CN101063106A - 产1,3－丙二醇氧化还原酶的工程菌及其酶制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，其采用PCR技术克隆来自克雷伯肺炎杆菌DSM 2026的dhaT基因，构建含dhaT基因的大肠杆菌表达载体pET－dhaT，转化至大肠杆菌DH5α中进行质粒复制，抽提的重组质粒再转化至大肠杆菌BL21(DE3)，获得了能表达1，3－丙二醇氧化还原酶(PDOR)的重组基因工程菌株E.coli－pET－dhaT，经验证，该重组菌在无抗生素选择压力下，仍能稳定的大量生产PDOR；采用乳糖代替IPTG作为诱导剂，在合适的培养条件，获得的PDOR比活达25.5U/mg。
Description
发明技术领域
本发明涉及一种产1，3-丙二醇氧化还原酶的基因工程菌及其1，3-丙二醇氧化还原酶制备方法，也即一种产PDOR的基因工程菌及其PDOR制备方法。属于基因工程和酶工程技术领域。
背景技术
1，3-丙二醇(1，3-propanediol，下称1，3-PD)是一种重要的环保型化工原料，主要是作为聚酯、聚醚和聚亚氨酯的单体，在地毯、工程塑料、服装面料等领域用途广泛，在国际市场上供不应求。1，3-PD的合成有化学法和生物法两种。目前，生物法生产1，3-PD虽还处于实验室研究或中试阶段，但从环境保护及长远发展来看，生物法更具有生命力。1999年Biebl等人在德国《应用微生物和生物工艺学》(52卷289-297页)中总结，已发现几种能以甘油为底物发酵生产1，3-PD的菌种，主要有肠道细菌中的克雷伯肺炎杆菌属(Klebsiella pneumoniae)、产气克雷伯菌属(Klebsiella aerogenes)、肠细菌属(Enterobacter agglomerans)、弗氏柠檬菌(Citrobacterfreundii)以及乳杆菌属的短乳杆菌(Lactobacilli brevis)和布氏乳杆菌(Lactobacilli buchneri)、梭菌属的丁酸梭状芽孢杆菌(Clostridia butyricum)和巴氏梭状芽孢杆菌(Clostridia pasteuianum)等。Deckwer于1995年在欧洲《FEMS微生物综述》(16卷143-9页)中提出，K.pneumoniae、C.butyricum和C.freundii具有较高的1，3-PD转化率及生产能力，是研究得比较多的三种菌。C.butyricum具有良好的1，3-PD耐受力，但是该菌属于严格厌氧菌，培养条件苛刻。K.pneumoniae属兼性厌氧菌，属于病原菌，但实验所用菌株较为温和，在实验室范围内未见有其致病的报道，因此是比较适宜的1，3-PD生产菌。
1998年Ahrens在美国《生物工程与工艺》(59卷第5期544-552页)上发表，甘油转化为1，3-PD的厌氧代谢途径中，甘油沿着氧化和还原两条平行路径代谢。在氧化途径中，甘油在依赖于NAD+的甘油脱氢酶(glycerol dehydrogenase，下称GDH，EC 1.1.1.6)的作用下形成二羟基丙酮(dihydroxyacetone，下称DHA)，再在二羟基丙酮激酶(dihydroxyacetone kinase，下称DHAK，EC 2.7.1.29)的作用下，生成二羟基丙酮磷酸(digydroxyacetonephosphate，下称DHAP)，然后进入糖酵解途径，这一代谢过程是以甘油为底物生长的微生物的共同代谢途径，为微生物生长提供ATP和NADH。在还原途径中，甘油在以维生素B12为辅酶的甘油脱水酶(glyceroldehydratase，下称GDHt，EC 4.2.1.30)的作用下生成3-羟基丙醛(3-hydroxypropionaldehyde，下称3-HPA)，然后在依赖于NADH的1，3-丙二醇氧化还原酶(1，3-propanedioloxidoreductase，下称PDOR，EC 1.1.1.202)的作用下形成1，3-PD。还原途径所需的NADH由氧化途径提供，整个过程伴随着辅酶I的再生。在甘油转化成1，3-PD的过程中，GDH、GDHt和PDOR是关键酶，它们的活力与1，3-PD的产率密切相关。
