KR101464109B1 - 젖산균 및 비피더스균을 검출하기 위한 선택배지 조성물 - Google Patents

젖산균 및 비피더스균을 검출하기 위한 선택배지 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식품에서 농산물에서 젖산균 및 비피더스균을 함께 검출할 수 있는 공동 선택배지 조성물 및 상기 선택배지 조성물을 이용하여 식품 내 젖산균 및 비피더스균을 검출하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 혈액무첨가(blood-free) 배지에 프로피온산을 첨가하고 pH를 적적하게 조절한 선택배지 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 선택배지는 종래 선택배지에 비해 식품에서 젖산균 및 비피더스균에 대한 선택성이 현저하게 우수하므로, 식품 내 젖산균 및 비피더스균 검출을 위한 선택배지로 유용하게 사용될 수 있는 특징이 있다.

Description

젖산균 및 비피더스균을 검출하기 위한 선택배지 조성물 {SELECTIVE MEDIUM COMPOSITION FOR DETECTION OF LACTIC ACID BACTERIA AND BIFIDOBACTERIA}
본 발명은 젖산균 및 비피더스균을 함께 검출할 수 있는 공동 선택배지 조성물 등에 관한 것이다.
젖산균 (lactic acid bacteria)은 유산균이라도 하며, 그람양성, 통성혐기성 또는 혐기성이고, 비피더스균(bifidobacteria)은 그람양성, 절대혐기성 균주이다. 젖산균과 비피더스균은 정장작용, 항암작용, 면역작용의 증진, 혈청 콜레스테롤의 저하, 유당 및 유단백질의 흡수 증진, 비타민 합성 등 인체에 유익한 효과가 보고됨에 따라 이를 이용한 발효제품에 대한 관심이 증가하고 있고 실제로 많은 수의 제품이 생산되어 상용화 되어 있다.
한편, 식품 내 젖산균 및 비피더스균 공동 검출 시, 국내외 공인검출법에서는 희석을 하고 선택배지에 도말하여 계수하는 표준화된 검출법을 사용하고 있다. 일반적으로 사용되는 선택배지는 BL agar, mMRS, RMS, AMC, mCol, LP 등이 있다. 배지의 선택성을 증진시키기 위하여 당류를 전환하거나 항생제를 사용하거나 pH를 낮춰주거나 pH indicator를 첨가하여 선택적으로 계수하는 방법 등이 사용된다.
상기와 같은 종래 젖산균 및 비피더스균 검출용 선택배지에는 다양한 물질과 항생제가 들어가지만, 식품 내 젖산균 및 비피더스균의 검출에는 한계점이 있는 것으로 알려져 있다. 종래 사용되는 선택배지에서 젖산균 및 비피더스균의 성장을 관찰 한 결과, 배지마다 성장의 차이를 보였으며 젖산균 및 비피더스균이 젼혀 검출 되지 않는 경우가 있음이 보고되었다(Saccaro, D.M. et al., African Journal of Microbiology Research 6, 2239-2245).
이처럼 선택배지의 구성성분인 항생제에 저항을 보이는 균일 경우 식품 내 젖산균 및 비피더스균의 검출에 방해가 되므로, 젖산균 및 비피더스균의 성장을 억제하지 않고 그 외의 지표미생물의 성장을 억제할 수 있는, 선택성이 높은 새로운 배지의 개발이 필요한 실정이다.
