CN106754553B - 利用木糖生产丁醇的拜氏梭菌及应用 - Google Patents

利用木糖生产丁醇的拜氏梭菌及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了利用木糖生产丁醇的拜氏梭菌及应用，利用木糖生产丁醇的拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)51543保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC M2017031。本发明以木糖为唯一底物通过自然选育和化学诱变相结合的方法筛选的拜氏梭菌菌株，该菌株能够高效的利用木糖进行发酵，实现了丁醇的高效生产，解决了底物利用率低的问题。另外该菌株经过11次转接传代60‑70代后仍然具备与未传代菌株相似的丁醇生产能力，具备一定的稳定性。本发明突破了菌株对纤维素底物利用率低的问题，同时突破了菌株不稳定的局限，解决了葡萄糖阻遏效应的瓶颈。

Description

利用木糖生产丁醇的拜氏梭菌及应用
技术领域
本发明属于生物化工领域，具体的说，涉及一种以木糖为唯一底物通过自然选育结合化学诱变得到的高产丁醇的拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)51543。
背景技术
ABE(丙酮-丁醇-乙醇)发酵曾是历史上仅次于乙醇发酵的第二大工业发酵产业。但是由于发酵生产丁醇比传统的化工法生产成本高，效率较低，因此发展非常缓慢以致最终被化工生产法代替。近年来，由于石油价格剧增，温室效应以及环境污染日益严重等问题，迫使一些科学家寻求一些可再生的生物质燃料代替石油来缓解目前所面临的环境与经济问题。厌氧梭状芽孢杆菌(Clostridium spp)可以通过ABE发酵生产丙酮、丁醇、乙醇、异丙醇等终产物及乙酸和丁酸等中间产物。丁醇具有能量容量高、挥发性低、亲水性低、腐蚀性低、蒸汽压力低等优点。另外，厌氧梭状芽孢杆菌(Clostridium spp)能够利用广泛的碳源来生产丁醇，基于这些优点，生物法生产丁醇(ABE发酵法生产丁醇)重新获得了科学界的广泛认可。传统的ABE发酵主要以淀粉类、糖质原料等为底物，存在成本高，违背了国家不与人争粮，不与地争田的新能源政策。木质纤维素是一种廉价且来源丰富的可再生资源，包括纤维素、半纤维素和木质素。这些成分经水解后主要成分是葡萄糖和木糖。大部分厌氧梭状芽孢杆菌对葡萄糖有较好的利用能力，但对木糖的利用能力非常弱，这样会大大降低纤维素底物的利用率，而且，现在已经报道的大多数菌株在传代几次后失去了产丁醇的能力，稳定性较差。因此，获得一株能够利用木糖且稳定的生产丁醇的菌株是亟待要解决的问题。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供利用木糖生产丁醇的拜氏梭菌。
本发明的第二个目的是提供利用木糖生产丁醇的拜氏梭菌的应用。
本发明的技术方案概述如下：
利用木糖生产丁醇的拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)51543保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC M2017031。
上述拜氏梭菌在利用木糖生产丁醇的应用。
本发明的优点：
本发明以木糖为唯一底物通过自然选育和化学诱变相结合的方法筛选的拜氏梭菌菌株，该菌株能够高效的利用木糖进行发酵，实现了丁醇的高效生产，解决了底物利用率低的问题。另外该菌株经过11次转接传代60-70代后仍然具备与未传代菌株相似的丁醇生产能力，具备一定的稳定性。本发明突破了菌株对纤维素底物利用率低的问题，同时突破了菌株不稳定的局限，解决了葡萄糖阻遏效应的瓶颈。
附图说明
图1为51543菌株的菌落形态；
图2为51543菌株与原始CH5菌株在静止培养条件下的生长曲线；
图3为51543菌株与原始CH5菌株在静止培养条件下的发酵曲线；
图4为51543菌株与经过10次转接后的菌株51543A10在静止条件下的稳定性发酵曲线；
具体实施方式
本发明以木糖为唯一底物从土壤中获得100株可能是拜氏梭菌的菌，对其进行HPLC分析，10株菌株具备高丁醇生产能力，其中丁醇产量最高的菌株被命名为CH5。
为了进一步提高菌株生产丁醇的能力，我们将出发菌株CH5进行化学诱变，获得了五株产量高于出发菌株的突变体。为了得到木糖利用率高，丁醇产量高及稳定性较好的菌株，我们将获得的突变体进行传代，经过11次转接传代60～70代后，菌株仍然具有同样程度的丁醇生产能力，表明菌株具备一定的稳定性。
实施例1
高产丁醇菌株(Clostridium beijerinckii)51543的选育步骤如下：
