CN111440830A - 一种玉米芯水解液发酵生产木糖醇的方法 - Google Patents

一种玉米芯水解液发酵生产木糖醇的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种玉米芯水解液发酵生产木糖醇的方法包括以下步骤：(1)获取未经离子交换的玉米芯半纤维素水解液，中和至pH不大于5.5，然后过滤除杂；(2)将步骤(1)处理后的玉米芯半纤维素水解液灭菌，灭菌温度100～105℃，灭菌时间30～40min；(3)将步骤(2)灭菌后的玉米芯半纤维素水解液与发酵培养基和发酵菌株混匀后进行发酵。本发明研究发现，使用灭菌温度100～105℃进行灭菌取代常用的115℃灭菌，能够大大降低灭菌过程中木糖的损失，并且经验证并没有微生物残留，不会影响发酵使用菌种的生长，提高生物法发酵玉米芯水解液生产木糖醇时的得率。

Description

一种玉米芯水解液发酵生产木糖醇的方法
技术领域
本发明涉及生物发酵技术领域，特别是涉及一种玉米芯水解液发酵生产木糖醇的方法。
背景技术
化学加氢法生产木糖醇要求较高纯度的木糖液(木糖纯度95％以上)，首先是因为若木糖液中有很多杂质，容易导致加氢过程的镍催化剂中毒并很快失去活性。同时，化学还原的选择性差，而半纤维素水解液中含有多种杂糖，其在化学催化加氢时也会被还原成相应的多元醇。由于多元醇的溶解性远好于其相应的糖类，故将木糖醇从多元醇混合物中分离的难度远大于将木糖从混合糖中分离的难度，需要用到模拟移动床等复杂分离技术。化学加氢法需要在氢化前对木糖水解液进行多步的纯化处理，大幅提高了木糖醇的生产成本。氢化步骤还要求高温(80～140℃)和高压(50atm)条件，镍催化剂又会污染环境。由于化学加氢法存在以上问题，并由于生物转化法能够直接转化半纤维素水解液中的木糖、而不需要使用纯木糖作为底物，且在温和条件下进行，因此生物转化法近年来已越来越多地受到国内外研究人员的关注。
半纤维素稀硫酸水解液中主要含有乙酸、糠醛、5-羟甲基糠醛、酚类、硫酸根离子、色素、木素、果胶等毒性物质，它们可以抑制菌体细胞的生长，对菌株发酵生产木糖醇造成不利影响。目前，工业上普遍采用离子色谱法对半纤维素水解液脱毒，此过程不但耗时，增加成本，而且产生大量废水，污染环境，需开发简便高效地脱毒方法进行替代。
目前常用的方法是采用石灰中和，因为石灰中和过程中，石灰和硫酸反应生成硫酸钙，硫酸钙在一定条件下以胶体形式存在，可以吸附水解液中部分抑制物，如乙酸、糠醛、果胶、色素等。但石灰中和的水解液直接采用常用的115℃，30min的方法灭菌会导致木糖损失率超过30％，因此，需对水解液灭菌条件及灭菌前的预处理条件进行研究，从而最大限度地减少木糖损失。
申请人在申请号为201910989216.8的发明专利申请中公开了通过将大肠杆菌的环腺苷酸受体蛋白(CRP)112位氨基酸I突变为L、127位T突变为G、144位A突变为T获得CRPG菌株，与ptsG基因敲除的ΔptsG方案组合应用于生产木糖醇的大肠杆菌，构建的木糖醇生产菌株IS5-5G彻底消除CCR效应，大幅提高木糖醇浓度和生产效率，同时提高其对水解液原料中毒物和抑制因子的耐受性，能够高效地利用石灰中和的玉米芯水解液发酵生产木糖醇。
发明内容
本发明针对现有技术中使用生物法制备木糖醇时，水解液使用常规方法进行灭菌过程中木糖损失过大的问题，提供了一种改进的玉米芯水解液发酵生产木糖醇的方法。
一种玉米芯水解液发酵生产木糖醇的方法，包括以下步骤：
(1)获取未经离子交换的玉米芯半纤维素水解液，中和至pH不大于5.5，然后过滤除杂；
(2)将步骤(1)处理后的玉米芯半纤维素水解液灭菌，灭菌温度100～105℃，灭菌时间30～40min；
(3)将步骤(2)灭菌后的玉米芯半纤维素水解液与发酵培养基和发酵菌株混匀后进行发酵。
