CN108884482B - 低聚木糖的制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了由包含木聚糖和纤维素的生物质制造低聚木糖的方法,该低聚木糖的制造方法简便,并且,通过抑制低聚木糖分解到木糖,从而低聚木糖的收量多。低聚木糖的制造方法中,通过在水解时至少具有木聚糖酶、纤维二糖水解酶和β‑葡糖苷酶的活性,并且实质上不具有β‑木糖苷酶的活性的纤维素酶组合物,来将包含木聚糖和纤维素的生物质进行水解。
Description
技术领域
本发明涉及由包含木聚糖和纤维素的生物质制造低聚木糖的方法。
背景技术
低聚木糖是通过β-糖苷键结合多个木糖单元而得的寡糖的总称。低聚木糖由于显示出优异的整肠作用等,因此也用作功能性食品用的素材(非专利文献1)。
低聚木糖可以通过将包含木聚糖和纤维素的生物质所包含的木聚糖进行水解来获得。作为水解的方法,已知进行水热处理的方法(非专利文献2)、进行酸水解的方法(非专利文献3)、使用木聚糖酶进行酶处理的方法(专利文献1)。
其中,如果用木聚糖酶将木聚糖进行水解,则能够选择性地制造低聚木糖,因此能够有效率地制造低聚木糖。然而,成为木聚糖酶的底物的木聚糖为半纤维素的主成分,在植物细胞中半纤维素与纤维素、木质素一起形成高级结构。因此,为了用木聚糖酶有效率地将木聚糖进行分解,需要将这些高级结构进行水解的其它工序。
此外,木聚糖酶由于作为微生物生产的纤维素酶组合物的一种酶成分而被生产,因此使用了木聚糖酶的酶的制造方法中,以木聚糖酶作为主成分的酶的制造成本成为课题。
非专利文献4中记载了,不从纤维素酶组合物分离纯化木聚糖酶而将包含木聚糖和纤维素的生物质水解,制造低聚木糖的方法。纤维素酶组合物中包含各种分解酶,因此可以同时进行将木聚糖向低聚木糖水解的反应、和包含木聚糖和纤维素的生物质所包含的高级结构的分解、从半纤维素向木聚糖的水解。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开2006-296224号公报
非专利文献
非专利文献1:Ayyappan AA等,Compre.Rev.Food.Sci.Food Saf.10, 2-16(2011)
非专利文献2:Patricia M等,Ind.Crops.Prod.62,460-465(2014)
非专利文献3:Ozlem A等,Carbohydr.Res.344,660-666(2009)
非专利文献4:Kumar R等,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.35, 377-391(2008)
发明内容
发明所要解决的课题
如上所述,通过使用了木聚糖酶的酶处理来制造低聚木糖的方法中,工序的复杂、木聚糖酶的成本存在课题。此外,非专利文献4所记载的方法虽然工序简单,酶的纯化成本也可以抑制得低,但制造的低聚木糖通过纤维素酶组合物所包含的水解酶而被分解直到木糖,存在低聚木糖的收量低这样的课题。
用于解决课题的方法
本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究,结果发现,本发明中,通过在对包含木聚糖和纤维素的生物质进行水解时至少具有木聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶的活性,并且实质上不具有β-木糖苷酶的活性的纤维素酶组合物,将包含木聚糖和纤维素的生物质的前处理物进行水解,能够同时进行从半纤维素向木聚糖的水解反应、和从木聚糖向低聚木糖的水解反应,同时,也能够抑制从低聚木糖向木糖的水解反应,可以有效率地生产低聚木糖,从而完成了本发明。
即,本发明具有以下[1]~[11]的构成。
(1)一种低聚木糖的制造方法,所述制造方法通过将包含木聚糖和纤维素的生物质利用纤维素酶组合物进行水解来制造低聚木糖,该纤维素酶组合物在对包含木聚糖和纤维素的生物质进行水解时,至少具有木聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶的活性,并且实质上不具有β-木糖苷酶的活性。
(2)根据(1)所述的低聚木糖的制造方法,上述纤维素酶组合物包含酶活性成分,该酶活性成分是通过将对包含上述木聚糖和纤维素的生物质至少具有木聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶活性和β-木糖苷酶活性的、木霉属真菌来源的纤维素酶混合物进行保温处理,从而使对上述生物质的β-葡糖苷酶和β-木糖苷酶的活性实质上失活而获得的。
(3)根据(2)所述的低聚木糖的制造方法,上述保温处理为将pH值调整为5.5~8.0的上述木霉属真菌来源的纤维素酶混合物在35℃~60℃下保温的处理。
(4)根据(1)~(3)中任一项所述的低聚木糖的制造方法,上述纤维素酶组合物的β-葡糖苷酶活性成分包含曲霉属真菌的β-葡糖苷酶活性成分。
(5)根据(1)~(4)中任一项所述的低聚木糖的制造方法,上述纤维素酶组合物的β-木糖苷酶的活性以分解4-硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷的酶活性计,相对于该纤维素酶组合物中的每1g蛋白质为50~500U/g。
(6)根据(1)~(5)中任一项所述的低聚木糖的制造方法,上述纤维素酶组合物的β-葡糖苷酶的活性以分解4-硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷的活性计,相对于该纤维素酶组合物中的每1g蛋白质为14,000U/g以上。
(7)根据(1)~(6)中任一项所述的低聚木糖的制造方法,上述水解时的 pH条件为pH值6.0~8.0。
