CN101696429B - 富含半纤维素废弃农作物水解发酵产丁醇方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了富含半纤维素废弃农作物水解发酵产丁醇方法，本发明属于生物质发酵生产生物能源，为溶剂发酵生产提供一种以富含半纤维素生物质为原料，经过乙酸预处理水解发酵产丁醇方法。本发明技术方案：混和水解：富含半纤维素生物质的农作物废弃物与水反应混和液中添加乙酸，控制温度和时间进行水解、发酵。本发明应用乙酸做预处理水解半纤维素，水解液中乙酸能被发酵菌体利用，避免了例如硫酸水解含盐类过高，及后处理废物对环境不友好的缺点。
Description
技术领域
本发明属于生物质发酵生产生物能源，本发明涉及利用富含半纤维素的农业废弃物，以及制糖工业的压榨残渣废弃物，乙酸水解，梭菌发酵生产溶剂丙酮、丁醇和乙醇。
背景技术
丙酮丁醇的发酵历史可追溯到19世纪，是一战和二战中重要的无烟炸药丙酮的生产方法，随着石油工业的大发展，逐渐走向没落，发酵法生产于上世纪90年代基本被以石油化工技术的石化方法所取代。由于化石能源的不可再生性，以及日益紧迫的环境压力，使人们又一次看到了，发酵法生产溶剂的众多优点。但是，传统发酵方法都是以粮食为底物，这和当今人口问题和可持续发展方针相矛盾。而且，发酵底物占据丙酮丁醇发酵成本的大部份(60％以上)。随着科学技术的发展，农业废弃物以及各种有利用价值的生物质，逐渐成为粮食发酵的有力替代品，应用生物质生产可再生能源及溶剂，成为当今科学界一大热点。
甜高粱(sweet sorghum)已经是世界公认的能源植物之一。种子可食用或作为饲料，秸秆富含糖类，压榨后汁液可制糖，但是产生大量的富含半纤维素类的残渣类物质，目前利用甜高粱渣生产溶剂丁醇的还鲜有报道。甜玉米，是一种玉米的改良品种，主要用作鲜食，它的秸秆与甜高粱相似，也是富含糖类，压榨后，剩余残渣富含半纤维素。蔗渣是甘蔗制糖压榨后的产物，富含半纤维素，一般都作为饲料添加成分，但是大量集中产生的蔗渣，存在处理难题。玉米芯为玉米果实成熟后，脱粒后剩余部分，富含半纤维素，我国是玉米的生产大国，可利用资源极其丰富。
罗鹏发表在《林产化学与工业》杂志2006年第26卷第2期的文章《木质生物资源的水解》概括介绍了当前常用的半纤维素水解的方法包括酶水解、酸水解，其中酸水解主要为硫酸和硝酸水解，稀酸水解反应速度快，能够满足连续式水解工艺的要求。但稀酸水解不具有选择性，有降解产物糠醛形成，得率较低，一般为50％左右。对于连续式水解工艺，为使酸液能够快速渗透到物料内部，需要将物料进行粉碎处理。反应须在高温下进行，能耗高，成本高，对反应器具有腐蚀性。
庄军平在发表于2009年的《现代化工》第29卷第2期的论文《木质纤维素稀水解液脱毒研究进展》介绍稀酸水解作为一种广泛使用的木质纤维原料的预处理方法，已在生产中得到广泛应用，但由于木质纤维素经稀酸水解预处理后，水解液中会产生大量的对发酵有毒的物质如乙酸、糠醛、酚类物质等，从而影响进一步发酵。
李岩发表于2008年10月《现代化工》第28卷增刊(2)的文章《玉米秸秆稀酸水解与水解液发酵的实验研究》，文章报道了玉米秸秆的稀酸水解性能，考察了底物浓度、反应温度、反应时间、硫酸浓度和秸秆粒径对水解得率和木糖得率的影响。在硫酸浓度为110％、水解温度126℃、水解时间1h、底物浓度为50～80g/L情况下。所得水解液主要成分为木糖和葡萄糖，经处理后可直接用于微生物的发酵培养。
中国专利申请200810046776.1公开了利用甜高粱秸秆或/和甜玉米秸秆发酵生产丙酮、丁醇的方法，该方法生产步骤包括：甜高粱秸秆或/和甜玉米秸秆榨汁，汁液含糖量稀释到10％～6％；加入磷酸盐、钙盐、氮源和微量生长因子，在121℃以上灭菌，冷却到32℃～37℃，得发酵培养基；将丙酮-丁醇生产菌株，接种于玉米培养基中，在100℃下热激活，在37℃下厌氧培养，得种子液；按发酵培养基体积比2％～5％将种子液接入发酵培养基中，32℃～37℃厌氧发酵，发酵采用分批发酵或者连续发酵，得丙酮和丁醇发酵液；检测丙酮、丁醇含量。本发明的特点：一是合理利用秸秆。二是可利用含糖量较低的不同地区、不同季节栽培的不同品种甜高粱秸秆和甜玉米秸秆。解决了大规模发酵生产鲜秸秆不好保藏的问题。
