WO2021182607A1 - 下痢抑制剤 - Google Patents

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WO2021182607A1
WO2021182607A1 PCT/JP2021/010027 JP2021010027W WO2021182607A1 WO 2021182607 A1 WO2021182607 A1 WO 2021182607A1 JP 2021010027 W JP2021010027 W JP 2021010027W WO 2021182607 A1 WO2021182607 A1 WO 2021182607A1
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WO
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diarrhea
derived
xylooligosaccharide
weight
composition
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PCT/JP2021/010027
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小林宏治
舩田茂行
山田勝成
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東レ株式会社
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    • Y02P60/87—Re-use of by-products of food processing for fodder production

Definitions

  • the present invention relates to a diarrhea suppressant containing an oligosaccharide derived from alkaline pretreated bagasse as an active ingredient.
  • Xylose oligosaccharide is a general term for oligosaccharides in which a plurality of xylose units are bound by ⁇ -glycosidic bond. Xylooligosaccharide is also used as a material for functional foods because it exhibits an excellent intestinal regulating effect (Non-Patent Document 1).
  • cellulosic biomass which is a raw material for xylooligosaccharides, and are produced from pulp and corn cobs (Patent Document 2).
  • the oligosaccharide derived from the alkaline pretreated bagasse has a higher diarrhea suppressing effect than the commercially available xylooligosaccharide derived from corn cob.
  • the present invention is as follows (1) to (10).
  • xylooligosaccharide is one or a mixture of two or more selected from the group consisting of xylobiose, xylotiose, xylotetraose, xylopentaose and xylhexaose. Inhibitor.
  • An animal growth promoter containing an alkali pretreated bagas-derived oligosaccharide composition as an active ingredient.
  • a method for suppressing diarrhea in which an alkaline pretreated bagasse-derived oligosaccharide composition is administered to a human or a non-human animal.
  • a method for promoting animal growth wherein an alkaline pretreated bagasse-derived oligosaccharide composition is administered to an animal other than human.
  • the oligosaccharide composition derived from the alkali pretreatment is excellent in the diarrhea suppressing effect, and is useful as an active ingredient of the diarrhea suppressing agent.
  • the oligosaccharide composition which is the active ingredient of the diarrhea suppressant of the present invention is obtained by hydrolyzing an alkaline pretreated bagasse.
  • the alkaline solution used for the alkaline treatment is not particularly limited, but sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium hydroxide, and ammonia can be used.
  • Sodium hydroxide is preferable from the viewpoint of being inexpensive and easy to handle.
  • the alkaline treatment conditions are set in the range of 0.1 to 50% by weight, preferably 1 to 20% by weight, and more preferably 5 to 10% by weight in a state where the bagasse solid content concentration is mixed with the alkaline aqueous solution. If the bagasse solid content concentration is less than 0.1% by weight, the amount of water used becomes extremely large, which is economically disadvantageous. On the other hand, if the bagasse solid content concentration exceeds 50% by weight, the bagasse will not be immersed in the alkaline solution, and the effect of the pretreatment may not be sufficiently obtained.
  • the amount of alkali added in the alkali pretreatment for example, when an aqueous sodium hydroxide solution is used, the amount of sodium hydroxide added is 0.1 to 100% by weight, preferably 1 to 50% by weight, based on the bagasse solid content. More preferably, it is added in the range of 5 to 15% by weight. If the amount of alkali added is less than 0.1% by weight, hydrolysis in the subsequent stage is difficult to proceed, and a sufficient yield of xylooligosaccharide may not be obtained. On the other hand, if the addition amount exceeds 100% by weight, the amount of alkali increases and the amount of acid used for pH adjustment in the hydrolysis reaction increases, which is economically disadvantageous.
  • the temperature at which the alkali treatment is performed is preferably 10 to 200 ° C., more preferably 25 to 120 ° C., further preferably 80 to 100 ° C., and particularly preferably 85 to 100 ° C. from the viewpoint of sugar yield in hydrolysis.
  • the alkali treatment time can be appropriately set according to the amount of alkali and the like, and is usually about 0.5 to 24 hours.
  • Alkali pretreatment may be performed under normal temperature or pressure, but it is preferably performed under normal pressure.