(8)根据(1)~(7)中任一项所述的低聚木糖的制造方法,将前处理物利用上述纤维素酶组合物进行水解,上述前处理物是通过将包含木聚糖和纤维素的生物质进行碱处理而获得的。
(9)根据(1)~(8)中任一项所述的低聚木糖的制造方法,其还包含下述工序:使通过上述水解反应而获得的水解物进行固液分离,将所得的液体成分通过超滤膜进行过滤,从非透过侧回收纤维素酶组合物,从透过侧获得低聚木糖。
(10)一种纤维素酶组合物,其具有以下(a)~(d)的酶活性。
(a)木聚糖酶活性以分解木聚糖的酶活性计,相对于该纤维素酶组合物中的每1g蛋白质为14,000U/g以上,
(b)纤维二糖水解酶活性以分解4-硝基苯基-β-D-吡喃乳糖苷的酶活性计,相对于该纤维素酶组合物中的每1g蛋白质为50U/g以上,
(c)β-葡糖苷酶活性以分解4-硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷的酶活性计,相对于该纤维素酶组合物中的每1g蛋白质为14,000U/g以上,
(d)β-木糖苷酶活性以分解4-硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷的酶活性计,相对于该纤维素酶组合物中的每1g蛋白质为50~500U/g。
(11)根据(10)所述的纤维素酶组合物,上述(c)的β-葡糖苷酶活性成分包含曲霉属真菌的β-葡糖苷酶活性成分。
发明的效果
通过本发明,能够由包含木聚糖和纤维素的生物质的前处理物,通过简便的方法有效率地生产低聚木糖。
具体实施方式
本发明中使用的包含木聚糖和纤维素的生物质是至少包含作为低聚木糖的原料的木聚糖和纤维素的植物来源的生物质。
木聚糖是存在于植物的细胞壁的半纤维素的构成成分,是在β-糖苷键合的木糖的主链结合有各种糖的异糖。纤维素和半纤维素经由氢键、化学键通过高级结构来构成植物的细胞壁。纤维素是具有葡萄糖通过β-糖苷键而结合在直链上的结构的细胞壁的主成分。
含有木聚糖和纤维素的生物质只要是含有木聚糖和纤维素的植物来源的资源,就没有特别限定,除了种子植物、蕨类植物、苔藓植物、藻类、水草等植物以外,还可以使用废建材等。种子植物被分类为裸子植物和被子植物,但哪种都可以优选使用。被子植物进一步分类为单子叶植物和双子叶植物,作为单子叶植物的具体例,可举出甘蔗渣、柳枝稷、象草、蔗茅、玉米秸秆、玉米穗轴、稻秸、麦秸等,作为双子叶植物的具体例,优选使用甜菜浆、桉树、橡树、白桦等。在本发明中,优选为木聚糖和纤维素的分解性优异的甘蔗渣、玉米穗轴、玉米秸秆、稻秸、麦秸,最优选为甘蔗渣。这些生物质可以单独使用,也可以组合使用多种。
包含木聚糖和纤维素的生物质所包含的木聚糖含量相对于包含木聚糖和纤维素的生物质固体成分重量优选为5重量%以上,更优选为10重量%以上,进一步优选为20%重量以上。包含木聚糖和纤维素的生物质所包含的木聚糖含量通常为50重量%以下。
本发明中使用的前处理方法没有特别限定,具体而言,可以使用酸处理、硫酸处理、稀硫酸处理、碱处理、水热处理、亚临界处理、微粉碎处理、蒸煮处理等公知的方法。优选地,优选为前处理中的木聚糖的分解少的碱处理或水热处理,最优选为碱处理。
碱处理时可以使用氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氨。从便宜且易于处理这样的观点考虑,优选为氢氧化钠。作为碱处理条件,优选包含木聚糖和纤维素的生物质固体成分浓度在与碱水溶液混合的状态下设定为 0.1~50重量%、优选为1~20重量%、进一步优选为5~10重量%的范围。如果包含木聚糖和纤维素的生物质固体成分浓度小于1重量%,则水的使用量变得极多,经济上变得不利。另一方面,如果包含木聚糖和纤维素的生物质固体成分浓度超过20重量%,则包含木聚糖和纤维素的生物质不浸泡于碱溶液,不能充分获得前处理的效果。作为使用的碱添加量,在例如使用氢氧化钠水溶液的情况下,优选氢氧化钠的添加量在相对于包含木聚糖和纤维素的生物质的固体成分为0.1~100重量%,优选为1~50重量%,进一步优选为5~10重量%的范围添加。
包含木聚糖和纤维素的生物质的固体成分浓度可以以固体成分重量为基础调整。固体成分重量可以通过以下方法算出。
包含木聚糖和纤维素的生物质固体成分重量可以通过以下方法算出。量取包含木聚糖和纤维素的生物质Ag,在105℃下加热直到变为恒量Bg。此时,B/A成为包含木聚糖和纤维素的生物质的固体成分率,将使含水状态的包含木聚糖和纤维素的生物质重量乘以B/A而得的值作为固体成分重量。包含木聚糖和纤维素的生物质的前处理物的固体成分重量的测定也可以通过同样的方法进行。
如果添加的碱量小于1重量%,则通过纤维素酶组合物进行的水解不易进行,得不到充分的低聚木糖收量。另一方面,如果添加量超过50重量%,则除了碱量增大以外,利用纤维素酶组合物进行水解反应时的pH调整所使用的酸量增大,经济上变得不利。进行碱处理的温度优选为10~200 ℃,从水解中的糖收率的观点出发,进一步优选为25~120℃,特别优选为75~100℃。碱处理的时间可以根据碱量等来适当设定,通常为0.5小时~24小时左右。
前处理后的包含木聚糖和纤维素的生物质的前处理物可以直接用于利用本申请的纤维素酶组合物进行的水解反应,也可以在水解反应前进行固液分离。可以使用通过固液分离而获得的固体成分作为包含木聚糖和纤维素的生物质的前处理物。作为固液分离的方法,可以使用螺旋倾析器等离心分离法、加压/抽滤等过滤法、或微量过滤等膜过滤法等公知的方法。此外,也可以将包含木聚糖和纤维素的生物质的前处理物的固体成分在固液分离的前后通过纯水进行洗涤。通过进行洗涤,能够进一步减少木质素分解物等酶反应抑制物质,也能够减少水解反应时的pH调整所需的酸的量,因此优选。
