CN105669843B - 一种长双歧杆菌蛋白质、其制备方法及医药用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种来源于长双歧杆菌的粘附蛋白，并明确了其氨基酸序列；在此基础上实验发现该粘附蛋白不仅能够粘附于肠上皮细胞，而且具有提升微生物抗生素敏感性的作用，特别是对大肠杆菌O157：H7，这种抗生素增效作用尤为突出。基于这种有益的发现，确定了该蛋白作为大肠杆菌O157：H7抑菌增效剂的用途，从而扩展了其用途范围，同时提供了一种提升微生物药敏性的新途径。本发明基于严谨的实验手段获得了突出的技术效果，具有广阔的应用前景。

Description

一种长双歧杆菌蛋白质、其制备方法及医药用途
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种长双歧杆菌蛋白质、其制备方法及医药用途。
背景技术
双歧杆菌作为肠道益生菌广为人知，近年来针对其肠道益生作用研究发现，双歧杆菌的某些代谢产物能够抑制其他微生物在肠道内壁的定植，进而降低病原微生物的侵害风险。该特征目前已经成为筛选双歧杆菌菌种、研发功能性益生菌菌剂的重要依据。
现有技术研究发现，双歧杆菌对其他微生物定植于肠道内壁的抑制机制主要是通过分泌有机酸降低肠道pH值，调节肠道微生态环境，同时分泌胞外酶从而影响致病菌或细菌毒素的黏附位点及其特异性受体。此外，近年来有学者认为，由双歧杆菌自身黏附于肠道所引发的占位效应和空间位阻效应可能是阻碍致病菌黏附和入侵的一个重要因素。黏附蛋白作为双歧杆菌黏附并定植于胃肠道上皮的重要因子，其物质基础、代谢特性在现有技术中尚无明确结论，
尽管现有技术中曾报道部分具有粘附性的双歧杆菌表达蛋白，但其是否就是菌体定植于肠道内壁的功能性物质尚不明确；此外，在明确获得一种双歧杆菌粘附蛋白的基础上，为实现进一步的应用，其表达量、纯化效率应当得到优化；再次，针对双歧杆菌粘附蛋白，应当进一步研究其生物学特性，从而为该粘附蛋白的其他用途奠定基础。
长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)是双歧杆菌属的一种，属革兰氏阳性、无芽孢、不运动、厌氧性杆菌，广泛存在于人体尤其婴儿的肠道中，属于药品、微生态菌剂制备领域的常规菌种之一。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种长双歧杆菌蛋白质、其制备方法及医药用途，以解决现有技术中缺乏一种成分单一、结构明确的双歧杆菌粘附蛋白的技术问题。
本发明要解决的另一技术问题是上述长双歧杆菌蛋白质制备方法不明确。
本发明要解决的再一技术问题是当采用重组表达方法制备上述长双歧杆菌蛋白质时，其纯化效率较低。
本发明要解决的又一技术问题是上述长双歧杆菌蛋白质的应用范围存在局限性。
本发明要解决的又一技术问题是大肠杆菌O157：H7对抗生素的敏感性有待提升。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种长双歧杆菌蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
一种上述长双歧杆菌蛋白质的制备方法，包括以下步骤：
1)制备长双歧杆菌蛋白质的重组大肠杆菌表达菌株；
2)取步骤1)所述长双歧杆菌蛋白质的重组大肠杆菌表达菌株进行培养，至培养液OD600nm为0.6～0.9时加入诱导剂IPTG至终浓度为0.8～1.2mM，而后于35～39℃、震荡条件下诱导培养4～5h；
3)收集菌体、破碎、收集上清；
4)取步骤3)上清液，利用GST亲和层析纯化，收集洗脱液后超滤浓缩，脱盐，干燥，即得到所述长双歧杆菌蛋白质。
作为优选，步骤3)所述的破碎是将菌体重悬于PBS缓冲液后，在冰浴条件下超声破碎20～30次，每次破碎的持续时间为2～4s，每2次破碎之间的时间间隔为4～6s。
