CN101914465A - 用于制备l-乳酸的凝结芽孢杆菌及其应用方法 - Google Patents

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Abstract

一种乳酸制备技术领域的用于制备L-乳酸的凝结芽孢杆菌及其应用方法，以五碳糖或六碳糖为原料，或以含有五碳糖和六碳糖或其组合的农业和工业废弃物为原料，进行发酵后得到L-乳酸。应用本发明方法产量最高可达195g/L，光学纯度大于99％，糖酸转化率最高可达0.98，发酵生产能力2.7g/L/h。本发明提供的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)XZL4(DSM No.23183)和XZL9(DSM No.23184)可以直接利用木糖醇生产副产物中的各种还原糖发酵生产高浓度L-乳酸，在节约成本的同时提高生产效率，适合于工业生产中推广应用。

Description

用于制备L-乳酸的凝结芽孢杆菌及其应用方法
技术领域
本发明涉及的是一种乳酸制备技术领域的菌株及其应用方法，具体是一种利用五碳糖/六碳糖的用于制备高浓度L-乳酸的凝结芽孢杆菌及其应用方法。
背景技术
乳酸(Lactic Acid)是一种重要的，多用途的有机酸，广泛应用于食品、化工、医药等领域，其中最重要、最广泛的工业应用为聚乳酸合成的单体。由乳酸聚合生成的聚乳酸具有良好的生物相容性和生物可降解性，因此被产业界认为是新世纪最有发展前途的新型可再生材料。乳酸分子中存在一个手性中心，具有旋光性，是一种手性分子。根据旋光性的不同，乳酸可分为L-乳酸、D-乳酸和消旋乳酸。由于聚L-乳酸使用规模最为广泛，因此光学纯L-乳酸的生产一直受到普遍关注。
生产乳酸的方法主要有化学合成法、酶催化法和发酵法。与化学法和酶催化法相比，微生物发酵法不仅能以淀粉、纤维素等可再生资源分解所得到的葡萄糖等为原料，通过菌种和培养条件的选择发酵生产乳酸，能获得光学纯的L-乳酸、D-乳酸或是两者一定比例的混合物，而且生产成本低，产品安全性高，目前是大规模生产乳酸的主要方法。乳杆菌(Lactobacillus)、链球菌(Streptococcus)、肠球菌(Enterococcus)、根霉(Rhizopus)等菌具有乳酸生成能力，如中国专利文献号200480036931.1。嗜热的芽孢杆菌是一种新的可用于L-乳酸发酵生产的微生物。由于芽孢杆菌具有营养要求低，具有较高的发酵温度(45～60℃)，可实现开放式发酵，同时大大减少了发酵过程中污染杂菌的机会，提高了L-乳酸的光学纯度，因此近年来关于利用芽孢杆菌生产乳酸的研究逐渐增多。日本专利文献号JP5840093、JP606200、JP327291、美国专利文献号US5079164、中国专利申请号200810098908.5均报道了芽孢杆菌生产乳酸。
经过对现有技术的检索发现，中国专利申请号200710176060.9、200910028930.7、02806664.2都报道了凝结芽孢杆菌发酵葡萄糖生产L-乳酸。但上述技术中所用凝结芽孢杆菌没有显示利用五碳糖如木糖生产高浓度高纯度乳酸。尤其在“一种生产L-乳酸的方法及其专用凝结芽孢杆菌”中使用的微生物为凝结芽孢杆菌，根据该菌株的特性，该菌株不能够利用木糖。
进一步检索发现，美国专利文献号US 2005/0250192A1中记载了能够利用葡萄糖和木糖生产乳酸的多株凝结芽孢杆菌生产L-乳酸等。在分离得到的多株菌中，Bacillus sp.36D1具有最强的利用六碳糖和五碳糖的能力。但该技术所记载的菌株生产乳酸产量较低，如Bacillus sp.36D1利用纯葡萄糖L-乳酸报道产量约25.2g/L左右；利用纯木糖L-乳酸报道产量约23.4g/L 左右；利用甘蔗渣中还原糖(主要为五碳糖-木糖，六碳糖-葡萄糖)为底物发酵生产L-乳酸，报道的L-乳酸最高产量约55.5g/L左右，且发酵时间很长，高达190多小时。
目前，乳酸的工业化生产主要原料是葡萄糖，或者玉米、大米等淀粉含量较高的农作物产品，存在的主要问题是生产成本高。利用富含碳水化合物的有机废弃物发酵生产乳酸，不仅能够降低乳酸的生产成本，而且可以解决废弃物的资源化问题。作为世界范围内提倡的环境保护和减少能源需求的一个环节，当前在国内外都在充分地进行有机废弃物的再利用。然而上述物质中含有五碳糖(如木糖、阿拉伯糖等)和六碳糖(如葡萄糖)，大多数乳酸生产菌株无法利用其中的五碳糖，因此限制其在乳酸生产中的应用。在我国，一部分木糖醇是利用从玉米芯水解液中提取的木糖为原料制得的；在该工艺中，产生了大量的副产物，且木糖醇生产的副产物中含有50％～70％的碳水化合物，如不利用既造成浪费又造成污染。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种用于制备L-乳酸的凝结芽孢杆菌及其应用方法，可以直接利用木糖醇生产副产物中的各种还原糖发酵生产L-乳酸，发酵获得高浓度的L-乳酸，在节约成本的同时提高生产效率，适合于工业生产中推广应用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明涉及一种用于制备L-乳酸的凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)XZL4和XZL9，于2009年12月4日保藏于布达佩斯条约指定的微生物国际保藏单位：德国微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)，地址：布伦瑞克英豪丰大街7B  邮编D-38124(Inhoffenstr.7B，Braunschweig，D-38124)，保藏编号分别为DSM No.23183和DSM No.23184。
