CN101532036B

CN101532036B - 利用菊芋原料发酵生产丁二酸的方法

Info

Publication number: CN101532036B
Application number: CN2008100074705A
Authority: CN
Inventors: 过鑫富; 孙志浩
Original assignee: Zhejiang Hangzhou Xinfu Pharmaceutical Co Ltd; Jiangnan University
Current assignee: Hangzhou Xinfu Science & Technology Co ltd; YIFAN XINFU PHARMACEUTICAL Co.,Ltd.; Jiangnan University
Priority date: 2008-03-11
Filing date: 2008-03-11
Publication date: 2012-03-14
Anticipated expiration: 2028-03-11
Also published as: CN101532036A

Abstract

本发明提供了一种利用廉价菊芋原料发酵生产丁二酸的方法。本发明还提供一种菊芋原料在制备丁二酸中的应用。本发明同时提供琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)在以菊芋为原料制备丁二酸的方法中的应用。本发明的方法利用可再生原料，对环境友好，可缓解化学合成丁二酸的石化资源紧张问题，也能够显著体现发酵可以不与人争粮、不与粮争地的优点，这不仅减少了发酵的培养基成本，并且能缓解粮食作为发酵原料的不足，还能解决大量荒原沙漠滩涂等边际土地的开发利用问题，有利环境，增加农民收入，利于农业与农村建设。

Description

利用菊芋原料发酵生产丁二酸的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域。具体地，本发明涉及一种利用廉价菊芋原料发酵生产丁二酸的方法。本发明还涉及一种菊芋原料在制备丁二酸中的应用。本发明同时涉及琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)在以菊芋为原料制备丁二酸的方法中的应用。

背景技术

丁二酸(succinic acid)，又称丁二酸，分子式为C₄H₆O₄，分子量为118.09，是一种常见的天然有机酸，广泛存在于人体、动物、植物和微生物中。

丁二酸是工业上一种重要的四碳化合物，它作为有机合成原材料、中间产物或专业化学制品广泛应用在食品、医药、农药、染料、香料、油漆、塑料和材料工业。其最大的市场是用于表面活性剂、清洁剂、绿色溶剂、离子鳌合剂、生物可降解塑料等领域。其在食品行业中作为酸化剂、pH改良剂、风味物质和抗菌剂，以及作为原料或中间体用于医药、抗生素、氨基酸和维生素的生产(Appl Microbiol Biotechnol，51：545-552，1999)。目前，发酵法生产丁二酸和它大多数衍生物的合成还处在进一步研究和开发阶段。

目前已开发出多项技术将丁二酸转化为重要的工业化学品，包括N-甲基吡咯烷酮、1，4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯、PBS可降解塑料等。其中许多化工产品目前都是以石油或煤化工产品(如苯、丁烷等)为原料合成的，资源紧缺，不可再生。现报道大约有250种以苯或丁烷等为原料的化工产品可以通过丁二酸为原料来生产。因此，全球对丁二酸的需求不断增加。

工业上丁二酸的生产方法主要为化学方法，主要有石蜡氧化法、轻油氧化法、丁烷氧化法、丁二腈水解法、顺酐电解还原法、以及以乙烯和一氧化碳为原料的电解氧化法。目前，国内外主要使用的是催化加氢法。以化学方法获得丁二酸，不可避免地要消耗大量不可再生的化石原料，还具有转化率低，易污染环境等弊端。

丁二酸的生产可通过发酵方法来进行，由于化石原料的日趋减少，用微生物发酵碳水化合物生产丁二酸的方法日益受到人们的重视。由于发酵法生产丁二酸是以可再生糖源(如葡萄糖)和二氧化碳作为主要原料，因此微生物发酵法生产丁二酸，具有成本低和摆脱对石化原料依赖的优点，而且开辟了温室气体二氧化碳利用的新途径，更加显示了环境友好特征。

丁二酸是继柠檬酸后最具市场潜力的发酵有机酸产品之一，但目前都还是用化学方法生产。根据美国Michigan大学MBI研究所的估计，在未来几年内，丁二酸的总需求将达到100万吨的水平。

目前文献报道的发酵法生产丁二酸研究用培养基原料多为葡萄糖，无论是牛瘤胃中分离的Actinobacillus succinogenes、基因工程构建的大肠杆菌Escherichia coli生产丁二酸的方法都是如此。使用价格低廉的碳源是降低发酵法生产丁二酸成本的一个关键因素。目前，已有一些利用不同原料发酵生成丁二酸的报道，比如美国Argonne在网上报道了从玉米(淀粉水解液)生产化学品丁二酸的消息(www.ipd.anl.gov/biotech/index.html，2002)，日本三菱化学和味之素公司也联合开发了采用以玉米淀粉为原料发酵生产丁二酸(http://www.bio168.com，2005)。韩国Lee PC等与Kim DY等曾先后报道了Mannheimia succiniciproducens MBEL55E发酵乳清原料和发酵木浆水解液生产丁二酸。发酵乳清原料产丁二酸15.5g/L，对消耗糖产率和生产强度为93％和0.24g/(L·小时)(Appl Microbiol Biotechnol 54：23-27，2000)；用NaOH预处理过的木浆水解液培养基分批发酵积累丁二酸11.73g/L，对消耗糖产率和生产强度分别为56％和1.17g/(L·小时)(Enzyme and Microbial Technology，35：648-653，2004)，反映了该菌种不适宜于纤维素原料发酵。2002年日本地球环境产业技术研究机构的Inui等人报道使用转基因微生物从废纸发酵制取丁二酸，每升培养液中可制取约30g的丁二酸(新华网http://news.xinhuanet.com/newscenter，2002)。由于上述研究结果产率很低，尚未能用于工业化生产。本发明人从牛瘤胃中筛选的琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes CGMCC1593，它能发酵的糖质原料包括葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、蔗糖、乳糖、半乳糖等糖类，能利用多种农副产品如乳糖、木薯、玉米、甜菜或甘蔗糖蜜等(中国专利申请200610038113.6、200710019686.9)，也适于发酵秸秆、木材工业下脚料，制糖造纸业下脚料和城市纤维垃圾等木质纤维物的水解糖浆原料生产丁二酸(中国专利20071092025.6)。发现它也很适宜于发酵菊芋原料生产丁二酸。