作为优选，步骤4)具体包括以下操作：
a)取缓冲液A，以2.5～3.5mL/min的流速平衡谷胱甘肽琼脂糖树脂柱；
b)取步骤2)上清液，以1～2mL/min的流速上样；
c)取缓冲液B，以0.8～1.2mL/min的流速洗脱，收集洗脱峰处溶液即为洗脱液；
d)取洗脱液超滤浓缩，而后过脱盐柱，再利用纯水以2.5～3.5mL/min的流速洗脱，收集洗脱峰处溶液即为第二洗脱液，而后冷冻干燥，即得到所述长双歧杆菌蛋白质；
其中所述缓冲液A是含有1.5～2.5mM EDTA的PBS缓冲液；
所述缓冲液B是含有1.5～2.5mM EDTA、15～25mM谷胱甘肽的PBS缓冲液；进一步优选的，步骤a)中用于平衡谷胱甘肽琼脂糖树脂柱的缓冲液A用量为25～35mL，更优的是30mL。
作为优选，步骤1)中所述的震荡是150～200r/min转速的摇床培养，更优的是180r/min转速的摇床培养。
氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白质用于提升大肠杆菌O157：H7对抗生素敏感性的应用；进一步优选的，是上述长双歧杆菌蛋白质作为抗生素抑菌增效剂的应用。
作为优选，所述抗生素是β-内酰胺类抗生素；进一步优选的，所述β-内酰胺类抗生素可以是氨苄青霉素、青霉素G或头孢霉素。
作为优选，所述抗生素是氨基糖苷类抗生素；进一步优选的，所述氨基糖苷类抗生素是卡那霉素。
作为优选，所述抗生素是酰胺醇类抗生素；进一步优选的，所述酰胺醇类抗生素是氯霉素。
作为优选，所述应用是利用含有浓度为45～55μg/mL的、氨基酸序列为SEQ ID NO:1的蛋白质溶液，以接触方式处理大肠杆菌O157：H7；进一步优选的，被处理大肠杆菌O157：H7在所述蛋白质溶液中的浓度是106CFU/mL；进一步优选的，所述处理时间是1.5～2.5h。
在以上技术方案中，所述敏感性是指微生物受抗生素抑制的程度，所述提升微生物对抗生素敏感性，是指利用含有本发明长双歧杆菌蛋白质的介质孵育微生物后，被处理微生物在抗生素作用下抑菌效果更为显著。所述长双歧杆菌蛋白质，是说明自然环境下该蛋白来源于长双歧杆菌，而并不构成对该蛋白质技术特征的限定作用；在本发明中，该蛋白质的技术特征仅由其序列限定。所述长双歧杆菌蛋白质的重组大肠杆菌表达菌株，是指整合有本发明长双歧杆菌天然表达基因的重组大肠杆菌；其制备方法通常包括长双歧杆菌总DNA的提取，目的基因的扩增，扩增产物的纯化，目的基因及载体的酶切、连接，重组载体向大肠杆菌中的导入，重组子的筛选等步骤；实际制备方法可依据本领域的一般技术常识进行适应性设计。
如前文所述，本发明可用于提升微生物对抗生素的敏感性。但利用本发明长双歧杆菌蛋白质处理后的物质并不必然予以抗生素处理，当予以抗生素处理时，其处理方法可采用以下方案：氨苄青霉素作用浓度为1～50μg/mL；青霉素G作用浓度为1～50μg/mL；头孢霉素作用浓度为1～50μg/mL；卡那霉素作用浓度为1～25μg/mL；氯霉素作用浓度为1～25μg/mL。
本发明提供了一种来源于长双歧杆菌的粘附蛋白，并明确了其氨基酸序列；在此基础上基于遗传工程技术获得了一株该蛋白的表达菌株，并针对菌株及粘附蛋白的特性从诱导表达、层析纯化、超滤浓缩等方面进行创新性设计，进而获得了上述粘附蛋白的高效制备方法。进一步的，实验发现该粘附蛋白不仅能够粘附于肠上皮细胞，而且具有提升微生物抗生素敏感性的作用，基于这种有益的发现，确定了该蛋白作为抗生素抑菌增效剂的用途，从而扩展了其用途范围，同时提供了一种提升微生物药敏性的新途径。本发明基于严谨的实验手段获得了突出的技术效果，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是本发明实施例1中长双歧杆菌特异性蛋白AIP2的表达纯化电泳检测图；图中泳道M是Protein Marker(12-80kDa)；泳道1是E.coli pGEX-4T-1表达产物(对照)；泳道2是纯化后的AIP2蛋白；泳道3是E.coli pGEX-4T-AIP2融合蛋白表达产物。