所述的凝结芽孢杆菌(B.coagulans)XZL4DSM No.23183为革兰氏阳性菌，其核苷酸序列如Seq.ID No.1所示，细胞直杆，营养细胞的菌体大小为(0.8～0.9)μm×(3.0～5.0)μm。形成内生孢子。在含有木糖、酵母粉和蛋白胨的琼脂平板上形成表面光滑、乳白色、边缘整齐的圆形菌落，由山东某玉米芯加工厂附近的土壤中分离得到。
所述的凝结芽孢杆菌(B.coagulans)XZL9 DSM No.23184为革兰氏阳性菌，其核苷酸序列如Seq.ID No.2所示，细胞直杆，营养细胞的菌体大小为(0.8～0.9)μm×(3.0～5.0)μm。形成内生孢子。在含有木糖、酵母粉和蛋白胨的琼脂平板上形成细小、淡乳白色、边缘整齐的圆形菌落，由山东某玉米芯加工厂附近的土壤中分离得到。
本发明涉及上述用于制备L-乳酸的凝结芽孢杆菌的应用方法，首先对凝结芽孢杆菌进行种子培养获得种子培养液，然后以含有五碳糖或六碳糖或其组合的农业和工废弃物(如糖蜜、糖浆、甘蔗渣等木糖醇生产副产物)作为发酵培养基的碳源进行发酵后得到L-乳酸。
所述的发酵是指采用发酵培养基，按10％体积比的接种量接入种子培养液，在50℃～60℃ 环境下培养48～72小时，温度优选50℃～55℃。
所述的发酵中包含补料流加工艺，该补料流加工艺是指：当发酵液中总还原糖含量低于20～30g/L时补加碳源，使总还原糖含量维持在30～70g/L，或达到50～70g/L。
所述的发酵培养基的组分及其含量为：碳源40～200g/L、氮源5～12g/L和用于调控培养基pH的中和剂50～100g/L，余量为水。
所述的发酵培养基的pH为5.5～6.2。
所述的碳源为五碳或六碳糖或富含五碳糖、六碳糖的原料，为以下三种中的任意一种：
(1)葡萄糖40～150g/L；
(2)木糖40～100g/L；
(3)木糖醇生产副产物100～200g/L。
所述的木糖醇副产物可从商业途径获得，如山东龙力生物科技有限公司、山东福田药业有限公司、山东邢店生物科技有限公司等公司直接购得，但不同公司不同批次的产品总糖含量有所不同，本发明所用的木糖醇生产副产物含有50％～70％的碳水化合物，其中葡萄糖含量为5％～10％(w/v)，木糖含量为40％～50％(w/v)，阿拉伯糖含量为10％～25％(w/v)。
所述的氮源为酵母粉，具体为酵母粉5～12g/L
所述的中和剂为碳酸钙，具体为碳酸钙50～100g/L。
所述的凝结芽孢杆菌的种子培养液是指：将芽孢杆菌(B.coagulans)XZL4 DSM No.23183或XZL9 DSM No.23184依次进行斜面培养和种子培养后获得培养物。
所述的斜面培养是指：将凝结芽孢杆菌(B.coagulans)XZL4DSM No.23183或XZL9 DSMNo.23184菌种接种于含有15g/L琼脂的固体斜面培养基上，45～55℃条件下，培养24～48小时；
所述的种子培养是指：将经过斜面培养的芽孢杆菌在无菌条件下接种到30ml种子培养基中，45～55℃条件下，静止培养10～24小时，加入中和剂控制发酵液pH，制得种子培养液。
所述的种子培养基每升中含有：葡萄糖40～60g，酵母粉5～10g，碳酸钙20～40g，余量为水，优选含有：葡萄糖50g/L，酵母粉10g/L，CaCO3 20g/L，余量为水；该种子培养基的pH为6.5。
本发明主要原料为葡萄糖、木糖和木糖醇生产副产物，可以直接代谢木糖醇副产物中的五碳糖和六碳糖生成L-乳酸，免去了单独进行五碳糖代谢的工艺步骤。通过提供合适的发酵工艺条件，使得该L-乳酸生产工艺不仅原料易得，成本低廉，而且达到较高的产酸能力。
本发明所提供的凝结芽孢杆菌(B.coagulans)XZL4 DSM No.23183和XZL9 DSM No.23184既能利用葡萄糖又能利用木糖作为乳酸生产碳源，且生产L-乳酸的能力强。利用葡萄糖 作碳源L-乳酸产量最高可达173g/L，光学纯度大于99％，糖酸转化率最高可达0.98，发酵生产能力2.4g/L/h；利用木糖作碳源L-乳酸产量最高可达195g/L，光学纯度大于99％，糖酸转化率最高可达0.98，发酵生产能力2.7g/L/h；利用木糖醇生产副产物中还原糖为底物发酵生产L-乳酸，L-乳酸最高产量106g/L，光学纯度大于99％，发酵生产能力2.08g/L/h。本发明所提供的凝结芽孢杆菌经过多次循环发酵后菌株不退化，仍能保持较高的活力。且该菌株可以直接利用葡萄糖、木糖以及木糖醇生产副产物中的各种还原糖发酵生产L-乳酸，发酵获得高浓度的L-乳酸。因此，利用本发明方法生产L-乳酸，能节约成本、提高生产效率，适合于工业生产中推广应用。
附图说明
图1为凝结芽孢杆菌(B.coagulans)XZL4 DSM No.23183和XZL9 DSM No.23184的16SrDNA进化树分析图；