菊芋(jerusalem artichoke)，俗名洋姜、鬼子姜，菊科，多年生草本植物。学名：Helianthus tuberosus L。主根上长出匍匐茎，其顶部膨大成块茎，形似马铃薯。适应性强，能在广泛的气候土壤条件下生长。可利用沙漠、盐碱地、山丘等边际土地或宅旁、地边零星土地种植。块根产量22-30吨/公顷，茎叶产量15吨/公顷。目前菊芋块根除少量用作制造酱菜、保健品菊粉与果糖类产品外，尚未能得到大批量开发利用。

到目前为止，工业上还没有见到利用菊芋原料发酵生产丁二酸的研究报道。

发明内容

本发明的一个目的在于，提供一种利用廉价菊芋原料发酵生产丁二酸的方法。本发明的另一个目的在于，提供菊芋原料在制备丁二酸中的应用。本发明的又一个目的在于，提供琥珀酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes)在以菊芋为原料制备丁二酸的方法中的应用。

针对上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一方面，本发明提供一种生产丁二酸的方法，该方法包括以下步骤：

1)、将菊芋原料水解得到含果糖和葡萄糖的菊芋糖浆，优选地，所述菊芋原料为植物菊芋的块根，该植物菊芋包括利用边际土地种植的菊芋或野生的菊芋；

2)、将1)中得到的菊芋糖浆配制成培养基，以琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)来发酵生产丁二酸；优选地，所述发酵为厌氧发酵；进一步优选地，所述厌氧发酵在充满CO₂或N₂的厌氧条件下进行。

优选地，步骤1)中所述的水解是酸水解或酶水解。

进一步优选地，所述酸水解是经过酸如稀硫酸或其他无机或有机酸如盐酸等的水解；所述酶水解采用的酶源是菊粉酶，包括外切酶与内切酶，可以外购商品，例如诺维信公司的菊糖水解酶Fructozyme，也可以经微生物发酵所得到，发酵所使用的菌种可以是黑曲霉、酵母、细菌以及其他能产菊粉酶的微生物种属。

优选地，所述的方法中，每升体积的步骤2)中所述的培养基内含有：步骤1)所得到的菊芋糖浆或该菊芋糖浆与其他碳水化合物原料的混合糖浆，以含总还原糖计50-100g；优选地，所述菊芋糖浆与其他碳水化合物原料的混合糖浆是由菊芋糖浆与玉米等淀粉原料物质水解糖浆或与秸秆等纤维素原料物质水解糖浆或与制糖工业废糖蜜以任意配比混合制备的。

进一步优选地，所述的方法中，每升体积的步骤2)中所述的培养基内还含有：MgCl₂ 0.1-0.5g、Na₂HPO₄·12H₂O 1-5g和NaH₂PO₄·2H₂O 1-5g；优选地，还含有酵母膏10-20g和/或玉米浆10-20g。

优选地，所述的方法中，步骤2)中所述培养基的起始pH范围为5.5-7.5，培养温度为30-40℃，在厌氧条件下发酵30-60小时，优选地，在发酵过程中，使用氨水、碳酸盐或碱溶液调节pH值，维持pH值在5.5-7.5的范围内。

优选地，所述方法是将菊芋原料经酸水解或酶水解得到糖浆进行分批发酵或补料分批发酵生产丁二酸，或是将菊芋原料未先经过酸水解或酶水解得到糖浆再发酵，而是直接投入菊芋原料用菊粉酶与琥珀酸放线杆菌同步水解(糖化)发酵生产丁二酸。

优选地，步骤1)中的菊芋原料是采用稀硫酸水解处理，更优选地，该步骤1)包括：将原料鲜菊芋块根洗净、切块、打浆，或干菊芋磨粉、调浆，按原料干物质体积的0.1％-2.0％的体积量加入浓硫酸，室温或加热至30-60℃，搅拌1-10小时，然后用NaOH调节pH值至6.5。

优选地，步骤1)中的菊芋原料采用酶水解处理，该步骤1)包括：将原料鲜菊芋块茎洗净、切块、打浆，或干菊芋磨粉、调浆，按原料总糖量每g加20-50U的酶液，室温或加热至30-60℃，搅拌水解1-10小时，然后用NaOH调节pH值至5.5-7.5的范围。

另一方面，本发明提供菊芋原料在制备丁二酸中的应用，其中所述菊芋原料为植物菊芋的块根。

另一方面，本发明提供琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)在以菊芋为原料制备丁二酸的方法中的应用。