中国专利申请200810035792.0公开了一种提高薯类原料发酵生产丙酮、丁醇、乙醇的产率的方法。本发明涉及一种提高薯类原料发酵生产丙酮、丁醇、乙醇的产率的方法。其特点在于：向所述薯类原料中补充氮源。解决现在因薯类原料无法被ABE梭菌有效利用，导致薯类原料发酵生产丙酮、丁醇、乙醇的产量低、成本高的问题。公开号为JP58031993(A)的日本专利申请公开了一种生产丁醇的方法和所用菌种。采用纤维素作为培养基碳源发酵生产丁醇。该菌种具有吸收利用纤维素的特性。现有技术在纤维素水解发酵生产丁醇工艺，都采用硫酸等进行水解，从而造成后期环保处理问题。
发明内容
本发明解决的问题是，为溶剂发酵生产提供一种以富含半纤维素生物质为原料，经过乙酸水解发酵产丁醇方法。
本发明技术方案概述如下：
混和水解：在富含半纤维素生物质的农作物废弃物与水的重量份数比例(简称固液比例)为1∶(1-10)；在反应混和液中添加乙酸，乙酸的添加量为2克/L-10克/L(乙酸添加量以反应混和液中水的添加量为基准)；控制温度在100-200℃、水解时间在5-60分钟进行水解。
发酵：向水解液中无菌加入矿物盐及微量生长因子，用氨水调节pH值到5-6，30-40℃下接入培养好的菌种，发酵3-6天。
所述水解液中可溶性糖类物质蔗糖、葡萄糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、糠醛、5羟甲基糠醛等作为发酵培养基碳源；以加入的氨水作为氮源；
所述菌种种子液添加量为水解液体积的2％-8％。
所述水解液中加入的矿物盐为磷酸二氢钾与磷酸氢二钾，所述磷酸二氢钾与磷酸氢二钾在水解液中添加量各为0.1％。
所述微量生长因子为氨基苯甲酸和生物素，加入量各为2ppm/L。
在水解过程中，通过水解温度和时间严格控制水解溶液中乙酸总量在15克/L以下、呋喃糖总量(糠醛和5羟甲基糠醛)在5克/L以下，使水解总糖浓度达到或接近45克/L。
所述富含半纤维素的废弃农作物包括甜高粱渣、甜玉米、甜玉米渣、蔗渣及玉米芯，均为榨汁后及脱粒后的废弃物，品种与种类不限，新鲜的或干燥后储存的不限。
所述富含半纤维素生物质的农作物废弃物与水的重量分数比例(简称固液比例)为1∶(5-10)。
发酵过程中通过监测溶剂含量(流加发酵监测产量，以丁醇不再增加为终点)决定发酵终点。
所述菌种如下，糖丁酸梭菌类(Clostridium saccharoacetobutylicum)，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，CICC8008菌株，丙酮丁醇梭菌类(Clostridium acetobutylicum)美国标准生物品收藏中心ATCC824菌株，拜氏梭菌类(Clostridium beijerinckii)英国食品工业与海洋细菌菌种保藏中心，NCIMB8052菌株)。
本发明的具体过程如下：
1、原料的收集处理
对农作物废弃物进行机械粉碎，到5厘米颗粒或长度以下，水的加入比例，以绝干(取样后105℃烘干过夜)生物质质量为参考依据，固液比例为1∶1-1∶10。乙酸添加量为2克/L-10克/L(乙酸添加量以反应混和液中水的添加量为基准)；
2、水解
将步骤1各物质装入带有冷却装置的高压反应釜或耐压发酵罐，控制温度100-200℃，水解时间5-60分钟，对富含半纤维素生物质进行水解，以水解液中溶出乙酸和投入乙酸的总量不超过15克/L，呋喃糖总量不超过5克/L，总糖浓度达到或接近45克/L，为目的优化调整水解条件。
3、培养基配制