GDH、GDHt和PDOR是由dha操纵子上的不同基因编码的，已有人利用基因工程技术对菌种进行改造，Tong(1991年美国《应用环境微生物》57卷3541-46页)将来自于Klebsiellapneumoniae的dha操纵子在大肠杆菌中表达生产1，3-PD，Rolf在1995年美国《细菌学》(177卷2151-6页)中发表，将Citrobacter freundii上的1，3-丙二醇脱氢酶基因在大肠杆菌中表达，但从成本和生产能力上看都达不到工业生产的要求。另外，杜邦公司申请了用单一微生物由葡萄糖发酵制备1，3-PD的专利(《一种高浓度生产1，3-丙二醇的生物法》2001年美国专利，WO.01/12833 A2)。
发明内容
本发明的目的是提供采用基因重组的方法构建能高产PDOR的工程菌，其生产成本低、生产能力高、能达到工业生产的要求；并提供其较低成本的发酵生产PDOR的方法。
本发明以如下方式实现：
1、菌种和质粒
克雷伯肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae DSM 2026)，E.coli BL21(DE3)，pMD18-T，质粒pET-15b，上述材料在尊重保护知识产权的情况下均方便获得或购得。
2、构建生产PDOR的重组工程菌
用常用的煮沸法从Klebsiella pneumoniae DSM 2026菌株上提取总DNA，以5’-GGCC
CATATGAGCTATCGTATGTTTGATTATC-3’为前引，5’-ACTT
GGATCCTCAGAATGCCTGGCGGAAAAT-3’为后引，采用PCR扩增得到目的基因dhaT，1％琼脂糖电泳分离，切胶回收；将目的基因插入pMD18-T。参照美国Sambrook等编写的《分子克隆实验指南》第三版，得到的重组质粒pMD-dhaT，将重组质粒pMD-dhaT和pET-15b分别用Nde I和BamH I酶切，按照T4DNA Ligation(Biolab)的说明书设计连接体系，并进行粘端连接，连接产物转化至用CaCl2法制备的感受态E.coli BL21(DE3)；具体过程见图1。用100μg/mL氨苄青霉素(ampicillin，下称Amp)的LB平板培养，37℃过夜，挑取8-10个菌落，用含75μg/mlAmp的LB培养基进行增菌培养12h，培养条件37℃、250rpm；用质粒抽提试剂盒(Omega)提取质粒，用Nde I和BamH I进行双酶切鉴定，选择一个含阳性重组质粒pET-dhaT的菌株寄往北京奥科生物技术有限责任公司测序，测序结果与本实验室提交的序列GenBankAY340973中的开放阅读框一致，证明dhaT序列正确，即获得重组大肠杆菌BL21(DE3)-pET-dhaT，也即为本发明所提供一种产1，3-丙二醇氧化还原酶的基因工程菌。
3、原核细胞的诱导、表达
将过夜培养的含有阳性重组子pET-dhaT的BL21(DE3)菌液接种于含75μg/mL Amp的5mL LB液体培养基内培养，接种量为1-5％，在30℃、180rpm下培养2h；加入诱导剂至终浓度；若以IPTG作诱导剂时至终浓度为0.05mM，若以乳糖作诱导剂时至终浓度为5mM，进行诱导。继续培养于25℃，200rpm，5h。
同样的条件下，用250mL的摇瓶装50mL LB培养基扩大培养。
为了考察Amp对PDOR生产的影响，在培养基中不添加抗生素Amp，用50mL培养管在上述条件下诱导表达，并与添加Amp时作比较。
4、无细胞抽提液的制备