在本发明中,低聚木糖是指具有木糖以2个以上~6个以下共价键合而成的结构,且木糖彼此通过β-糖苷键连接而成的寡糖。它们根据木糖数被称为木二糖(二糖)、木三糖(三糖)、木四糖(四糖)、木五糖(五糖)、木六糖(六糖)。
纤维素酶组合物是将β-1,4-葡聚糖的糖苷键水解的各种水解酶的混合物。所谓纤维素酶组合物所包含的水解酶,可举出例如,纤维二糖水解酶、木聚糖酶、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖酶、木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、壳聚糖酶、几丁质酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶等。
本发明中使用的纤维素酶组合物(以下,称为“本发明的纤维素酶组合物”。)中,其中,只要在对包含木聚糖和纤维素的生物质进行水解时至少具有木聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶的活性,并且实质上不具有β-木糖苷酶的活性即可,这些酶活性的来源没有特别限定。可以将纯化的酶、市售的纤维素酶制品、或市售制品混合来调制本发明的纤维素酶组合物。此外,也可以直接使用培养微生物而获得的培养液作为纤维素酶组合物,也可以将由培养液纯化的酶、其它市售的酶制品进行混合而用于本发明。
在使用来源于微生物的纤维素酶组合物作为本发明的纤维素酶组合物的情况下,作为微生物,可以优选使用真菌。作为真菌的具体例,可以例示木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、纤维单胞菌属 (Cellulomonas)、梭菌属(Chlostridium)、链霉菌属(Streptomyces)、腐质霉属(Humicola)、枝顶孢霉属(Acremonium)、耙齿菌属(Irpex)、毛霉属 (Mucor)、篮状菌属(Talaromyces)等的微生物。这些真菌中,优选为木霉属、曲霉属真菌。
作为木霉属真菌的具体例,可以例示里氏木霉QM9414(Trichoderma reeseiQM9414)、里氏木霉QM9123(Trichoderma reesei QM9123)、里氏木霉RutC-30(Trichodermareesei RutC-30)、里氏木霉PC3-7(Trichoderma reesei PC3-7)、里氏木霉CL-847(Trichoderma reesei CL-847)、里氏木霉 MCG77(Trichoderma reesei MCG77)、里氏木霉MCG80(Trichoderma reesei MCG80)、绿色木霉QM9123(Trichoderma viride QM9123)。这些木霉属真菌中,优选为里氏木霉。此外,也可以优选使用通过对上述生产纤维素酶组合物的真菌通过诱变剂或紫外线照射等实施诱变处理而使纤维素酶组合物的生产性提高了的突变株、β-木糖苷酶的活性降低了的突变株。
此外,作为曲霉属真菌的具体例,可以例示黑曲霉(Aspergillus niger)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、土曲霉 (Aspergillusterreus)。
作为本发明的纤维素酶组合物,可以使用上述真菌之中的1种真菌来源的纤维素酶组合物,也可以混合使用多种真菌来源的纤维素酶组合物。在使用多种真菌来源的纤维素酶组合物的情况下,组合没有特别限定,可以混合使用例如木霉属真菌来源的纤维素酶组合物、与曲霉属真菌来源的纤维素酶组合物。具体而言,作为曲霉属真菌来源的β-葡糖苷酶,可以例示Novozyme188(ノボザイムズ社)、β-Glucosidase from Aspergillus niger(来源于黑曲霉的β-葡糖苷酶,Megazyme社)、スミチームBGA(新日本化学工业社)等。另外,β-葡糖苷酶活性成分优选包含上述曲霉属真菌的β-葡糖苷酶活性成分。
本发明的纤维素酶组合物中,除了酶以外,可以包含盐类、糖等夹杂物、或提高酶保存性的化学试剂、pH调节剂、活性增强剂。此外,也可以使用生产纤维素酶组合物的真菌的菌体破碎液和培养液以及从它们中除去了盐类、糖等的粗酶等。
如果利用本发明的纤维素酶组合物将包含木聚糖和纤维素的生物质进行水解,则可以获得以低聚木糖和葡萄糖作为主成分的水解物。该情况下的所谓主成分,在水解物包含低聚木糖、葡萄糖和木糖的情况下,是指低聚木糖的浓度%(w/v)比木糖的浓度%(w/v)高。另一方面,如果通过具有木聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶和β-木糖苷酶的活性的纤维素酶组合物,将包含木聚糖和纤维素的生物质进行水解,则可获得以木糖和葡萄糖作为主成分的水解物。
β-木糖苷酶的活性作为分解4-硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷的酶活性来测定。将1分钟生成1μmol的4-硝基苯酚的酶量定义为1U。酶活性通过依照后述的参考例5所记载的步骤的方法进行测定。
本发明的纤维素酶组合物优选的是:在包含木聚糖和纤维素的生物质的水解时,实质上不具有β-木糖苷酶的活性,纤维素酶组合物中的每1g 蛋白质的β-木糖苷酶的活性优选为500U/g以下,进一步优选为400U/g以下,最优选为300U/g以下。这里,本发明中的纤维素酶组合物中的蛋白质量是使用Bradford法测定的。采用Bradford法的蛋白质量的测定方法中,可以将纤维素酶组合物的稀释溶液、与包含亮蓝G的溶液进行混合,然后保温一定时间,测定595nm下的吸光度而求出。可以以另行使用牛血清白蛋白的标准液制作的标准曲线为基础,算出纤维素酶组合物的稀释溶液中的蛋白质浓度,求出纤维素酶组合物中的蛋白质含量。
