CN111826314A - L-乳酸的生产菌株凝结芽孢杆菌h-2及l-乳酸的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种L‑乳酸的生产菌株凝结芽孢杆菌H‑2及L‑乳酸的生产方法，在L‑乳酸的生产方法中，首先通过对发酵时的四种条件pH值、温度、初始葡萄糖浓度和接种量进行优化，得到发酵的最优条件；其次，在最优条件下，采用长期重复补料分批(LtRFb)策略进行L‑乳酸生产，最后应用两个方程对LtRFb进行发酵动力学模拟分析；本发明采用了LtRFb策略，在重复批次内始终保持菌株的良好活性，产率、产量、转化率始终维持稳定且优良，有利于节省生产时间和成本，具有很好的工业生产应用价值；本发明进行了对L‑乳酸的LtRFb策略发酵动力学的分析，与模型拟合程度较好，有助于进一步指导并调整改进工艺，具有潜在指导意义。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种L-乳酸的生产菌株凝结芽孢杆菌H-2及其在长期重复分批补料(LtRFb)策略下生产L-乳酸的方法。
背景技术
近年来，传统塑料制品造成的环境污染问题日益严重。而开发生物可降解的绿色材料来代替石油塑料是解决塑料污染的关键措施。聚乳酸(PLA)材料是一种环境友好的绿色材料，由于其生物降解性和生物相容性而受到全球瞩目，具有很高的可以取代传统塑料的潜力。PLA的很多特性包括结晶度、热稳定性以及抗水解性等都取决于L-乳酸和D-乳酸的相对比例。因此，这些前体的有效生产对于PLA的生产是非常重要的。
相比于传统的化学生产法，乳酸的生物发酵法具有许多优势，不会产生外消旋物，也不会对环境造成污染。而对于L-乳酸的生物发酵生产，首先，选择生产菌株是最为基本和关键的，一个优良的生产菌株可以保证高效的产品合成以及可行的工艺改进。已报道的能用于L-乳酸生产的菌株非常多，其中利用凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans产L-乳酸有很大优势，其具有耐高温、耐贫瘠、产物转化率高且光学纯度高等优点。该菌株最适的生长温度是50-55℃，因此可以用于高温发酵，而高温发酵则比普通的中温发酵具备许多在工业改良等方面的优点，比如减少发酵设备冷却的费用，降低染菌风险，可以开放体系从而简化操作等。
对于工业产品，高效低成本的生产是始终追求的普遍目标，这就有赖于对发酵工艺的改良优化。传统的分批发酵模式有很多限制性，由于底物浓度限制会导致无法充分发挥菌株的潜力，从而影响总体产量，经济效益低下。而基于分批补料发酵的改良发酵策略，可以降低底物的初始浓度，在发酵的过程中持续添加底物。这样就能有效地缓解底物的抑制作用，从而提升产量。重复分批发酵也是一种非常有效的策略，在这种发酵模式下，可以减少种子的准备时间、降低底物残余、提升菌株细胞活力等，从而有效地提升工业发酵生产的效率。
发明内容
针对现有技术中的不足，为了进一步优化L-乳酸的生产条件和发酵工艺，本发明引入了一种两类发酵模式相结合的长期重复分批补料(LtRFb)策略，即利用凝结芽孢杆菌H-2以长期重复分批补料(LtRFb)策略进行L-乳酸生产，在发酵期间不间断地提供新鲜且高活性地种子液，让设备充分利用，减少生产设备的空置时间和种子的准备时间，从而有效地缩减生产成本。同时，本发明还对利用LtRFb策略的L-乳酸发酵动力学进行模拟和分析，这对于其他产物的类似发酵工艺具有指导意义和工业应用价值。
为达到上述目的，本发明的解决方案是：
一种L-乳酸的生产菌株凝结芽孢杆菌H-2，该生产菌株凝结芽孢杆菌H-2(Bacillus coagulans H-2)于2020年5月29日保藏在中国典型培养物保藏中心(湖北省武汉市珞珈山武汉大学，中国)，保藏编号为CCTCC NO:M2020155。
该生产菌株凝结芽孢杆菌H-2的细胞成杆状，可运动，能产芽孢；菌株菌落呈黄褐色，圆形，边缘无齿状，表面光滑，易被挑起；菌株为革兰氏阳性菌，兼性厌氧。菌株具备高效高产高转化率生产L-乳酸的能力。
一种L-乳酸的生产菌株凝结芽孢杆菌H-2在生产L-乳酸中的应用。
具体地，首先对发酵条件进行优化探索，筛选出能够最大化生产效率的优势条件；之后采用LtRFb策略，一段较长的时间内持续高效的生产L-乳酸；最后应用两个方程对LtRFb策略进行发酵动力学模拟。