  • the pretreated product after the alkali pretreatment may be subjected to the hydrolysis reaction as it is, but it is preferable that the pretreated product is subjected to solid-liquid separation before the hydrolysis reaction and the obtained solid component is subjected to hydrolysis as the pretreated product.
  • a solid-liquid separation method a known method such as a centrifugal separation method such as a screw decanter, a filtration method such as pressurization / suction filtration, or a membrane filtration method such as microfiltration can be used.
  • the solid component of the pretreated bagasse may be washed with pure water before and after the solid-liquid separation. Washing is preferable because it can further reduce enzyme reaction inhibitors such as lignin decomposition products and can also reduce the amount of acid required for pH adjustment during the hydrolysis reaction.
  • the type of oligosaccharide contained in the oligosaccharide composition is not particularly limited, but is preferably a xylooligosaccharide.
  • the xylooligosaccharide preferably has a structure in which 2 to 6 xylose units are covalently bonded, but the structure is not limited, and a side chain may be contained. Xyloses are linked by ⁇ -glycosidic bonds.
  • the active ingredient of the diarrhea suppressant may be one or a mixture of two or more of these, but a mixture of three or more is more preferable, and a mixture of four or more is more preferable. Particularly preferably, a mixture of xylobiose, xylotriose, xylotetraose and xylopentaose is included.
  • the oligosaccharide composition which is the active ingredient of the diarrhea suppressant of the present invention is obtained by the hydrolysis reaction of the pretreated product of the alkaline pretreated bagasse, preferably by the enzymatic hydrolysis of the pretreated product of the alkaline pretreated bagasse. can get.
  • the enzyme used for the hydrolysis reaction of the pretreated product of the alkaline pretreated bagasse is not particularly limited, but it is preferable to use a cellulase composition.
  • Cellulase compositions are a mixture of various hydrolases that hydrolyze the glycosidic bonds of ⁇ -1,4-glucan.
  • the hydrolases contained in the cellulase composition include, for example, cellobiohydrase, xylanase, endoglucuronase, ⁇ -glucosidase, ⁇ -xylosidase, arabinofuranosidase, xylantherase, ferulate esterase, ⁇ -glucuronidase, chitosanase, chitinase.
  • the cellulase composition used in the hydrolysis reaction has at least the activity of xylanase, theobilohydrase and ⁇ -glucosidase with respect to bagas at the time of hydrolysis, and substantially the activity of ⁇ -xylosidase.
  • a cellulase composition that does not have is preferably used from the viewpoint of xylanase sugar production. The origin of these enzyme activities is not particularly limited. Examples of preparation of such cellulase compositions are described in WO2017 / 170919 or WO2017 / 170917.
  • the culture solution obtained by culturing the microorganism may be used as it is as a cellulase composition, or an enzyme purified from the culture solution and another commercially available enzyme product may be mixed and used in the present invention. ..
  • a fungus can be preferably used as the microorganism.
  • the fungus include the genus Trichoderma, the genus Aspergillus, the genus Cellulomonas, the genus Chrostridium, the genus Streptomyces, the genus Humicola, and the genus Humicola. ), Irpex, Mucor, Talaromyces and other microorganisms can be exemplified.
  • Trichoderma and Aspergillus fungi are preferable.
  • Trichoderma genus fungus examples include Trichoderma reesei QM9414 (Trichoderma reesei QM9414), Trichoderma reesei QM9123, Trichoderma reesei QM9123, Trichoderma resei RutC-30 (Trichoderma Resei) RutC-30 (Trichoderma Resei) Trichoderma reesei PC3-7), Trichoderma reesei CL-847 (Trichoderma reesei CL-847), Trichoderma reesei MCG77 (Trichoderma reesei) MCG77), Trichoderma reesei MCG80 (Trichoderma reesei MCG80), Trichoderma viride QM9123 (Trichoderma viride QM9123) can be exemplified.
  • Trichoderma lysei is preferable. Further, a mutant strain in which the productivity of the cellulase composition is improved by subjecting the fungus producing the above cellulase composition to a mutation treatment with a mutant agent or ultraviolet irradiation, or a mutant strain in which the activity of ⁇ -xylosidase is reduced is also preferable. Can be used.
  • Aspergillus fungi include Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus, Aspergillus aquaretas, and Aspergillus teleus.
  • a cellulase composition derived from one of the above fungi may be used, or a cellulase composition derived from a plurality of fungi may be mixed and used.