(1)土样的采集：用小铁铲刨去土壤表层，于表层10cm左右采集土壤20g左右，然后将采集的土样放于一次性的手套中封好，每次采集土样前后用卫生纸擦干净小铁铲，共收集土样100份(其中32份取自天津周边地区，68份来自中国各地)。
(2)菌种的富集：于室温下，分别从100份土壤中各称量1g左右分别接种到100份含10ml木糖培养基的10ml螺旋扣试管中(木糖培养基(1L)：酵母粉5g，CaCO33g，过磷酸钙0.7g，(NH4)2SO43g，木糖30g，自然pH,121℃21min)，上下颠倒混匀，于80℃条件下热激10min，用流水冷却至室温，于30℃培养箱中培养5天。将得到的菌液以5％的接种量转接至新鲜的木糖培养基中，在80℃条件下热激10min，然后用流水冷却至室温，于30℃培养箱中培养5天，如此循环转接10次，淘汰掉一些产芽孢能力弱、稳定性较差的菌株。最后将第十次培养物长势较好(产生气泡和顶层气泡较多)的菌液产物进行HPLC色谱分析，选择色谱结果中丁醇产量较高的10株菌株菌液。
(3)出发菌株的分离：于室温下，将步骤(2)中选出的菌液混匀后进行梯度稀释，即取100ul混匀的菌液于1.5ml的Ep管中，然后加入900ul经高压蒸汽灭菌的蒸馏水，混合均匀后，再取100ul混合液于新的1.5ml的Ep管中，然后加入900ul经高压蒸汽灭菌的蒸馏水，混合均匀…如此稀释至10-6，将10-3,10-4,10-5,10-6浓度的混合液分别涂布于0.002％溴甲酚绿平板(溴甲酚绿平板(1L)：牛肉膏5g，蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 5g，葡萄糖5g，琼脂20g，溴甲酚绿0.02g，pH 6.5,121℃21min)中进行划线分离，每个浓度梯度涂两个板。通过形态学观察，选出底部变黄、表面褶皱、呈乳白色、不透明的菌落接种至新鲜的TYA液体培养基(TYA培养基(1L)：木糖40g，牛肉膏2g，酵母粉2g，胰蛋白胨6g，乙酸铵3g，K2HPO40.5g，MgSO4 ˙7H2O 0.2g，FeSO4·7H2O 0.01g，pH 6.5,121℃21min)中，于30℃,培养一周后进行HPLC分析。4％木糖条件下筛选出丁醇产量最高的菌株作为出发菌株进行下一步的研究，命名为CH5。
(4)菌株的鉴定：
1)微生物基因组DNA的提取：
粗提：
①取保存于-20℃的CH5菌菌液，转接入5ml TYA液体培养基之中，30℃恒温培养过夜，使其长至OD600＝4；
②将培养物移至1.5ml离心管中，12000rpm，离心1min，弃上清，沉淀用30ul水重悬后12000rpm，离心min，弃上清。
③向1.5ml离心管中顺次加入以下试剂：
Figure BDA0001217616540000031
振荡4min；
④13000rpm，离心10min，转移300ul上清至新离心管；
⑤加入600ul无水乙醇，颠倒混匀，降温至-20℃，放置30min；
⑥13000rpm，离心10min，弃上清，沉淀晾干，无菌水重悬得基因组液；
⑦电泳。
基因组提纯：
①.取RNA酶2ul到粗提的30ul基因组液中，震荡离心去掉管壁液体，放在37℃水浴锅中水浴30min；置于1.5ml离心管中，补充无菌水至总体积达500ul；
②加入酚(Tris饱和酚)/氯仿，两者体积按1:1加，即各加250ul，混合均匀后，溶液呈乳浊液。13000rpm、4℃的条件下离心15分钟，转移上清液至新离心管，约500ul。
③向上清液中加入酚(Tris饱和酚)/氯仿，两者体积按1:1加，即各加250ul，混合均匀后，13000rpm、4℃的条件下离心15分钟，转移上清液至新离心管，约400ul；
④向上清液中加入40ul、3mol/L、pH 5.2的NaAc，800ul的无水乙醇，混合均匀后，在-20℃的条件下静置30分钟，13000rpm、4℃的条件下离心15分钟，弃上清；
⑤加入上清的2倍的体积浓度为70％乙醇水溶液，颠倒混匀，13000rpm、4℃的条件下离心5分钟，弃上清。沉淀晾干，取30ul无菌水重悬。
2)引物合成及PCR产物扩增：
引物：
5’-AGAGTTTGATCATGGCTC-3’SEQ ID NO.1
5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’SEQ ID NO.2
合成：用于鉴定CH5的16SrRNA的引物为：
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2
PCR反应条件：94℃预变性3min，94℃解链变性1min，59.5℃退火60s，72℃延伸90s，反应30个循环，72℃保温延伸10min，15℃终止反应。采用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，产物进行醇沉、加A尾后使用TIANgel凝胶回收试剂盒纯化目的片段，将回收的片段进行T载体连接、转化、酶切鉴定。最后将转化后的单克隆培养液送测序。