一种生产L-乳酸的方法，其包括如下步骤：
具体地，一种凝结芽孢杆菌H-2在长期重复分批补料(LtRFb)策略下生产L-乳酸的方法为：
(1)、斜面培养：将凝结芽孢杆菌H-2接种至种子固体培养基中的斜面培养基内，在50℃下培养24-36h；
(2)、种子培养：在无菌环境中，将步骤(1)中斜面上清晰可见的较大单菌落挑至种子液体培养基内，用封口膜和塑料薄膜封住瓶口，在50℃条件下静置培养24-36h，获得种子液；
(3)、发酵罐培养：将步骤(2)的种子液转接到发酵罐培养基中，按照pH、温度、初始葡萄糖浓度和接种量的顺序依次进行优化，搅拌转速为80rpm，培养30-48h，期间其他条件控制不变，最终获得优化后的发酵条件；
(4)、长期重复分批补料(LtRFb)发酵：重复步骤(1)、步骤(2)获得的种子液接种到发酵罐培养基中，在步骤(3)优化后的发酵条件下，进行长期重复分批补料发酵，其中每个批次培养至24h的发酵液作为下一批次的种子，直至单批次发酵周期超过48h，并且在整个发酵过程中及时补加葡萄糖，防止葡萄糖消耗影响菌株活性；
步骤(1)中的凝结芽孢杆菌H-2为上述保藏编号为CCTCC NO:M2020155的凝结芽孢杆菌H-2。
进一步地，步骤(1)中，种子固体培养基的配方为：100g/L葡萄糖、1g/L酵母粉、5g/L蛋白胨和50g/L CaCO3，添加2％琼脂粉。
进一步地，步骤(2)中，种子液体培养基的配方为：100g/L葡萄糖、1g/L酵母粉、5g/L蛋白胨和50g/L CaCO3。
进一步地，步骤(3)中，优化后的发酵条件为：pH值为6.2-7.5，温度为50-57℃，初始葡萄糖浓度为140-220g/L，接种量为10-30％；发酵期间定期取样，使用SBA-40D生物传感分析仪检测残余葡萄糖浓度，使用紫外可见分光光度计检测菌体600nm处的光密度值，使用HPLC检测L-乳酸浓度。
进一步地，步骤(4)中，发酵期间，每批次定期取样，使用SBA-40D生物传感分析仪检测残余葡萄糖浓度，使用紫外可见分光光度计检测菌体600nm处的光密度值，使用HPLC检测L-乳酸浓度。
其中，SBA-40D生物传感分析仪样品处理具体方式为：将样品加蒸馏水稀释100倍。
紫外可见分光光度计样品处理具体方式为：将样品用同等体积的6mol/L HCl酸解杂质后，用蒸馏水稀释至光密度在0.2-1.0之间。
HPLC样品处理的具体方法为：将样品置于沸水浴中处理10min，取2mL样品加入2mL、2mol/L的H2SO4酸解10min，使乳酸钙转化为乳酸，加蒸馏水使L-乳酸浓度稀释至1-5g/L，6000-10000rpm离心10min，取上清液，用0.22μm的水相滤膜过滤于液相小瓶中。
HPLC检测条件为：液相色谱柱为Bio-Rad Aminex HPX-87H，流动相为5mmol/L的H2SO4，流速为0.5mL/min，柱温为55℃，进样量为10μL，使用二极管阵列检测器(DAD)检测。
进一步地，步骤(3)和步骤(4)中，发酵罐培养基的配方为：140-220g/L葡萄糖、1g/L酵母粉、0.37g/L ZnSO4·7H2O、0.57g/L KH2PO4、0.57g/L K2HPO4、8.33g/L(NH4)2SO4和3g/L(NH4)2HPO4。
一种利用上述的凝结芽孢杆菌H-2(Bacillus coagulans H-2)在长期重复分批补料(LtRFb)策略下生产L-乳酸的发酵动力学分析中的应用，且发酵动力学拟合程度良好，可以用于指导探究产物生产与菌体生长偶联之间的关系，选择菌体生产产品最高的时期开始发酵，从而改良工艺。
由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
第一、本发明利用了凝结芽孢杆菌作为生产菌株，凝结芽孢杆菌H-2具有耐高温、耐贫瘠营养等特点，能在50-55℃条件下，以1g/L酵母粉为氮源营养生长，在30-42h内生产200g/L以上的L-乳酸，且转化率能够高达90％以上，因此LtRFb策略生产的L-乳酸具有产量高、转化率高、成本低、副产物形成少等优势，从而实现L-乳酸的高效转化，节省生产时间，节约能源；另外，本发明采用了长期重复分批补料(LtRFb)策略，在重复批次内始终保持菌株的良好活性，从而具有很好的工业生产应用价值。