图中：实线的水平距离(长度之和)代表菌株的进化距离，选取的参照菌是与本发明提供的菌株亲缘关系较近的凝结芽孢杆菌菌株，共11株，其中凝结芽孢杆菌(B.coagulans)2-6是中国专利菌株(CN 200710176060.9)，其16S rDNA序列为测序得到(见SEQ ID NO：3)；凝结芽孢杆菌(B.coagulans)36D1是美国专利菌株(Pub.No：US 2005/0250192A1)，其16SrDNA序列根据参考文献“Patel，M.A.；Ou，M.S.；Harbrucker，R.；Aldrich，H.C.；Buszko，M.L.；Ingram，L.O.；Shanmugam，K.T.Isolation and characterization of acid-tolerant，thermophilic bacteria for effective fermentation of biomass-derived sugars to lactic acid.Appl.Environ.Microbiol.2006，72，3228-3235”获得(见SEQ ID NO：4)。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
以下实施例涉及的凝结芽孢杆菌(B.coagulans)XZL4 DSM No.23183和XZL9 DSM No.23184的分离、筛选和鉴定方法如下：
一、菌株的分离、筛选
该实施例中所用的培养基的组成如下：
营养液体培养基：木糖10g/L，酵母粉10g/L，pH为6。
营养琼脂培养基：木糖50g/L，酵母粉10g/L，CaCO3 20g/L，琼脂粉20g/L，pH为6。
菌株筛选培养基：木糖100g/L，酵母粉20g/L，CaCO3 75g/L，pH为6。
该实施例的具体操作过程如下：
采集山东省某玉米芯加工厂附近的土壤，称取2g溶于50ml营养液体培养基中，50℃富集培养6～10小时。然后稀释涂布到含营养琼脂培养基的培养皿中，50℃培养24小时。待长 出单菌落后，挑选菌落面积和产酸透明圈面积大的菌落，接种到发酵培养基中，50℃静止培养48小时，测定L-乳酸的产量，经过多次筛选，挑取两株L-乳酸产量较高的菌株。
将上述菌株多次传代培养，然后再进行10个循环的发酵测试，其第10次循环发酵产生的L-乳酸产量和转化率基本保持原有水平，证明上述菌株即是目的菌株，名称为XZL4和XZL9。
二、菌株的鉴定
上述菌株的形态特征观察和生理生化特性鉴定在德国微生物保藏中心(DSMZ)完成。16SrDNA序列鉴定和比对参照文献“Altschul，S.F.；Gish，W.；Miller，W.；Myers，E.W.；Lipman，D.J.Basic local alignment search tool.J.Mol.Biol.1990，215，403-410”提供的方法。具体结果如下：
本实施例得到两株以木糖为碳源生成L-乳酸的菌株。
所述的两株菌均为革兰氏阳性菌，细胞直杆，营养细胞的菌体大小为(0.8～0.9)μm×(3.0～5.0)μm。形成内生孢子。在含有木糖、酵母粉和蛋白胨的琼脂平板上XZL4形成表面光滑、乳白色、边缘整齐的圆形菌落；XZL9形成细小、淡乳白色、边缘整齐的圆形菌落。具体的生理生化特征如表1和表2所示。
表1XZL4生理生化特性
  检测指标   XZL4   XZL9
  厌氧生长   +   +
  60℃生长   +   +
  65℃生长   -   -
  V.P.   +   +
  pH in V.P.   4.6   4.5
  利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、果糖产酸   +   +
  利用甘露醇产酸   -   -
  葡萄糖发酵产气   -   -
  代谢柠檬酸、丙酸   -   -
  降解酪氨酸   -   -
  苯丙氨酸脱氨酶   -   -
  卵磷脂酶   -   -
  Arginindihydrolase   -   -
  还原硝酸盐   +   -
  形成吲哚   -   -
[0048] 
  明胶液化   -   -
  水解酪蛋白   +   w
  水解淀粉、七叶苷   +   +
  水解Tween 80   -   -
  同型发酵产生L-乳酸   +   +
表中结果“+”表示结果为阳性，“-”表示结果为阴性，“w”表示菌株弱生长，“V.P.”为Vogesproskauer缩写。
通过数据库TSBA40 4.10 Library检索，XZL4的脂肪酸组成与凝结芽孢杆菌(B.coagulans)具有较高的相似性(0.12)。该菌的16S rDNA的核苷酸序列(见SEQ ID NO：1)不同于所有已报导或者提交到公共数据库的菌株16S rDNA，与芽孢杆菌(B.coagulans)的同源性最高(99％)，说明该菌是一个全新的菌株。基于以上特征，结合16S rDNA诊断区分析，将本株L-乳酸生产菌鉴定为凝结芽孢杆菌(B.coagulans)XZL4，并将其保藏于德国微生物保藏中心，保藏号为DSM No.23183。
表2XZL9生理生化特性
  检测指标   XZL4   XZL9
  厌氧生长   +   +
  60℃生长   +   +
  65℃生长   -   -
  V.P.   +   +
  pH in V.P.   4.6   4.5
  利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、果糖产酸   +   +
  利用甘露醇产酸   -   -
  葡萄糖发酵产气   -   -
  代谢柠檬酸、丙酸   -   -
  降解酪氨酸   -   -
  苯丙氨酸脱氨酶   -   -
  卵磷脂酶   -   -
  Arginindihydrolase   -   -
  还原硝酸盐   +   -