(5)化学诱变：将出发菌株CH5单菌落接种至新鲜的TYA培养基(将TYA中的木糖换为葡萄糖)中，于30℃培养12h，约OD为2.取5ml菌液离心收集菌体，用不含葡萄糖(G)的新鲜TYA培养基洗涤一次，再用5ml不含G的TYA培养基重悬菌体，37℃培养2h以消耗细胞内的营养；在试管中加入200ug/ml的NTG，处理30min。离心收集菌体，用新鲜的不含G的TYA培养基洗涤3次。然后将菌体用5ml新鲜的TYA培养基重悬后，在厌氧条件下于37℃培养12h。将培养液如步骤(1)进行稀释后，选取浓度为10-5浓度稀释液分别涂布于含有氟乙酸3mg/l的选择平板上，于37℃培养，长出的单菌落用TYA培养基进行培养后，产物进行HPLC分析，与出发菌株进行对比，筛选出的高产菌株进行传代培养，获得稳定的高效利用木糖的高产菌株51543。菌落形态如图1所示。
该菌株的形态特征，培养特征，分子生物学特性分析的结果，鉴定为拜氏梭菌。具体鉴定结果如下:
一、菌体形态和生理生化特性
1.菌体形态观察
菌株呈革兰氏阳性、短杆状、乳白色、表面褶皱、微向上凸起、菌体湿润。于分离培养基上呈现较大的淀粉透明圈。
2.菌体生理生化特性
表1为51543菌株在静止条件下利用不同碳源的特性；
Figure BDA0001217616540000041
二、出发菌株CH5的16SrDNA基因序列测定结果(拜氏梭菌，Clostridiumbeijerinckii SEQ ID NO.3)
TGCCCAAATTCGCATGCTCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGGGAATTCGATTAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGATGAAGTTCCTTCGGGAACGGATTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTCATAGAGGGGAATAGCCTTTCGAAAGGAAGATTAATACCGCATAAGATTGTAGTGCCGCATGGCATAGCAATTAAAGGAGTAATCCGCTATGAGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGGGAAACCCTGATGCAGCAACGCCGCGTGAGTGATGACGGTCTTCGGATTGTAAAGCTCTGTCTTCAGGGACGATAATGACGGTACCTGAGGAGGAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTACTGGGCGTAAAGGGAGCGTAGGTGGATATTTAAGTGGGATGTGAAATACTCGGGCTTAACCTGGGTGCTGCATTCCAAACTGGATATCTAGAGTGCAGGAGAGGAAAGTAGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTAGGAAGAATACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGACTGTAACTGACACTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATACTAGGTGTAGGGGTTGTCATGACCTCTGTGCCGCCGCTAACGCATTAAGTATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGACCATGTGGTTTAA
本发明的利用木糖生产丁醇的菌株拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)51543，已于2017年1月12日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M2017031。保藏地址湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山保藏。
实施例2
在静置条件下比较51543菌株与原始菌株的生长
1.试验材料：51543菌株；原始菌株(Clostridium beijerinckii)CH5。
2.实验方法：
种子培养基(g/l)：酵母粉5，CaCO33，过磷酸钙0.7，(NH4)2SO43,自然pH，121℃灭菌21min，在接种前加入木糖使其终浓度达到30g/l。单独灭菌：木糖母液200g/l，110℃灭菌18min。