第二、本发明在L-乳酸的发酵过程中通过对pH、温度、初始葡萄糖浓度以及接种量四个条件的优化，选定了L-乳酸生产的最佳条件，从而有利于提升L-乳酸的产量和产率，取得更高的经济效益。
第三、本发明进行了对L-乳酸的LtRFb发酵动力学的分析，与模型拟合程度较好，产物生产的主要影响因素从细胞浓度维持逐渐转变至细胞生长，此变化可以指导将调整种子至最佳发酵状态，有助于进一步改进工艺，并且也可以借鉴到其他产物的类似发酵模式中。
附图说明
图1为本发明的实施例1中pH值对葡萄糖消耗的影响示意图。
图2为本发明的实施例1中pH值对细胞生长的影响示意图。
图3为本发明的实施例1中pH值对L-乳酸生产的影响示意图。
图4为本发明的实施例1中pH值对L-乳酸转化率的影响示意图。
图5为本发明的实施例2中温度对葡萄糖消耗的影响示意图。
图6为本发明的实施例2中温度对细胞生长的影响示意图。
图7为本发明的实施例2中温度对L-乳酸生产的影响示意图。
图8为本发明的实施例2中温度对L-乳酸转化率的影响示意图。
图9为本发明的实施例3中初始葡萄糖浓度对葡萄糖消耗的影响示意图。
图10为本发明的实施例3中初始葡萄糖浓度对细胞生长的影响示意图。
图11为本发明的实施例3中初始葡萄糖浓度对L-乳酸生产的影响示意图。
图12为本发明的实施例3中初糖浓度对L-乳酸转化率的影响示意图。
图13为本发明的实施例4中接种量对葡萄糖消耗的影响示意图。
图14为本发明的实施例4中接种量对细胞生长的影响示意图。
图15为本发明的实施例4中接种量对L-乳酸生产的影响示意图。
图16为本发明的实施例4中接种量对L-乳酸转化率的影响示意图。
图17为本发明的实施例5中长期重复分批补料(LtRFb)发酵的OD600曲线示意图。
图18为本发明的实施例5中长期重复分批补料(LtRFb)发酵的L-乳酸生产曲线示意图。
图19为本发明的实施例5中长期重复分批补料(LtRFb)发酵的L-乳酸转化率示意图。
图20为本发明的实施例6中LtRFb发酵第20批次OD600的发酵动力学模型拟合示意图。
图21为本发明的实施例7中LtRFb发酵第20批次L-乳酸生产的发酵动力学模型拟合示意图。
图22为本发明的实施例8中LtRFb发酵中所有批次的发酵动力学参数变化曲线示意图。
凝结芽孢杆菌H-2Bacillus coagulans H-2在2020年5月29日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M2020155。
具体实施方式
本发明提供了一种L-乳酸的生产菌株凝结芽孢杆菌H-2及L-乳酸的生产方法。
本发明的材料与设备：
葡萄糖购自山东阜丰集团有限公司。
酵母粉购自国药集团化学试剂有限公司。
蛋白胨购自国药集团化学试剂有限公司。
CaCO3购自江西德兴市明缘化工材料有限责任公司。
ZnSO4·7H2O购自国药集团化学试剂有限公司。
KH2PO4购自国药集团化学试剂有限公司。
K2HPO4购自国药集团化学试剂有限公司。
(NH4)2SO4购自国药集团化学试剂有限公司。
(NH4)2HPO4购自国药集团化学试剂有限公司。
发酵罐(5L)购自上海百伦生物科技有限公司。
SBA-40D生物传感分析仪购自山东省科学院生物研究所。
以下结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1：
本实施例的L-乳酸生产过程中pH值对L-乳酸分批补料发酵的影响：
(1)、斜面培养：将凝结芽孢杆菌H-2接种至种子固体培养基中的斜面培养基内，在50℃下培养36h；其中，凝结芽孢杆菌H-2保藏于中国典型培养物保藏中心(湖北省武汉市珞珈山武汉大学，中国)，其保藏编号为CCTCC No.M 2020155；种子固体培养基的配方为：100g/L葡萄糖、1g/L酵母粉、5g/L蛋白胨和50g/L CaCO3，添加2％琼脂粉。
(2)、种子培养：在无菌环境中，将步骤(1)中斜面上清晰可见的较大单菌落挑至种子液体培养基内，用封口膜和塑料薄膜封住瓶口，在50℃条件下静置培养36h，获得种子液；其中，种子液体培养基的配方为：100g/L葡萄糖、1g/L酵母粉、5g/L蛋白胨和50g/L CaCO3。
