CN105031635A

CN105031635A - 一种鸡白痢沙门氏菌灭活疫苗的制备方法及其应用

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Publication number: CN105031635A
Application number: CN201510156074.9A
Authority: CN
Inventors: 龚建森; 许明; 张笛; 苗晋锋; 朱春红; 窦新红; 顾蓓蓓; 刘学贤; 徐步; 童海兵; 邹剑敏
Original assignee: Jiangsu Institute Poultry Sciences
Current assignee: Jiangsu Institute Poultry Sciences
Priority date: 2015-04-03
Filing date: 2015-04-03
Publication date: 2015-11-11
Anticipated expiration: 2035-04-03
Also published as: CN105031635B

Abstract

本发明公开了一种鸡白痢染色凝集抗原及其制备方法和应用，属于兽医诊断技术领域。该抗原是将鸡白痢沙门氏菌菌种SP7220、SP7701、SP8441和SP9905分别复苏传代后制成种子菌液，再将种子菌液接种固体培养基增殖，经福尔马林灭活后，通过比浊法调整菌液浓度，最后加入结晶紫溶液染色后充分混匀分装即制成鸡白痢凝集抗原。本发明工艺方法简单合理、科学、生产稳定，成本低廉，选用的鸡白痢染色凝集抗原生产菌种抗原性好、变异率低，制成的鸡白痢染色凝集抗原产品具有敏感性高、特异性强、诊断快速、凝集图像清晰的优点，是一种较为理想的检测鸡白痢的染色凝集抗原。

Description

一种鸡白痢沙门氏菌灭活疫苗的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于生物制品技术领域，具体涉及一种鸡白痢沙门氏菌灭活疫苗的制备方法及其应用。

背景技术

鸡白痢是由鸡白痢沙门氏菌引起的各年龄段鸡或火鸡的常见多发性传染病。该病自1899年首次发现，目前已呈世界范围流行，造成养禽业的重大损失。20日龄以内的雏鸡感染鸡白痢沙门氏菌后，通常引发急性败血症，死亡率高达80%~100%。目前国内通常采用药物控制的方法减轻疫病的危害，但长期反复用药不仅使饲养成本上升，而且导致细菌耐药性增强以及药物残留等一系列问题，事实证明仅依赖药物控制不是防治鸡白痢的上选对策。相比而言，采用疫苗免疫，既不会造成细菌耐药性增强，也不会产生药物残留，因而更容易被广大养殖者和消费者接受。灭活疫苗具有安全性好，抗原含量高，生产工艺简单等优点，在传染病防治中得到广泛的应用。但是传统的灭活疫苗由于免疫原性不强，通常需重复接种，导致免疫力产生较慢，且鸡白痢沙门氏菌包含三种不同亚型（标准型、中间型和变异型），而不同亚型间的交叉保护性不高，因而给疫苗研制带来了较大的难度，目前尚未出现能够高效防治鸡白痢的灭活疫苗产品。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种用于预防鸡白痢沙门氏菌的灭活疫苗的制备方法。

本发明的原理是从历年来收集、保存的500余株自然病例所分离的鸡白痢沙门氏菌菌种中，经多年反复筛选验证后获得的三株不同亚型的、免疫原性良好的鸡白痢沙门氏菌菌种SP7220（中间型）、SP8441（变异型）和SP9905（标准型）作为制苗菌种，经培养灭活后采用新型佐剂配方制备疫苗，解决了传统灭活疫苗免疫力产生较慢、细胞免疫保护功能弱、交叉保护性不强等缺点，全面提升疫苗的免疫效力。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种用于预防鸡白痢沙门氏菌的灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1）种子菌液的制备：将鸡白痢沙门氏菌菌种SP7220、SP8441和SP9905复苏繁殖后，接种平板固体培养基，37℃培养24h，挑选典型菌落接种扁瓶固体培养基，37℃培养24h后用液体培养基洗下菌苔，检验合格后作为种子菌液；

