては１６ＳｒＲＮＡの遺伝情報から種までを特定することは困難であると述べている。これらを総合的に解釈し、ワイセラ属乳酸菌Ｗ３は既知の菌株とは異なる新たな株と認定し、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｓｐ．（ｗ３）として、独立行政法人製品評価技術基板機構特許微生物寄託センターに、２０１４年１月２１日に寄託した。受託番号はＮＩＴＥ ＢＰ−０１７８９である。
５．口腔内でワイセラ属乳酸菌と組み合わせに適した糖類の検索
乳酸菌を口腔内の疾病予防または治療に使用することを考えると、乳酸菌の栄養源となる糖は、一般的な細菌、特に齲蝕の原因であるＳ．ミュータンスには代謝され辛く、乳酸菌だけを増殖・活性化する糖が好ましい。上記観点より、キシロースに注目した。
Ｓ．ミュータンスによる糖質の資化性評価の結果（図２）、Ｓ．ミュータンスは５％のキシロースを含む培地で培養してもｐＨ５．７を上回った。これはキシロースがＳ．ミュータンスに代謝され辛いこと、また、キシロースがむし歯の原因となり辛いことを示している。
一方、培地に含まれる糖の種類を限定してワイセラ属乳酸菌Ｗ３を培養し、増殖曲線を評価した結果、図３に示すように、ワイセラ属乳酸菌Ｗ３はキシロース、スクロース、キシロオリゴ糖、フラクトオリゴ糖のいずれの糖でも、ＨＩ培地と比べて増殖が促進し、中でもキシロースとキシロオリゴ糖は増殖をより促進した。これらの糖はワイセラ属乳酸菌Ｗ３における代謝が早いものと思われる。
以上より、キシロースは口腔内の疾病予防または治療に使用するために、ワイセラ属乳酸菌と組み合わせる糖として有効と考えられる。
乳酸菌を口腔内の疾病予防または治療に使用することを考えると、乳酸菌の栄養源となる糖は、一般的な細菌、特に齲蝕の原因であるＳ．ミュータンスには代謝され辛く、乳酸菌だけを増殖・活性化する糖が好ましい。上記観点より、キシロースに注目した。
Ｓ．ミュータンスによる糖質の資化性評価の結果（図２）、Ｓ．ミュータンスは５％のキシロースを含む培地で培養してもｐＨ５．７を上回った。これはキシロースがＳ．ミュータンスに代謝され辛いこと、また、キシロースがむし歯の原因となり辛いことを示している。
一方、培地に含まれる糖の種類を限定してワイセラ属乳酸菌Ｗ３を培養し、増殖曲線を評価した結果、図３に示すように、ワイセラ属乳酸菌Ｗ３はキシロース、スクロース、キシロオリゴ糖、フラクトオリゴ糖のいずれの糖でも、ＨＩ培地と比べて増殖が促進し、中でもキシロースとキシロオリゴ糖は増殖をより促進した。これらの糖はワイセラ属乳酸菌Ｗ３における代謝が早いものと思われる。
以上より、キシロースは口腔内の疾病予防または治療に使用するために、ワイセラ属乳酸菌と組み合わせる糖として有効と考えられる。
６．ワイセラ属乳酸菌Ｗ３のＳ．ミュータンスのバイオフィルム形成抑制効果におけるスクロース濃度依存性
Ｓ．ミュータンスバイオフィルム形成抑制活性評価の結果、ワイセラ属乳酸菌Ｗ３は０．２５％〜２％スクロース添加培地のいずれの条件においてもバイオフィルム形成を抑制した（図４（ａ）及び（ｂ）Ｓ．ミュータンス＋ワイセラ属乳酸菌Ｗ３）。さらにキシロース１．５％存在下で、Ｓ．ミュータンスバイオフィルム形成抑制活性評価を行ったところ、１〜２％と高濃度のスクロース存在下においては、ワイセラ属乳酸菌Ｗ３とともにキシロース１．５％添加すると、ワイセラ属乳酸菌Ｗ３のみ添加した場合と比較してバイオフィルム形成抑制効果を有意に高めた（ｐ＜０．０５）（図４（ａ）および（ｂ）Ｓ．ミュータンス＋ワイセラ属乳酸菌Ｗ３＋キシロース）。