优选的，步骤(1)中使用石灰中和，中和至pH不大于3.5。更优选的，步骤(1)中使用石灰中和，中和至pH为3.5。本申请研究发现，石灰中和后的水解液pH值不超过3.5，中和过程中没有木糖损失，浓缩过程和灭菌过程总的木糖损失率为4.4％。总体上，木糖损失率随pH值升高而增大。根据实验结果，石灰中和后的水解液pH值为3.5的情况下，浓缩后pH值将下降到3.0左右。考虑到后期水解液上罐发酵需要，若pH太低(如2.5或更低)，上罐发酵过程将用到大量氨水调节发酵液pH，对菌体生长和木糖醇的生产造成不利影响。因此，确定最佳的石灰中和后的水解液pH值为3.5。
优选的，步骤(2)中灭菌温度100℃，灭菌时间30min。本申请经研究发现，115℃灭菌木糖损失率为3.3％，121℃灭菌木糖损失率为9.5％。100℃灭菌0.5h，灭菌过程的木糖损失率为0.9％，石灰中和、浓缩和灭菌过程总的木糖损失率不超过2％。并且，对100℃灭菌的水解液，经过10次的无抗LB固体平板划线，以及10次的液体LB培养基过夜培养，未发现有菌体生长，表明本研究中100℃，0.5h可以将浓缩水解液彻底灭菌。因此，确定最佳的水解液灭菌条件为100℃，0.5h。当然，灭菌时间可以适当的延长，比如延长到40min。
优选的，步骤(2)灭菌前先将玉米芯半纤维素水解液浓缩，浓缩至木糖浓度500～600g/L。更优选的，浓缩至木糖浓度550g/L。
更优选的，浓缩前后均进行过滤。本申请研究发现，真空浓缩前后都必须对水解液进行过滤，否则浓缩过程和灭菌过程的木糖损失均超过4％。
更优选的，步骤(3)发酵时，灭菌后的玉米芯半纤维素水解液占总体积的25％。
优选的，发酵培养基的成分为：葡萄糖10g/L，玉米浆干粉24g/L，NaCl0.5g/L，KH2PO4 3g/L，Na2HPO4·12H2O 9g/L，NH4Cl 1g/L。
优选的，发酵菌株为申请号201910989216.8的发明专利申请中的大肠杆菌菌株IS5-5G。
本发明研究发现，使用灭菌温度100～105℃进行灭菌取代常用的115℃灭菌，能够大大降低灭菌过程中木糖的损失，并且经验证并没有微生物残留，不会影响发酵使用菌种的生长，提高生物法发酵玉米芯水解液生产木糖醇时的得率。
附图说明
图1为大肠杆菌IS5-5G菌株15L罐发酵生产木糖醇的典型过程图。
具体实施方式
作为原料的玉米棒芯水解液来自浙江华康药业，未经离子交换，初始pH1.42，木糖浓度55g/L。
实施例1
水解液pH值对中和、浓缩及115℃灭菌过程中木糖损失率的影响。
由生产厂家获得的玉米芯水解液的初始pH为1.42左右(大肠杆菌的最适生长pH为7.2～7.6左右)，且其中含有毒性物质，目前一般采用石灰中和。中和后的水解液需过滤、浓缩、灭菌后，进行发酵。
1.用Ca(OH)2水溶液对水解液进行中和
将1.5L的水解液倒入2L的三口烧瓶中，于75℃、250rpm电动搅拌的条件下缓慢加入Ca(OH)2水溶液，采用pH计即时测定水解液的pH，将水解液中和至不同的pH(2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5)。用HPLC分析中和前后水解液中的木糖浓度，计算中和过程中木糖的损失率，考察中和至不同的pH对水解液中和过程中木糖损失率的影响。
中和后的水解液采用定性滤纸趁热过滤，倒入2L的旋蒸瓶，60℃真空浓缩至十分之一体积，浓缩后的水解液用定性滤纸趁热过滤。用HPLC分析浓缩前后水解液中的木糖浓度，计算浓缩过程中木糖的损失率，考察上述不同pH对水解液浓缩过程中木糖损失率的影响。
浓缩后的水解液，采用高压灭菌锅115℃灭菌0.5h。用HPLC分析灭菌前后水解液中的木糖浓度，计算灭菌过程中木糖的损失率，考察上述不同pH对水解液灭菌过程中木糖损失率的影响。
由表1可知，石灰中和后的水解液pH值不超过3.5，中和过程中没有木糖损失，浓缩过程和灭菌过程总的木糖损失率为4.4％。总体上，木糖损失率随pH值升高而增大。根据实验结果，石灰中和后的水解液pH值为3.5的情况下，浓缩后pH值将下降到3.0左右。考虑到后期水解液上罐发酵需要，若pH太低(如2.5或更低)，上罐发酵过程将用到大量氨水调节发酵液pH，对菌体生长和木糖醇的生产造成不利影响。因此，确定最佳的石灰中和后的水解液pH值为3.5。
