CN105274166A - 一种低聚半乳糖联产l-乳酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种低聚半乳糖联产L-乳酸的方法，配置发酵培养基，按照发酵培养基体积5～15％的接种量接入乳酸菌，45～55℃静置发酵48～120小时，发酵结束后经固液分离收集清液，即为含有低聚半乳糖及L-乳酸的溶液。本发明方法的优越性在于：所用微生物是GRAS菌株，用于制备低聚半乳糖具有较高的安全性；发酵所产低聚半乳糖为功能性低聚糖，是优良的双歧杆菌增殖因子，在医药保健品领域具有广阔的应用前景；发酵所产L-乳酸光学纯度高，是聚乳酸合成的主要前体，市场前景广阔。

Description

一种低聚半乳糖联产L-乳酸的方法

技术领域

本发明涉及一种低聚半乳糖联产L-乳酸的方法，具体涉及一种利用乳酸菌以乳糖或富含乳糖的乳清为碳源发酵实现低聚半乳糖联产L-乳酸的方法。

背景技术

乳酸菌是一类能利用可发酵糖产生乳酸的细菌统称，该类菌株具有FDA认证的GRAS(GenerallyRecognizedAsSafe)地位，兼性厌氧，能以葡萄糖、甘露糖、果糖、以及纤维二糖等可发酵糖为底物同型发酵产L-乳酸或D-乳酸，糖酸转化率高达80％以上。低聚半乳糖(GOS)是近年来备受关注的功能性低聚糖，并且是众多功能性低聚糖中获得最广泛认可、最为安全的低聚糖之一。低聚半乳糖是以乳糖为底物，在β-半乳糖苷酶的作用下合成的含有2-6个单糖分子的低聚糖，具有促进双歧杆菌增殖、改善脂质代谢及提高人体免疫力等功能，更重要的是，低聚半乳糖是母乳的天然成分之一，这正是母乳喂养对婴儿肠内的菌群发展和炎症防御起重要作用的原因。低聚半乳糖的制备方法主要有：天然原料提取法、多糖酸水解法、化学合成法、酶法和发酵法。由于自然界中低聚半乳糖的含量非常少，给天然原料提取分离带来了非常大的困难；多糖的酸水解产品得率低，产物成分复杂，分离纯化困难较大；化学合成法毒性大、易残留、得率低、环境污染大；酶法合成低聚半乳糖主要以高浓度乳糖或乳清为原料，由β-半乳糖苷酶催化合成；发酵法合成研究较少。在工业生产中，一般以微生物来源的β-半乳糖苷酶催化乳糖生产低聚半乳糖，尚无直接利用安全菌株高效生产低聚半乳糖的报道。

L-乳酸在医药、农药、化工等方面有十分广泛的应用。近年来，乳酸的衍生物聚乳酸引起了人们的广泛关注。聚乳酸被认为是最有前景的生物可降解材料之一，可用作药物缓释材料、医用缝合线、生物植片、纺织行业、包装材料和农地用膜等。聚乳酸通常由光学纯L-乳酸制得，具有可观的延展性、生物相容性和生物可降解性。作为聚乳酸的单体，L-乳酸引起了全球各大公司和研究部门的关注。

现有的技术中都是利用不同方法分别生产低聚半乳糖和L-乳酸。在低聚半乳糖的生产中，有大量葡萄糖剩余，影响了糖尿病患者的使用，其应用范围受到局限。

发明内容

本技术的所要解决的技术问题是提供一种低聚半乳糖联产L-乳酸的方法。该方法实现了低聚半乳糖和L-乳酸的联产，提高了乳糖的利用率和低聚半乳糖的纯度，节省了发酵成本。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种低聚半乳糖联产L-乳酸的方法，配置发酵培养基，按照发酵培养基体积5～15％的接种量接入乳酸菌，45～55℃静置发酵48～120小时，发酵结束后经固液分离收集清液，即为含有低聚半乳糖及L-乳酸的溶液。

其中，所述的乳酸菌优选为嗜热芽孢杆菌CCTCCNO：M2011468或凝结芽胞杆菌DSMNo.23183。其中，所述的嗜热芽孢杆菌其分类命名为嗜热芽孢杆菌(Bacillusthermophilus)NL01，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏编号为：CCTCCNO：M2011468，保藏日期为：2011年12月12日，该菌株是发明人于2011年5月从土壤筛选获得得到。