发酵液于6000rpm，1℃下离心10min，收集菌体，加入发酵液体积1/20～1/50量的结合缓冲液(20mM Na3PO3，0.5M NaCl，pH 8.0)悬浮，BL21(DE3)-pET-dhaT按加入的结合缓冲液的1/10体积加入10mg/mL溶菌酶，冰浴30min，4℃振摇10min；BL21(DE3)plysS-pET-dhaT于-20℃和室温下反复冻融4次。然后，12000r/min、4℃下离心10min，上清液为无细胞抽提液，用于酶活力分析。
5、PDOR检测
PDOR使3-羟基丙醛(3-HPA)加氢生成1，3-PD，由于3-HPA不稳定且没有商品化，PDOR酶活力测定使用逆反应。辅酶I NAD+作为受体得氢被还原为NADH，NADH在340nm的紫外光下有最大吸收。根据吸光度的增加情况，用初速度法测定PDOR的活力。1.5mL反应液含有30mM(NH4)25O4、0.1M 1，3-PD、2mM NAD+、1μM Fe(NH4)2(SO4)2、0.1M K2CO3缓冲溶液(pH9.5)以及测定时加入的适量酶液。45℃下，加入100μL酶液启动反应，用紫外分光光度计在340nm波长下测定吸光度，连续测1min，每隔6s读取数据。按Ahrens等的研究，PDOR的活力定义为：在上述条件下，每分钟还原1μmol 1，3-PD的酶量为1个单位，逆反应PDOR的酶活乘以系数3.95转换为正反应的酶活；酶的比活力为每mg蛋白所含酶的单位数(U/mg)。
检测结果：在50mL管中培养的BL21(DE3)-pET-dhaT表达的PDOR比活达到18.6U/mg，在250mL摇瓶培养的比活为24.9U/mg。导致PDOR在摇瓶中比活较高的原因可能是因为生长空间较大，溶氧浓度较高，因此菌体生长较快。用摇瓶培养的PDOR比活约是Rolf用E.coliK38/pGP1-2表达的1，3-丙二醇脱氢酶的4.3倍，约是Tong用E.coli AG1表达的PDOR的41倍，约是Chen(英国《生化工程》2005年25卷47-53页)测得的克雷伯肺炎杆菌中的PDOR的1.33倍。
重组大肠杆菌以IPTG和乳糖分别作为诱导剂，在添加抗生素和不加抗生素Amp的LB培养基中发酵培养，发酵液经处理得到无细胞抽提液，测定PDOR的比活力，结果见表1。
表1重组菌pET-dhaT/BL21(DE3)在不同培养条件下表达PDOR的比活
| 诱导剂+抗生素 | 50mL试管 | 250mL摇瓶 | 备注 |
| IPTG+AmpIPTGLactose+AmpLactose | 18.618.018.320.4 | 24.925.124.625.5 | IPTG：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷Lactose：乳糖Amp：氨苄青霉素 |
从表1可看出，抗生素对PDOR比活力几乎没有影响，说明重组质粒pET-dhaT在没有抗生素选择压力下基本保持稳定。用乳糖作诱导剂不仅可以代替昂贵的IPTG，并且在没有抗生素条件下，PDOR比活力反而提高3.5～11.5％。乳糖还可以作为培养基中的碳源。
采用本发明所构建的能在胞内大量表达PDOR的基因工程菌BL21(DE3)-pET-dhaT，能在没有抗生素压力下，运用廉价的乳糖代替IPTG作为诱导剂，而且能够获得比应用已知微生物更好的效果，以比较低的成本生产PDOR，适合大规模的发酵生产。
具体实施例
实施例1
将于-70℃下保存的含10-25％甘油的1，3-丙二醇氧化还原酶的基因工程菌BL21(DE3)-pET-dhaT取出，少量菌液接种含Amp的LB的培养基，25-39℃摇床活化6-12h。
再将活化的菌液接种于(1-5％的接种量)含0-150μg/mL Amp的LB培养基中，25-39℃发酵罐培养0.5-2h，加入诱导剂至终浓度，若以IPTG作诱导剂时为0.05-1mM，以乳糖为2-200mM，进行诱导；继续于15-28℃下发酵培养3-12h。