表1不同pH对中和、浓缩及115℃灭菌过程木糖损失的影响
pH 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5
中和后木糖损失％ 0 0 0 0.8±0.1 1.2±0.1 2.0±0.2 3.0±0.2
浓缩木糖损失％ 0 0 1.1±0.1 2.9±0.2 4.1±0.3 8.2±0.6 10.2±0.6
灭菌木糖损失％ 0 1.4±0.1 3.3±0.2 3.8±0.2 4.7±0.3 12.4±0.9 21.8±1.4
实施例2
灭菌温度对木糖损失率的影响。
在实施例1确定石灰中和后的水解液pH值为3.5的条件下，考察灭菌温度对木糖损失率的影响，实验步骤同实施例1。
灭菌温度对木糖损失率的影响如表2所示。115℃灭菌木糖损失率为3.3％，121℃灭菌木糖损失率为9.5％。100℃灭菌0.5h，灭菌过程的木糖损失率为0.9％，石灰中和、浓缩和灭菌过程总的木糖损失率不超过2％。并且，对100℃灭菌的水解液，经过10次的无抗LB固体平板划线，以及10次的液体LB培养基过夜培养，未发现有菌体生长，表明本研究中100℃，0.5h可以将浓缩水解液彻底灭菌。因此，确定最佳的水解液灭菌条件为100℃，0.5h。
表2不同的灭菌温度对水解液木糖损失率的影响
灭菌温度(℃) 100 105 110 115 121
木糖损失率％ 0.9±0.1 1.3±0.1 1.8±0.2 3.3±0.2 9.5±0.5
实施例3
真空浓缩前后过滤对木糖损失率的影响。
在上述实验确定中和后的水解液pH值为3.5，100℃灭菌0.5h的条件下，考察真空浓缩前后是否过滤对木糖损失率的影响，实验步骤同实施例1。
通过实验发现，真空浓缩前后都必须对水解液进行过滤，否则浓缩过程和灭菌过程的木糖损失均超过4％，相关数据如表3所示。
表3浓缩前后过滤对水解液木糖损失率的影响
是否过滤 是 否
浓缩木糖损失％ 1.1±0.1 4.3±0.3
灭菌木糖损失％ 0.9±0.1 4.8±0.3
实施例4
15-L罐发酵生产木糖醇实验
1.上罐发酵方法及步骤(1)原料及仪器
a)发酵原料：浙江华康药业提供的未经离子交换的玉米棒芯水解液(初始pH1.42，木糖浓度55g/L，用石灰中和至3.5后，定性滤纸过滤，60℃真空浓缩至十分之一体积，木糖，葡萄糖与阿拉伯糖浓度分别为：550g/L，35g/L与45g/L，定性滤纸过滤)；
b)LB平板固体培养基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10，琼脂粉2.0％(质量分数)；
一级种子培养基：LB培养基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10二级种子培养基(g/L)：酵母粉7.5，蛋白胨7.5，葡萄糖15，NaCl 10；
发酵培养基(g/L)：葡萄糖10，玉米浆干粉24，NaCl 0.5，KH2PO4 3，Na2HPO4·12H2O9，NH4Cl 1。葡萄糖单独灭菌。
c)实验仪器：
10L旋转蒸发仪；国强15-L机械搅拌通气式发酵罐；Agilent 1260HPLC；ELSD检测器；Bio-red HPX87C分析柱
(2)实验方法
a)半纤维素水解液的浓缩：采用真空减压浓缩原理，用旋转蒸发仪将水解液浓缩至木糖浓度大约为550g/L，备用。
b)菌株活化：发酵所用菌株采用申请号201910989216.8中的大肠杆菌菌株IS5-5G，取甘油管保藏菌株，于LB固体培养基平板划线，37℃培养～12h。
c)一级种子的制备：挑取LB平板上的单菌落，接入5mL LB培养基的试管，37℃，200rpm培养过夜。
d)二级种子的制备：吸取2mL菌液接种到含有300mL种子培养基的1L三角瓶中，37℃，200rpm培养10h，至OD600为5.0左右。