木聚糖酶的酶活性以分解作为试剂的木聚糖的木聚糖分解活性来测定。将1分钟生成1μmol的还原糖的酶量定义为1U。酶活性通过依照后述的参考例5所记载的步骤的方法进行测定。
具体而言,优选纤维素酶组合物中的每1g蛋白质的木聚糖分解活性优选为14,000U/g以上,更优选为16,000U/g以上,进一步优选为18,000U/g 以上。纤维素酶组合物的木聚糖分解活性通常是纤维素酶组合物中的每1g 蛋白质为50,000U/g以下。
纤维二糖水解酶的活性以分解4-硝基苯基-β-D-吡喃乳糖苷的酶活性来测定。将1分钟生成1μmol的4-硝基苯酚的酶量定义为1U。酶活性通过依照后述的参考例5所记载的步骤的方法测定。
具体而言,优选纤维素酶组合物中的每1g蛋白质的纤维二糖水解酶的活性包含优选为50U/g以上,更优选为65U/g以上,进一步优选为80U/g 以上。纤维素酶组合物的纤维二糖水解酶活性通常相对于纤维素酶组合物中的每1g蛋白质为300U/g以下。
β-葡糖苷酶的酶活性作为将4-硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷分解的酶活性来测定。将1分钟生成1μmol的4-硝基苯酚的酶量定义为1U。酶活性通过依照后述的参考例5所记载的步骤的方法测定。
具体而言,优选只要纤维素酶组合物中的每1g蛋白质的β-葡糖苷酶的活性为1000U/g以上即可,优选为10,000U/g以上,更优选为14,000U/g 以上,进一步优选为16,000U/g以上,最优选为18,000U/g以上。纤维素酶组合物的β-葡糖苷酶活性通常相对于纤维素酶组合物中的每1g蛋白质为 50,000U/g以下。
纤维素酶组合物中的酶成分除了上述测定酶活性的方法以外,可以通过凝胶过滤、离子交换、二维电泳等公知方法来分离,进行分离出的成分的氨基酸序列的分析(N末端分析、C末端分析、质谱分析),通过与数据库的比较来鉴定酶成分。
在本发明中,如果使用对包含木聚糖和纤维素的生物质进行水解时至少具有木聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶的活性,并且实质上不具有β-木糖苷酶的活性的纤维素酶组合物,将包含木聚糖和纤维素的生物质的前处理物进行水解,则能够获得包含低聚木糖的水解物。
本发明的水解的反应条件,只要是本发明的纤维素酶组合物能够将生物质的前处理物水解而获得低聚木糖的反应条件,就没有特别限定,优选水解的反应温度优选为50℃以下,更优选维持在30℃~45℃的范围。如果将反应温度维持在30℃~45℃,则纤维素酶组合物所包含的各种水解酶的活性不降低,因此可以在水解反应后再利用纤维素酶组合物。
水解反应的优选的pH条件没有特别限定,优选pH为4.5~8.0,更优选pH为6.0~8.0,进一步优选pH为6.5~7.5。通过使pH在6.5~7.5的范围,从而具有提高低聚木糖的生成量的效果,此外,在水解后也可以将纤维素酶组合物中的木聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶的活性保持得高。
进行水解时的pH的调整可以在包含木聚糖和纤维素的生物质的前处理物中添加纤维素酶组合物之前,调整包含木聚糖和纤维素的生物质的前处理物和纤维素酶组合物各自的pH,也可以在包含木聚糖和纤维素的生物质的前处理物中添加纤维素酶组合物后,进行pH的调整。优选的是,优选在包含木聚糖和纤维素的生物质的前处理物中添加纤维素酶组合物前,分别进行pH的调整。
调整pH时可以使用酸、碱或pH缓冲液。关于酸、碱或pH缓冲液的种类,只要是能够调整为规定的pH的种类,就没有特别限定,作为酸,可例示盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲酸、乙酸等。其中,从便宜并且以少量就能够调整为所希望的pH这样的观点考虑,优选为盐酸、硫酸。作为碱,可例示氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氨、碳酸钠、碳酸钙、磷酸三钠等。其中,从便宜并且以少量就能够调整为所希望的pH这样的观点考虑,优选为氢氧化钠、氢氧化钾。此外,在使用pH缓冲液的情况下,作为使用的pH缓冲液,可例示乙酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液、 Tris-盐酸缓冲液等,但从调整的pH为pH6.0~8.0这样的观点考虑,优选为磷酸缓冲液、Tris-盐酸缓冲液。
水解反应中,为了促进包含木聚糖和纤维素的生物质的前处理物与本发明的纤维素酶组合物的接触,此外为了使水解物的糖浓度均匀,优选进行搅拌混合。优选水解中的包含木聚糖和纤维素的生物质的前处理物的固体成分浓度为1~30重量%,优选为3~20重量%,进一步优选为5~10 重量%的范围。
优选水解的反应时间为1~144小时,优选为3~72小时,进一步优选为6~24小时,最优选为6~10小时的范围。
本发明的水解反应中,通过纤维素酶组合物所包含的水解酶,包含木聚糖和纤维素的生物质的前处理物中所包含的纤维素被纤维二糖水解酶分解成纤维寡糖,纤维寡糖被β-葡糖苷酶水解成葡萄糖。此外,包含木聚糖和纤维素的生物质的前处理物中所包含的木聚糖通过木聚糖酶而被水解成低聚木糖。
这里,木聚糖是存在于植物的细胞壁的半纤维素的构成成分,半纤维素与纤维素通过经由氢键、化学键的高级结构而构成植物的细胞壁。在本发明中发现:通过将不仅具有木聚糖酶的活性,而且具有纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶的活性的纤维素酶组合物用于水解反应,能够有效率地生产低聚木糖。