  形成吲哚   -   -
  明胶液化   -   -
[0053] 
  水解酪蛋白   +   w
  水解淀粉、七叶苷   +   +
  水解Tween 80   -   -
  同型发酵产生L-乳酸   +   +
表中结果“+”表示结果为阳性，“-”表示结果为阴性，“w”表示菌株弱生长，“V.P.”为Vogesproskauer缩写。
通过数据库TSBA40 4.10 Library检索，XZL9的脂肪酸组成与凝结芽孢杆菌(B.coagulans)具有较高的相似性(0.69)。该菌的16S rDNA的核苷酸序列(见SEQ ID NO：2)不同于所有已报导或者提交到公共数据库的菌株16S rDNA，与芽孢杆菌(B.coagulans)NRIC1526的同源性最高(99％)，说明该菌是一个全新的菌株。基于以上特征，结合16S rDNA诊断区分析，将本株L-乳酸生产菌鉴定为凝结芽孢杆菌(B.coagulans)XZL9，并将其保藏于德国微生物保藏中心，保藏号为DSM No.23184。
进一步比较和分析了凝结芽孢杆菌(B.coagulans)XLZ4和XLZ9以及2-6和36D1的16SrDNA序列和在进化地位上的差异(图1)。从进化地位的角度来说，2-6，XLZ4和XLZ9与标准菌株ATCC7050归为同一分支，但36D1则位于另一分支，这说明36D1与2-6，XLZ4和XLZ9可能是从不同的祖先进化而来。凝结芽孢杆菌(B.coagulans)XLZ9的16S rDNA与36D1在第830，890，1262，1267，1268，1286，1308，1315，1344，1345，1362位存在碱基差异，与2-6在第340，1212，1225，1276，1309，1345，1346位与相对应的位置存在不同(位置以XLZ9为准其余取对应位置)。凝结芽孢杆菌(B.coagulans)XLZ4与36D1在340，830，890，1214，1225，1264，1268，1269，1275，1316，1345，1346位存在不同，与2-6在第3位存在差别(位置以XLZ4为准其余取对应位置)。凝结芽孢杆菌(B.coagulans)XLZ9与XLZ4在第1，340，1212，1224，1274，1374，1375位存在不同(位置以XLZ9为准其余取对应位置)。
上述凝结芽孢杆菌(B.coagulans)XZL4 DSM No.23183和XZL9 DSM No.23184均通过山东某玉米芯加工厂附近的土壤中分离得到。
以下实施例涉及的利用凝结芽孢杆菌(B.coagulans)ZL4 DSM No.23183和XZL9 DSMNo.23184发酵生产L-乳酸方法的步骤如下：
(1)斜面培养：将凝结芽孢杆菌(B.coagulans)XZL4 DSM No.23183和XZL9 DSM No.23184菌种接种于含有15g/L琼脂的固体斜面培养基上，50～60℃条件下，培养24～48小时。
(2)种子培养：将步骤(1)的斜面培养物，在无菌条件下接种到30m1种子培养基中，50～60℃条件下，静止培养10～24小时，加入中和剂控制发酵液pH，制得种子培养液。
(3)发酵培养：以10％体积比的接种量，将种子培养液接种于发酵培养基中，50～60℃ 条件下培养48～72小时。
其中，步骤(1)、(2)、(3)中所述的菌体培养温度优选是50～55℃。
其中，步骤(2)、(3)所述的培养过程中加入的中和剂为碳酸钙，控制pH。
上述发酵培养过程中，每3个小时取发酵液，先加热至80～100℃，再6,000转/分钟离心5分钟，取上清液检测发酵液中L-乳酸浓度、D-乳酸浓度、葡萄糖浓度，木糖浓度，计算糖酸转化率、L-乳酸发酵生产能力和L-乳酸光学纯度。
其中，总还原糖的测定方法为DNS法。其中，葡萄糖的测定方法为，发酵液稀释后离心，采用生物传感分析仪SBA-40C(山东省科学院)测定。生物传感分析仪SBA-80是以固定化酶为传感器的分析仪器，葡萄糖与氧气、水在酶的催化下生成双氧水。反应放出的双氧水与白金-银电极接触，并产生电流信号，该电流信号与葡萄糖浓度成线性比例关系，通过测定电流信号强度可得出葡萄糖浓度。
木糖测定方法为使用木糖测定试剂盒(南京建成科技有限公司)。
L-乳酸和D-乳酸产量(发酵液乳酸含量或者浓度，g/L)的测定方法为，采用Agilent 1100液相色谱仪，配备手性分离柱(日本三菱化学公司，MCI GEL-CRS10W(3μ)4.6ID×50mm，光学异体分离用)。具体操作条件为：0.002mol/L硫酸铜作为流动相，流量0.5ml/min，进样量20μL，紫外检测器，检测波长254nm，操作温度25℃。利用L-乳酸和D-乳酸标准品做出标准曲线，再根据标准曲线计算出发酵液中L-乳酸和D-乳酸的含量。
本发明中，作为标准品的D-乳酸为德国Sigma-Aldrich公司的产品，其货号为L0625-25MG；作为标准品的L-乳酸为德国Sigma-Aldrich公司的产品，其货号为L1750-10G。在如上色谱条件下，D-乳酸保留时间为10.150分钟。
光学纯度(optical purity)是衡量旋光性样品中一个对映体超过另一个对映体的量的量度，它可用对映体过量值(enantiomeric excess，ee)表示。本发明中L-乳酸的光学纯度(ee)按以下公式计算：((L-乳酸产量-D-乳酸产量)÷(L-乳酸产量+D-乳酸产量))×100％。
糖酸转化率定义为(g/g)：(L-乳酸产量(g/L)÷底物消耗量(g/L，葡萄糖或者木糖或者总糖的消耗量(g/L))×100％。