(3)、发酵罐培养：将步骤(2)的种子液按照20％的接种量转接到平行的发酵罐培养基中，控制发酵罐温度为52℃，搅拌转速为80rpm，控制的变量为pH值，分别设定为6.2、6.5、7.0、7.5，使用250g/L Ca(OH)2作为中和剂调节pH值，并在发酵过程中及时补加葡萄糖，以防止糖耗光而造成菌株活性下降；其中，发酵罐培养基的配方为：140g/L葡萄糖、1g/L酵母粉、0.37g/L ZnSO4·7H2O、0.57g/L KH2PO4、0.57g/L K2HPO4、8.33g/L(NH4)2SO4和3g/L(NH4)2HPO4。
(4)、发酵过程中，每8小时取样，使用SBA-40D生物传感分析仪检测残余葡萄糖浓度，使用紫外可见分光光度计检测菌体600nm处的光密度值，使用HPLC检测L-乳酸浓度。
其中，步骤(4)中，SBA-40D生物传感分析仪样品处理具体方式为：将样品加蒸馏水稀释100倍。
步骤(4)中，紫外可见分光光度计样品处理具体方式为：将样品用同等体积的6mol/L HCl酸解杂质后，用蒸馏水稀释至光密度在0.6左右。
步骤(4)中，HPLC样品处理的具体方法为：将样品置于沸水浴中处理10min，取2mL样品加入2mL、2mol/L的H2SO4酸解10min，使乳酸钙转化为乳酸，加蒸馏水使L-乳酸浓度稀释至3g/L左右，6000rpm离心10min，取上清液，用0.22μm的水相滤膜过滤于液相小瓶中。
步骤(4)中，HPLC检测条件为：液相色谱柱为Bio-Rad Aminex HPX-87H，流动相为5mmol/L的H2SO4，流速为0.5mL/min，柱温为55℃，进样量为10μL，使用二极管阵列检测器(DAD)检测。
故发酵48h的葡萄糖消耗情况如图1所示，pH值为7的条件下消耗最快。
发酵48h的OD600变化情况如图2所示，pH值为7的条件下能生长到的最大OD600值最高。
发酵48h的L-乳酸生产情况如图3所示，pH值为7的条件下L-乳酸生产速率最高。
不同pH值对L-乳酸转化率的影响如图4所示，pH值为6.2、6.5、7.0条件下的L-乳酸转化率都较高。
综上，pH值为7是凝结芽孢杆菌H-2生产L-乳酸的最适pH。
实施例2：
本实施例的L-乳酸生产过程中温度对L-乳酸分批补料发酵的影响：
(1)、斜面培养：将凝结芽孢杆菌H-2接种至种子固体培养基中的斜面培养基内，在50℃下培养36h；其中，凝结芽孢杆菌H-2保藏于中国典型培养物保藏中心(湖北省武汉市珞珈山武汉大学，中国)，其保藏编号为CCTCC No.M 2020155；种子固体培养基的配方为：100g/L葡萄糖、1g/L酵母粉、5g/L蛋白胨和50g/L CaCO3，添加2％琼脂粉。
(2)、种子培养：在无菌环境中，将步骤(1)中斜面上清晰可见的较大单菌落挑至种子液体培养基内，用封口膜和塑料薄膜封住瓶口，在50℃条件下静置培养36h，获得种子液；其中，种子液体培养基的配方为：100g/L葡萄糖、1g/L酵母粉、5g/L蛋白胨和50g/L CaCO3。
(3)、发酵罐培养：将步骤(2)的种子液按照20％的接种量转接到平行的发酵罐培养基中，控制发酵罐的pH值为7.0，使用250g/L Ca(OH)2作为中和剂,搅拌转速为80rpm，控制的变量为温度，分别设定为50℃、52℃、55℃、57℃，并在发酵过程中及时补加葡萄糖，以防止糖耗光而造成菌株活性下降；其中，发酵罐培养基的配方为：140g/L葡萄糖、1g/L酵母粉、0.37g/L ZnSO4·7H2O、0.57g/L KH2PO4、0.57g/L K2HPO4、8.33g/L(NH4)2SO4和3g/L(NH4)2HPO4。
(4)、发酵过程中，每8小时取样，使用SBA-40D生物传感分析仪检测残余葡萄糖浓度，使用紫外可见分光光度计检测菌体600nm处的光密度值，使用HPLC检测L-乳酸浓度。
其中，步骤(4)中，SBA-40D生物传感分析仪样品处理具体方式为：将样品加蒸馏水稀释100倍。
步骤(4)中，紫外可见分光光度计样品处理具体方式为：将样品用同等体积的6mol/L HCl酸解杂质后，用蒸馏水稀释至光密度在0.6左右。
步骤(4)中，HPLC样品处理的具体方法为：将样品置于沸水浴中处理10min，取2mL样品加入2mL、2mol/L的H2SO4酸解10min，使乳酸钙转化为乳酸，加蒸馏水使L-乳酸浓度稀释至3g/L左右，6000rpm离心10min，取上清液，用0.22μm的水相滤膜过滤于液相小瓶中。
步骤(4)中，HPLC检测条件为：液相色谱柱为Bio-Rad Aminex HPX-87H，流动相为5mmol/L的H2SO4，流速为0.5mL/min，柱温为55℃，进样量为10μL，使用二极管阵列检测器(DAD)检测。