水解物中,除了低聚木糖以外,还可以包含通过纤维素酶组合物所包含的水解酶而产生的葡萄糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖等单糖、纤维二糖、纤维四糖、甘露二糖、半乳二糖等寡糖等。
在纤维素酶组合物具有木聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶和β- 木糖苷酶的活性的情况下,通过进行以下那样的处理,能够调制本发明的纤维素酶组合物。
使纤维素酶组合物悬浮或溶解于水系介质。将所得的纤维素酶组合物的悬浮液或水溶液的pH调整到5.5~8.0并在35℃~60℃进行保温处理。在将纤维素酶组合物悬浮时,优选为不添加底物的状态。更优选的pH的范围为pH6.0~8.0,进一步优选为pH6.5~8.0。保温时间没有特别限定,优选为24小时以内,进一步优选为12小时以内。进一步优选为0.1~8小时的范围,最优选为2~6小时的范围。此外,将纤维素酶组合物悬浮时的、纤维素酶组合物的浓度没有特别限定,优选以蛋白质浓度计成为优选为 0.1g/L~100g/L,更优选为1~50g/L,进一步优选为2~10g/L的方式调整纤维素酶组合物的浓度。这里的蛋白质浓度为通过Bradford法测定的蛋白质浓度。纤维素酶组合物的悬浮液或水溶液的pH调整时,可以使用上述的包含木聚糖和纤维素的生物质的前处理物的pH调整所使用的酸、碱或 pH缓冲液。
如下述实施例所具体记载地那样,通过上述处理,β-木糖苷酶的活性被大幅降低,另一方面,木聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶的活性的降低比较小。因此,能够使纤维素酶组合物中的β-木糖苷酶活性非常选择性地降低。因此,例如,即使在上述保温处理前的纤维素酶组合物的β- 木糖苷酶的活性相对于纤维素酶组合物中的每1g蛋白质为超过500U/g的情况下,通过上述保温处理,也能够使β-木糖苷酶活性降低直到相对于纤维素酶组合物中的每1g蛋白质为500U/g以下,优选为400U/g以下,进一步优选为300U/g以下,另一方面,木聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶的活性能够维持在上述各自的优选范围。来源于真菌的纤维素酶组合物中,β-木糖苷酶活性相对于纤维素酶组合物中的每1g蛋白质为超过 500U/g的情况也不少,但即使是这样的纤维素酶组合物,也能够通过上述的简单的保温处理,制成能够使用于本发明的方法的、实质上不具有β-木糖苷酶的活性的纤维素酶组合物。另外,这里,“来源于真菌的纤维素酶组合物”只要包含通过真菌生产的纤维素酶组合物,则也包括另行追加地添加木聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶的1种或2种以上而得的物质的情况。另外,对于β-木糖苷酶活性,由于纤维素酶组合物中的每1g 蛋白质的β-木糖苷酶活性通常为50U/g以上,因此β-木糖苷酶活性优选为 50~500U/g。
从水解反应后的水解物回收纤维素酶组合物的方法没有特别限定,例如,可举出将水解物用超滤膜进行过滤并由非透过侧回收纤维素酶组合物的方法、将水解物进行固液分离而从固体成分中溶出纤维素酶组合物的方法。
其中,优选采用超滤膜回收纤维素酶组合物。采用超滤膜的回收方法中,可以在非透过侧获得纤维素酶组合物,在透过侧获得包含低聚木糖的糖液,因此优选。另外,对非透过液加水,再次反复进行超滤膜的过滤,从而能够使纤维素酶组合物的纯度进一步提高。
在使用超滤膜回收纤维素酶组合物的情况下,其截留分子量的优选范围只要是1,000~50,000的范围即可,更优选为截留分子量5,000~50,000 的范围,进一步优选为截留分子量10,000~30,000的范围。
作为超滤膜的素材,可以使用聚醚砜(PES)、聚砜(PS)、聚丙烯腈(PAN)、聚1,1-二氟乙烯(PVDF)、再生纤维素、纤维素、纤维素酯、磺化聚砜、磺化聚醚砜、聚烯烃、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸甲酯、聚四氟乙烯等,但再生纤维素、纤维素、纤维素酯受到纤维素酶组合物的分解,因此优选使用以PES、PVDF等合成高分子作为素材的超滤膜。
作为超滤膜的过滤方式,有死端过滤、交叉流过滤,但从抑制膜污染的观点考虑,优选为交叉流过滤。此外,作为使用的超滤膜的膜形态,可以使用平膜型、螺旋型、管型、中空纤维型等适当形态的膜。具体而言,可举出DESAL社的G-5型、G-10型、G-20型、G-50型、PW型、HWSUF 型、KOCH社的HFM-180、HFM-183、HFM-251、HFM-300、HFK-131、 HFK-328、MPT-U20、MPS-U20P、MPS-U20S、Synder社的SPE1、SPE3、 SPE5、SPE10、SPE30、SPV5、SPV50、SOW30、旭化成株式会社制的マイクローザ(注册商标)UF系列的相当于截留分子量3,000~10,000的膜、日东电工株式会社制的NTR7410、NTR7450等。
此外,为了进一步提高糖浓度,可以将通过本发明获得的包含低聚木糖的糖液进行浓缩。浓缩处理可以例示蒸发浓缩、减压浓缩、膜浓缩等,但优选通过能量使用量少并能够分离糖液所包含的发酵抑制物质的 WO2010/067785号所记载的、通过纳滤膜和/或反渗透膜进行过滤的方法,来获得糖成分被浓缩的糖浓缩液。
此外,通过本发明获得的低聚木糖可以直接作为食品、饲料等素材的原料而使用。或者,也可以将通过公知的方法提高了纯化度的低聚木糖作为食品、饲料等素材的原料使用。