发酵培养基(g/l)：牛肉膏2，酵母粉2，胰蛋白胨6，乙酸铵3，K2HPO40.5，pH 6.5，121℃灭菌21min，发酵前加入使木糖终浓度为40g/l。单独灭菌：木糖母液200g/l，110℃灭菌18min，MgSO4·7H2O 0.2,FeSO4·7H2O 0.01过滤除菌。
将51543菌株与出发菌株(于-20℃甘油管中保存)分别取500ul接种于10ml种子培养基中，80℃热激10min，用流水冷却后于30℃恒温培养16h，再以5％的接种量接种于30mlTYA培养基中，在30℃恒温培养16h，约OD为2，均以初始菌体浓度OD600＝0.1接种于含有150ml的250ml螺旋扣的锥形瓶中，于30℃恒温培养，使用紫外分光光度计测菌体生长曲线。
3.实验结果
如图2所示，51543菌株在24h就已经进入对数生长期，表现出快速生长的趋势，在24～48h的时候菌株表现出下降的趋势，从48h到96h再次表现出明显的生长优势，并逐渐向稳定期转入。而原始菌株在24h进入对数生长期，在24～48h的时候菌株表现出下降的趋势，从48h到96h再次表现出明显的生长并逐渐进入稳定期，与51543菌株相比生长较慢，且对数期较短。由此可知，51543菌株表现出了明显的生长优势，与原始菌株相比显示了更能高效的利用木糖的优势。
4.结论
在4％的木糖条件下，原始菌株生长较慢，而51543菌种表现出了明显的生长优势，能够高效利用木糖进行生长。
实施例3
在静置条件下比较51543菌株与原始CH5菌株的发酵曲线
1.实验材料：同实施例2
2.实验方法：种子培养基、发酵培养基同实施例2
将51543菌株与出发菌株(于-20℃甘油管中保存)分别取500ul接种于10ml种子培养基中，80℃热激10min，用流水冷却后于30℃恒温培养16h，OD约为2.再以5％的接种量接种于TYA培养基中，在30℃恒温培养16h，OD为2.以初始菌体浓度OD600＝0.1接种于含有150ml的250ml螺旋扣的锥形瓶中，于30℃恒温培养，测定菌体木糖浓度、丁醇浓度、异丙醇浓度、乙醇浓度、丁酸浓度、乙酸浓度等。
3.分析方法：木糖浓度、丁醇浓度、异丙醇浓度、乙醇浓度、乙酸浓度等用高效液相色谱(Agilent 1200)测定，条件:带有保护柱(Cation-H R efill Cartridges)的AminexHPX-87H(Bio-R ad)分离柱，柱温45℃；流动相为4mM H2SO4，流速0.8ml/min；RID检测器，光学单元温度45℃，进样量为50ul。丁酸浓度用紫外检测器检测，检测波长为250nm，流速为0.8ml/min，进样量为50ul。
4.计算方法：
丁醇产量(g/l)(样品峰面积/标准峰面积)×样品稀释倍数×100％
丁醇得率(g/g)＝丁醇产量/消耗糖的量
木糖含量、异丙醇含量、乙酸含量和丁酸含量的计算方法同丁醇计算方法
5.实验结果
如图3所示，图3显示了木糖的消耗和丁醇的生产的曲线。实心代表51543菌株，空心代表原始菌株CH5，方形代表丁醇的产生，圆形代表木糖的消耗。由图可以看出，随着时间的增长，丁醇的产量越来越高，直到第3d，51543菌株与原始菌株开始表现出明显的区别，之后51543菌株继续迅速增长，到第6d丁醇的产量达到最高值随后进入稳定期，其中51543菌株的丁醇产量明显高于原始菌株，丁醇的最高产量达到10.6g/l，达到理论产量的79％，超过了已报道的丁醇比例。而原始菌株从第3d开始生长逐渐变慢，到第6d基本进入平台期，此时丁醇的产量约为8.2g/l，达到理论产量的77％。对于木糖的消耗，51543菌株与原始菌株在前3d利用速度基本相同，随后51543菌株仍能快速利用，直到第6d木糖消耗了90％，剩余木糖约为5g/l左右。而原始菌株从第3d开始木糖利用较慢，到第6d时还有约15g/l的木糖没有被利用。木糖消耗约为28g/l左右，剩余13g/l左右没有利用。这充分体现出51543菌株在利用木糖生产丁醇方面比原始菌株具有更好的发酵性能。
6.结论
由图3可以看出，51543菌株能够高效的利用木糖生产丁醇，且表现出了良好的发酵性能，木糖利用能力明显优于出发菌株。而且丁醇产量比出发菌株高，达到理论产量的79％。实施例4
在静置条件下比较菌株51543与传代后菌株51543A10的发酵性能
1.试验材料：同实施例2
2.实验方法：种子培养基和发酵培养基同实施事例2
将于-20℃甘油管中保存的51543菌株与51543A10(51543菌株经过10次转接得到的51543A10菌株)分别取500ul接种于10ml种子培养基中，80℃热激10min后于30℃恒温培养16h，OD至2.再在以5％的接种量接种于30ml的TYA培养基中，30℃恒温培养16h，OD至2.均以初始菌体浓度OD600＝0.1接种于含有150ml的250ml螺旋扣的锥形瓶中，于30℃恒温培养，测定菌体木糖浓度、丁醇浓度异丙醇浓度、乙醇浓度、丁酸浓度、乙酸浓度等。
3.分析方法：同实施例3
4.计算方法：同实施例3
5.结果