将步骤2中水解液固液分离，采用离心、静置沉淀、过滤或抽滤等方法进行离心，水解液无菌加入氨水作为氮源同时调节pH到5-6之间；以磷酸二氢钾与磷酸氢二钾各自0.1％作为磷元素提供体；以对氨基苯甲酸和生物素作为微量元素加入量均为2ppm/L；可作为培养基进行连续或批次发酵使用。也可不分离固液在一起作为批次发酵培养基使用。
4、接种发酵
将步骤3中配制好的培养基，无菌操作接入已经活化的发酵菌种(体积比为2％-8％)，维持发酵温度30-40℃开始发酵，定时取样分析溶剂含量，及底物糖的含量变化，以丁醇浓度含量最大为发酵终点作为发酵结束的判断。
本发明中分别检测乙酸、水解糖类、丙酮、丁醇、乙醇含量，其检测设备和方法如下：
乙酸、丙酮、丁醇、乙醇含量测定，采用北京市生物加工过程重点实验室，气相分析室岛津GC2010气相色谱仪，岛津玻璃填充柱填料为Porapak Q80-100目，采用外标法定性定量分析。
水解液及发酵液中各种糖类物质，采用北京市生物加工过程重点实验室，液相分析室，岛津LC-20A液相色谱仪，紫外及视差检测器分析，应用Bio-rad公司HPX-87P与HPX-87H色谱柱，采用外标法分析。
本发明中水解装置及发酵装置均为密闭耐压容器及设备，发酵可采用水解液分批和连续发酵及水解液连同固体残渣批次发酵。
1.菌种活化和保藏培养基，使用梭菌强化培养基(见微生物培养手册Handbook on clostridia作者Peter Dürre 2005年出版出版商Taylor&.Francis(具体出版单位，作者，出版时间))，一级种子和二级种子均使用水解糖液培养基(见生产步骤3)。
有益效果：
1、针对制糖榨汁后含水量较大的富含半纤维素残渣，及高半纤维素含量的农业废弃物，生产溶剂丙酮丁醇乙醇(ABE)进行发酵。
2、应用乙酸做预处理水解半纤维素，水解液中乙酸能被发酵菌体利用，避免了例如硫酸水解含盐类过高，及后处理废物对环境不友好的缺点。
3、控制水解工艺中乙酸添加量及反应温度和时间，灵活控制水解液中各种有利及有害成分的水解程度，使水解液更加适合发酵工艺。
4.水解液直接无菌加入矿物盐和生长因子后，应用氨水调节pH值，接种即可直接发酵，相比其它文献报道方法更方便简洁，而且对环境友好，没有毒、害物质及盐类物质产生及排放。
5.本发明使用的菌种为Clostridium acetobutylicum ATCC824等菌种为高耐乙酸高产丁醇的菌种，能够耐受15克/升乙酸发酵生产12克/升以上丁醇。应用此菌种能够最大限度的利用转化乙酸，不但减少糖的用量而且由于利用乙酸，糖对溶剂的转化率显著提高。
具体实施方式
实施例一
应用甜高粱渣乙酸水解，发酵水解液生产溶剂丙酮丁醇乙醇(ABE)。
生产步骤包括：
1、原料的收集处理
对于榨汁后的甜高粱渣、甜玉米渣、蔗渣以及玉米芯，机械粉碎到5厘米颗粒或长度以下，以绝干(取样后105℃烘干过夜)生物质质量为参考依据，固液比例在1∶5，单位是kg/L；乙酸添加量2克/L(乙酸添加量以反应混和液中水的添加量为基准)。
2、水解
将步骤1各物质装入带有冷却装置的高压反应釜，采用温度170℃和反应水解停留保温时间10分钟，对富含半纤维素生物质进行水解，水解液中溶出乙酸和投入乙酸总量为15克/L，呋喃糖总量为4克/L，总糖浓度达到或接近45克/L。
3、培养基配制
将步骤2中水解液固液分离，水解液无菌加入氨水作为氮源同时调节pH到5；以磷酸二氢钾与磷酸氢二钾各自0.1％作为磷元素提供体添加；以对氨基苯甲酸和生物素作为微量元素加入量均为2ppm/L。
4、接种发酵
将步骤3中配制好的培养基转入发酵罐中，无菌操作接入已经活化的发酵菌种培养液，体积比为2％，维持发酵温度37℃开始发酵，定时取样分析溶剂含量，及底物糖的含量变化，经过6天完全发酵后，产生丁醇8.5克/升，丙酮4.2克/升乙醇1.1克/升，总溶剂在15克/升左右。菌种采用ATCC824菌株。