图2是本发明实施例5中长双歧杆菌特异性蛋白AIP2提升3种常见食源性致病菌对氨苄青霉素敏感性的实验结果图；图中A部分是长双歧杆菌特异性蛋白AIP2对单核增生李斯特菌的作用结果；B部分是长双歧杆菌特异性蛋白AIP2对大肠杆菌O157:H7的作用结果；C部分是长双歧杆菌特异性蛋白AIP2对鼠伤寒沙门氏菌的作用结果。
图3是本发明实施例6中长双歧杆菌特异性蛋白AIP2提升3种常见食源性致病菌对青霉素G、头孢霉素、卡那霉素、氯霉素敏感性的实验结果图。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。
除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1(制备长双歧杆菌蛋白质的重组大肠杆菌表达菌株)
1.1实验材料
1.1.1菌株与载体
长双歧杆菌，大肠杆菌DH5α，载体pGEX-4T-1均自市面购得。
1.1.2常用试剂
(1)TE缓冲液(pH 8.0)：10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，1mmol/L EDTANa2(pH8.0)。配置后高压灭菌，室温贮存。
(2)10mg/mL溶菌酶：100mg溶菌酶溶解于10mL ddH2O中，–20℃保存备用。
(3)10％SDS：5g SDS加ddH2O溶解定容至50mL。
(4)3M KAc：14.72g KAc溶解于ddH2O中并定容至50mL。
(5)3M NaAc：12.35g NaAc溶解于ddH2O中并定容至50mL。
(6)0.1M CaCl2：11.1g CaCl2溶解于1000mL ddH2O中，121℃高压灭菌15min，于4℃保存。
(7)50×TAE电泳buffer：12.2g Tris，2.85mL冰醋酸，10mL 0.25mol/L EDTA(pH8.0)，加ddH2O溶解定容至50mL。
(8)6×loading buffer(上样缓冲液)：0.25％二甲苯青FF，0.25％溴酚蓝，30％甘油。
1.1.3常用培养基
(1)MRS培养基：牛肉膏3g，酵母粉5g，吐温801mL，MgSO4·7H2O 0.6406g，K2HPO45g，冰乙酸4.3mL，MnSO4·H2O 0.13g，蛋白胨7g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，眎胨7g，柠檬酸铵2g，L-半胱氨酸0.5g，加ddH2O至1000mL，调pH为6.5，然后115℃高压灭菌15min。
(2)LB液体培养基：酵母膏5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，加ddH2O至1000mL，调pH至7.0，121℃高压灭菌15min。
(3)LB平板的制备：在LB液体培养基按1.5％(w/v)加入琼脂粉，121℃高压灭菌后倒平板。
(4)LB/Amp(Ampicillin，氨苄青霉素)平板的制备：在LB液体培养基按1.5％(w/v)加入琼脂粉，然后121℃高压灭菌后冷却至不烫手(约50℃)，加入100mg/mL的Amp至终浓度为50μg/mL，混匀后倒平板，并置于超净工作台晾干备用。
1.2实验方法
1.2.1长双歧杆菌基因组DNA的提取与检测
1.2.1.1双歧杆菌基因组DNA的提取
提取长双歧杆菌的基因组DNA，本实验采用“溶菌酶-SDS-醋酸钾”法，具体方法如下：
(1)将双歧杆菌接种于盛有MRS液体培养基的试管中，37℃条件下静置厌氧培养24h。
(2)用1mL吸管移取中管底部的双歧杆菌，置于2mL离心管中。