Ｓ．ミュータンスバイオフィルム形成抑制活性評価の結果、ワイセラ属乳酸菌Ｗ３は０．２５％〜２％スクロース添加培地のいずれの条件においてもバイオフィルム形成を抑制した（図４（ａ）及び（ｂ）Ｓ．ミュータンス＋ワイセラ属乳酸菌Ｗ３）。さらにキシロース１．５％存在下で、Ｓ．ミュータンスバイオフィルム形成抑制活性評価を行ったところ、１〜２％と高濃度のスクロース存在下においては、ワイセラ属乳酸菌Ｗ３とともにキシロース１．５％添加すると、ワイセラ属乳酸菌Ｗ３のみ添加した場合と比較してバイオフィルム形成抑制効果を有意に高めた（ｐ＜０．０５）（図４（ａ）および（ｂ）Ｓ．ミュータンス＋ワイセラ属乳酸菌Ｗ３＋キシロース）。
７．ワイセラ属乳酸菌Ｗ３のバイオフィルム形成抑制効果におけるキシロース濃度依存性
１％スクロースを含むＴＳＢ培地でＳ．ミュータンスとともにワイセラ属乳酸菌Ｗ３を加えて培養してバイオフィルムを形成させた。培養の際、０．０２％から３．０％のキシロースを加えたところ、添加したキシロースの濃度依存的にバイオフィルム形成が抑制された（図５）。ダネットの多重比較で統計解析したところ、キシロース無添加の場合と比較して、０．１９％以上のキシロースを含む培地で有意にバイオフィルムを減少させた（ｐ＜０．０５）。
１％スクロースを含むＴＳＢ培地でＳ．ミュータンスとともにワイセラ属乳酸菌Ｗ３を加えて培養してバイオフィルムを形成させた。培養の際、０．０２％から３．０％のキシロースを加えたところ、添加したキシロースの濃度依存的にバイオフィルム形成が抑制された（図５）。ダネットの多重比較で統計解析したところ、キシロース無添加の場合と比較して、０．１９％以上のキシロースを含む培地で有意にバイオフィルムを減少させた（ｐ＜０．０５）。
８．ワイセラ属乳酸菌Ｗ３の顕微鏡観察
グラム染色したワイセラ属乳酸菌Ｗ３の形態観察結果を図６に示す。
グラム染色したワイセラ属乳酸菌Ｗ３の形態観察結果を図６に示す。
以上、本実施例より、ワイセラ属乳酸菌Ｗ３はＳ．ミュータンスのバイオフィルム形成を抑制し、口腔内の疾病の予防または治療に有効であることが分かった。また、ワイセラ属乳酸菌はキシロースと組み合わせるとその抑制活性が高まった。キシロースはＳ．ミュータンスに代謝されにくいことから、ワイセラ属乳酸菌、とりわけ、ワイセラ属乳酸菌Ｗ３と組み合わせて、口腔内の疾病の予防または治療に有効であることが分かった。
Claims (5)
- ワイセラ属乳酸菌Ｗ３乳酸菌（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｓｐ．（Ｗ３）：受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０１７８９）もしくはその変異体、又はそれらの形質転換体。
- ワイセラ属乳酸菌とキシロースからなる口腔内の疾病の予防または治療のための口腔組成物。
- ワイセラ属乳酸菌がワイセラ属乳酸菌Ｗ３乳酸菌（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｓｐ．（Ｗ３）：受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０１７８９）もしくはその変異体、又はそれらの形質転換体である請求項２の口腔組成物。
- ワイセラ属乳酸菌Ｗ３（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｓｐ．（Ｗ３）：受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０１７８９）もしくはその変異体、又はそれらの形質転換体を含むことを特徴とする飲食品。
- 請求項２または３の口腔組成物を含むことを特徴とする飲食品。
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