故发酵48h的葡萄糖消耗情况如图5所示，52℃条件下消耗最快。
发酵48h的OD600变化情况如图6所示，50℃和52℃条件下的最大OD600值都较高。
发酵48h的L-乳酸生产情况如图7所示，52℃条件下L-乳酸生产速率最高。
不同pH值对L-乳酸转化率的影响如图8所示，50℃、52℃、55℃条件下的L-乳酸转化率都较高。
综上，52℃是凝结芽孢杆菌H-2生产L-乳酸的最适温度。
实施例3：
本实施例的L-乳酸生产过程中初始葡萄糖浓度对L-乳酸分批补料发酵的影响：
(1)、斜面培养：将凝结芽孢杆菌H-2接种至种子固体培养基中的斜面培养基内，在50℃下培养36h；其中，凝结芽孢杆菌H-2保藏于中国典型培养物保藏中心(湖北省武汉市珞珈山武汉大学，中国)，其保藏编号为CCTCC No.M 2020155；种子固体培养基的配方为：100g/L葡萄糖、1g/L酵母粉、5g/L蛋白胨和50g/L CaCO3，添加2％琼脂粉。
(2)、种子培养：在无菌环境中，将步骤(1)中斜面上清晰可见的较大单菌落挑至种子液体培养基内，用封口膜和塑料薄膜封住瓶口，在50℃条件下静置培养36h，获得种子液；其中，种子液体培养基的配方为：100g/L葡萄糖、1g/L酵母粉、5g/L蛋白胨和50g/L CaCO3。
(3)、发酵罐培养：将步骤(2)的种子液按照20％的接种量转接到平行的发酵罐培养基中，控制发酵罐温度为52℃，pH值为7.0，使用250g/L Ca(OH)2作为中和剂，搅拌转速为80rpm，控制的变量为发酵培养基中的初始葡萄糖浓度，设定为140g/L、160g/L、180g/L、200g/L、220g/L，并在发酵过程中及时补加葡萄糖，以防止糖耗光而造成菌株活性下降；其中，发酵罐培养基的配方为：140g/L葡萄糖、1g/L酵母粉、0.37g/L ZnSO4·7H2O、0.57g/LKH2PO4、0.57g/L K2HPO4、8.33g/L(NH4)2SO4和3g/L(NH4)2HPO4。
(4)、发酵过程中，每8小时取样，使用SBA-40D生物传感分析仪检测残余葡萄糖浓度，使用紫外可见分光光度计检测菌体600nm处的光密度值，使用HPLC检测L-乳酸浓度。
其中，步骤(4)中，SBA-40D生物传感分析仪样品处理具体方式为：将样品加蒸馏水稀释100倍。
步骤(4)中，紫外可见分光光度计样品处理具体方式为：将样品用同等体积的6mol/L HCl酸解杂质后，用蒸馏水稀释至光密度在0.6左右。
步骤(4)中，HPLC样品处理的具体方法为：将样品置于沸水浴中处理10min，取2mL样品加入2mL、2mol/L的H2SO4酸解10min，使乳酸钙转化为乳酸，加蒸馏水使L-乳酸浓度稀释至3g/L左右，6000rpm离心10min，取上清液，用0.22μm的水相滤膜过滤于液相小瓶中。
步骤(4)中，HPLC检测条件为：液相色谱柱为Bio-Rad Aminex HPX-87H，流动相为5mmol/L的H2SO4，流速为0.5mL/min，柱温为55℃，进样量为10μL，使用二极管阵列检测器(DAD)检测。
故发酵48h的葡萄糖消耗情况如图9所示，160g/L初始葡萄糖浓度条件下消耗最快。
发酵48h的OD600变化情况如图10所示，140g/L和160g/L初始葡萄糖浓度件下的最大OD600值都较高。
发酵48h的L-乳酸生产情况如图11所示，160g/L初始葡萄糖浓度条件下L-乳酸生产速率最高。
不同初糖浓度对L-乳酸转化率的影响如图12所示，140-220g/L初始葡萄糖浓度条件下转化率都较高。
综上，160g/L是凝结芽孢杆菌H-2生产L-乳酸的最适初始葡萄糖浓度。
实施例4：
本实施例的L-乳酸生产过程中接种量对L-乳酸分批补料发酵的影响：
(1)、斜面培养：将凝结芽孢杆菌H-2接种至种子固体培养基中的斜面培养基内，在50℃下培养36h；其中，凝结芽孢杆菌H-2保藏于中国典型培养物保藏中心(湖北省武汉市珞珈山武汉大学，中国)，其保藏编号为CCTCC No.M 2020155；种子固体培养基的配方为：100g/L葡萄糖、1g/L酵母粉、5g/L蛋白胨和50g/L CaCO3，添加2％琼脂粉。