经过大量的实验，本发明人惊奇地发现，菊芋原料经水解得到果糖和葡萄糖后不需要进行提纯，即可直接用于发酵生产丁二酸。

以下，本发明将详细描述包括采用菊粉酶水解菊芋中的菊糖，使之分解成以为果糖主要成份的还原糖，然后进行丁二酸发酵，以及多种实施例。

根据本发明的一种实施方式，所述方法以菊芋为原料，经菊粉酶或酸水解处理得到果糖和葡萄糖混合还原糖的菊芋糖浆(含总还原糖浓度50-100g/L)，再用琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)CGMCC 1593在含有还原糖的水解菊芋糖浆的培养基中发酵生产丁二酸，或菊芋原料直接用菊粉酶与琥珀酸放线杆菌同步水解(糖化)发酵生产丁二酸。本发明使用发明人从牛瘤胃中筛选得到的微生物Actinobacillus succinogenes CGMCC1593，在厌氧和维持pH 5.5-7.5的环境下，在5L发酵罐进行分批厌氧发酵36-48小时，投入总还原糖浓度53.38-55.5g/L，产丁二酸浓度40.52-50.22g/L，丁二酸对消耗糖产率77.8-93.4％(糖利用率94-99％)，生产强度0.84-1.22g/(L·小时)；在5L发酵罐进行菊芋水解糖液补料分批发酵72小时，投入总还原糖浓度84.0g/L，产丁二酸浓度61.80g/L，丁二酸对消耗糖产率78.8％(糖利用率93.4％)，生产强度0.86g/(L·小时)；在5L发酵罐进行同步水解(糖化)分批发酵48小时，投入总还原糖浓度64.9g/L，产丁二酸浓度58.93g/L，丁二酸对消耗糖产率93.6％(糖利用率97.0％)，生产强度1.23g/(L·小时)；在5L发酵罐进行同步水解(糖化)补料分批发酵72小时，投入总还原糖浓度82.8g/L，产丁二酸浓度68.48g/L，丁二酸对消耗糖产率94.2％(糖利用率87.8％)，生产强度0.95g/(L·小时)。本发明突出的优点是利用边际土地种植或野生的菊芋原料发酵生产丁二酸，是一种利用可再生原料的生产方法，对环境友好，可缓解化学合成丁二酸的石化资源紧张问题。

根据本发明的一种实施方式，提供一种利用菊芋原料发酵法生产丁二酸的方法，以菊芋为原料，经水解处理得到果糖和葡萄糖的水解菊芋糖浆，再用琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)CGMCC1593在含有果糖和葡萄糖等还原糖的水解菊芋糖浆的培养基中发酵生产丁二酸；

发酵培养基组成以每g/L计为：水解菊芋糖浆含总还原糖20-100g，酵母膏10-20g，玉米浆10-20g，MgCl₂ 0.1-0.5g，Na₂HPO₄·12H₂O 1-5g，NaH₂PO₄·2H₂O 1-5g，培养基起始pH 5.5-7.5；培养温度30-40℃，维持pH5.5-7.5，厌氧条件下发酵20-60小时。

发酵过程中采用补加浓缩的菊芋糖浆，发酵培养基的初始总还原糖浓度35-55g/L，当发酵液残糖降为10g/L时，补加浓缩的菊芋糖浆溶液将发酵液中的糖浓度控制在10-20g/L。

所用水解菊芋糖浆是菊芋原料经过菊粉酶酶水解或稀酸水解得到的糖浆。

所述的方法包括发酵培养基组成中使用单一菊芋糖浆或菊芋糖浆与玉米等淀粉质原料水解糖浆或与秸秆等纤维素物质原料水解糖浆或与制糖工业废糖蜜以任意配比混合的丁二酸发酵。

所述的方法包括发酵培养基组成中不加玉米浆的厌氧条件下发酵；包括发酵培养基组成中不加酵母膏的厌氧条件下发酵；包括发酵在充满CO₂的厌氧条件下进行；包括发酵过程中，用碳酸盐或碱溶液维持pH 5.5-7.5。

所述的方法中的菊芋原料为植物原料菊芋的根茎，包括利用边际土地种植的菊芋或野生的菊芋。其酶水解或稀酸水解处理的方法是：将原料菊芋洗净、切块、打浆，或菊芋干磨粉、调浆，按原料总糖量每g总糖加20-50U的酶液，或按原料干物质量的0.1％-2.0％(V/V)加浓硫酸，室温或加热至30-60℃，搅拌水解1-10小时，然后用NaOH调pH 5.5-7.5。

所述的方法中的菊芋原料酶水解处理所采用的酶源为微生物发酵所得到的菊粉酶(包括外切酶与内切酶)，发酵所用的菌种可以是黑曲霉、酵母、细菌，以及其他能产菊粉酶的微生物种属。本发明菊粉酶的发酵方法：所用的菌种为黑曲霉(Aspergillus niger)AS3.4309，产酶发酵培养基组成以每L计为：菊粉20-100g，蛋白胨10-50g，蔗糖酯1-10g，培养基起始pH为5.5-7.5，培养温度30-40℃，搅拌条件下通气发酵1-5天。