图4展示了51543菌株与51543A10菌株在相同条件下的发酵曲线，方形代表51543菌株，三角形代表51543A10，实心代表丁醇产生，半实心代表总溶剂(异丙醇+丁醇)、×代表异丙醇、空心代表木糖的消耗。由图4可以看出51543菌株随着时间的增长，丁醇、异丙醇和总溶剂都在增加，到第4d产物浓度达到最大值并逐渐进入稳定期，而51543A10菌株也表现出了同样的趋势。
对于木糖的消耗，51543菌株在4d之前迅速利用木糖，随后利用木糖越来越慢，直至不在利用。而51543A10菌株对木糖的利用情况和51543菌株基本一致。这说明51543菌株经过10次转接传代60～70代后仍然具备与未传代菌株相似的丁醇生产能力及木糖利用能力。
6.结论
51543菌株经过10次转接得到的51543A10菌株无论是在木糖利用能力方面，还是产物(丁醇、异丙醇、总溶剂)生成方面都没有明显的差异，表明51543菌株具备一定的稳定性。实施例5
在静置条件下51543菌株利用约2％不同碳源的发酵性能
1.试验材料：同实施例2
2.实验方法：种子培养基和发酵培养基同实施事例2
将51543菌株(于-20℃甘油管中保存)接种于10ml TYA培养基中，80℃热激10min后于30℃恒温培养16h，OD约为2.再以5％的接种量接种于同样的培养基中，于30℃恒温培养16h，OD约为2.然后将菌液混匀离心，然后全部接种于200ml的TYA培养基中，，在30℃恒温培养16h，OD为2.然后将菌液混匀离心，后用无菌水洗涤2次后，均以初始菌体浓度OD600＝0.1接种于含有150ml的250ml螺旋扣的锥形瓶中，于30℃恒温培养，测定菌体木糖浓度、葡萄糖浓度、果糖浓度、阿拉伯糖浓度、纤维二糖浓度、蔗糖浓度、甘油浓度、麦芽糖浓度、乳糖浓度、丁醇浓度、异丙醇浓度、乙醇浓度、丁酸浓度、乙酸浓度等。
4.分析方法：同实施例3
5.计算方法：同实施例3
6.实验结果：
表1显示了51543菌株在约(1.5％～2％)碳源(阿拉伯糖为1％碳源)条件下的发酵性能，本实验涉及的碳源包括葡萄糖、木糖、果糖、阿拉伯糖、纤维二糖、蔗糖、甘油、麦芽糖、乳糖、淀粉。其中葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、纤维二糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉被完全利用了，主要的产物为丁醇和异丙醇，乙醇产量几乎为0。丁醇和总溶剂的产率变化范围分别是0.15～0.27g/g和0.27～0.42g/g。在发酵过程中伴随着乙酸和丁酸的产生，从而导致了pH的下降。丁酸通过还原作用会转变为丁醇。表1显示该菌株能够完全利用17.92g/l的木糖生产丁醇，丁醇和总溶剂的产量分别是4.05g/l和5.3g/l，已超过2％碳源条件下报道菌株的产醇能力。从表1中显示的数据发现，最高的丁醇和总溶剂产量是利用纤维二糖得到的，分别为5.23g/l和8.23g/l，对应消耗的纤维二糖是19.7g/l，在72h就能够将所有的纤维二糖利用完，说明该菌株可能具有较强的β-葡萄糖苷酶活，能够将纤维二糖降解为葡萄糖。该菌株利用纤维二糖和淀粉产丁醇的速度差不多，但是由于淀粉的底物较少，导致在第2d就已经将15g/l的淀粉利用完，由于没有碳源，丁醇的生产进入稳定期。其次是利用葡萄糖进行的发酵，丁醇产量达到5.12g/l，总溶剂产量达到7.19g/l，在2％碳源条件下，该菌株的生产的丁醇产量已经超越已报道的其他菌株的产量。而对于麦芽糖的利用情况与葡萄糖类似，丁醇与总溶剂产量分别为4.95g/l和7.16g/l，与利用葡萄糖生产的丁醇和总溶剂的产量相近。另外，该菌株能够完全利用19.65g/l果糖，丁醇和总溶剂的产量分别是4.82g/l和6.2g/l。改菌株也能完全利用17.2g/l的蔗糖，丁醇和总溶剂的产量也较高，分别为3.67g/l和4.61g/l。阿拉伯糖也是木质纤维素水解后存在的单糖，由于阿拉伯糖的含量较低，我们选取了1％的阿拉伯糖作为碳源来检测51543菌株的发酵性能，结果显示该菌株能够完全利用1％的阿拉伯糖，且利用效果较好，丁醇和总溶剂的产量分别为1.52g/l和1.89g/l。而对于甘油和乳糖来讲，该菌株也能够利用，产物主要是乙酸和丁酸，而几乎没有乙醇和丁醇的产生。综上所述，该菌株能够利用广泛的碳源作为底物生产丁醇，其中对木糖、葡糖糖、果糖、蔗糖、纤维二糖、淀粉、阿拉伯糖利用能力较好，对甘油，乳糖利用能力较差。