2）半成品制备：将种子菌液按培养基总体积的3.0%接种，经发酵罐37℃深层通气培养12h后，收集菌液，经5000r/min离心15min去除上清液，用含有0.3%甲醛的生理盐水重新悬浮菌泥，置8℃灭活12h，制成半成品；

3）疫苗制备：将半成品与含有0.5mg/ml壳聚寡糖、0.75mg/ml刺五加多糖和20mg/ml蜂胶的佐剂等体积充分搅拌混匀，经无菌检验和安全性检验合格后分装制成鸡白痢沙门氏菌灭活疫苗。

所述的鸡白痢沙门氏菌(Salmonellapullorum)SP7220、SP8441、SP9905均已于2014年10月15日送中国典型培养物保藏中心(中国.武汉.武汉大学)保藏，保藏编号分别为：CCTCCNO.M2014476、CCTCCNO.M2014477、CCTCCNO.M2014478。

所述的液体培养基组成为：蛋白胨15.0g、酵母浸出粉5.0g、甘油12.0ml、硫代硫酸钠5.0g、甘露醇3.0ml、可溶性淀粉6.0g、硫酸镁0.5g、氯化钙0.3g、半胱氨酸1.0g、牛胆盐5.0g、葡萄糖8.0g、蒸馏水1000ml。

液体培养基中加入1.5%纯化琼脂粉制成固体培养基。

所述的深层通气发酵培养为37℃条件下采用逐渐加大通气量的方式培养12h。

本发明方法所生产的鸡白痢沙门氏菌灭活疫苗所含有的细菌浓度为每毫升100亿，其中含有鸡白痢沙门氏菌SP7220、SP8441和SP9905的细菌数量分别为30%、20%和50%。

本发明还要求保护上述所述的鸡白痢沙门氏菌SP7220、SP8441、SP9905。

本发明的另一目的还在于通过本发明方法制备得到的鸡白痢沙门氏菌灭活疫苗。

本发明的另一目的还在于上述鸡白痢沙门氏菌灭活疫苗在预防或治疗鸡白痢药物中的用途。

本发明的有益效果为：本发明方法所生产的鸡白痢沙门氏菌灭活疫苗，具有产量高、产品安全可靠，疫苗免疫后在第7天即可产生较好的免疫保护力，在第10天可产生坚强保护力，免疫保护率达100%，并且对不同亚型的鸡白痢沙门氏菌和其它血清型沙门氏菌的攻击具有较好的保护能力。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

实施例1

1）分离纯化与染色镜检

鸡白痢沙门氏菌SP7220株于1972年11月从山东省青岛市某鸡场死亡的白来航雏鸡肝脏中分离所得。其具体分离方法为：无菌采集死亡雏鸡的肝脏置营养肉汤中37℃过夜培养后，再接种于马丁琼脂培养基，37℃培养24小时。挑取直径为1.0mm-2.0mm、灰白色透明、表面光滑的菌落，接种于马丁琼脂培养基，37℃培养24小时。将纯培养后的细菌进行革兰氏染色镜检，然后用光学显微镜观察，呈两端稍圆的细长杆菌。

鸡白痢沙门氏菌SP8441株于1984年12月从北京市某鸡场的6月龄白来航蛋鸡输卵管中分离所得。其具体分离方法为：无菌剪取输卵管一小段加入营养肉汤中37℃过夜培养，再接种于马丁琼脂培养基，37℃培养24小时。挑取直径为1.0mm-2.0mm、灰白色透明、表面光滑的菌落，接种于马丁琼脂培养基，37℃培养24小时。将纯培养后的细菌进行革兰氏染色镜检，然后用光学显微镜观察，呈两端稍圆的细长杆菌。