根据本发明的一种具体实施方式，提供了本发明方法的详细描述：

菊芋原料的预处理与水解：

将菊芋块茎洗净、切块、打浆，或菊芋干磨粉、调浆，按原料总糖量每g加20-50U的酶液，或按原料干物质量的0.1％-2.0％(V/V)加浓硫酸，室温或加热至30-60℃，搅拌水解1-10小时，然后用NaOH调pH 5.5-7.5，直接用于发酵配料使用；将酶水解菊芋糖液用常规方法真空浓缩，得到200-300g/L糖浓度的混合糖浆，作为补料用糖液。

菊芋酶水解采用的酶源为微生物发酵所得到的菊粉酶(包括外切酶与内切酶)，发酵所用的菌种可以是黑曲霉、酵母、细菌，以及其他能产菊粉酶的微生物种属。菊粉酶的发酵方法：所用菌种黑曲霉Aspergillus nigerCGMCC 3.4309，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。产酶发酵培养基组成以每L计为：菊粉20-100g，蛋白胨10-50g，蔗糖酯1-10g，培养基起始pH 5.5-7.5，培养温度30-40℃，搅拌条件下通气发酵1-5天，发酵液酶活力可达到40-50U/ml。

酶水解或酸水解的菊芋糖浆发酵生产丁二酸：

菌株：琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)CGMCC1593，为本实验室从牛的瘤胃中分离获得，保藏在中国北京中关村中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，且已在CN1814747A中公开，公开日为2006年8月9日。

种子培养基的组成为(每L)：葡萄糖5-15g，酵母膏1-10g，K₂HPO₄·3H₂O0.5-2.0g，NaH₂PO₄·2H₂O 0.2-2.0g，1000ml水。

发酵培养基的组成为(每L)：含菊芋糖浆(以总还原糖计)50-100g，酵母膏10-20g，玉米浆10-20g，MgCl₂ 0.1-0.5g，Na₂HPO₄·12H₂O 1-5g，NaH₂PO₄·2H₂O 1-5g，pH 5.5-7.5。

发酵培养基组成中可以使用单一菊芋糖浆，或用菊芋糖浆与玉米等淀粉质原料水解糖浆或与秸秆等纤维素物质原料水解糖浆以任意配比混合进行丁二酸发酵。

发酵培养基组成中可以不加玉米浆，或者不加酵母膏在厌氧条件下发酵。

种子培养在150ml厌氧瓶中进行，装液20-80ml。发酵在150ml厌氧瓶或5L-25L搅拌发酵罐(New Brunswich 110，New Brunswick Scientific，Edison，NJ，USA)中进行。种子和发酵培养基的灭菌温度为115-121℃，15分钟。

将实验菌株接种到种子培养基中，于30-40℃在充满CO₂的环境中静止或振荡培养24-60小时。

按1％-10％的接种量将培养好的种子接入发酵培养基，在充满CO₂或N₂气体的环境下，30-40℃静止或振荡(或搅拌)发酵30-60小时，并用碳酸盐或碱溶液调节维持发酵液pH 5.5-7.5。

酶水解或酸水解的菊芋糖浆可以进行分批发酵或补料分批发酵生产丁二酸；也可以直接投入菊芋原料(未先经过酸水解或酶水解得到糖浆)，用菊粉酶与琥珀酸放线杆菌进行同步水解(糖化)发酵生产丁二酸。

分析方法：

将培养液离心，采用高效液相色谱法分析上清液中的丁二酸等代谢产物及糖类物质。采用美国Waters高效液相色谱仪，Waters RI检测器，Breeze色谱工作站。其中，丁二酸，乙酸，乳酸和甲酸等有机酸的测定使用AminexHPX-87H离子色谱柱(300mm×7.8mm，9μm；Bio-Rad Chemical Division，Richmond，Calif.)，流动相8mM硫酸；柱温55℃；流速0.5ml/分钟；进样量10μL。葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、乳糖和麦芽糖等糖类含量的测定采用Zobax NH₂氨基柱(250mm×4.6mm，5μm；Agilent，USA)，流动相：75％乙腈；流速1ml/分钟进样量10μL。(附图为高效液相色谱法分析本发明方法的关于各代谢产物尤其是包含丁二酸产物的典型谱图)。

菊芋水解糖浆总还原糖测定采用3，5-二硝基水杨酸法(DNS法)，测定时选用果糖为还原糖标准物。

丁二酸的对糖产率定义为每消耗1克还原糖所能产生的丁二酸克数，并以百分数表示。

糖利用率定义为消耗糖所占投入糖的百分比(对于酶或酸水解菊芋糖浆，所述的糖以总还原糖计算)。

与现有技术相比，本发明具有如下的明显优点：

本发明利用从牛瘤胃中筛选的琥珀酸放线杆菌Actinobacillussuccinogenes CGMCC1593，它不仅适宜于玉米等粮食原料的发酵，也很适宜于发酵菊芋原料，用其发酵经酶或酸水解的菊芋糖浆生产丁二酸的产物丁二酸浓度达30-68g/L，对糖产率80％-82％(糖利用率90％-95％)和生产强度达到0.9-1.2g/(L·小时)，很适用于低成本丁二酸的工业化生产。本发明突出的优点是利用廉价菊芋原料发酵生产丁二酸，菊芋作为一种价格低廉的农作物原料可以替代纯葡萄糖或者用粮食原料玉米等水解糖作为碳源用来发酵生产丁二酸，是一种利用可再生原料的生产方法，对环境友好，可缓解化学合成丁二酸的石化资源紧张问题，也能够显著体现发酵可以不与人争粮、不与粮争地的优点，这不仅减少了发酵的培养基成本，并且能缓解粮食作为发酵原料的不足，还能解决大量荒原沙漠滩涂等边际土地的开发利用问题，有利环境，增加农民收入，利于农业与农村建设。