(2)、种子培养：在无菌环境中，将步骤(1)中斜面上清晰可见的较大单菌落挑至种子液体培养基内，用封口膜和塑料薄膜封住瓶口，在50℃条件下静置培养36h，获得种子液；其中，种子液体培养基的配方为：100g/L葡萄糖、1g/L酵母粉、5g/L蛋白胨和50g/L CaCO3。
(3)、发酵罐培养：将步骤(2)的种子液按照10％、20％、30％的接种量转接到平行的发酵罐培养基中，控制发酵罐温度为52℃，pH值为7.0，使用250g/L Ca(OH)2作为中和剂，搅拌转速为80rpm，控制的变量为接种量，并在发酵过程中及时补加葡萄糖，以防止糖耗光而造成菌株活性下降；其中，发酵罐培养基的配方为：160g/L葡萄糖、1g/L酵母粉、0.37g/LZnSO4·7H2O、0.57g/L KH2PO4、0.57g/L K2HPO4、8.33g/L(NH4)2SO4和3g/L(NH4)2HPO4。
(4)、发酵过程中，每8小时取样，使用SBA-40D生物传感分析仪检测残余葡萄糖浓度，使用紫外可见分光光度计检测菌体600nm处的光密度值，使用HPLC检测L-乳酸浓度。
其中，步骤(4)中，SBA-40D生物传感分析仪样品处理具体方式为：将样品加蒸馏水稀释100倍。
步骤(4)中，紫外可见分光光度计样品处理具体方式为：将样品用同等体积的6mol/L HCl酸解杂质后，用蒸馏水稀释至光密度在0.6左右。
步骤(4)中，HPLC样品处理的具体方法为：将样品置于沸水浴中处理10min，取2mL样品加入2mL、2mol/L的H2SO4酸解10min，使乳酸钙转化为乳酸，加蒸馏水使L-乳酸浓度稀释至3g/L左右，6000rpm离心10min，取上清液，用0.22μm的水相滤膜过滤于液相小瓶中。
步骤(4)中，HPLC检测条件为：液相色谱柱为Bio-Rad Aminex HPX-87H，流动相为5mmol/L的H2SO4，流速为0.5mL/min，柱温为55℃，进样量为10μL，使用二极管阵列检测器(DAD)检测。
故发酵48h的葡萄糖消耗情况如图13所示，20％和30％接种量条件下糖消耗速率都较高。
发酵48h的OD600变化情况如图14所示，10％、20％、30％接种量条件下最大OD600值都较高。
发酵48h的L-乳酸生产情况如图15所示，20％、30％接种量条件下L-乳酸生产速率都较高。
不同接种量对L-乳酸转化率的影响如图16所示，20％、30％接种量条件下转化率都较高。
综上，以及考虑经济效益，20％是凝结芽孢杆菌H-2生产L-乳酸的最适接种量。
实施例5：
本实施例在长期重复分批补料(LtRFb)策略下利用凝结芽孢杆菌生产L-乳酸的方法包括如下步骤：
(1)、斜面培养：将凝结芽孢杆菌H-2接种至种子固体培养基中的斜面培养基内，在50℃下培养36h；其中，凝结芽孢杆菌H-2保藏于中国典型培养物保藏中心(湖北省武汉市珞珈山武汉大学，中国)，其保藏编号为CCTCC No.M 2020155；种子固体培养基的配方为：100g/L葡萄糖、1g/L酵母粉、5g/L蛋白胨和50g/L CaCO3，添加2％琼脂粉。
(2)、种子培养：在无菌环境中，将步骤(1)中斜面上清晰可见的较大单菌落挑至种子液体培养基内，用封口膜和塑料薄膜封住瓶口，在50℃条件下静置培养36h，获得种子液；其中，种子液体培养基的配方为：100g/L葡萄糖、1g/L酵母粉、5g/L蛋白胨和50g/L CaCO3。
(3)、发酵罐培养：将步骤(2)的种子液按照20％的接种量转接到平行的发酵罐培养基中，控制发酵罐温度为52℃，pH值为7.0，使用250g/L Ca(OH)2作为中和剂，搅拌转速为80rpm，平均培养36h，直至所有添加的葡萄糖耗尽；其中，发酵罐培养基的配方为：160g/L葡萄糖、1g/L酵母粉、0.37g/L ZnSO4·7H2O、0.57g/L KH2PO4、0.57g/L K2HPO4、8.33g/L(NH4)2SO4和3g/L(NH4)2HPO4。
(4)、长期重复分批补料(LtRFb)发酵：将步骤(3)中培养至24h的发酵液作为下一批次的种子，以20％的接种量转接到下一批次的发酵罐培养基中，重复步骤(3)和步骤(4)，直至发酵效率降低至一定程度，并且在整个发酵过程中及时补加葡萄糖，防止葡萄糖消耗影响菌株活性；
(5)、发酵过程中每批次定期取样，使用SBA-40D生物传感分析仪检测残余葡萄糖浓度，使用紫外可见分光光度计检测菌体600nm处的光密度值，使用HPLC检测L-乳酸浓度。