此外,以通过上述方法分离出的包含葡萄糖和木糖的糖液作为发酵原料,使具有生产化学品的能力的微生物生长,从而能够制造各种化学品。这里所说的“作为发酵原料使微生物生长”,是指利用糖液所包含的糖成分或氨源作为微生物的营养素,进行微生物的增殖、生长维持。作为化学品的具体例,可以举出醇、有机酸、氨基酸、核酸等在发酵工业上大量生产的物质。关于这样的化学品,以糖液中的糖成分作为碳源,在其代谢的过程中在生物体内外作为化学品而蓄积生产。作为能够通过微生物而生产的化学品的具体例,可以举出乙醇、1,3-丙二醇、1,4-丁二醇、甘油等醇、乙酸、乳酸、丙酮酸、琥珀酸、苹果酸、衣康酸、柠檬酸等有机酸、肌苷、鸟苷等核苷、肌苷酸、鸟苷酸等核苷酸、尸胺等胺化合物。进一步,本发明的糖液也能够适用于酶、抗生素、重组蛋白质等的生产。关于这样的化学品的制造所使用的微生物,只要是能够有效率地生产目标的化学品的微生物即可,可以使用大肠杆菌、酵母、真菌(丝状菌、担子菌)等的微生物。
实施例
以下,举出实施例和比较例具体地说明本发明。
参考例1
包含木聚糖和纤维素的生物质的前处理
使用甘蔗渣作为包含木聚糖和纤维素的生物质进行前处理。量取甘蔗渣5g,加热直到变为105℃。以此时的重量变化为基础,算出甘蔗渣的固体成分率。将含水状态的甘蔗渣乘以含水率而得的值设为固体成分重量。将甘蔗渣100g以固体成分重量在与氢氧化钠溶液混合的状态下成为5重量%、相对于甘蔗渣固体成分的氢氧化钠添加量成为10重量%的方式,浸泡于氢氧化钠水溶液,在80℃下前处理3小时。通过离心分离(3,000G,10 分钟)进行固液分离,分离成溶液成分和固体成分。将固体成分用纯水洗涤后的物质作为包含木聚糖和纤维素的生物质的前处理物而使用于以下实验。
参考例2
纤维素酶组合物的调制
[前培养]
以成为玉米浆(Corn Steep Liquor)5%(w/vol)、葡萄糖2%(w/vol)、酒石酸铵0.37%(w/vol)、硫酸铵0.14(w/vol)、磷酸二氢钾0.2%(w/vol)、氯化钙二水合物0.03%(w/vol)、硫酸镁七水合物0.03%(w/vol)、氯化锌 0.02%(w/vol)、氯化铁(III)六水合物0.01%(w/vol)、硫酸铜(II)五水合物 0.004%(w/vol)、氯化锰四水合物0.0008%(w/vol)、硼酸0.0006%(w/vol)、七钼酸六铵四水合物0.0026%(w/vol)的方式将它们添加于蒸馏水中,将 100mL倒入到500mL带有挡板的锥形烧瓶中,在121℃下进行15分钟高压灭菌器灭菌。放冷后,分别添加0.01%(w/vol)的另行分别在121℃下进行了15分钟高压灭菌器灭菌的PE-M和Tween80,制成前培养培养基。在该前培养培养基100mL中以成为1×105个/mL的方式接种里氏木霉 ATCC66589(由ATCC出售),在28℃、72小时、180rpm的条件下振荡培养,进行前培养(振荡装置:TAITEC社制BIO-SHAKER BR-40LF)。
[正式培养]
以成为玉米浆5%(w/vol)、葡萄糖2%(w/vol)、纤维素(微晶纤维素,アビセル)10%(w/vol)、酒石酸铵0.37%(w/vol)、硫酸铵0.14%(w/vol)、磷酸二氢钾0.2%(w/vol)、氯化钙二水合物0.03%(w/vol)、硫酸镁七水合物 0.03%(w/vol)、氯化锌0.02%(w/vol)、氯化铁(III)六水合物0.01%(w/vol)、硫酸铜(II)五水合物0.004%(w/vol)、氯化锰四水合物0.0008%(w/vol)、硼酸0.0006%(w/vol)、七钼酸六铵四水合物0.0026%(w/vol)的方式添加于蒸馏水,将2.5L倒入到5L容积搅拌瓶(ABLE社制DPC-2A)容器中,在121℃下进行15分钟高压灭菌器灭菌。放冷后,分别添加0.1%的另行分别在121 ℃下进行了15分钟高压灭菌器灭菌的PE-M和Tween80,作为正式培养培养基。在该正式培养培养基2.5L中接种250mL预先用上述前培养培养基进行了前培养的里氏木霉ATCC66589。然后,在28℃、87小时、300rpm、通气量1vvm的条件下进行培养,在离心分离后,将上清液进行膜过滤(ミリポア社制ステリカップ-GV材质:PVDF)。相对于该调制出的培养液,添加以蛋白质重量比计为1/100量的β-葡糖苷酶(Novozyme188),获得了纤维素酶组合物。
另外,由于LA Grange DC等(Appl.Environ.Microbiol.62,1036-1044, 1996)、Boer H等(Biotechnol.Bioeng.69,486-494,2000)、William JC等 (Eur.J.Biochem.165,333-341,1987)中记载了丝状菌来源的纤维素酶组合物中的木聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶的最佳pH分别为pH5.0 ~6.0、pH5.0、pH5.0,因此判断本参考例中获得的纤维素酶组合物的酶反应的最佳pH为pH5。
参考例3
蛋白质浓度的测定
纤维素酶组合物的蛋白质浓度的测定时,使用了市售的蛋白质浓度测定试剂(Quick Start Bradford蛋白质测定,Bio-Rad制)。在恢复到室温的蛋白质浓度测定试剂250μL中添加5μL稀释的本发明的纤维素酶组合物溶液,通过酶标仪(POWERSCAN HT,大日本住友制药株式会社制)测定在室温下静置5分钟后的595nm下的吸光度。以牛血清白蛋白水溶液作为标准液,对照标准曲线而算出纤维素酶组合物溶液的蛋白质浓度。
参考例4
糖浓度的测定
低聚木糖、葡萄糖、木糖使用日立高效液相色谱LaChrom Eite(HITACHI),在以下的条件下进行定量分析。