在产业实用性方面，本发明也具有非常突出的优点：

首先，菊芋块根成分中除水分外，含大量菊糖(其结构是D-呋喃果糖以β-1，2-键与蔗糖的果糖脱水缩合的聚合度为32-34的多糖)，可达干重的70％-80％，是工业中一种较廉价的碳源原料。

其次，我国有广阔的边际土地有待于开发，特别是一些沙漠荒原，种植菊芋植物不仅具有经济价值，还能有固沙功能。菊芋具有来源丰富、种植简单、产量高、再生时间短、价格低廉等优点。菊芋原料与葡萄糖或玉米淀粉水解液比较，作为发酵工业的主要碳源具有很大潜力，同时可以结合改造荒漠沙地滩涂，对环境生态有利，实现国民经济可持续发展。

再次，与葡萄糖或玉米淀粉水解液比较，菊芋价格低廉，已经用于食品、多糖、寡糖、结晶果糖与高果糖浆等产品的工业生产，也已开始用于发酵生产酒精、乳酸的产品的研究开发。

最后，菊芋原料发酵生产丁二酸与用粮食原料发酵生产丁二酸相比，能节约大量粮食，有利于国家粮食安全。菊芋发酵生产丁二酸与用菊芋发酵生产燃料乙醇相比，产品丁二酸附加值比乙醇高，而且生产菌种琥珀酸放线杆菌不像酵母发酵酒精要放出大量CO₂，反之它能利用固定CO₂，环境友好。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1为高效液相色谱法分析本发明方法的关于各代谢产物尤其是包含丁二酸产物的典型谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。

实施例1

黑曲菊粉酶的发酵制备

用黑曲霉(Apergillus niger)CGMCC 3.4309，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。用常规霉菌土豆琼脂培养基斜面培养孢子，配制孢子悬液(10⁶个/mL)，接入装有80mL产酶培养基的250mL三角瓶中。产酶发酵培养基配方(每L)：菊粉50g/L，蛋白胨40g/L，蔗糖酯6g/L，pH 6.0。在30℃，200转数/分钟的条件下，摇瓶发酵2-5天，分别取不同培养天数的发酵液，测定酶活。并于50℃条件下水解含总糖为8.5％的菊芋浆液(加酶量40U/g总糖)测定4小时、8小时、12小时后的还原糖和计算水解率，结果见表1。

表1黑曲菊粉酶的发酵制备

发酵天数(天)	菊粉酶活(U/mL)	对含总糖8.5％菊芋浆液的水解率(％)
					4小时	8小时	12小时
		1	8.9	-				-	-
2	21.9				61.8	74.2	88.9
		3	44.1	72.8				93.4	99.5
4	43.8				71.4	89.4	89.8
		5	43.2	78.5				90.3	98.4

表1结果表明，发酵3天后的酶液，菊粉酶活可达到44.1U/mL，12小时的水解率达到99.5％。

实施例2

不同水解方法制备菊芋水解糖的丁二酸发酵

种子培养基(每L)：葡萄糖5g，酵母膏5g，K₂HPO₄·3H₂O 1.0g，NaH₂PO₄·2H₂O 1.0g，pH 7.0。37℃厌氧培养16小时。

发酵培养基(每L)：菊芋水解糖浆(总还原糖)60g，酵母膏15g，玉米浆20g，MgCl₂ 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 1.5g，NaH₂PO₄·2H₂O 1.5g，pH 6.5。37℃厌氧培养48小时。

酶水解菊芋糖浆制备采用的方法简述如下：

(1)酶水解：将菊芋鲜块茎洗净、去泥，粗切至20-30mm大小，用组织捣碎机打浆，配制成含总糖为5％-10％的菊芋浆液，使用实施例1制备的菊粉酶(44.1U/ml，对投入总糖计为40U/g总糖)，酶解10小时，滤取得到澄清果糖和葡萄糖混合糖液(总还原糖约5％-10％)，用NaOH调整总还原糖和pH，按发酵培养基配方配料用于发酵。

(2)稀酸水解：将菊芋原料粗切至20-30mm大小，用1.0％稀硫酸做催化剂，在90℃下水解反应1小时，快速冷却，过滤去残渣，滤液测糖，调整总还原糖和pH，按发酵培养基配方配料用于发酵。

不同水解方法制备的菊芋水解糖的丁二酸发酵结果见表2。

表2不同水解方法制备菊芋水解糖的丁二酸发酵结果(厌氧瓶分批发酵)

水解方法	残还原糖(g/L)	丁二酸(g/L)	乙酸等杂酸(g/L)	丁二酸产率(％)	糖利用率(％)
						酶水解	6.2	42.9	10.8	79.7	89.7
稀酸水解	12.6	38.3	7.7	80.8	79.0

比较以上2种制备方法，两种方法都能得到很好的发酵结果，其中以酶水解的发酵结果稍好，糖利用率较高。说明本发明筛选的琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes CGMCC 1593可适宜于发酵不同水解处理的菊芋水解糖浆。以菊粉酶酶水解菊芋水解糖浆，初糖浓度60g/L，发酵48h，能够产生42.9g/L的丁二酸，对消耗糖产率79.7％，糖利用率达89.7％。