乙酸、丙酮、丁醇、乙醇含量测定：采用北京市生物加工过程重点实验室，气相分析室岛津GC2010气相色谱仪，岛津玻璃填充柱填料为Porapak Q80-100目，采用外标法定性定量分析。
水解液及发酵液中各种糖类物质，采用北京市生物加工过程重点实验室，液相分析室，岛津LC-20A液相色谱仪，紫外及视差检测器分析，应用Bio-rad公司HPX-87P与HPX-87H色谱柱，采用外标法分析。
经过上述步骤水解后，每批的水解总糖是有出入的，但大致总糖在40——50克/升范围内，水解糖的组成成分为蔗糖、葡萄糖、果糖、木糖及少量阿拉伯糖分别含量为蔗糖3-5克/升，葡萄糖15-25克/升，果糖10-15克/升，木糖7-10克/升，阿拉伯糖3克/升以下，并且产生糠醛与羟甲基糠醛(这两个东西是由葡萄糖和木糖高温转变来的)，我们的这个工艺就是通过温度和反应时间控制这两种物质的产生量在3克/升以下。半纤维素的水解率在75％以上(甜高粱的半纤维素含量在45％左右)，温度提高能达到100％但抑制物就会成倍的产生(硫酸半纤维素100％水解，但是硫酸水解产生过多的其它抑制成分，就是因为水解的太彻底了)。
发酵的过程培养基的配制，我们优化出一种发酵最小配方培养基分别是：MgSO40.2克/升，MnSO40.01克/升，FeSO40.01克/升，KH2PO41克/升，K2HPO41克/升，对氨基苯甲酸0.001克/升，生物素0.00001克/升。培养基的糖类由水解液提供，用氨水调节pH到6.8既可接种发酵。种子配方如上述，把水解液换成葡萄糖即成为种子配方。一般菌种都保藏为孢子形式，接种需要热激活，即接种后80度热水烫3-5分钟迅速冷却到室温然后37度培养。
经过转接种子到水解液中发酵。
实施例子2基本过程同例1
1、原料的收集处理
对于玉米芯，进行机械粉碎，到5厘米颗粒或长度以下，以绝干(取样后105℃烘干过夜)生物质质量为参考依据，固液比例在1∶6。乙酸添加量2克/L。
2、水解
将步骤1各物质装入带有冷却装置的耐压发酵罐，采用温度150℃和反应水解停留保温时间20分钟，对富含半纤维素生物质进行水解，水解液中溶出乙酸和投入乙酸总量为14克/L，呋喃糖总量为3克/L，总糖浓度达到或接近50克/L。
5、培养基配制
将步骤2中水解液固液分离，水解液无菌加入氨水作为氮源同时调节pH到6.0；以磷酸二氢钾与磷酸氢二钾各自0.1％作为磷元素提供体添加；以对氨基苯甲酸和生物素作为微量元素加入量均为2ppm/L。
6、接种发酵
将步骤3中配制好的培养基，无菌操作接入已经活化的发酵菌种，体积比为4％，维持发酵温度35℃开始发酵，定时取样分析溶剂含量，及底物糖的含量变化，经过4天完全发酵后，产生丁醇7.5克/升，丙酮5.2克/升乙醇1.1克/升，总溶剂在14克/升左右。菌种采用CICC8008菌株。
例3基本过程同例1
1、原料的收集处理
对于甜玉米渣，进行机械粉碎，到5厘米颗粒或长度以下，以绝干(取样后105℃烘干过夜)生物质质量为参考依据，固液比例在1∶8。乙酸添加量5克/L加入比例。
2、水解
将步骤1各物质装入带有冷却装置的高压反应釜，采用温度150℃和反应水解停留保温时间60分钟，对富含半纤维素生物质进行水解，水解液中溶出乙酸和投入乙酸总量为13克/L，呋喃糖总量为3.5克/L，总糖浓度达到或接近45克/L。
7、培养基配制
将步骤2中水解液固液分离，水解液无菌加入氨水作为氮源同时调节pH到5.5；以磷酸二氢钾与磷酸氢二钾各自0.1％作为磷元素提供体添加；以对氨基苯甲酸和生物素作为微量元素加入量均为2ppm/L。
8、接种发酵
将步骤3中配制好的培养基，无菌操作接入已经活化的发酵菌种，体积比为5％，维持发酵温度40℃开始发酵，定时取样分析溶剂含量，及底物糖的含量变化，经过6天完全发酵后，产生丁醇9.5克/升，丙酮3.2克/升乙醇1.1克/升，总溶剂在15克/升左右。菌种采用NCIMB 8052。
例4基本过程同例1
1、原料的收集处理