종래 사용되고 있는 젖산균 및 비피더스균 선택배지는 항생제 저항성을 나타내는 균주로 인해 높은 위양성 결과가 도출됨에 따라, 본 발명자들은 종래기술의 문제점을 극복하기 위하여 위양성 결과를 야기하는 지표미생물을 효과적으로 억제하여 젖산균 및 비피더스균 선택성을 높일 수 있는 새로운 조성의 선택배지를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 프로피온산(propionic acid)을 더 포함하며, pH가 조절된, 식품에서 젖산균(Lactobacillus sp.) 및 비피더스균(Bifidobacterium sp.)을 검출하기 위한 선택배지 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 식품 시료를 상기 선택배지 조성물에 배양하는 단계를 포함하는 식품에서 젖산균 및 비피더스균을 선택적으로 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 프로피온산(propionic acid)을 포함하며 pH가 5.8 내지 6.0인 것을 특징으로 하는, 식품에서 젖산균(Lactobacillus sp.) 및 비피더스균(Bifidobacterium sp.)을 검출하기 위한 선택배지 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 선택배지는 mMRS 한천 배지, BL 한천 배지 또는 BCP 한천 배지일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 있어서, 상기 BL 한천 배지는 혈액무첨가(Blood-free) 배지일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 프로피온산은 4 ml/L 내지 10 ml/L 농도로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 식품 시료를 상기 선택배지 조성물에 배양하는 단계를 포함하는 식품에서 젖산균 및 비피더스균을 선택적으로 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 실시예에 있어서, 상기 배양은 37℃에서 24시간 내지 48 시간 동안 이루어지는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 배양은 혐기적 조건(anaerobic condition)에서 수행되는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 선택배지는 종래 선택배지에 비해 식품에서 젖산균 및 비피더스균에 대한 선택성이 현저하게 우수하므로, 식품 내 젖산균 및 비피더스균 검출을 위한 선택배지로 유용하게 사용될 수 있는 특징이 있다.
본 발명은 프로피온산(propionic acid)을 포함하며 pH가 5.8 내지 6.0인 것을 특징으로 하는, 식품에서 젖산균(Lactobacillus sp.) 및 비피더스균(Bifidobacterium sp.)을 검출하기 위한 선택배지 조성물을 제공하는 것을 특징으로 한다.
식품에서 젖산균(Lactobacillus sp.) 및 비피더스균(Bifidobacterium sp.)을 검출하고자 할 때, 종래 사용되는 선택배지의 경우 함유된 항생제에 내성을 보이는 균으로 인해 위양성(false positive) 결과가 도출되는 문제점이 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 종래 선택배지(BL agar, BCP agar 또는 mMRS agar)에 프로피온산을 첨가하였으며, 그 결과 위양성 결과가 현저하게 개선됨을 확인하였다(실시예 1 참조). 다만, 프로피온산을 첨가하면 pH가 낮아져 젖산균 및 비피더스균의 성장도 저해되는 것으로 나타남에 따라 선택배지의 pH를 조절한 결과, pH 5.8 내지 6.0 범위의 선택배지에서 위양성 결과가 개선되면서도 젖산균 및 비피더스균의 성장은 저해되지 않음을 확인하였다(실시예 2 참조).
이에, 본 발명자들은 본 발명의 선택배지를 이용하여 식품에서 젖산균 및 비피더스균을 효과적으로 검출할 수 있는 지 확인하고자, 젖산균 및 비피더스균이 포함된 시중 제품을 구입하여 검증한 결과, 특히, 혈액무첨가(blood-free) BLP agar 선택배지에서 가장 효과적으로 젖산균 및 비피더스균을 계수할 수 있음을 확인하였다(실시예 3 참조).
따라서 본 발명은 식품에서 젖산균 및 비피더스균을 검출하기 위하여, 프로피온산을 포함하는 pH 5.8 내지 6.0의 선택배지를 제공할 수 있으며, 바람직하게 상기 선택배지는 mMRS 한천(agar) 배지, BL 한천 배지 또는 BCP 한천 배지를 사용할 수 있고, 가장 바람직하게는 혈액무첨가 BL 한천 배지를 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 프로피온산은 4 ml/L 내지 10 ml/L 농도로 배지에 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기로부터, 본 발명은 식품 시료를 상기 선택배지 조성물에 배양하는 단계를 포함하는 식품에서 젖산균 및 비피더스균을 선택적으로 검출하는 방법을 제공할 수 있다.