(3)离心(4500rpm，5min)，弃上清，剩余管底约0.1g湿菌体。
(4)加1mL TE(pH 8.0)重悬洗涤一次，离心(4500rpm，5min)，弃上清。
(5)加入0.7mL TE(pH 8.0)和0.1mL 10mg/mL的溶菌酶，用移液器吹打，使菌体均匀悬浮于溶液中。
(6)置40℃水浴作用3h，期间颠倒混匀数次。
(7)迅速加入0.1mL 10％SDS，上下倒匀后置40℃水浴作用1h。
(8)离心(10000rpm，5min，4℃)，移取0.5mL上清液于新2mL离心管中，弃沉淀。
(9)加入0.1mL(约1/6体积)冰预冷的KAc(3M)，置冰水浴15min。
(10)离心(12000rpm，10min，4℃)，移取400μL上清液于新2mL离心管中，弃沉淀。
(11)加入等体积(400μL)的氯仿：异戊醇(24：1)进行抽提，轻柔地上下颠倒混匀，静置3min。
(12)离心(12000rpm，5min，4℃)，吸取上清于新2mL离心管中。
(13)加入40μL(1/10体积)冰预冷的NaAc(3M)以及880μL(2倍体积)的预冷的无水乙醇，上下倒匀后置于-20℃冷冻30min。
(14)离心(12000rpm，10min，4℃)，去上清。
(15)加入400μL预冷的75％的乙醇洗涤。
(16)离心(12000rpm，10min，4℃)，去上清，并使乙醇挥发干净。
(17)加入40μL TE溶解沉淀。
(18)加入RNaseA(终浓度为50μg/mL)，37℃水浴1h。
(19)-20℃保存备用。
1.2.1.2琼脂糖凝胶电泳
(1)制胶：
称取0.25g琼脂糖放入150mL三角瓶中，加入25mL 1×TAE在微波炉中中火加热溶解成凝胶溶液。安装好电泳模具和样品梳，取少量凝胶溶液将电泳模具两端封死，加入2μLDNA染色物质GoldView染料，混匀后倒入模具，注意不可产生气泡。
(2)上样电泳：
在电泳槽中盛放1×TAE电泳buffer。待胶凝固后将电泳模具放入电泳槽中，然后小心取出样品梳。分别取样品加入6×loading buffer混匀后上样，正确连接电极，琼脂糖凝胶的点样孔靠近负极，在5V/cm恒压条件下进行电泳，20min后停止电泳，将凝胶放入凝胶成像系统进行成像、分析。
1.2.2AIP2基因的扩增
上游引物:TTCGAATTCGTGAAAACTTTCACTCCGAAGCC EcoR I 63.4℃
下游引物:CGCGCGGCCGCTTGGCCTGCTGCGAGAC Not I 63.3℃
表1PCR反应体系
用移液枪混匀反应液，稍离心，盖紧盖子，在管盖上用记号笔做好标记后，按照表2所示程序于PCR仪上进行扩增。
表2PCR反应程序
PCR反应结束后采用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。取5μL PCR产物与1μL 6×Loading buffer混匀，点入琼脂糖凝胶上样孔中，以DNA Marker(DL2000)为对照，在DNA水平电泳槽中5V/cm恒压电泳30min。电泳结束后将凝胶放入凝胶成像系统进行成像、分析。
1.2.3PCR产物的纯化
采用北京赛百盛基因技术有限公司的PCR产物纯化试剂盒，对PCR产物进行纯化，具体步骤如下：
(1)将无石蜡油的PCR反应产物在1％的普通琼脂糖凝胶上电泳，切下所需的DNA条带装入2mL离心管中。尽量切掉不含DNA的琼脂糖凝胶。
(2)200～400mg琼脂糖凝胶中加入0.4mL纯化树脂(使用前充分混匀)，70℃保温5～10min，每2min颠倒混匀1次，使琼脂糖凝胶完全融化。
(3)将混合液转移入离心纯化柱，13000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液。