其中，所述的乳酸菌经过如下斜面培养和种子培养预处理后，再进行发酵：

斜面培养：将嗜热芽孢杆菌CCTCCM2011468或DSM23183接种到固体斜面培养基上，在45～55℃条件下静置培养12～24小时；所述固体斜面培养基的配方为(g/L)：葡萄糖20～40，蛋白胨10～20，牛肉膏10～20，酵母提取物5～10，磷酸氢二钾2～3，柠檬酸氢二铵2～3，乙酸钠3～6，硫酸镁0.5～1，硫酸锰0.2～0.5，碳酸钙10～25，琼脂粉15-20，其余为水；pH5.0～7.0，121℃条件下灭菌15分钟。

种子培养：刮取1～2环斜面培养所得的斜面培养物接种到50～500mL液体种子培养基中，在45～55℃、pH5.0～7.0的条件下，静置培养12～24小时，制得种子培养液。所述液体种子培养基配方为(g/L)：葡萄糖20～40，蛋白胨10～20，牛肉膏10～20，酵母提取物5～10，磷酸氢二钾2～3，柠檬酸氢二铵2～3，乙酸钠3～6，硫酸镁0.5～1，硫酸锰0.2～0.5，碳酸钙10～25，其余为水；pH5.0～7.0，121℃条件下灭菌15分钟。

其中，所述的发酵培养基以乳糖或富含乳糖的乳清为碳源。所述碳源的添加量为80～200g/L，优选140～180g/L。

其中，所述的发酵培养基中含有氮源，所述的氮源包括有机氮源和无机氮源，有机氮源和无机氮源的质量比优选大于5:1，其中有机氮源为酵母粉、蛋白胨、玉米浆和牛肉膏中的任意一种或几种的混合物，无机氮源为柠檬酸氢二胺、乙酸铵、氯化铵、硝酸铵和硝酸钠中的任意一种或几种的混合物。所述氮源的添加量为0.5～30g/L，优选5～20g/L。

其中，所述的发酵培养基中含有无机盐，所述的无机盐为磷酸氢二钾、乙酸钠、硫酸镁和硫酸锰中的任意一种或几种的混合物。所述无机盐的添加量为1～10g/L，优选3～7g/L。

其中，所述的发酵培养基中添加碳酸钙、氢氧化钠和氢氧化钾中的任意一种或多种，以维持培养基的pH值在5.0～7.0之间，优选pH值为5.5～6.8，最优选pH6.8。

其中，所述的发酵培养基需要121℃条件下灭菌15分钟后使用。

其中，所述的固液分离，其手段为离心或板框过滤。

其中，优选在48～52℃静置发酵60～72小时。

通过本发明方法得到的清液(即含有低聚半乳糖及L-乳酸的溶液)，按照如下方法进行样品处理和检测：将清液先加热至100℃，再以10000rpm离心10分钟，取上清液稀释适当倍数后以HPLC检测低聚半乳糖和L-乳酸的含量。

本发明的有益效果：本发明利用嗜热芽孢杆菌CCTCCM2011468或DSM23183既能产β-半乳糖苷酶合成低聚半乳糖，又能同时将葡萄糖转化为光学纯L-乳酸的特性，在提高低聚半乳糖纯度的同时，增加了一种有价值的附加产品，首次实现了低聚半乳糖和L-乳酸的联产，提高了乳糖的利用率和低聚半乳糖的纯度，节省了发酵成本。本发明所用微生物是GRAS菌株，用于制备低聚半乳糖具有较高的安全性；发酵所产低聚半乳糖为功能性低聚糖，是优良的双歧杆菌增殖因子，在医药保健品领域具有广阔的应用前景；发酵所产L-乳酸光学纯度高，是聚乳酸合成的主要前体，市场前景广阔。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例中低聚糖及L-乳酸组分的含量测定技术，均为本领域技术人员公知的技术。

一般性说明：

低聚半乳糖含量的测定方法：采用高效液相色谱(Agilent1200)分析，外标法测定。色谱条件：Bio-RadAminexHPX-42A色谱柱(7.8mm×300mm)，进样量10μL，流动相为超纯水，流速0.6mL/min，柱温80℃，检测器为示差折光检测器。