对于甘蔗渣，进行机械粉碎，到3厘米颗粒或长度以下，以绝干(取样后105℃烘干过夜)生物质质量为参考依据，固液比例在1∶10。乙酸添加量10克/L加入比例，
2、水解
将步骤1各物质装入带有冷却装置的高压反应釜或耐压发酵罐，采用温度200℃和反应水解停留保温时间10分钟，对富含半纤维素生物质进行水解，水解液中溶出乙酸和投入乙酸总量为14克/L，呋喃糖总量为3.5克/L，总糖浓度达到或接近48克/L。
3.培养基配制
将步骤2中水解液固液分离，水解液无菌加入氨水作为氮源同时调节pH到6；以磷酸二氢钾与磷酸氢二钾各自0.1％作为磷元素提供体添加；以对氨基苯甲酸和生物素作为微量元素加入量均为2ppm/L。
4.接种发酵
将步骤3中配制好的培养基，无菌操作接入已经活化的发酵菌种，体积比为8％，维持发酵温度36℃开始发酵，定时取样分析溶剂含量，及底物糖的含量变化，经过4天完全发酵后，产生丁醇9克/升，丙酮3.5克/升乙醇1.5克/升，总溶剂在14克/升左右。菌种采用ATCC824菌株。
例5基本过程同例1
1、原料的收集处理
对于甜玉米，进行机械粉碎，以绝干(取样后105℃烘干过夜)生物质质量为参考依据，固液比例在1∶9。乙酸添加量为10克/L加入比例，
2、水解
将步骤1各物质装入带有冷却装置的高压反应釜或耐压发酵罐，采用温度200℃和反应水解停留保温时间10分钟，对富含半纤维素生物质进行水解，水解液中溶出乙酸和投入乙酸总量为14克/L，呋喃糖总量为3.5克/L，总糖浓度达到或接近48克/L。
3.培养基配制
将步骤2中水解液固液分离，水解液无菌加入氨水作为氮源同时调节pH到6；以磷酸二氢钾与磷酸氢二钾各自0.1％作为磷元素提供体添加；以对氨基苯甲酸和生物素作为微量元素加入量均为2ppm/L。
4.接种发酵
将步骤3中配制好的培养基，无菌操作接入已经活化的发酵菌种，体积比为8％，维持发酵温度36℃开始发酵，定时取样分析溶剂含量，及底物糖的含量变化，经过4天完全发酵后，产生丁醇9克/升，丙酮3.5克/升乙醇1.5克/升，总溶剂在14克/升左右。菌种采用ATCC824菌株。
Claims (4)
1.一种利用富含半纤维素的废弃农作物水解发酵产丁醇的方法，包括混合水解步骤和发酵步骤，其特征在于：
1)所述混和水解步骤中，富含半纤维素生物质的农作物废弃物与水的重量分数比例为1∶(1-10)；在反应混和液中添加2克/L-10克/L乙酸，控制温度在100-200℃、水解时间在5-60分钟，使得水解溶液中乙酸总量在15克/L以下，呋喃糖总量在5克/L以下，水解总糖浓度达到或接近45克/L；
2)所述发酵步骤中，水解液中无菌加入0.1％的磷酸二氢钾和0.1％的磷酸氢二钾，加入2ppm/L的氨基苯甲酸和2ppm/L的生物素，用氨水调节pH值到5-6，30-40℃下接入培养好的糖丁酸梭菌(Clostridium saccharoacetobutylicum)CICC8008、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)ATCC824或拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)NCIMB 8052的种子液，发酵3-6天。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于乙酸的添加量为2克/L、5克/L或10克/L。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述富含半纤维素的农作物包括甜高粱秸秆渣、甜玉米秸秆渣、蔗渣及玉米芯。
4.根据权利要求1所述的富含半纤维素废弃农作物水解发酵产丁醇方法，其特征在于所述所述富含半纤维素生物质的农作物废弃物与水的重量分数比例为1∶5-10。
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