(4)加入500μL 80％乙醇，13000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液。
(5)重复上一步，此步骤13000rpm离心2min，将乙醇除尽。
(6)将离心纯化柱套入干净的1.5mL或2mL离心管中，开盖放置2～3min，务必使乙醇充分挥发干净。加入30μL ddH2O于纯化树脂上。放置2min后，13000rpm离心30s。
(7)离心管中的液体即是纯化的DNA片段，取1μL电泳检测。-20℃保存备用。1.2.4目的片段及载体的酶切处理
目的片段回收后，进行目的片段及载体的酶切,参照表3配制酶切体系，两个酶切体系置于37℃保温1.5h。
表3酶切体系
1.2.5目的基因与载体pGEX-4T-1的连接
参照方法2.2.3，将酶切后的片段和载体回收，回收产物按照按表4配制连接反应体系，22℃连接30min。
表4连接反应体系
1.2.6转化
1.2.6.1感受态细胞的制备
取大肠杆菌DH5α制备感受态细胞，具体方法如下：
(1)取-70℃冻存的大肠杆菌DH5α划线接种于无抗性LB平板，于37℃培养过夜。
(2)挑取生长良好的单菌落接种于5mL LB液体培养基中，置于37℃摇床180rpm振荡培养过夜。
(3)按1％的接种量将活化培养过夜的菌液，转接至含100mL LB液体培养基的三角瓶(500mL)中，37℃摇床180rpm振荡培养至OD600为0.4～0.6。
(4)将三角瓶置于冰水中静置10min后，离心(5000rpm，10min，4℃)，弃上清。
(5)加入50mL冰预冷的0.1M CaCl2，用移液器将菌体轻轻吹散，然后冰浴10min。
(6)离心(5000rpm，10min，4℃)，弃上清，加入25mL冰预冷的0.1M CaCl2，用移液器将菌体轻轻吹散，冰水浴10min。
(7)离心(5000rpm，10min，4℃)，弃上清，加入2mL冰预冷的0.1M CaCl2，加已灭菌的甘油至终浓度为10％，用移液器轻轻混匀，每管200μL分装。
(8)-70℃冻存备用。
1.2.6.2将连接产物转化入感受态细胞
将连接产物转化到DH5α大肠杆菌细胞中。具体步骤如下：
(1)制备LB/Amp板。
(2)取200μL感受态细胞置于冰水中浴冷。
(3)向感受态细胞悬液中加入5μL连接产物，轻轻旋转离心管以混匀内容物，在冰浴中静置30min。
(4)将离心管置于42℃水浴热激90s，然后迅速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却2min，该过程不要摇动离心管。
(5)向每个离心管中加入1mL 37℃预热的无菌LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃摇床150rpm振荡培养40min。
(6)将离心管内容物混匀，吸取500μL已转化的感受态细胞，加到LB/Amp琼脂平板培养基上，用无菌涂布棒涂布均匀。将平板置于室温直至液体被吸收，37℃培养箱中倒置培养12～16h。
1.2.7阳性克隆子的验证
1.2.7.1菌落PCR验证
用牙签从平板培养基上挑选单菌落进行菌落PCR验证(菌落PCR体系和PCR程序分别见表5与表6)，并把牙签放入至5mL含有终浓度为100μg/mL Amp的LB液体培养基中，37℃摇床180rpm振荡培养12h。
表5菌落PCR反应体系
表6菌落PCR反应程序
1.2.7.2重组质粒的提取
取菌落PCR验证为阳性的对应菌液，采用EasyPure Plasmid MiniPrep Kit提取重组质粒DNA。具体方法如下：
(1)取1～4mL的过夜培养菌液，10000g离心1min，尽量吸尽上清。
(2)加入250μL无色溶液RB(含RNase A)，震荡悬浮菌体沉淀，不应留有小的菌块。
(3)加入250μL蓝色溶液LB，温和地上下翻转混合4～6次，使菌体充分裂解，形成蓝色透亮的溶液，颜色由半透亮变为透亮蓝色，指示完全裂解(不宜超过5min)。