L-乳酸含量的测定方法：采用高效液相色谱(Agilent1200)分析，外标法测定。色谱条件：Bio-RadAminexHPX-87H色谱柱(7.8mm×300mm)，进样量10μL，流动相为5mmol/L的H₂SO₄，流速0.6mL/min，柱温55℃，检测器为示差折光检测器。

实施例1：

(1)斜面培养：将嗜热芽孢杆菌CCTCCM2011468接种到固体斜面培养基上，在50℃条件下静置培养12小时。所述固体斜面培养基组分(g/L)为：葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母提取物5，磷酸氢二钾2，柠檬酸氢二铵2，乙酸钠3，硫酸镁0.5，硫酸锰0.2，碳酸钙10，琼脂粉15，其余为水；pH6.8，121℃条件下灭菌15分钟。

(2)种子培养：刮取1～2环步骤(1)所得的斜面培养物接种到100mL液体种子培养基中，在50℃、pH6.8的条件下，静置培养12小时，制得种子培养液。所述液体种子培养基组分(g/L)为：葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母提取物5，磷酸氢二钾2，柠檬酸氢二铵2，乙酸钠3，硫酸镁0.5，硫酸锰0.2，碳酸钙10，其余为水；pH6.8，121℃条件下灭菌15分钟。

(3)发酵：按照培养基体积10％的接种量将步骤(2)所得的种子培养液接入发酵培养基，在50℃、pH6.8的条件下，静置发酵48小时，然后以8000rpm离心10分钟，收集上清液。所述发酵培养基组分(g/L)为：乳糖150，酵母粉15，磷酸氢二钾2，柠檬酸氢二铵2，乙酸钠2，硫酸镁0.58，硫酸锰0.27，碳酸钙30，其余为水。

(4)样品处理与检测：将步骤(3)获得的上清液先加热至100℃，再以10000rpm离心10分钟，取上清液稀释适当倍数后以HPLC检测低聚半乳糖和L-乳酸的含量，最终发酵液中低聚半乳糖和L-乳酸的含量分别为12g/L和39g/L。

实施例2：

(1)斜面培养：将嗜热芽孢杆菌CCTCCM2011468接种到固体斜面培养基上，在45℃条件下静置培养24小时。所述固体斜面培养基组分(g/L)为：葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母提取物5，磷酸氢二钾2，柠檬酸氢二铵2，乙酸钠3，硫酸镁0.5，硫酸锰0.2，碳酸钙10，琼脂粉15，其余为水；pH6.8，121℃条件下灭菌15分钟。

(2)种子培养：刮取1～2环步骤(1)所得的斜面培养物接种到100mL液体种子培养基中，在45℃、pH6.8的条件下，静置培养24小时，制得种子培养液。所述液体种子培养基组分(g/L)为：葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母提取物5，磷酸氢二钾2，柠檬酸氢二铵2，乙酸钠3，硫酸镁0.5，硫酸锰0.2，碳酸钙10，其余为水；pH6.8，121℃条件下灭菌15分钟。

(3)发酵：按照培养基体积10％的接种量将步骤(2)所得的种子培养液接入发酵培养基，在45℃、pH6.8的条件下，静置发酵60小时，然后以8000rpm离心10分钟，收集上清液。所述发酵培养基组分(g/L)为：乳糖180，酵母粉15，磷酸氢二钾2，柠檬酸氢二铵2，乙酸钠2，硫酸镁0.58，硫酸锰0.27，碳酸钙40，其余为水。

(4)样品处理与检测：将步骤(3)获得的上清液先加热至100℃，再以10000rpm离心10分钟，取上清液稀释适当倍数后以HPLC检测低聚半乳糖和L-乳酸的含量，最终发酵液中低聚半乳糖和L-乳酸的含量分别为10g/L和34g/L。

实施例3：

(1)斜面培养：将嗜热芽孢杆菌CCTCCM2011468接种到固体斜面培养基上，在55℃条件下静置培养12小时。所述固体斜面培养基组分(g/L)为：葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母提取物5，磷酸氢二钾2，柠檬酸氢二铵2，乙酸钠3，硫酸镁0.5，硫酸锰0.2，碳酸钙10，琼脂粉15，其余为水；pH6.8，121℃条件下灭菌15分钟。