以由作为低聚木糖的木二糖、木三糖、木四糖、木五糖、木六糖、和葡萄糖、木糖的标准品制作的标准曲线为基础,进行了定量分析。另外,本实施例中记载的所谓低聚木糖,是指通过β糖苷键而结合了2~6个木糖单元而得的低聚木糖。
柱:KS802、KS803(Shodex)
流动相:水
检测方法:RI
流速:0.5mL/min
温度:75℃。
参考例5
酶活性测定方法
关于酶活性,对于1)β-木糖苷酶的活性、2)木聚糖分解活性、3)纤维二糖水解酶的活性、4)β-葡糖苷酶的活性这4种,在作为参考例2的纤维素酶组合物的酶反应的最佳pH值的pH5下,通过以下步骤进行了测定评价。
1)β-木糖苷酶的活性
在50mM乙酸钠缓冲液(pH5.0)中,以成为1mM的方式溶解了4-硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷(Sigma-Aldrich社制),将由此而得的溶液作为底物溶液。在90μL的底物溶液中添加酶液10μL,在30℃下进行静置反应。在 10分钟后添加碳酸钠溶液10μL使反应停止,测定405nm的吸光度从而定量了4-硝基苯酚。在上述反应体系中,将1分钟生成1μmol的4-硝基苯酚的酶量定义为1U,依照下述式算出活性值(U/mL)。
β-木糖苷酶的活性(U/mL)=4-硝基苯酚(μmol/ml)×反应液量(μl)/((反应时间(min)×酶液量(μL))×稀释倍率(倍)。
2)木聚糖分解活性
在50mM乙酸钠缓冲液(pH5.0)中,以成为1重量%的方式悬浮了木聚糖(Xylanfrom Birch wood,Fluka社制),将由此而得的溶液作为底物溶液。在分注的500μL的底物溶液中添加酶液5μL,在50℃下一边旋转混合一边反应。反应时间以30分钟作为基本,根据酶活性的高度而适当变更到10~ 60分钟。反应后,将管进行离心分离,通过DNS法测定其上清液成分的还原糖浓度。在上述反应体系中,将1分钟生成1μmol的还原糖的酶量定义为1U,依照下述式算出活性值(U/mL)。
木聚糖分解活性(U/mL)=还原糖浓度(g/L)×1000×505(μL)/(150.13×反应时间(分钟)×5(μL))。
3)纤维二糖水解酶的活性
在50mM乙酸钠缓冲液(pH5.0)中,以成为1mM的方式溶解了4-硝基苯基-β-D-吡喃乳糖苷(Sigma-Aldrich社制),将由此而得的溶液作为底物溶液。在90μL的底物溶液中添加酶液10μL,在30℃进行静置反应。在10 分钟后添加碳酸钠溶液10μL使反应停止,测定405nm的吸光度从而定量了4-硝基苯酚。在上述反应体系中,将1分钟生成1μmol的4-硝基苯酚的酶量定义为1U,依照下述式算出活性值(U/mL)。
纤维二糖水解酶的活性(U/mL)=4-硝基苯酚(μmol/ml)×反应液量 (μl)/(反应时间(min)×酶液量(μL))×稀释倍率(倍)。
在本测定方法中,如果活性值变为小于5U/g,则检测灵敏度降低,因此以小于5U/g作为检测限度。
4)β-葡糖苷酶的活性(BGL活性)。
在50mM乙酸钠缓冲液(pH5.0)中,以成为1mM的方式溶解了4-硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷(Sigma―Aldrich社制),将由此而得的溶液作为底物溶液。在90μL的底物溶液中添加酶液10μL,在30℃下进行静置反应。在 10分钟后添加碳酸钠溶液10μL使反应停止,测定405nm的吸光度从而定量了4-硝基苯酚。在上述反应体系中,将1分钟生成1μmol的4-硝基苯酚的酶量定义为1U,依照下述式算出活性值(U/mL)。
β-葡糖苷酶的活性(U/mL)=4-硝基苯酚(μmol/ml)×反应液量(μl)/(反应时间(min)×酶液量(μL))×稀释倍率(倍)。
在本测定方法中,如果活性值变为小于50U/g,则检测灵敏度降低,因此以50U/g作为检测限度。
比较例1
使用了木聚糖酶的水解反应
通过与参考例1所记载的甘蔗渣的固体成分率同样的方法测定按照参考例1调制的、包含木聚糖和纤维素的生物质的前处理物的固体成分率,将以固体成分计各1g称量到50mL管中。以包含木聚糖和纤维素的生物质的前处理物的固体成分浓度在反应开始时变为10重量%的方式加入纯水,同时使用稀盐酸将pH值调整为5.0。向调制了pH的包含木聚糖和纤维素的生物质的前处理物中,以通过参考例5所记载的方法测定木聚糖分解活性,木聚糖分解活性相对于包含木聚糖和纤维素的生物质的前处理物的每 1g固体成分成为250U的方式,添加作为工业用木聚糖酶的セルロシン TP25(エイチビィアイ社制)到包含木聚糖和纤维素的生物质的前处理物中。接着,使用杂交转子(Hybridization rotator,日伸理化社制SN-06BN),在作为セルロシンTP25的推荐pH、温度条件的pH5.0、40℃的反应条件下旋转混合8小时。通过参考例4所记载的方法测定了水解物的上清液所包含的糖成分。
实施例1
使用了在特定的pH/温度条件下保温的本发明的纤维素酶组合物的水解反应
通过1N氢氧化钠水溶液将通过参考例2获得的纤维素酶组合物的pH 调整为pH5.5~8.0,通过水稀释直到蛋白质浓度为4g/L后,在35~60℃的温度范围保温。详细的保温处理条件记载于表1。对在各个条件下进行了保温处理的纤维素酶组合物,将通过参考例5所记载的方法测定了纤维二糖水解酶的活性、β-葡糖苷酶的活性、木聚糖分解活性、β-木糖苷酶的活性的结果、与保温处理前的活性进行了比较的结果分别示于表1中。由这些结果可知,通过任何条件的保温处理,酶活性的最佳pH时的β-木糖苷酶的活性都降低到在对生物质的水解时实质上不具有活性的值,纤维二糖水解酶的活性、β-葡糖苷酶的活性、木聚糖分解活性残存60%以上,因此通过任选的保温处理条件,β-木糖苷酶活性都选择性地失活。