实施例3

菊芋糖浆不同初始还原糖浓度的丁二酸发酵

按实施例2方法，使用实施例1制备的菊粉酶水解的菊芋鲜块茎水解糖浆，用厌氧瓶分批发酵，初始还原糖浓度分别为30，45，55，65，80g/L时，结果如表3所示：

表3不同初始还原糖浓度菊芋糖浆的丁二酸发酵结果(厌氧瓶分批发酵)

初始还原糖浓度(g/L)	残还原糖(g/L)	丁二酸(g/L)	乙酸等杂酸(g/L)	丁二酸产率(％)	糖利用率(％)
						30	0.22	19.13	9.56	64.2	99.3
45	2.50	32.32	7.53	76.0	94.4
						55	5.21	40.08	8.52	80.5	90.5
65	6.20	46.54	11.75	79.1	90.5
						80	18.08	46.61	12.42	75.3	77.4

由表3可以看出，以初始还原糖浓度为65-80g/L时丁二酸的产量为最高，达到46.54-46.61g/L，初始还原糖浓度为65g/L时，丁二酸对消耗糖产率79.1％，糖利用率90.5％。

实施例4

菊芋糖浆与谷物等水解糖浆混合的丁二酸发酵

按实施例2方法，使用实施例1制备的菊粉酶水解的菊芋鲜块茎水解糖浆，用厌氧瓶分批发酵，将菊芋糖浆与玉米等谷物水解糖浆或秸秆等纤维质原料水解糖浆或与制糖工业废糖蜜以任意配比混合进行丁二酸发酵，结果如表4所示：

表4菊芋糖浆与谷物原料水解糖浆等混合丁二酸发酵结果(厌氧瓶分批发酵)

混合糖浆及配比(以糖浆总还原糖计g/g)		残还原糖(g/L)	丁二酸(g/L)	乙酸等杂酸(g/L)	丁二酸产率(％)	糖利用率(％)
							菊芋糖浆/玉米糖浆	10/50	6.20	42.23	7.25	78.5	89.7
30/30	2.40	45.68	7.60	79.3	96.0
						50/10		4.00	45.12	8.02	80.6	93.3
菊芋糖浆/秸秆糖浆	10/50	10.20	39.02	6.52	78.4								83.0
						30/30	5.80	43.54	7.62	80.3	90.3
	50/10	2.10	46.08	7.86	79.6							96.5
						菊芋糖浆/废糖蜜	10/50	6.42	42.61	7.85	79.5		89.3
30/30	4.21	44.52	7.91	79.8	93.0
							50/10	3.15	45.11	8.14	79.3	94.8

由表4可以看出，以初始还原糖浓度为60g/L时，以任意配比的混合糖浆都能很好进行丁二酸发酵，一般水平都达到39.02-46.08g/L，丁二酸对消耗糖产率为78.4％-80.6％，糖利用率83.0％-96.5％。

实施例5

酸水解菊芋鲜块根糖浆分批发酵生产丁二酸(5L搅拌罐)

按实施例2方法，使用稀酸水解的菊芋鲜块根水解糖浆，初始还原糖浓度为55.5g/L，在5L搅拌发酵罐(New Brunswich 110，New BrunswickScientific，Edison，NJ，USA，使用两组圆盘六平直叶涡轮搅拌浆)中进行分批发酵。接种量5％，发酵温度37℃，搅拌转速200转数/分钟，通气为100％CO₂。实验结果如表5所示：

表5菊芋鲜块茎酸水解糖浆分批发酵生产丁二酸结果(5L搅拌罐)

发酵时间(小时)	残还原糖(g/L)	丁二酸(g/L)	乙酸(g/L)	甲酸(g/L)
					0	55.45	0.85	1.11	0.71
4	44.68	6.55	3.47	1.35
					8	34.91	15.66	4.52	1.64
12	31.39	19.27	5.02	1.87
					16	30.17	20.98	5.07	2.24
20	23.18	27.39	5.92	0
					24	18.03	32.01	6.43	0
28	12.46	35.91	6.72	0
					32	8.75	39.39	7.00	0
36	5.89	42.21	7.25	0
					40	3.76	46.25	7.24	0
48	1.66	50.22	8.23	0

5L搅拌罐分批发酵，48小时总投入酸水解菊芋糖浆按最终体积计还原糖浓度为55.45g/L，发酵剩余还原糖浓度为1.66g/L，产丁二酸50.22g/L，对消耗糖产率93.4％，糖利用率97.0％，生产强度1.05g/(L·小时)。

实施例6

菊芋鲜块根酶水解糖浆分批发酵生产丁二酸

按实施例5方法，使用实施例1制备的菊粉酶水解的菊芋鲜块根水解糖浆，初始还原糖浓度为55.38g/L，在5L搅拌发酵罐(New Brunswich 110，New Brunswick Scientific，Edison，NJ，USA，使用两组圆盘六平直叶涡轮搅拌浆)中进行分批发酵。接种量5％，发酵温度37℃，搅拌转速200转数/分钟，通气为100％CO₂。实验结果如表6所示：

表6菊粉酶水解菊芋鲜块根糖浆分批发酵生产丁二酸结果(5L搅拌罐)