鸡白痢沙门氏菌SP9905株于1999年5月从江苏省扬州市某鸡场的11月龄狼山鸡盲肠内容物中分离所得。其具体分离方法为：无菌采集盲肠内容物加入亚硒酸盐胱氨酸增菌液中37℃过夜培养，再接种麦康凯琼脂37℃培养24小时，挑取直径为0.5mm-1.0mm、灰白色透明、表面光滑的菌落，接种于马丁琼脂培养基，37℃培养24小时。将纯培养后的细菌进行革兰氏染色镜检，然后用光学显微镜观察，呈两端稍圆的细长杆菌。

2）生化鉴定

从马丁琼脂平板上挑取菌落，进行生化鉴定试验。微量生化鉴定管购自杭州微生物试剂有限公司，按照说明书进行操作。结果菌株的各项生化指标（见表1）均符合鸡白痢沙门氏菌生化特性。

表1鸡白痢沙门氏菌生化鉴定结果

菌株

靛基质

尿素

氰化钾

赖氨酸

鸟氨酸

甘露醇

山梨醇

SP9905

-

+

-

SP8441

-

+

-

SP7220

-

+

-

菌株

水杨苷

丙二酸盐

ONPG

卫矛醇

葡萄糖

麦芽糖

乳糖

SP9905

-

+

-

SP8441

-

+

-

SP7220

-

+

-

菌株

蔗糖

阿拉伯糖

伯胶糖

鼠李糖

酒石酸

硫化氢

运动性

SP9905

-

+

-

+

-

SP8441

-

+

-

SP7220

-

+

-

3）血清学分型

从马丁琼脂平板上挑取菌落至生理盐水中，用比浊法调整细菌浓度至每毫升1.0×10¹⁰CFU，采用玻片凝集的方法对菌株进行血清学分型鉴定。具体操作方法如下：取洁净玻片1张，用微量移液器吸取25μl沙门氏菌阳性血清（除O12₂和O12₃购自中国兽医药品检查所外，其余血清均购自丹麦哥本哈根国立血清研究所）滴于载玻片上，另吸取25μl生理盐水做对照，然后吸取25μl菌液分别加入血清和生理盐水中，充分混匀。轻轻摇动载玻片，2min后判定结果。检测结果如表2：SP9905为标准型，SP7220为中间型，SP8441为变异型。

表2鸡白痢沙门氏菌血清学分型结果

菌株

A-F

O1

O2

O4

O7

O8

O9

SP9905

++++

++

-

+++

SP8441

++++

-

+++

SP7220

++++

-

++++

菌株

O10

O11

O15

O19

O12₂

O12₃

SP9905

-

+

++++

SP8441

-

++++

+

SP7220

-

+++

注：“++++”代表100%凝集，“+++”代表75%凝集，“++”代表50%凝集，“+”代表25%凝集，“-”代表未发生凝集。

下面结合具体实施例说明成上述鸡白痢沙门氏菌制备的活疫苗及方法。

A.培养基配置：

液体培养基组成为：蛋白胨15.0g、酵母浸出粉5.0g、甘油12.0ml、硫代硫酸钠5.0g、甘露醇3.0ml、可溶性淀粉6.0g、硫酸镁0.5g、氯化钙0.3g、半胱氨酸1.0g、牛胆盐5.0g、葡萄糖8.0g、蒸馏水1000ml。

液体培养基中加入1.5%纯化琼脂粉制成固体培养基。

B.鸡白痢沙门氏菌的灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

2）半成品制备：将种子菌液按培养基总体积的3.0%接种，经发酵罐37℃深层通气培养（37℃条件下采用逐渐加大通气量的方式培养）12h后，收集菌液，经5000r/min离心15min去除上清液，用含有0.3%甲醛的生理盐水重新悬浮菌泥，置8℃灭活12h，制成半成品；