(6)、LtRFb发酵中20个批次的OD600曲线如图17所示，每个批次的OD600峰值在一个较稳定的范围内波动，表明菌株稳定的活性。
(7)、LtRFb发酵中20个批次的L-乳酸生产曲线如图18所示，每个批次的L-乳酸产量和产率都较为稳定，表明菌株生产L-乳酸的性能优良且稳定。
(8)、LtRFb发酵中20个批次的L-乳酸转化率如图19所示，所有批次的L-乳酸转化率都处在一个稳定的范围内，较高且稳定的转化率显示出菌株生产L-乳酸得率高的优势。
其中，步骤(5)中，SBA-40D生物传感分析仪样品处理具体方式为：将样品加蒸馏水稀释100倍。
步骤(5)中，紫外可见分光光度计样品处理具体方式为：将样品用同等体积的6mol/L HCl酸解杂质后，用蒸馏水稀释至光密度在0.6左右。
步骤(5)中，HPLC样品处理的具体方法为：将样品置于沸水浴中处理10min，取2mL样品加入2mL、2mol/L的H2SO4酸解10min，使乳酸钙转化为乳酸，加蒸馏水使L-乳酸浓度稀释至3g/L左右，6000rpm离心10min，取上清液，用0.22μm的水相滤膜过滤于液相小瓶中。
步骤(5)中，HPLC检测条件为：液相色谱柱为Bio-Rad Aminex HPX-87H，流动相为5mmol/L的H2SO4，流速为0.5mL/min，柱温为55℃，进样量为10μL，使用二极管阵列检测器(DAD)检测。
实施例6：
对长期重复分批补料(LtRFb)策略中单批次的细胞密度发酵动力学分析：
(1)、将LtRFb发酵中的所有批次的OD600变化利用GraphPad Prism软件与logistic模型进行拟合，获得相关的动力学参数μm；
(2)、最后一批次的OD600拟合曲线如图20所示，其与logistic模型拟合度程度很高；
(3)、综上，logistic模型可以很好的描述L-乳酸的LtRFb发酵历程中细胞密度的变化趋势，对于指导采用类似分批、补料分批或重复补料分批的发酵工艺生产的其他分子量大小不同的生物产品如甲酸、1,3-丙二醇、缬氨霉素等具有潜在意义。
上述步骤(1)中的logistic模型公式为dX/dt＝μm(1-X/Xm)X，其中X表示细胞密度，用OD600值代入，μm表示最大比生长速率，Xm表示最大细胞密度(OD600)。
实施例7：
对长期重复分批补料(LtRFb)策略中单批次的产物生产发酵动力学分析：
(1)、将LtRFb发酵中的所有批次的L-乳酸浓度变化利用GraphPad Prism软件与Luedeking-Piret模型进行拟合，获得相关的动力学参数α和β；
(2)、最后一批次的L-乳酸拟合曲线如图21所示，其与Luedeking-Piret模型合度程度很高；
(3)、综上，Luedeking-Piret模型可以很好的描述L-乳酸的LtRFb发酵历程中L-乳酸生产的变化趋势，对于指导采用类似分批、补料分批或重复补料分批的发酵工艺生产的其他分子量大小不同的生物产品如甲酸、1,3-丙二醇、缬氨霉素等具有潜在意义。
上述步骤(1)中的Luedeking-Piret模型公式为dP/dt＝αdX/dt+βX，其中X表示细胞密度，用OD600值代入，P是产物浓度，P在此实施例中是L-乳酸浓度，α是生长相关常数，β是非生长相关常数。
实施例8：
长期重复分批补料(LtRFb)策略中所有批次的发酵动力学参数变化分析：
(1)、将LtRFb发酵中的所有批次的OD600变化和L-乳酸浓度变化利用GraphPadPrism软件与logistic模型和Luedeking-Piret模型进行拟合，获得相关的动力学参数μm、α和β；
(2)、所有批次的发酵动力学参数对比如图22所示，在前四个批次，β始终大于α*μm，从第五批次开始，β开始小于或者接近于α*μm，总体上α*μm有一个从小于β到大于β的趋势，体现了在整个L-乳酸的LtRFb发酵历程中细胞生长逐渐取代细胞浓度维持成为起主导作用的影响因素；
上述步骤(1)中的logistic模型公式为dX/dt＝μm(1-X/Xm)X，其中X表示细胞密度，用OD600值代入，μm表示最大比生长速率，Xm表示最大细胞密度(OD600)。
上述步骤(1)中的Luedeking-Piret模型公式为dP/dt＝αdX/dt+βX，其中X表示细胞密度，用OD600值代入，P是产物浓度，P在此实施例中是L-乳酸浓度，α是生长相关常数，β是非生长相关常数。