接着,使用通过在各条件下进行保温处理从而β-木糖苷酶活性选择性地失活的纤维素酶组合物作为本发明的纤维素酶组合物,进行了包含木聚糖和纤维素的生物质的水解反应。以在保温处理前按照参考例5测定的木聚糖分解活性为基础,将本发明的纤维素酶组合物以木聚糖分解活性成为相对于包含木聚糖和纤维素的生物质的前处理物的每1g固体成分为250U 的方式添加到将pH值调整为7.0的包含木聚糖和纤维素的生物质的前处理物中,使用杂交转子在pH7.0、40℃下旋转混合8小时。通过参考例4所记载的方法测定了水解物的上清液所包含的糖成分,将其结果示于表2中。明确了:与使用了比较例1的木聚糖酶的水解反应和比较例2的未实施保温处理的纤维素酶组合物的水解反应相比,可获得更多的低聚木糖。
表1
表2
实施例2
在实施例1的水解反应中,使用在pH值为7.5、温度40℃、保温时间 2小时的条件下进行了保温处理的纤维素酶组合物,在pH6.0~8.0、温度 40℃的条件下进行了水解反应。除此以外的操作与实施例1的水解反应相同。将测定了水解物的上清液所包含的糖成分的结果示于表3中。由这些结果可知,在任选的pH条件下进行水解反应,与使用了比较例1的木聚糖酶的水解反应相比,都可获得更多的低聚木糖。
表3
实施例3
在参考例2中的纤维素酶组合物中,在添加β-葡糖苷酶(Novozyme188) 前,在pH7.5、温度40℃、保温时间2小时的条件下进行了保温处理后。保温处理后的β-葡糖苷酶的活性为124U/g。接下来,向保温处理后的纤维素酶组合物中以β-葡糖苷酶活性分别成为1,000U/g、5,000U/g、10,000U/g、 14,000U/g、18,000U/g、25,000U/g的方式添加了β-葡糖苷酶(Novozyme188),将由此获得的组合物作为本实施例中使用的纤维素酶组合物。在实施例2 的水解反应中,使用该纤维素酶组合物在pH7.0、温度40℃的条件下进行水解反应。将通过参考例4所记载的方法测定了水解物的上清液所包含的糖成分的结果示于表4中。由这些结果可知,在β-葡糖苷酶添加量多的纤维素酶组合物中,低聚木糖收量提高。
表4
实施例3
在实施例1的水解反应中,使用在pH7.5、温度40℃、保温时间2小时的条件下进行了保温处理的纤维素酶组合物,在pH7.0、温度35~45℃的条件下进行了水解反应。通过将旋转混合8小时而获得的水解物8,000g 进行5分钟离心分离,从而分离成液体成分和固体成分。液体成分通过细孔径0.22μm的微量过滤膜(Millex-GV,ミリポア社制)进行过滤,从而获得了滤液。进一步,通过将所得的滤液通过截留分子量10,000的超滤膜 (Vivaspin20-10K,ザルトポア社制)进行过滤,从而获得了透过液和非透过液。将测定了透过液所包含的糖成分的结果示于表4中,将依照参考例 5的方法而测定了非透过液中所包含的酶活性的结果示于表5中。这里,酶活性相对地表示在将纤维素酶组合物进行保温处理前的各酶活性设为 100的情况下的非透过液中的酶活性。由这些结果可知,由生成了低聚木糖的水解物,能够回收在水解后木聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶的活性也维持得高的纤维素酶组合物。
表5
表6
产业可利用性
通过本发明获得的低聚木糖,能够作为包含低聚木糖的食品、饲料等素材的原料使用。
Claims (5)
1.一种低聚木糖的制造方法,所述制造方法通过将包含木聚糖和纤维素的生物质利用纤维素酶组合物进行水解来制造低聚木糖,该纤维素酶组合物在对生物质进行水解时,至少具有木聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶的活性,并且实质上不具有β-木糖苷酶的活性,所述纤维素酶组合物的木聚糖酶活性成分和纤维二糖水解酶活性成分包含下述酶活性成分,该酶活性成分是将对所述生物质至少具有木聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶和β-木糖苷酶的活性的里氏木霉来源的纤维素酶混合物在35℃~60℃、pH值5.5~8.0下进行保温处理而获得的,所述纤维素酶组合物的β-木糖苷酶的活性以分解4-硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷的酶活性计,相对于该纤维素酶组合物中的每1g蛋白质为50~500U/g,所述纤维素酶组合物的β-葡糖苷酶的活性以分解4-硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷的活性计,相对于该纤维素酶组合物中的每1g蛋白质为14,000U/g以上,所述纤维素酶组合物的木聚糖酶活性以分解木聚糖的酶活性计,相对于该纤维素酶组合物中的每1g蛋白质为14,000U/g以上,所述纤维素酶组合物的纤维二糖水解酶活性以分解4-硝基苯基-β-D-吡喃乳糖苷的酶活性计,相对于该纤维素酶组合物中的每1g蛋白质为50U/g以上。
2.根据权利要求1所述的低聚木糖的制造方法,所述纤维素酶组合物的β-葡糖苷酶活性成分包含曲霉属真菌的β-葡糖苷酶活性成分。
3.根据权利要求1或2所述的低聚木糖的制造方法,所述水解时的pH条件为pH值6.0~8.0。
4.根据权利要求1或2所述的低聚木糖的制造方法,将前处理物利用所述纤维素酶组合物进行水解,所述前处理物是通过将包含木聚糖和纤维素的生物质进行碱处理而获得的。
5.根据权利要求1或2所述的低聚木糖的制造方法,其还包含下述工序:将通过所述水解反应而获得的水解物进行固液分离,使所得的液体成分通过超滤膜进行过滤,从非透过侧回收纤维素酶组合物,从透过侧获得低聚木糖。
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