L-乳酸发酵生产能力(g/L/h)为：L-乳酸产量(g/L)÷发酵时间(h)。
下面通过实施例进一步阐述本发明。
实施例1
利用凝结芽孢杆菌(B.coagulans)XZL4 DSM No.23183和XZL9 DSM No.23184在三角瓶中以葡萄糖为碳源分批发酵生产L-乳酸
本实施例中所使用的各培养基的组成如下：
斜面培养基每升中含有：木糖30g，酵母粉10g，CaCO3 10g，琼脂粉15g，余量为水。所述斜面培养基的pH为6.5。115℃灭菌20分钟。
种子培养基每升中含有：葡萄糖50g，酵母粉10g，CaCO3 20g，余量为水。所述种子培养基的pH为6.5。115℃灭菌20分钟。
发酵培养基每升中含有：葡萄糖55～150g，酵母粉10g，CaCO3 60g，余量为水；所述发酵培养基的pH为5.5～7。115℃条件下灭菌20分钟。
本实施例所述发酵生产L-乳酸的方法包括以下步骤：
(1)斜面培养：将凝结芽孢杆菌(B.coagulans)XZL4 DSM No.23183和XZL9 DSM No.23184分别接种于斜面培养基上，50℃培养24小时；
(2)种子培养：将步骤(1)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于装有30ml种子培养基的100ml三角瓶中，50℃静止培养20小时，制得种子培养液；
(3)发酵培养：将10ml步骤(2)制得的种子培养液接入装有90ml发酵培养基的300ml三角瓶中，50℃静止培养，当葡萄糖和L-乳酸含量保持稳定时，结束发酵。
发酵结束后，根据上述具体实施方式中所述的检测和计算方法，检测发酵液中L-乳酸浓度和葡萄糖浓度，计算L-乳酸生产速率。
该实验共设3次重复，结果见表3。
表3以葡萄糖为碳源L-乳酸的生成情况
Figure GDA0000021541250000091
实施例2
利用凝结芽孢杆菌(B.coagulans)XZL4 DSM No.23183和XZL9 DSM No.23184在三角瓶中以木糖为碳源分批发酵生产L-乳酸：
本实施例中所使用的各培养基的组成如下：
斜面培养基和种子培养基同实施例1。
发酵培养基每升中含有：木糖55～100g，酵母粉10g，CaCO3 60g，余量为水；所述发酵培养基的pH为5.5～7。115℃条件下灭菌20分钟。
该发酵生产L-乳酸的方法包括以下步骤：
(1)斜面培养：同实施例1；
(2)种子培养：同实施例1；
(3)发酵培养：同实施例1。
当木糖和L-乳酸含量保持稳定时，发酵结束，根据上述具体实施方式中所述的检测和计算方法，检测发酵液中L-乳酸浓度和木糖浓度，计算L-乳酸生产速率。该实验共设3次重复，结果见表4。
表4以木糖为碳源L-乳酸的生成情况
Figure GDA0000021541250000101
实施例3
利用凝结芽孢杆菌(B.coagulans)XZL4 DSM No.23183和XZL9 DSM No.23184在三角瓶中以木糖醇生产副产物为碳源分批发酵生产L-乳酸：
斜面培养基和种子培养基同实施例1。
发酵培养基每升中含有：木糖醇生产副产物75～150g，酵母粉10g，CaCO3 60g，余量为水；所述发酵培养基的pH为5.5～7。115℃条件下灭菌20分钟。
该发酵生产L-乳酸的方法包括以下步骤：
(1)斜面培养：同实施例1；
(2)种子培养：同实施例1；
(3)发酵培养：将10ml步骤(2)制得的种子培养液接入装有90ml发酵培养基的300ml三角瓶中，50℃静止培养48小时，结束发酵。
发酵结束后，根据上述具体实施方式中所述的检测和计算方法，检测发酵液中L-乳酸浓度和总还原糖浓度，计算L-乳酸生产速率。
该实验共设3次重复，结果见表5。
表5以木糖醇生产副产物为碳源L-乳酸的生成情况
Figure GDA0000021541250000102
Figure GDA0000021541250000111
实施例4
利用凝结芽孢杆菌(B.coagulans)XZL4 DSM No.23183和XZL9 DSM No.23184在三角瓶中以木糖醇生产副产物为碳源，55℃分批发酵生产L-乳酸
本实施例中所使用的各培养基的组成如下：
斜面培养基和种子培养基同实施例1。
发酵培养基每升中含有：木糖醇生产副产物150g，酵母粉10g，CaCO3 100g，余量为水；所述发酵培养基的pH为5.5～7。115℃条件下灭菌20分钟。
该发酵生产L-乳酸的方法包括以下步骤：
(1)斜面培养：同实施例1。
(2)种子培养：同实施例1。
(3)发酵培养：将10ml步骤(2)制得的种子培养液接入装有90ml发酵培养基的300ml三角瓶中，55℃静止培养48小时，结束发酵。
发酵结束后，根据上述具体实施方式中所述的检测和计算方法，检测发酵液中L-乳酸浓度和总还原糖浓度，计算L-乳酸生产速率。
该实验共设3次重复。结果表明：XZL4 DSM No.23183生产L-乳酸浓度为57±3g/L，L-乳酸生产速率为1.19g/L/h；XZL9 DSM No.23184生产L-乳酸浓度为53±2g/L，L-乳酸生产速率为1.10g/L/h。
实施例5
利用凝结芽孢杆菌(B.coagulans)XZL4 DSM No.23183和XZL9 DSM No.23184在三角瓶中以木糖醇生产副产物为碳源，60℃分批发酵生产L-乳酸
本实施例中所使用的各培养基的组成如下：
斜面培养基和种子培养基同实施例1。