实施例2

将鸡白痢沙门氏菌菌种SP7220、SP8441和SP9905分别复苏繁殖后，选取典型菌落扩大培养后制成种子菌液。将种子菌液按培养基总体积的3.0%接种，经发酵罐37℃深层通气培养12h后收集菌液，经5000r/min离心15min去除上清液，用含有0.3%甲醛的生理盐水重新悬浮菌泥，置8℃灭活12h。将灭活菌液与含有0.5mg/ml壳聚寡糖、0.75mg/ml刺五加多糖和20mg/ml蜂胶的佐剂等体积充分混匀，无菌分装制成鸡白痢沙门氏菌灭活疫苗。

将疫苗分别肌肉注射3日龄健康来航鸡和3日龄健康贝蒂纳火鸡（每羽份0.2ml，含菌20亿），同时设非免疫对照组。在免疫后的3d、7d、10d、14d和21d，免疫组和对照组各选取10只鸡（火鸡）攻击致死剂量的鸡白痢沙门氏菌CVCC520，单独饲养14d，记录发病死亡情况。

结果见表3，由表可见，免疫组的试验鸡在免疫后3d、7d、10d、14d和21d的攻毒存活率分别为50%、80%、100%、100%和100%，试验火鸡存活率分别为60%、80%、100%、100%和100%，而非免疫对照组的存活率均小于20%。上述结果表明，用本发明方法制备的鸡白痢沙门氏菌灭活疫苗在免疫后的第7天即可产生较好的免疫保护力，在第10天可产生坚强保护力，免疫保护率达100%。

表3鸡白痢沙门氏菌灭活疫苗的近期免疫效力检验结果

实施例3

按实施例2所述制备方法制成鸡白痢沙门氏菌灭活疫苗，同时使用灭活疫苗半成品，按照《实用兽医生物制品技术》（张振兴等，中国农业科技出版社，1996，53-54）所述的油乳佐剂灭活疫苗与蜂胶佐剂灭活疫苗的制造方法，分别制成油乳佐剂灭活疫苗和蜂胶佐剂灭活疫苗（抗原浓度均为每毫升100亿个细菌）。选取7日龄的健康白来航雏鸡80只，均分为4组。第一组试验鸡肌肉注射实施例一所述制备方法制成的鸡白痢沙门氏菌灭活疫苗（每羽份0.2ml），第二组肌肉注射油乳佐剂灭活疫苗（每羽份0.2ml），第三组肌肉注射蜂胶佐剂灭活疫苗（每羽份0.2ml），第四组肌肉注射灭菌生理盐水（每羽份0.2ml）。在免疫后的14天攻击致死剂量的鸡白痢沙门氏菌CVCC520，单独饲养14d，记录发病死亡情况。

结果第一组试验鸡的存活率为100%（20/20），第二组试验鸡的存活率为65%（13/20），第三组试验鸡的存活率为70%（14/20），第四组试验鸡的存活率为15%（3/20）。上述结果表明，本发明方法生产的鸡白痢沙门氏菌灭活疫苗的免疫保护率显著高于2种传统佐剂制备的灭活疫苗（P<0.01）。

实施例4

按实施例2所述制备方法制成的鸡白痢沙门氏菌灭活疫苗经肌肉注射免疫7日龄的健康白来航雏鸡（每羽份0.2ml，含菌20亿），同时设非免疫对照组。在免疫后的14d，分别使用不同亚型的鸡白痢沙门氏菌标准强毒株，以及鸡伤寒沙门氏菌标准强毒株进行攻击，继续饲养14d后记录发病死亡情况，

结果见表4。免疫雏鸡对三种不同亚型鸡白痢沙门氏菌的攻毒保护率均为100%，而对鸡伤寒沙门氏菌的攻毒保护率为85%。上述结果表明，本发明方法生产的鸡白痢沙门氏菌灭活疫苗不仅对不同亚型鸡白痢沙门氏菌的攻击具有坚强的保护力，对其它血清型沙门氏菌的攻击同样具有较好的保护能力。