发酵液于6000rpm，1℃下离心10min，收集菌体，加入发酵液体积1/20-1/50量的结合缓冲液(20mM Na3PO3，0.5M NaCl，pH 7.5-8.5)或Tris缓冲液(pH7.3-8.5)悬浮，以加入的结合缓冲液的1/10体积的量加入10mg/mL溶菌酶，冰浴30min，4℃振摇10min；然后在12000r/min、4℃下离心10min，上清液即为PDOR的无细胞抽提液。
也可用超声波破壁。
Claims (2)
1、一种产PDOR的基因工程菌，其特征是：
A、材料
克雷伯肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae DSM 2026)，E.coli BL21(DE3)，pMD18-T，质粒pET-15b，上述材料在尊重保护知识产权的情况下均方便获得或购得；
B、生产PDOR工程菌的构建
用煮沸法从Klebsiella pneumoniae DSM 2026菌株上提取总DNA；
以5’-GGCC
CATATGAGCTATCGTATGTTTGATTATC-3’为前引；
5’-ACTT
GGATCCTCAGAATGCCTGGCGGAAAAT-3’为后引；
采用PCR扩增得到目的基因dhaT，1％琼脂糖电泳分离，切胶回收；
参照美国Sambrook等编写的《分子克隆实验指南》第三版的基因插入方法，将目的基因dhaT插入pMD18-T，得到重组质粒pMD-dhaT，再将pMD-dhaT和pET-15b分别用Nde I和BamH I酶切，按照T4 DNA Ligation(Biolab)的说明书设计连接体系，并进行粘端连接，连接产物转化至用CaCl2法制备的感受态BL21(DE3)；
用100μg/mL氨苄青霉素(ampicillin，Amp)的LB平板培养，37℃过夜，挑取8-10个菌落，用含75μg/ml Amp的LB培养基进行增菌培养3-12h(37℃，250rpm)，用质粒抽提试剂盒(Omega)提取质粒，用Nde I和BamH I进行双酶切鉴定，选择一个含阳性重组质粒pET-dhaT的菌株，即为重组大肠杆菌BL21(DE3)-pET-dhaT，也即一种产1，3-丙二醇氧化还原酶的基因工程菌。
2、应用本发明构建的产PDOR的基因工程菌发酵培养制备PDOR的方法，其特征是：
将活化的重组大肠杆菌BL21(DE3)-pET-dhaT菌液接种于(1-5％的接种量)含0-150μg/mLAmp的LB培养基中，25-39℃培养0.5-2h，加入诱导剂至终浓度，若以IPTG作诱导剂时为0.05-1mM，以乳糖为2-200mM，进行诱导；继续于15-28℃发酵培养3-12h；发酵液于6000rpm，1℃下离心10min，收集菌体，加入发酵液体积1/20-1/50量的结合缓冲液(20mM Na3PO3，0.5MNaCl，pH 7.5-8.5)或Tris缓冲液(pH7.3-8.5)悬浮，用溶菌酶、超声波等生物或物理方法进行细胞破壁，经离心，上清液即为PDOR的无细胞抽提液；再经进一步分离、提取等纯化操作得PDOR。
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| CN103789248A (zh) * | 2014-02-14 | 2014-05-14 | 江苏大学 | 一种1,3-丙二醇基因工程菌及转化生产1,3-丙二醇的方法 |
| CN108893497A (zh) * | 2018-07-18 | 2018-11-27 | 大连理工大学 | 一种改变通气条件调控产物的多细胞体系及发酵方法 |
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2007
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