发酵培养基每升中含有：木糖醇生产副产物200g，酵母粉5g，CaCO3 100g，余量为水；所述发酵培养基的pH为5.5～7。115℃条件下灭菌20分钟。
该发酵生产L-乳酸的方法包括以下步骤：
(1)斜面培养：同实施例1；
(2)种子培养：同实施例1；
(3)发酵培养：将10ml步骤(2)制得的种子培养液接入装有90ml发酵培养基的300ml三角瓶中，60℃静止培养48小时，结束发酵。
发酵结束后，根据上述具体实施方式中所述的检测和计算方法，检测发酵液中L-乳酸浓度和总还原糖浓度，计算L-乳酸生产速率。
该实验共设3次重复。结果表明：XZL4 DSM No.23183生产L-乳酸浓度为48±6g/L，L-乳酸生产速率为1.0g/L/h；XZL9 DSM No.23184生产L-乳酸浓度为44±2g/L，L-乳酸生产速率为0.92g/L/h。
实施例6
利用凝结芽孢杆菌(B.coagulans)XZL4 DSM No.23183和XZL9 DSM No.23184在50升全自动发酵罐中以100g/L葡萄糖为碳源，补料(糖)流加发酵生产L-乳酸
本实施例中所使用的各培养基的组成如下：
斜面培养基和种子培养基同实施例1。
发酵培养基每升中含有：葡萄糖100g，酵母粉12g，CaCO3 100g，余量为水；所述发酵培养基的pH为5.5～7。115℃条件下灭菌20分钟。
该发酵生产L-乳酸的方法包括以下步骤：
(1)斜面培养：同实施例1；
(2)种子培养：将步骤(1)培养的菌株在无菌条件下用接种环接2环于装有30ml种子培养基的100ml三角瓶中，50℃静止培养20小时，制得种子培养液1；将30ml种子培养液1在无菌条件下接入装有300ml种子培养基的500ml三角瓶中，50℃静止培养20小时，制得种子培养液2；继续以相同方式扩大种子培养，得到4升种子培养液3。
(3)发酵培养：将4升步骤(2)制得的种子培养液3在无菌条件下接入装有36升发酵培养基的50升全自动发酵罐(上海保兴BIOTECH)中，50℃静止培养。每3个小时取样一次，测定发酵液中的残糖量和L-乳酸浓度，当葡萄糖浓度降到20～30g/L时，流加葡萄糖，使葡萄糖浓度达到50～70g/L，共计补糖2次。当发酵过程中总糖消耗速率趋于平稳，结束发酵。
发酵结束后，根据上述具体实施方式中所述的检测和计算方法，检测发酵液中L-乳酸浓度和残留葡萄糖浓度，计算L-乳酸生产速率。
该发酵实验共设3次重复。结果表明：XZL4 DSM No.23183生产L-乳酸浓度为173±3g/L，发酵时间为72小时，L-乳酸生产速率为2.40g/L/h，糖酸转化率为0.98，光学纯度为99.2％；XZL9 DSM No.23184生产L-乳酸浓度为171±5g/L，发酵时间为72小时，L-乳酸生产速率为2.38g/L/h，糖酸转化率为0.96，光学纯度为99.3％。
实施例7
利用凝结芽孢杆菌(B.coagulans)XZL4 DSM No.23183和XZL9 DSM No.23184在50升全自动发酵罐中以100g/L的木糖为碳源，补料(糖)流加发酵生产L-乳酸
本实施例中所使用的各培养基的组成如下：
斜面培养基和种子培养基同实施例1。
发酵培养基每升中含有：木糖100g，酵母粉12g，CaCO3 100g，余量为水；所述发酵培养基的pH为5.5～7。115℃条件下灭菌20分钟。
该发酵生产L-乳酸的方法包括以下步骤：
(1)斜面培养：同实施例1；
(2)种子培养：同实施例6；
(3)发酵培养：将4升步骤(2)制得的种子培养液3在无菌条件下接入装有36升发酵培养基的50升全自动发酵罐(上海保兴BIOTECH)中，50℃静止培养。每3个小时取样一次，测定发酵液中的残糖量和L-乳酸浓度，当木糖浓度降到20～30g/L时，流加木糖，使木糖浓度达到50～70g/L，共计补糖2次。当发酵过程中木糖消耗速率趋于平稳，结束发酵。
发酵结束后，根据上述具体实施方式中所述的检测和计算方法，检测发酵液中L-乳酸浓度和残留木糖浓度，计算L-乳酸生产速率。
该实验共设3次重复。结果表明：XZL4 DSM No.23183生产L-乳酸浓度为195±1g/L，L-乳酸生产速率为2.70g/L/h，糖酸转化率为0.98，光学纯度为99.3％；XZL9 DSM No.23184生产L-乳酸浓度为186±4g/L，发酵时间为72小时，L-乳酸生产速率为2.58g/L/h，糖酸转化率为0.97，光学纯度为99.4％。
实施例8
利用凝结芽孢杆菌(B.coagulans)XZL4 DSM No.23183和XZL9 DSM No.23184在50升全自动发酵罐中以100g/L木糖醇生产副产物为碳源，补料(糖)流加发酵生产L-乳酸
本实施例中所使用的各培养基的组成如下：
斜面培养基和种子培养基同实施例1。
发酵培养基每升中含有：木糖醇生产副产物100g，酵母粉12g，CaCO3 100g，氯化钠0.1g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.2g，余量为水；所述发酵培养基的pH为5.5～7。115℃条件下灭菌20分钟。
该发酵生产L-乳酸的方法包括以下步骤：
(1)斜面培养：同实施例1；
(2)种子培养：同实施例6；
(3)发酵培养：将4升步骤(2)制得的种子培养液3在无菌条件下接入装有36升发酵培养基的50升全自动发酵罐(上海保兴BIOTECH)中，50℃静止培养。每3个小时取样一次，测定发酵液中的残糖量和L-乳酸浓度，当总糖浓度降到20～30g/L时，流加木糖醇生产副产物，使底物浓度达到50～70g/L，共计补糖2次。当发酵过程中总糖消耗速率趋于平稳，结束发酵。