이때, 상기 배양은 혐기적 조건(anaerobic condition) 또는 호기적 조건(aerobic condition)에서 37℃에서 24시간 내지 48 시간 동안 수행되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기에서 식품은 젖산균 및 비피더스균과 같은 유산균을 포함하는 식품, 상기 유산균을 가공하여 만든 발효식품을 포함하는 건강기능식품을 의미하는 것으로, 가장 바람직하게는 치즈, 요거트(Yogurt), 생균 보충제(probiotic supplement) 또는 김치일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
선택배지의 선택성 비교실험
<1-1> 젖산균 및 비피더스균과 지표 미생물 균주 준비
본 발명에 따른 선택배지의 선택성을 검증하기 위하여 12종의 비피더스균(Bifidobacterium sp.), 17종의 젖산균(Lactobacillus sp.), 8종의 LAB cocci(Lactococcus 균주 2, Leuconostoc 균주 1, Pediococcus 균주 1, Enterococcus 균주 2, Streptococcus 균주 1 및 Weissella 균주 1), 9종의 지표 미생물(Bacillus cereus , Escherichia coli , Escherichia coli O157:H7, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes , Pseudomonas fluorescens , Staphylococcus aureus, Salmonella Typhimurium, Propionibacterium freudenreichii)을 사용하였다. 각각의 균주는 MRS broth 또는 L-cysteine HCl(0.05%)이 포함된 MRS broth 또는 TSB를 이용하여 37C에서 24시간 또는 48시간동안 배양한 뒤 실험에 사용하였다.
<1-2> 종래 선택배지와 프로피온산 첨가 배지에서의 젖산균 및 비피더스균과 지표 미생물의 성장 측정
상기 실시예 <1-1>을 통해 배양된 균을 종래 선택배지(BL agar, BCP agar 또는 mMRS agar) 및 종래 선택배지에 프로피온산(propionic acid)을 5 ml/L 농도로 첨가한 선택배지(letter P를 추가하여 다음과 같이 표기함: BLP agar, BCPP agar, mMRSP agar)에 획선 도말한 후, 혐기적 환경에서 37°C에서 48시간 배양한 뒤 이들의 콜로니 형성 유무를 확인하였으며, 종래 선택배지와 종래 선택배지에 프로피온산을 첨가한 배지에서의 젖산균 및 비피더스균과 지표 미생물의 성장을 확인한 결과를 하기 표 1에 나타냈다.
Culture media Number of strains
Bifidobacteria
(12 strains)		 LAB bacilli
(17 strains)		 LAB cocci
(8 strains)		 Total
(37 strains)		 Indicator m/o
(9 strains)
AMCa 3 9 4 16 0
AMCb 11 9(1) 6 26(1) 1(1)
RCM 11 10(4) 8 29(4) 8
LBS 1(6)d 15(1) 2 18(7) 1
M17 11 14(2) 8 33(2) 8
BL 12 17 8 37 8
BLPc 4(5) 13 2 19(5) 0
BCP 12 17 8 37 8
BCPPc 6 10(3) 1 17(3) 0
mMRSe 12 17 8 37 7
mMRSPc 6(2) 14 2 22(2) 0
a Antibiotics sterilized by filter method were added into AMC agar following autoclaving.
b Antibiotics were added into AMC agar and then agar was autoclaved.
c Propionic acid was added into BL, BCP or mMRS agar, adjusted to pH 5 using NaOH.
d Colonies were recovered weakly.
e Modified De Man Rogosa and Sharpe agar
표 1에 나타난 바와 같이, 종래 선택배지에서는 지표 미생물이 자라 선택성이 떨어짐을 알 수 있으나, 프로피온산이 첨가된 BLP, BCPP, mMRSP agar의 경우 지표 미생물이 자라지 못하는 것을 알 수 있었다.