表4鸡白痢沙门氏菌灭活疫苗的交叉保护试验结果

实施例5

按实施例2所述制备方法制成鸡白痢沙门氏菌灭活疫苗（以下简称“试验疫苗”），同时使用灭活疫苗半成品，按照《实用兽医生物制品技术》中介绍的方法，分别制成与“试验疫苗”抗原浓度一致的油乳佐剂灭活疫苗（以下简称“油乳疫苗”）和蜂胶佐剂灭活疫苗（以下简称“蜂胶疫苗”）。选取7日龄的健康白来航雏鸡40只，均分为4组。第一组试验鸡肌肉注射“试验疫苗”（每羽份0.2ml），第二组肌肉注射“试验疫苗”（每羽份0.2ml），第三组肌肉注射“蜂胶疫苗”（每羽份0.2ml），第四组作为非免疫对照组。在免疫后的1、2、4、6、8W，所有试验鸡与对照鸡均无菌静脉采血，通过T淋巴细胞转化率的测定来评价不同灭活疫苗对机体细胞免疫的影响。

结果见表5，与非免对照组相比，免疫“试验疫苗”和“蜂胶疫苗”后均对T淋巴细胞的增殖反应有一定影响。其中“试验疫苗”在免疫后第2~6周时间内具有极显著的差异（P＜0.01），在第1周和第8周时具有显著差异（P＜0.05）。而“蜂胶疫苗”在免疫后2~4周时间内具有显著的差异（P＜0.05），“油乳疫苗”免疫后未发生显著差异。通过该实验证明，与传统灭活疫苗相比，本发明方法生产的鸡白痢沙门氏菌灭活疫苗可以有效激发机体产生细胞免疫应答。

表5试验鸡T淋巴细胞增殖试验结果

注：试验组与非免对照组比较，“**”表示有极显著差异（P＜0.01），“*”表示有显著差异（P＜0.05）。

实施例6

按实施例2所述制备方法制成的三个不同批次的鸡白痢沙门氏菌灭活疫苗经肌肉注射免疫7日龄的健康AA肉鸡（每羽份0.2ml，含菌20亿），每组20只，另设非免疫对照组。连续饲养观察7天，统计不同组别的日采食量.

结果见表6，试验鸡免疫不同批次灭活疫苗后的平均日增重为39.07~39.84g，而对照组的平均日增重为39.57g，无显著差异。以上实验证明，本发明方法生产的鸡白痢沙门氏菌灭活疫苗免疫后不影响雏鸡的生产性能。

表6试验鸡免疫后的增重结果（g）

Claims

1.一种用于预防鸡白痢沙门氏菌的灭活疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的鸡白痢沙门氏菌SP7220、SP8441、SP9905均已于2014年10月15日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号分别为：CCTCCNO.M2014476、CCTCCNO.M2014477、CCTCCNO.M2014478。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的鸡白痢沙门氏菌灭活疫苗所含有的细菌浓度为每毫升100亿，其中含有鸡白痢沙门氏菌SP7220、SP8441和SP9905的细菌数量分别为30%、20%和50%。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：

所述的液体培养基组成为：蛋白胨15.0g、酵母浸出粉5.0g、甘油12.0ml、硫代硫酸钠5.0g、甘露醇3.0ml、可溶性淀粉6.0g、硫酸镁0.5g、氯化钙0.3g、半胱氨酸1.0g、牛胆盐5.0g、葡萄糖8.0g、蒸馏水1000m；

所述的固体培养基通过液体培养基中加入1.5%纯化琼脂粉制成。

5.权利要求2所述的一种鸡白痢沙门氏菌SP7220。

6.权利要求2所述的一种鸡白痢沙门氏菌SP8441。

7.权利要求2所述的一种鸡白痢沙门氏菌SP9905。

8.权利要求1所述的制备方法所制备得到的鸡白痢沙门氏菌灭活疫苗。

9.根据权利要求8所述的鸡白痢沙门氏菌灭活疫苗在制备预防或治疗鸡白痢药物中的应用。