(4)加入350μL黄色溶液NB，轻轻混合5～6次(颜色由蓝色完全变成黄色，指示混合均匀，中和完全)，直至形成紧实的黄色凝集块，室温静置2min。
(5)15000g离心5min，小心吸取上清加入吸附柱中。
(6)15000g离心1min，弃流出液。
(7)加入650μL溶液WB，15000g离心1min，弃流出液。
(8)15000g离心1～2min，彻底去除残留的WB。
(9)将吸附柱置于一干净的离心管中，在柱的中央加入30μL EB或ddH2O后，室温静置1min。
(10)1000g离心1min，洗脱DNA，洗脱出的DNA于-20℃保存。
1.2.7.3双酶切重组质粒鉴定插入片段大小
选用重组质粒多克隆位点两侧的酶切位点EcoR I和Not I对质粒进行双酶切，验证目的片段大小。酶切反应体系按表7配制。酶切反应的条件：37℃，4h。
表7酶切反应体系
采用1％琼脂糖凝胶电泳检测质粒酶切的效果，电泳结束后将凝胶放入凝胶成像系统成像、分析。
1.2.7.4测序验证与分析
将初步筛选为阳性的菌株测序，验证正确后，命名该重组质粒为pGEX-4T-AIP2，命名该重组大肠杆菌为E.coli DH5αpGEX-4T-AIP2。
实施例2(长双歧杆菌黏附蛋白的诱导表达和纯化)
第一步：长双歧杆菌黏附蛋白的诱导表达
取实施例1制备的长双歧杆菌黏附蛋白表达菌株E.coli DH5αpGEX-4T-AIP2用IPTG进行诱导表达，具体步骤如下：
(1)挑取已平板划线培养的菌株单菌落，接种至3ml LB液体培养基中，并在试管中加入Amp至终浓度为100μg/ml，于37℃恒温培养振荡器180r/m培养8h。
(2)按1％的接种量转接至20ml低盐LB液体培养基，加入Amp至终浓度为100μg/ml，于37℃恒温培养振荡器180r/m培养。
(3)待菌体密度OD600nm＝0.6-0.9时，加入诱导剂IPTG至终浓度为1mM，于37℃恒温培养振荡器180r/m诱导培养4-5h。
(4)诱导培养后将菌液等量转移至两支50ml离心管，4℃，5000r/m离心8min，弃上清。分别加入10mlPBS缓冲液重悬洗涤菌体沉淀，5000r/m离心8min，弃上清，10ml菌液离心所得菌体中加入3ml PBS缓冲液重悬，冰浴超声(180W，工作3s，间隙5s)破碎20-30次，至菌液澄清透明即可。
(5)所得溶液按1mL/管分装，-20℃保存备用。
第二步：SDS-PAGE检测表达蛋白
采用SDS-PAGE凝胶电泳检测黏附蛋白的诱导表达情况，具体步骤如下：
(1)分别取第一步中所得样品各100μl，4℃，13000r/m离心5min，分别取5μl上清液加入等量的2×SDS凝胶上样缓冲液，混匀备用。
(2)将样品于100℃沸水浴中煮6min后上样，按80V，25-35min+140V，1-1.5h电泳。
(3)电泳完毕后，取凝胶置于SDS凝胶染色液中，室温水平摇床摇动染色4-6h。
(4)回收染色液，用蒸馏水冲洗凝胶后，加入适量脱色液，室温摇床晃动脱色6-8h，其间更换脱色液2-3次。观察分析电泳结果。
第三步：双歧杆菌黏附蛋白的亲和纯化
采用GST亲和层析柱纯化目的蛋白，步骤如下：
(1)谷胱甘肽树脂预装柱的平衡：使用30ml的缓冲液A(PBS+2mMEDTA)进行层析柱平衡，控制流速为3mL/min左右。
(2)融合蛋白与层析柱的结合：将澄清的细胞粗提物上样，控制流速为1-2mL/min左右。
(3)融合蛋白的洗脱：待曲线下降平稳后用缓冲液B(PBS+2mMEDTA+20mM谷胱甘肽)将目的蛋白洗脱，控制流速为1ml/min，收集洗脱峰。
(4)浓缩蛋白：用超滤管浓缩洗脱液，过脱盐柱，纯水洗脱，控制流速为3mL/min，取洗脱峰溶液，真空冷冻干燥后，取部分溶解进行SDS-PAGE电泳鉴定。鉴定结果如图1所示。