(2)种子培养：刮取1～2环步骤(1)所得的斜面培养物接种到100mL液体种子培养基中，在55℃、pH6.8的条件下，静置培养12小时，制得种子培养液。所述液体种子培养基组分(g/L)为：葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母提取物5，磷酸氢二钾2，柠檬酸氢二铵2，乙酸钠3，硫酸镁0.5，硫酸锰0.2，碳酸钙10，其余为水；pH6.8，121℃条件下灭菌15分钟。

(3)发酵：按照培养基体积10％的接种量将步骤(2)所得的种子培养液接入发酵培养基，在55℃、pH6.8的条件下，静置发酵120小时，然后以8000rpm离心10分钟，收集上清液。所述发酵培养基组分(g/L)为：乳糖160，酵母粉15，磷酸氢二钾2，柠檬酸氢二铵2，乙酸钠2，硫酸镁0.58，硫酸锰0.27，碳酸钙35，其余为水。

(4)样品处理与检测：将步骤(3)获得的上清液先加热至100℃，再以10000rpm离心10分钟，取上清液稀释适当倍数后以HPLC检测低聚半乳糖和L-乳酸的含量，最终发酵液中低聚半乳糖和L-乳酸的含量分别为15g/L和48g/L。

实施例4：

(1)斜面培养：将凝结芽胞杆DSM23183菌接种到固体斜面培养基上，在50℃条件下静置培养16小时。所述固体斜面培养基组分(g/L)为：葡萄糖40，蛋白胨20，牛肉膏20，酵母提取物10，磷酸氢二钾3，柠檬酸氢二铵3，乙酸钠6，硫酸镁1，硫酸锰0.5，碳酸钙25，琼脂粉20，其余为水；pH6.8，121℃条件下灭菌15分钟。

(2)种子培养：刮取1～2环步骤(1)所得的斜面培养物接种到100mL液体种子培养基中，在50℃、pH6.8的条件下，静置培养164小时，制得种子培养液。所述液体种子培养基组分(g/L)为：葡萄糖40，蛋白胨20，牛肉膏20，酵母提取物10，磷酸氢二钾3，柠檬酸氢二铵3，乙酸钠6，硫酸镁1，硫酸锰0.5，碳酸钙25，其余为水；pH6.8，121℃条件下灭菌15分钟。

(3)发酵：按照培养基体积10％的接种量将步骤(2)所得的种子培养液接入发酵培养基，在50℃、pH6.8的条件下，静置发酵72小时，然后以8000rpm离心10分钟，收集上清液。所述发酵培养基组分(g/L)为：乳糖100，酵母粉15，磷酸氢二钾2，柠檬酸氢二铵2，乙酸钠2，硫酸镁0.58，硫酸锰0.27，碳酸钙25，其余为水。

(4)样品处理与检测：将步骤(3)获得的上清液先加热至100℃，再以10000rpm离心10分钟，取上清液稀释适当倍数后以HPLC检测低聚半乳糖和L-乳酸的含量，最终发酵液中低聚半乳糖和L-乳酸的含量分别为8g/L和31g/L。

实施例5：

(1)斜面培养：将凝结芽胞杆菌DSM23183接种到固体斜面培养基上，在50℃条件下静置培养12小时。所述固体斜面培养基组分(g/L)为：葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母提取物5，磷酸氢二钾2，柠檬酸氢二铵2，乙酸钠3，硫酸镁0.5，硫酸锰0.2，碳酸钙10，琼脂粉15，其余为水；pH6.8，121℃条件下灭菌15分钟。

(2)种子培养：刮取1～2环步骤(1)所得的斜面培养物接种到100mL液体种子培养基中，在50℃、pH6.8的条件下，静置培养12小时，制得种子培养液。所述液体种子培养基组分(g/L)为：葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母提取物5，磷酸氢二钾2，柠檬酸氢二铵2，乙酸钠3，硫酸镁0.5，硫酸锰0.2，碳酸钙10，其余为水；pH6.8，121℃条件下灭菌15分钟。

(3)发酵：按照培养基体积10％的接种量将步骤(2)所得的种子培养液接入发酵培养基，在50℃、pH6.8的条件下，静置发酵60小时，然后以8000rpm离心10分钟，收集上清液。所述发酵培养基组分(g/L)为：乳清(乳糖含量120)，酵母粉15，磷酸氢二钾2，柠檬酸氢二铵2，乙酸钠2，硫酸镁0.58，硫酸锰0.27，碳酸钙30，其余为水。