发酵结束后，根据上述具体实施方式中所述的检测和计算方法，检测发酵液中L-乳酸浓度和总还原糖浓度，计算L-乳酸生产速率。
该实验共设3次重复，发酵时间为48小时。结果表明：XZL4 DSM No.23183生产L-乳酸浓度为95±2g/L，L-乳酸生产速率为1.98g/L/h，光学纯度为99.1％；XZL9 DSM No.23184生产L-乳酸浓度为92±5g/L，L-乳酸生产速率为1.92g/L/h，光学纯度为99.3％。
实施例9利用凝结芽孢杆菌(B.coagulans)XZL4 DSM No.23183和XZL9 DSM No.23184在50升全自动发酵罐中以200g/L木糖醇生产副产物为碳源，补料(糖)流加发酵生产L-乳酸
本实施例中所使用的各培养基的组成如下：
斜面培养基和种子培养基同实施例1。
发酵培养基每升中含有：木糖醇生产副产物200g，酵母粉12g，CaCO3 100g，氯化钠0.1g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.2g，余量为水；所述发酵培养基的pH为5.5～7。115℃条件下灭菌20分钟。
该发酵生产L-乳酸的方法包括以下步骤：
(1)斜面培养：同实施例1；
(2)种子培养：同实施例6；
(3)发酵培养：同实施例8。
发酵结束后，根据上述具体实施方式中所述的检测和计算方法，检测发酵液中L-乳酸浓度和总还原糖浓度，计算L-乳酸生产速率。
该实验共设3次重复，发酵时间为72小时。结果表明：XZL4 DSM No.23183生产L-乳酸浓度为98±5g/L，L-乳酸生产速率为1.36g/L/h，光学纯度为99.2％；XZL9 DSM No.23184生产L-乳酸浓度为94±5g/L，L-乳酸生产速率为1.31g/L/h，光学纯度为99.1％。
实施例10利用凝结芽孢杆菌(B.coagulans)XZL4 DSM No.23183和XZL9 DSM No.23184在50升全自动发酵罐中以150g/L木糖醇生产副产物为碳源，补料(糖)流加发酵生产L-乳酸
本实施例中所使用的各培养基的组成如下：
斜面培养基和种子培养基同实施例1。
发酵培养基：木糖醇生产副产物150g，酵母粉12g，CaCO3 100g，氯化钠0.1g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.2g，余量为水；所述发酵培养基的pH为5.5～7。115℃条件下灭菌20分钟。
该发酵生产L-乳酸的方法包括以下步骤：
(1)斜面培养：同实施例1；
(2)种子培养：同实施例6；
(3)发酵培养：同实施例8。
发酵结束后，根据上述具体实施方式中所述的检测和计算方法，检测发酵液中L-乳酸浓度和总还原糖浓度，计算L-乳酸生产速率。
该实验共设3次重复，发酵时间为51小时。结果表明：XZL4 DSM No.23183生产L-乳酸浓度为106±3g/L，L-乳酸生产速率为2.08g/L/h，光学纯度为99.1％；XZL9 DSM No.23184生产L-乳酸浓度为100±6g/L，L-乳酸生产速率为1.96g/L/h，光学纯度为99.3％。
序列表
<110>上海交通大学
<120>用于制备L-乳酸的凝结芽孢杆菌及其应用方法
<160>4
<170>PatentIn version    3.3
<210>1
<211>1466
<212>DNA
<213>凝结芽孢杆菌(B.coagulans)XZL4 DSM No.2318316s rDNA序列
<400>1
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gctggcacgt agttagccgt ggctttctgg ccgggtaccg tcaaggcgcc gccctgttcg    1020
aacggcactt gttcttcccc ggcaacagag ttttacgacc cgaaggcctt cttcactcac    1080
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<210>2
<211>1458
<212>DNA
<213>凝结芽孢杆菌(B.coagulans)XZL9 DSM No.2318416s rDNA序列
<400>2
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ccgcccgtca caccacgaga gtttgtaaca cccgaagtcg gtgaggtaac ctttacggag    1440
ccagccgccg aaggtggg                                                  1458
<210>3
<211>1547
<212>DNA
<213>凝结芽孢杆菌(B.coagulans)2-616s rDNA序列
<400>3
aaaggaggtg atccagccgc accttccgat acggctacct tgttacgact tcaccccaat    60
catctgtccc accttcggcg gctggctccg taaaggttac ctcaccgact tcgggtgtta    120
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tcacccgtcc gccgctaacc ttttaaaagc aagcttttaa aaggtccgca cgacttgcat    1500