实施例2(一种氨基酸序列为SEQ ID NO:1的蛋白质制备方法)
1)取重组大肠杆菌E.coli DH5αpGEX-4T-AIP2培养，至培养液OD600nm为0.6时加入诱导剂IPTG至终浓度为0.8mM，而后于35℃、震荡条件下诱导培养4h；
2)收集菌体，将菌体重悬于PBS缓冲液后，在冰浴条件下超声破碎20次(每次破碎的持续时间为2s，每2次破碎之间的间隔时间为4s)，而后收集上清；
3)取缓冲液A，以2.5mL/min的流速平衡谷胱甘肽琼脂糖树脂柱；取步骤2)上清液，以1mL/min的流速上样；取缓冲液B，以0.8mL/min的流速洗脱，收集洗脱峰处溶液即为洗脱液；取洗脱液超滤浓缩，而后过脱盐柱，再利用纯水以2.5mL/min的流速洗脱，收集洗脱峰处溶液即为第二洗脱液，而后冷冻干燥，即得到所述蛋白质；
其中所述缓冲液A是含有1.5mM EDTA的PBS缓冲液；
所述缓冲液B是含有1.5mM EDTA、15mM谷胱甘肽的PBS缓冲液。
实施例3(一种氨基酸序列为SEQ ID NO:1的蛋白质制备方法)
1)取重组大肠杆菌E.coli DH5αpGEX-4T-AIP2培养，至培养液OD600nm为0.9时加入诱导剂IPTG至终浓度为1.2mM，而后于39℃、震荡条件下诱导培养5h；
2)收集菌体、破碎、收集上清；
3)取缓冲液A，以3.5mL/min的流速平衡谷胱甘肽琼脂糖树脂柱；取步骤2)上清液，以2mL/min的流速上样；取缓冲液B，以1.2mL/min的流速洗脱，收集洗脱峰处溶液即为洗脱液；取洗脱液超滤浓缩，而后过脱盐柱，再利用纯水以3.5mL/min的流速洗脱，收集洗脱峰处溶液即为第二洗脱液，而后冷冻干燥，即得到所述蛋白质；
其中所述缓冲液A是含有2.5mM EDTA的PBS缓冲液；
所述缓冲液B是含有2.5mM EDTA、25mM谷胱甘肽的PBS缓冲液。
实施例4(一种氨基酸序列为SEQ ID NO:1的蛋白质制备方法)
1)取重组大肠杆菌E.coli DH5αpGEX-4T-AIP2培养，至培养液OD600nm为0.7时加入诱导剂IPTG至终浓度为0.9mM，而后于37℃、震荡条件下诱导培养4.5h；
2)收集菌体，将菌体重悬于PBS缓冲液后，在冰浴条件下超声破碎30次(每次破碎的持续时间为4s，每2次破碎之间的间隔时间为6s)，而后收集上清；
3)取步骤2)上清液，利用GST亲和层析纯化，收集洗脱液后超滤浓缩，脱盐，干燥，即得到所述蛋白质。
实施例5(实施例2所制备蛋白分别对单核增生李斯特菌、大肠杆菌O157:H7、鼠伤寒沙门氏菌的氨苄青霉素敏感性影响实验)
单核增生李斯特菌、大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌均与长双歧杆菌特异性蛋白AIP2共培养2h，进行活菌计数后分别将三种致病菌等量转接到加入不同浓度氨苄的等体积LB液体培养基，对黏附蛋白处理组和GST处理组进行活菌计数对比。具体方法如下：
(1)用无菌PBS溶液将黏附蛋白AIP2分别稀释至浓度均为45μg/mL，GST作为对照稀释至相同浓度，4℃保存备用。
(2)单核增生李斯特菌培养至对数中期，8000r/min，4℃条件下离心5min后，收集菌体，无菌PBS洗涤3次，分别用GST稀释液、黏附蛋白AIP2稀释液重悬菌体，稀释至细菌浓度均为106CFU/mL，于37℃细菌培养震荡器处理2h。
(3)分别等量接种黏附蛋白处理过和GST处理的单核增生李斯特菌、大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌于2mL加入不同浓度的氨苄LB液体培养基，氨苄浓度梯度为50，25，10，1，0.1μg/mL，均于37℃恒温震荡培养箱中培养6h，进行活菌计数。实验结果见图2。