发酵时间(小时)	残还原糖(g/L)	丁二酸(g/L)	乙酸(g/L)	甲酸(g/L)
					0	55.38	0.69	0.21	0
4	43.01	7.98	4.37	5.95
					8	39.54	10.05	5.20	2.53
12	35.17	13.81	5.43	1.69
					16	31.95	17.70	5.77	1.42
20	23.27	23.26	6.79	0.50
					24	18.1	28.04	7.40	0
28	12.04	33.70	7.73	0
					32	8.9	36.97	7.94	0
36	5.01	35.92	7.03	0
					40	4.45	40.47	7.99	0
48	3.32	40.52	8.09	0

5L搅拌罐分批发酵，48小时总投入菊粉酶水解菊芋鲜块茎糖浆按最终体积计还原糖浓度为55.38g/L，发酵剩余还原糖浓度为3.32g/L，产丁二酸40.52g/L，对消耗糖产率77.8％，糖利用率94.0％，生产强度0.84g/(L·小时)。

实施例7

干菊芋粉的酶水解糖浆分批发酵生产丁二酸

按实施例5方法，使用实施例1制备的菊粉酶水解的干菊芋粉水解糖浆，初始还原糖浓度为53.5g/L，在5L搅拌发酵罐(New Brunswich 110，NewBrunswick Scientific，Edison，NJ，USA，使用两组圆盘六平直叶涡轮搅拌浆)中进行分批发酵。接种量5％，发酵温度37℃，搅拌转速200转数/分钟，通气为100％CO₂。实验结果如表7所示：

表7菊粉酶水解干菊芋粉糖浆分批发酵生产丁二酸结果(5L搅拌罐)

发酵时间(小时)	残还原糖(g/L)	丁二酸(g/L)	乙酸(g/L)	甲酸(g/L)
					0	53.46	0.00	0.20	0.00
6	44.21	7.77	2.49	5.95
					9	34.52	15.51	4.02	2.53
15	25.29	23.42	5.97	1.69
					20	17.05	31.77	7.60	1.42
24	11.91	35.44	7.60	0.50
					28	6.02	39.84	8.00	0.00
32	1.80	42.32	8.70	0.00
					36	0.52	43.81	8.80	0.00

5L搅拌罐分批发酵，36小时总投入菊粉酶水解干菊芋粉糖浆按最终体积计还原糖浓度为53.5g/L，发酵剩余还原糖浓度为0.52g/L，产丁二酸43.81g/L，对消耗糖产率82.7％，糖利用率99.0％，生产强度1.22g/(L·小时)。

实施例8

酶水解菊芋糖浆补料分批发酵生产丁二酸

按实施例5方法，使用实施例1制备的菊粉酶水解的菊芋鲜块根水解糖浆，在5L搅拌罐中进行补料分批发酵，初始还原糖浓度为55g/L，当发酵液残糖降为20g/L时，用蠕动泵以一定速度流加总还原糖浓度为200g/L的菊粉酶水解的菊芋糖浆溶液将发酵液中的糖浓度控制在20-30g/L。实验结果如表8所示：

表8酶水解菊芋鲜块茎糖浆补料分批发酵生产丁二酸结果(5L搅拌罐)

发酵时间(小时)	残还原糖(g/L)	丁二酸(g/L)	乙酸(g/L)	甲酸(g/L)
					0	55.05	1.67	0.05	8.69
8	38.17	12.95	3.91	2.19
					16	29.66	26.37	6.35	1.79
24	26.38	35.57	6.76	1.72
					32	22.85	47.44	7.84	1.64
40	15.43	53.14	9.53	1.42

发酵时间(小时)	残还原糖(g/L)	丁二酸(g/L)	乙酸(g/L)	甲酸(g/L)
					48	10.54	57.95	11.32	0
56	6.19	60.50	12.82	0
					72	5.54	61.81	13.29	0

5L搅拌罐补料分批发酵，72小时总投入玉米秸秆糖浆按最终体积计还原糖浓度为84.0g/L，发酵剩余还原糖浓度为5.54g/L，产丁二酸61.81g/L，对消耗糖产率78.8％，糖利用率93.4％，生产强度0.86g/(L·小时)。

实施例9

菊芋浆同步糖化(水解)发酵生产丁二酸

用菊芋粉或菊芋鲜块茎经打浆机制备的浆液，以其含总糖量(葡萄糖计)计算按发酵培养基配方配制培养液，在5L搅拌罐中，经消毒灭菌、冷却至40℃后，加入按实施例1制备的菊粉酶40U/g总糖，同时接入按实施例2制备的丁二酸发酵用种子液，接种量5％，按实施例5方法进行同步糖化(水解)发酵，初始总糖浓度为64.9g/L，发酵温度37℃，搅拌转速200转数/分钟，通气为100％CO₂。实验结果如表9所示：

表9菊芋原料同步糖化(水解)发酵生产丁二酸结果(5L搅拌罐)

发酵时间(小时)	残还原糖(g/L)	丁二酸(g/L)	乙酸(g/L)	甲酸(g/L)
					0	20.64	1.31	0.29	0
4	22.71	8.38	2.42	1.82
					8	22.36	13.95	3.81	2.41
12	21.20	19.55	4.32	2.21
					16	22.50	21.97	4.68	1.72
20	14.28	32.24	5.71	0.94
					24	12.75	37.85	6.43	0.36
28	13.32	40.13	6.81	0.59
					32	7.52	45.89	7.33	0
36	5.64	50.43	8.00	0
					40	5.92	54.01	8.30	0