gtattaggca cgccgccagc gttcgtcctg agccaggatc aaactct                  1547
<210>4
<211>1548
<212>DNA
<213>凝结芽孢杆菌(B.coagulans)36D116s rDNA序列
<400>4
agaaaggagg tgatccagcc gcaccttccg atacggctac cttgttacga cttcacccca    60
atcatctgtc ccaccttcgg cggctggctc cgtaaaggtt acctcaccga cttcgggtgt    120
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ccgaactggg aatggttttc tgggattggc ttaacctcgc ggtctcgcag ccctttgtac    300
catccattgt agcacgtgtg tagcccaggt cataaggggc atgatgattt gacgtcatcc    360
ccaccttcct ccggtttgtc accggcagtc accttagagt gcccaactga atgctggcaa    420
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agcactcatc gtttacggcg tggactacca gggtatctaa tcctgtttgc tccccacgct    780
ttcgcgcctc agcgtcagtt acagaccaga gagccgcctt cgccactggt gttcctccac    840
atctctacgc atttcaccgc tacacgtgga attccactct cctcttctgc actcaagccc    900
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atgtattagg cacgccgcca gcgttcgtcc tgagccagga tcaaactc                 1548

Claims (10)

1.一种用于制备L-乳酸的凝结芽孢杆菌，其特征在于，具体为凝结芽孢杆菌(B.coagulans)XZL4和XZL9，其中：
所述的凝结芽孢杆菌(B.coagulans)XZL4DSM No.23183为革兰氏阳性菌，其16S rRNA基因的核苷酸序列如Seq.ID No.1所示；
所述的凝结芽孢杆菌(B.coagulans)XZL9DSM No.23184为革兰氏阳性菌，其16S rRNA基因的核苷酸序列如Seq.ID No.2所示。
2.一种根据权利要求1所述的用于制备L-乳酸的凝结芽孢杆菌的应用方法，其特征在于，以含有五碳糖或六碳糖或其组合的农业和工业产品和废弃物作为发酵培养基的碳源，进行发酵后得到L-乳酸。
3.根据权利要求2所述的用于制备L-乳酸的凝结芽孢杆菌的应用方法，其特征是，所述的发酵是指采用发酵培养基按10％体积比的接种量在50℃～60℃环境下培养48～72小时。
4.根据权利要求2或3所述的用于制备L-乳酸的凝结芽孢杆菌的应用方法，其特征是，所述的发酵中包含补料流加工艺，该补料流加工艺是指：当发酵液中总还原糖含量低于20～30g/L时补加碳源，使总还原糖含量维持在30～70g/L，或达到50～70g/L。
5.根据权利要求2所述的用于制备L-乳酸的凝结芽孢杆菌的应用方法，其特征是，所述的发酵培养基的组分及其含量为：碳源40～200g/L、氮源5～12g/L和用于调控培养基pH的中和剂50～100g/L，余量为水。
6.根据权利要求2所述的用于制备L-乳酸的凝结芽孢杆菌的应用方法，其特征是，所述的碳源为以五碳糖或六碳糖或其组合为有效组分的葡萄糖、木糖或农业和工业废弃物，其中：葡萄糖浓度为40～150g/L，木糖浓度为40～100g/L，木糖醇生产副产物浓度为100～200g/L。
7.根据权利要求2所述的用于制备L-乳酸的凝结芽孢杆菌的应用方法，其特征是，所述的芽孢杆菌的种子培养液是指：将芽孢杆菌(B.coagulans)XZL4DSM No.23183和XZL9DSM No.23184依次进行斜面培养和种子培养后获得的培养物。
8.根据权利要求7所述的用于制备L-乳酸的凝结芽孢杆菌的应用方法，其特征是，所述的斜面培养是指：将凝结芽孢杆菌(B.coagulans)XZL4DSM No.23183和XZL9DSM No.23184菌种接种于含有15g/L琼脂的固体斜面培养基上，50～60℃条件下，培养24～48小时。
9.根据权利要求7所述的用于制备L-乳酸的凝结芽孢杆菌的应用方法，其特征是，所述的种子培养是指：将经过斜面培养的芽孢杆菌在无菌条件下接种到30ml种子培养基中，50～60℃条件下，静止培养10～24小时，加入中和剂控制发酵液pH，制得种子培养液。
10.根据权利要求9所述的用于制备L-乳酸的凝结芽孢杆菌的应用方法，其特征是，所述的种子培养基每升中含有：葡萄糖40～60g，酵母粉5～10g，CaCO3 20～40g，余量为水；该种子培养基的pH为6.5。
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