如图2所示，与对照组相比较，被粘附蛋白处理后的微生物在抗生素的作用下抑菌效果更为明显，由于抗生素0点处对照组与粘附蛋白处理组的生物量水平相当，因此可以认为粘附蛋白本身并不具有直接的抑菌效果，而仅起到抗生素抑菌增效作用。
实施例6(实施例2所制备蛋白分别对单核增生李斯特菌、大肠杆菌O157:H7、鼠伤寒沙门氏菌的青霉素G敏感性、头孢霉素敏感性、卡那霉素敏感性、氯霉素敏感性影响实验)
单核增生李斯特菌、大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌均与长双歧杆菌特异性蛋白AIP2共培养2h，进行活菌计数后分别将三种致病菌等量转接到加入不同浓度氨苄的等体积LB液体培养基，对黏附蛋白处理组和GST处理组进行活菌计数对比。具体方法如下：
(1)用无菌PBS溶液将黏附蛋白AIP2分别稀释至浓度均为55μg/mL，GST作为对照稀释至相同浓度，4℃保存备用。
(2)单核增生李斯特菌培养至对数中期，8000r/min，4℃条件下离心5min后，收集菌体，无菌PBS洗涤3次，分别用GST稀释液、黏附蛋白AIP2稀释液重悬菌体，稀释至细菌浓度均为106CFU/mL，于37℃细菌培养震荡器处理2h。
(3)分别等量接种黏附蛋白处理过和GST处理的单核增生李斯特菌、大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌于2mL加入浓度分别为1μg/mL青霉素G、1μg/mL头孢霉素、2μg/mL卡那霉素或2μg/mL氯霉素的LB液体培养基，均于37℃恒温震荡培养箱中培养6h，进行活菌计数。结果见图3。
如图3所示，黏附蛋白处理后的微生物在抗生素作用下受到了更为突出的抑制，菌体密度普遍为对照组的1/10以下，由此可见，本发明长双歧杆菌蛋白质具有确切、显著的抑菌增效作用。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种长双歧杆菌蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种权利要求1所述长双歧杆菌蛋白质的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)制备长双歧杆菌蛋白质的重组大肠杆菌表达菌株；
2)取步骤1)所述长双歧杆菌蛋白质的重组大肠杆菌表达菌株进行培养，至培养液OD600nm为0.6～0.9时加入诱导剂IPTG至终浓度为0.8～1.2mM，而后于35～39℃、震荡条件下诱导培养4～5h；
3)收集菌体、破碎、收集上清；
4)取步骤3)上清液，利用GST亲和层析纯化，收集洗脱液后超滤浓缩，脱盐，干燥，即得到所述长双歧杆菌蛋白质。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤3)所述的破碎是将菌体重悬于PBS缓冲液后，在冰浴条件下超声破碎20～30次，每次破碎的持续时间为2～4s，每2次破碎之间的时间间隔为4～6s。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤4)具体包括以下操作：
a)取缓冲液A，以2.5～3.5mL/min的流速平衡谷胱甘肽琼脂糖树脂柱；
b)取步骤2)上清液，以1～2mL/min的流速上样；
c)取缓冲液B，以0.8～1.2mL/min的流速洗脱，收集洗脱峰处溶液即为洗脱液；
d)取洗脱液超滤浓缩，而后过脱盐柱，再利用纯水以2.5～3.5mL/min的流速洗脱，收集洗脱峰处溶液即为第二洗脱液，而后冷冻干燥，即得到所述长双歧杆菌蛋白质；
其中所述缓冲液A是含有1.5～2.5mM EDTA的PBS缓冲液；
所述缓冲液B是含有1.5～2.5mM EDTA、15～25mM谷胱甘肽的PBS缓冲液。
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