e)接种：在发酵罐中装入5.5L发酵培养基(除葡萄糖)，121℃灭菌30min，冷却至30℃，调节pH至7.0。采用火焰接种法接入发酵种子(约600mL)与灭好的葡萄糖溶液，此时罐中体积约为7L。
f)原料的制备：取浓缩好的半纤维素水解液。根据终体积为10L左右，量取2.5L水解液(木糖质量为1370g)，100℃灭菌30min，第一次补料木糖浓度75g/L，第二次补料木糖浓度76g/L。按木糖与葡萄糖质量比为1:0.6再称量一定量葡萄糖，溶解，115℃单独灭菌30min，备用。氮源的配制：称取160g玉米浆干粉两份，溶解，115℃灭菌30min。
g)补料：接种后，控制pH为7.0，温度为30℃。通气量为0.6vvm,初始转速为400rpm，初始溶氧设定为35，培养9h左右至OD大于18时补料。采用火焰接种法，加入配好的原料与氮源，葡萄糖采用流加补料。补料后控制pH为7.0，溶氧设定为25。
h)放罐：根据pH变化确定发酵终点，当pH上升、溶氧上升时，取样HPLC分析，若木糖醇浓度不再增加，则发酵停止。
3.糖和糖醇的液相检测方法
将所取的样品进行适当浓度的稀释后，使用0.22μm的过滤头进行过滤。利高效液相系统对木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖醇和阿拉伯糖醇进行定量检测。动相：超纯水，流速：0.6mL/min,柱温设定：76℃。
4.结果
IS5-5G菌株采用15-L罐分批补料进行发酵，利用未经离子交换的玉米棒芯半纤维素水解液，63h生产了136.7g/L的木糖醇，生产速率为1.75g/L，木糖醇对木糖的收率为1.0g/g，未检测到残余的葡萄糖、木糖、阿拉伯糖或其他残糖。发酵过程如图1所示。

Claims (9)

1.一种玉米芯水解液发酵生产木糖醇的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)获取未经离子交换的玉米芯半纤维素水解液，中和至pH不大于5.5，然后过滤除杂；
(2)将步骤(1)处理后的玉米芯半纤维素水解液灭菌，灭菌温度100～105℃，灭菌时间30～40min；
(3)将步骤(2)灭菌后的玉米芯半纤维素水解液与发酵培养基和发酵菌株混匀后进行发酵。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中使用石灰中和，中和至pH不大于3.5。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中使用石灰中和，中和至pH为3.5。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中灭菌温度100℃，灭菌时间30min。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)灭菌前先将玉米芯半纤维素水解液浓缩，浓缩至木糖浓度500～600g/L。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，浓缩前后均进行过滤。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)发酵时，灭菌后的玉米芯半纤维素水解液占总体积的25％。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵培养基的成分为：葡萄糖10g/L，玉米浆干粉24g/L，NaCl 0.5g/L，KH2PO4 3g/L，Na2HPO4·12H2O 9g/L，NH4Cl 1g/L。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵菌株为申请号201910989216.8的发明专利申请中的大肠杆菌菌株IS5-5G。
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