상기 결과로부터, BL, BCP, mMRS 배지에 프로피온산을 첨가한 배지들의 선택성이 증가됨을 알 수 있었다.
선택배지의 pH 최적화
상기 실시예 <1-2>에서 확인한 바와 같이, 종래 선택배지에 프로피온산을 첨가할 경우, 지표 미생물의 성장을 모두 억제시키지만 프로피온산 첨가로 낮아진 pH로 인해 젖산균 및 비피더스균의 성장까지 억제됨을 알 수 있었다. 이에, 배지에 NaOH를 첨가하여 배지의 pH를 높여주면서 젖산균 및 비피더스균과 지표미생물의 성장을 관찰하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
Culture media Number of strains
Bifidobacteria
(12 strains)		 LAB bacilli
(17 strains)		 LAB cocci
(8 strains)		 Total
(37 strains)		 Indicator m/o
(8 strains)
BLP 5.2a 11 17 8 36 0
BLP 5.4 11 17 8 36 0
BLP 5.6 11 17 8 36 0
BLP 5.8 12 17 8 37 0
BLP 6.0 12 17 8 37 5
BLP 6.2 12 17 8 37 7
BCPP 5.2 8 16 8 32 0
BCPP 5.4 11 17 8 36 0
BCPP 5.6 11 17 8 36 0
BCPP 5.8 11 17 8 36 0
BCPP 6.0 12 17 8 37 0
BCPP 6.2 12 17 8 37 0
mMRSP 5.2 11 17 8 36 0
mMRSP 5.4 11 17 8 36 0
mMRSP 5.6 11 17 8 36 0
mMRSP 5.8 11 17 8 36 0
mMRSP 6.0 12 17 8 37 0
mMRSP 6.2 12 17 8 37 1
a Propionic acid was added into BL, BCP and mMRS agar, and pH was adjusted from 5.2 to 6.2 using NaOH, respectively
그 결과, BLP 5.8, BCPP 6.0, mMRSP 6.0 선택배지에서 지표미생물의 성장이 모두 억제되며, 젖산균 및 비피더스균의 성장에는 방해되지 않음을 알 수 있었다.
젖산균 및 비피더스균을 포함한 식품에서 선택배지의 검증
젖산균 및 비피더스균이 포함된 제품 10개를 시중 마트에서 구입하여 사용하였다. 검출방법은 식품공전에 공지된 방법을 이용하였으며, 간략하면, 고체타입의 식품은 25g과 50 ml buffered peptone water (BPW)를 멸균 stomacher bag에 넣어준 후 2분간 섞어주었고, 액체타입의 식품은 BPW로 10배 희석법을 사용하여 희석한 후 각각의 배지에 획선 도말한 다음 혐기적 환경에서 37°C에서 48시간 배양한 후 콜로니를 계수하였다. 상기와 같은 방법으로 다양한 배지를 이용하여 식품에서 분리한 젖산 및 비피더스균을 계수한 결과는 하기 표 3에 나타낸 바와 같다.
Culture media Aa B C D E F G H I J
mMRS 8.88±0.21Ab 8.64±0.18A 9.05±0.09A 8.61±0.08C 8.93±0.18A 7.68±0.33A 7.99±0.12A 7.76±0.11A 6.46±0.03A 8.17±0.02A
BL 8.27±0.69ABC 8.85±0.05A 8.80±0.64A 8.95±0.13A 9.11±0.08A 7.61±0.28A 7.84±0.31A 7.72±0.08A 6.62±0.12A 8.14±0.05A
BCP 8.59±0.76AB 8.86±0.12A 8.82±0.65A 8.81±0.02B 9.11±0.11A 7.58±0.32A 7.81±0.29A 7.72±0.07A 6.63±0.14A 8.12±0.01A
BLP 5.8
(+blood)		 7.66±0.36C <5.00D 8.40±0.24A 8.48±0.05C 7.28±1.05B 6.56±0.19B 7.68±0.33A 7.67±0.05A 4.63±0.20BC 7.44±0.02D
BLP 5.8
(-blood)		 7.94±0.21BC 8.26±0.21B 8.45±0.08A 7.41±0.08D 8.71±0.20A 6.68±0.29B 7.69±0.10A 7.76±0.06A 4.81±0.08B 7.65±0.04C
mMRSP 6.0 7.84±0.14BC 5.47±0.40C 6.80±0.03B 7.31±0.05D 6.58±0.32B 6.97±0.37B 7.73±0.05A 7.66±0.06A 4.52±0.07C 7.99±0.07B
a All product were commercial products (A, B, C, D and E were yoghurt; F and G were Kimchi; H and I were cheese; J was probiotic supplement).