发酵时间(小时)	残还原糖(g/L)	丁二酸(g/L)	乙酸(g/L)	甲酸(g/L)
					48	1.92	58.93	9.78	0

5L搅拌罐菊芋原料同步糖化(水解)发酵48小时，产丁二酸58.93g/L，对消耗糖产率[琥珀酸浓度/(初始总糖浓度-残还原糖浓度)]93.6％，糖利用率97.0％，生产强度1.23g/(L·小时)。

实施例10

菊芋浆分批补料同步糖化(水解)发酵生产丁二酸

按实施例9方法，在5L搅拌罐中进行菊芋浆同步糖化(水解)发酵的补料分批发酵，初始还原糖浓度为40g/L，当发酵液残糖降为10g/L左右时，用蠕动泵以一定速度流加总还原糖浓度为200g/L的菊粉酶水解的菊芋糖浆溶液将发酵液中的糖浓度控制在10-15g/L。实验结果如表10所示：

表10菊芋浆分批补料同步糖化(水解)发酵生产丁二酸结果(5L搅拌罐)

发酵时间(小时)	残还原糖(g/L)	丁二酸(g/L)	乙酸(g/L)	甲酸(g/L)
					0	8.46	1.01	0.07	0
4	27.14	4.91	2.48	1.91
					8	32.77	14.20	4.02	2.20
16	24.64	29.93	6.95	1.73
					24	18.62	42.7	8.17	2.20
32	17.97	51.5	9.26	1.31
					40	17.16	56.78	9.36	0
48	14.79	62.94	10.17	0
					56	11.71	65.04	10.72	0
64	10.92	67.81	11.83	0
					72	10.1	68.48	11.88	0

5L搅拌罐补料分批发酵，72小时总投入玉米秸秆糖浆按最终体积计还原糖浓度为82.8g/L，发酵剩余还原糖浓度为10.1g/L，产丁二酸68.48g/L，对消耗糖产率94.2％，糖利用率87.8％，生产强度0.95g/(L·小时)。

实施例11

菊芋水解糖浆发酵液提取丁二酸

按实施例9方法，发酵液含丁二酸58.93g/L，乙酸9.78g/L。将发酵液加热90℃以上30分钟，然后离心，去除菌体及培养基中的固形物，得到预处理发酵清液。取上述发酵清液1000ml(测定其含丁二酸65.05g/L)，在不断搅拌下，加40％CaCl₂溶液，50-80℃下进行钙化2-5小时，将滤饼丁二酸钙配成浓度30％左右的溶液，在60-80℃下，缓慢滴加25％硫酸进行酸解，过滤、并水洗滤饼硫酸钙，酸解滤液用0.1％-2％的活性炭，70-80℃，脱色30-60分钟，过滤得脱色滤清液于70-80℃，0.08-0.1MPa真空下浓缩后，置冰箱中冷却析出结晶，滤出湿晶于60-65℃烘箱干燥得到白色粗晶，干重46.33g，测其纯度含丁二酸98.05％，计算总提取收率69.8％。样品经HPLC检测为一单峰，证明无杂酸，红外光谱与标准品一致。

Claims

1.一种生产丁二酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)、将菊芋原料水解得到含果糖和葡萄糖的菊芋糖浆，所述菊芋原料为植物菊芋的块根；

2)、将1)中得到的菊芋糖浆经过或不经过提纯配制成培养基，以琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)CGMCC1593发酵来生产丁二酸，其中培养基中含有的菊芋糖浆初始还原糖浓度为55～80g/L，MgCl₂0.1～0.5g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 1～5g/L，NaH₂PO₄·2H₂O 1～5g/L；培养基的起始pH范围为5.5-7.5，培养温度为30-40℃，在厌氧条件下发酵30-60小时，所述厌氧发酵在充满CO₂或N₂的厌氧条件下进行。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植物菊芋包括利用边际土地种植的菊芋或野生的菊芋。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述的水解是酸水解或酶水解。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基还可以加入酵母膏10～20g/L，玉米浆10～20g/L。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述酸水解是经过无机酸或有机酸进行的水解；所述无机酸为稀硫酸或稀盐酸；所述酶水解采用的酶源是菊粉酶。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述培养基还包括其他碳水化合物原料的混合糖浆；所述碳水化合物原料是秸秆纤维素原料物质水解糖浆、制糖工业废糖蜜以任意配比混合制备的。

7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，步骤2)在发酵过程中，使用氨水或碳酸盐调节pH值，维持pH值在5.5-7.5的范围内。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法是将菊芋原料经酸水解或酶水解得到菊芋糖浆进行分批发酵或补料分批发酵生产丁二酸。

9.根据权利要求1-6或8中任一项所述的方法，其特征在于，步骤1)中的菊芋原料是采用稀硫酸水解处理，该步骤1)包括：将原料鲜菊芋块根洗净、切块、打浆，或干菊芋磨粉、调浆，按菊芋原料干物质质量的0.1％-2.0％(V/V)加入稀硫酸，室温或加热至30-60℃，搅拌1-10小时，然后用NaOH调节pH值至6.5。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中的菊芋原料采用酶水解处理，该步骤1)包括：将原料鲜菊芋块茎洗净、切块、打浆，或干菊芋磨粉、调浆，按原料总糖量每g加20-50U的菊粉酶，室温或加热至30-60℃，搅拌水解1-10小时，然后用NaOH调节pH值至5.5-7.5的范围。