7.结论：表2显示了菌株51543能够高效的利用广泛的碳源生产丁醇，本实验涉及的碳源包括葡萄糖、木糖、果糖、阿拉伯糖、纤维二糖、蔗糖、甘油、麦芽糖、乳糖、淀粉。其中葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、纤维二糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉被完全利用了，且丁醇的产量较高。报道的大部分菌株可以很好的利用葡萄糖为底物高效的生产丁醇，而对于木糖和阿拉伯糖利用能力较弱，木质纤维素(作为来源丰富的低成本底物)经过彻底的水解后存在的碳源主要为葡萄糖、木糖、阿拉伯糖，有些木质纤维素原料经不彻底水解可能存在纤维二糖，这样就造成了原料利用率较低。该菌株解决了只利用葡萄糖的限制，能够很好的利用木糖等五碳糖和阿拉伯糖等发酵，且发酵性能较好。从该表中可以看出51543菌株有望高效利用木质纤维素经水解后产生的水解液为底物，解决只利用淀粉质原料为底物生产丁醇的瓶颈，使得利用低成本原料高效生产丁醇成为可能。
表2
51543菌株利用不同的2％碳源的发酵性能
Figure BDA0001217616540000091
SEQUENCE LISTING
<110> 天津大学
<120> 利用木糖生产丁醇的拜氏梭菌及应用
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
agagtttgat catggctc 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ggctaccttg ttacgactt 19
<210> 3
<211> 974
<212> DNA
<213> Clostridium beijerinckii
<400> 3
tgcccaaatt cgcatgctcc ggccgccatg gcggccgcgg gaattcgatt agagtttgat 60
cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgagc gatgaagttc 120
cttcgggaac ggattagcgg cggacgggtg agtaacacgt gggtaacctg cctcatagag 180
gggaatagcc tttcgaaagg aagattaata ccgcataaga ttgtagtgcc gcatggcata 240
gcaattaaag gagtaatccg ctatgagatg gacccgcgtc gcattagcta gttggtgagg 300
taacggctca ccaaggcgac gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacattggg 360
actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgc acaatggggg 420
aaaccctgat gcagcaacgc cgcgtgagtg atgacggtct tcggattgta aagctctgtc 480
ttcagggacg ataatgacgg tacctgagga ggaagccacg gctaactacg tgccagcagc 540
cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc cggatttact gggcgtaaag ggagcgtagg 600
tggatattta agtgggatgt gaaatactcg ggcttaacct gggtgctgca ttccaaactg 660
gatatctaga gtgcaggaga ggaaagtaga attcctagtg tagcggtgaa atgcgtagag 720
attaggaaga ataccagtgg cgaaggcgac tttctggact gtaactgaca ctgaggctcg 780
aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgaata 840
ctaggtgtag gggttgtcat gacctctgtg ccgccgctaa cgcattaagt attccgcctg 900
gggagtacgg tcgcaagatt aaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcagcgg 960
accatgtggt ttaa 974

Claims (2)

1.一株利用木糖生产丁醇的拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)菌株51543，其特征在于，所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO：M 2017031。
2.权利要求1所述的拜氏梭菌菌株51543在利用木糖生产丁醇的应用。
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