b Same letters in the same column mean that the differences in counts due to the culture media are not significant (P ≥ 0.05).
종래 선택배지 mMRS, BL, BCP의 경우 식품 I (치즈)를 제외하고는 콜로니 수가 7 log CFU/ml(또는 CFU/g)인 것으로 나타났고, 식품 A, B, C, D, E(요거트)의 경우 8 log CFU/ml 이상이 계수되었다. 식품마다 차이를 보이긴 하나 전체적으로 혈액무첨가(-blood) BLP 5.8 선택배지에서 혈액이 포함된 BLP 5.8 선택배지 및 mMRSP 6.0 선택배지보다 유의적으로 높은 계수를 나타냄을 알 수 있었다.
상기 결과로부터, 식품으로부터 젖산균 및 비피더스균을 계수하는데 혈액무첨가 BLP 5.8 선택배지가 가장 효과적임을 확인하였다.
본원발명의 젖산균 및 비피더스균 검출용 선택배지의 제조
상기 실시예 결과들로부터, 본원발명의 젖산균 및 비피더스균 검출용 선택배지(BLP 5.8)를 개발하였다. 보다 상세하게는, BL 배지는 제조자 (Difco 사)의 매뉴얼대로 준비하였으며, 상기 BL 배지에서 혈액을 제외하고, 프로피온산(propionic acid)을 추가로 첨가한 뒤, NaOH를 이용하여 배지의 pH를 5.8로 맞춤으로써 본원발명의 젖산균 및 비피더스균 검출용 선택배지(BLP 5.8)를 제조하였다. 본원발명의 선택배지 조성을 정리하면 하기 표 4와 같다.
BL agar BLP 5.8 agar
용매 멸균 증류수 1L 멸균 증류수 1L
베이스 성분 -BL agar 58 g (BD) - BL agar 58 g (BD)
선택첨가제 - Lysed horse blood 50 ml (Oxoid) - Propionic acid (5 ml/L)
- 2.5N-NaOH (10 ml/L)
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.

Claims (7)

  1. 프로피온산(propionic acid)을 포함하며 pH가 5.8 내지 6.0인 것을 특징으로 하는, 식품에서 젖산균(Lactobacillus sp.) 및 비피더스균(Bifidobacterium sp.)을 검출하기 위한 선택배지 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 선택배지는 L-cysteine HCl 첨가 MRS (de Man, Rogosa and Sharpe) 한천 배지, BL (glucose-blood-liver) 한천 배지 또는 BCP (Bromocresol Purple) 첨가 한천 배지인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 BL 한천 배지는 혈액무첨가(Blood-free) 배지인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 프로피온산은 4 ml/L 내지 10 ml/L 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  5. 식품 시료를 제1항의 선택배지 조성물에 배양하는 단계를 포함하는 식품에서 젖산균 및 비피더스균을 선택적으로 검출하는 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 배양은 37℃에서 24시간 내지 48시간 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는, 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 배양은 혐기적 조건(anaerobic condition)에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
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CN107400642A (zh) * 2017-07-24 2017-11-28 内蒙古东达獭兔循环产业研究院 一种细菌营养培养基及其制备方法

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