综上，对长期重复补料分批(LtRFb)策略生产L-乳酸的发酵动力学分析，发现L-乳酸的生产主导因素有一个从细胞量维持转变到细胞生长的趋势，因此对于利用类似发酵模式的其他生物产品的生产具有巨大的指导可能性。故凝结芽孢杆菌H-2对于L-乳酸的工业应用具有重要的应用前景。
上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种L-乳酸的生产菌株凝结芽孢杆菌H-2，其特征在于：该生产菌株凝结芽孢杆菌H-2的保藏编号为CCTCC NO:M2020155。
2.一种L-乳酸的生产菌株凝结芽孢杆菌H-2在生产L-乳酸中的应用。
3.一种生产L-乳酸的方法，其特征在于：其包括如下步骤：
(1)、将凝结芽孢杆菌H-2接种至种子固体培养基中的斜面培养基内，在50℃下培养24-36h；
(2)、在无菌环境中，将步骤(1)中斜面上的单菌落挑至种子液体培养基内，用封口膜和塑料薄膜封住瓶口，在50℃条件下静置培养24-36h，获得种子液；
(3)、将步骤(2)的种子液转接到发酵罐培养基中，按照pH、温度、初始葡萄糖浓度和接种量的顺序依次进行优化，搅拌转速为80rpm，培养30-48h，期间其他条件控制不变，最终获得优化后的发酵条件；
(4)、重复步骤(1)、步骤(2)获得的种子液接种到发酵罐培养基中，在步骤(3)优化后的发酵条件下，进行长期重复分批补料发酵，其中每个批次培养至24h的发酵液作为下一批次的种子，期间进行葡萄糖补料，防止葡萄糖消耗影响菌株活性；
步骤(1)中的凝结芽孢杆菌H-2为权利要求1所述的凝结芽孢杆菌H-2。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述种子固体培养基的配方为：100g/L葡萄糖、1g/L酵母粉、5g/L蛋白胨和50g/L CaCO3，添加2％琼脂粉。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述种子液体培养基的配方为：100g/L葡萄糖、1g/L酵母粉、5g/L蛋白胨和50g/L CaCO3。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述优化后的发酵条件为：pH值为6.2-7.5，温度为50-57℃，初始葡萄糖浓度为140-220g/L，接种量为10-30％。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(3)和步骤(4)中，所述发酵罐培养基的配方为：140-220g/L葡萄糖、1g/L酵母粉、0.37g/L ZnSO4·7H2O、0.57g/L KH2PO4、0.57g/L K2HPO4、8.33g/L(NH4)2SO4和3g/L(NH4)2HPO4。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(3)和步骤(4)中发酵期间的样品，使用SBA-40D生物传感分析仪检测残余葡萄糖浓度，使用紫外可见分光光度计检测菌体600nm处的光密度值，使用HPLC检测L-乳酸浓度。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述SBA-40D生物传感分析仪样品处理具体方式为：将样品加蒸馏水稀释100倍；和/或，
所述紫外可见分光光度计样品处理具体方式为：将样品用同等体积的6mol/L HCl酸解杂质后，用蒸馏水稀释至光密度在0.2-1.0之间；和/或，
所述HPLC样品处理的具体方法为：将样品置于沸水浴中处理10min，取2mL样品加入2mL、2mol/L的H2SO4酸解10min，使乳酸钙转化为乳酸，加蒸馏水使L-乳酸浓度稀释至1-5g/L，6000-10000rpm离心10min，取上清液，用0.22μm的水相滤膜过滤于液相小瓶中；和/或，
所述HPLC检测条件为：液相色谱柱为Bio-Rad Aminex HPX-87H，流动相为5mmol/L的H2SO4，流速为0.5mL/min，柱温为55℃，进样量为10μL，使用二极管阵列检测器检测。
10.一种利用权利要求1所述的凝结芽孢杆菌H-2在长期重复分批补料策略下生产L-乳酸的发酵动力学分析中的应用。
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