(4)样品处理与检测：将步骤(3)获得的上清液先加热至100℃，再以10000rpm离心10分钟，取上清液稀释适当倍数后以HPLC检测低聚半乳糖和L-乳酸的含量，最终发酵液中低聚半乳糖和L-乳酸的含量分别为9g/L和30g/L。

实施例6：

(1)斜面培养：将凝结芽胞杆菌DSM23183接种到固体斜面培养基上，在50℃条件下静置培养16小时。所述固体斜面培养基组分(g/L)为：葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母提取物5，磷酸氢二钾2，柠檬酸氢二铵2，乙酸钠3，硫酸镁0.5，硫酸锰0.2，碳酸钙10，琼脂粉15，其余为水；pH5.0，121℃条件下灭菌15分钟。

(2)种子培养：刮取1～2环步骤(1)所得的斜面培养物接种到100mL液体种子培养基中，在50℃、pH5.0的条件下，静置培养16小时，制得种子培养液。所述液体种子培养基组分(g/L)为：葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母提取物5，磷酸氢二钾2，柠檬酸氢二铵2，乙酸钠3，硫酸镁0.5，硫酸锰0.2，碳酸钙10，其余为水；pH5.0，121℃条件下灭菌15分钟。

(3)发酵：按照培养基体积10％的接种量将步骤(2)所得的种子培养液接入发酵培养基，在50℃、pH5.0的条件下，静置发酵72小时，然后以8000rpm离心10分钟，收集上清液。所述发酵培养基组分(g/L)为：乳糖150，酵母粉15，磷酸氢二钾2，柠檬酸氢二铵2，乙酸钠2，硫酸镁0.58，硫酸锰0.27，碳酸钙30，其余为水。

(4)样品处理与检测：将步骤(3)获得的上清液先加热至100℃，再以10000rpm离心10分钟，取上清液稀释适当倍数后以HPLC检测低聚半乳糖和L-乳酸的含量，最终发酵液中低聚半乳糖和L-乳酸的含量分别为7g/L和19g/L。

Claims (10)

1.一种低聚半乳糖联产L-乳酸的方法，其特征在于，配置发酵培养基，按照发酵培养基体积5～15％的接种量接入乳酸菌，45～55℃静置发酵48～120小时，发酵结束后经固液分离收集清液，即为含有低聚半乳糖及L-乳酸的溶液。

2.根据权利要求1所述的低聚半乳糖联产L-乳酸的方法，其特征在于，所述的乳酸菌为嗜热芽孢杆菌CCTCCNO：M2011468或凝结芽胞杆菌DSMNo.23183。

3.根据权利要求1所述的低聚半乳糖联产L-乳酸的方法，其特征在于，所述的发酵培养基以乳糖或富含乳糖的乳清为碳源。

4.根据权利要求3所述的低聚半乳糖联产L-乳酸的方法，其特征在于，所述碳源的添加量为80～200g/L。

5.根据权利要求1或3所述的低聚半乳糖联产L-乳酸的方法，其特征在于，所述的发酵培养基中含有氮源，所述的氮源包括有机氮源和无机氮源，其中有机氮源为酵母粉、蛋白胨、玉米浆和牛肉膏中的任意一种或几种的混合物，无机氮源为柠檬酸氢二胺、乙酸铵、氯化铵、硝酸铵和硝酸钠中的任意一种或几种的混合物。

6.根据权利要求5所述的低聚半乳糖联产L-乳酸的方法，其特征在于，所述氮源的添加量为0.5～30g/L。

7.根据权利要求1或3所述的低聚半乳糖联产L-乳酸的方法，其特征在于，所述的发酵培养基中含有无机盐，所述的无机盐为磷酸氢二钾、乙酸钠、硫酸镁和硫酸锰中的任意一种或几种的混合物。

8.根据权利要求7所述的低聚半乳糖联产L-乳酸的方法，其特征在于，所述无机盐的添加量为1～10g/L。

9.根据权利要求1或3所述的低聚半乳糖联产L-乳酸的方法，其特征在于，所述的发酵培养基中添加碳酸钙、氢氧化钠和氢氧化钾中的任意一种或多种，以维持培养基的pH值在5.0～7.0之间。

10.根据权利要求1所述的低聚半乳糖联产L-乳酸的方法，其特征在于，所述的固液分离，其手段为离心或板框过滤。