  • a plurality of fungal-derived cellulase compositions are used, the combination is not particularly limited, and for example, a cellulase composition derived from Trichoderma fungus and a cellulase composition derived from Aspergillus fungus may be mixed and used.
  • ⁇ -glucosidase derived from Aspergillus fungus "Novozyme 188" (Novozymes), " ⁇ -Glucosidase from Aspergillus niger” (Megazyme), "Sumiteam BGA” (Shin Nihon Kagaku Kogyo Co., Ltd.), etc. It can be exemplified.
  • the ⁇ -glucosidase active ingredient preferably contains the ⁇ -glucosidase active ingredient of the above-mentioned Aspergillus fungus.
  • the oligosaccharide composition is obtained as a sugar solution containing an oligosaccharide by hydrolysis of an alkaline pretreated product, and the oligosaccharide is selectively separated from monosaccharides such as glucose and xylose contained in the sugar solution in a subsequent step.
  • the method for separation or concentration is not particularly limited, but membrane separation is preferably used.
  • the type of membrane used for membrane separation is not particularly limited, but a polyamide separation membrane is preferably used.
  • the molecular weight cut-off of the polyamide separation membrane is also not particularly limited, but those having a molecular weight cut-off in the range of 200 to 1000 are preferably used. When filtering through a polyamide separation membrane having a molecular weight cut-off of 300 to 1,000, the xylooligosaccharide is selectively concentrated on the non-permeable side.
  • filtration may be performed through a separation membrane having a molecular weight cut-off of 2,000 to 100,000.
  • the separation membrane with a molecular weight cut-off of 2,000 to 100,000 used in the previous step is larger than the molecular weight cut-off of the polyamide separation membrane used thereafter, and also permeates xylobiose and other xylooligosaccharides to contain enzymes and the like.
  • the molecular weight cut-off is in the range of 5,000 to 50,000, more preferably 10,000 to 30,000.
  • the enzyme component used for preparing the sugar solution can be removed, and impurities in the oligosaccharide concentrate can be reduced.
  • the load on the polyamide separation membrane used in the subsequent step can be reduced.
  • Materials for the separation membrane with a fractional molecular weight of 2,000 to 100,000 include polyethersulfone (PES), polysulfone (PS), polyacrylonitrile (PAN), polyvinylidene fluoride (PVDF), regenerated cellulose, cellulose, and cellulose ester.
  • Sulfoned polysulfone, sulfonated polyether sulfone, polyolefin, polyvinyl alcohol, polymethylmethacrylate, polytetrafluoride ethylene and the like can be used.
  • the enzyme preparation may contain a group of enzymes involved in cellulose decomposition, and regenerated cellulose, cellulose, and cellulose ester are decomposed. Therefore, PES, PVDF, etc. It is preferable to use a separation membrane made of the synthetic polymer of.
  • separation membranes having a molecular weight cut-off of 2,000 to 100,000 include GE W & PT DESAL brand M series, P series, and G series GH (G-10) type and GK (G-20) type. , GM (G-50) type, "DURATHERM” (registered trademark) series HWS UF type, STD UF type, and Synder VT, MT, ST, SM, MK, MW, LY, BN, BY, Asahi Kasei There are "Microza” (registered trademark) UF series manufactured by Nitto Denko Corporation, NTR-7410 and NTR-7450 manufactured by Nitto Denko KK.
  • a separation membrane having a molecular weight cut off of 2,000 to 100,000 As the microfiltration membrane, a separation membrane having an average pore diameter of about 0.01 to 10 ⁇ m is preferably used.
  • the oligosaccharide composition may be colored derived from alkaline pretreated bagasse.
  • the degree of coloring is not particularly limited, but it is preferable that the absorbance at a wavelength of 420 nm measured using a 1 cm cell diluted to a total sugar concentration of 5 g / L is 0.1 to 1.0. , 0.15 to 0.8, more preferably.
  • the sugar that is the main component of the oligosaccharide composition is an oligosaccharide, but monosaccharides such as glucose and xylose derived from alkaline pretreated bagasse may be contained.
  • the total sugar concentration in the composition is not particularly limited, but is preferably 20% by weight or more, more preferably 25% by weight or more, further preferably 30% by weight or more, and further preferably 35% by weight or more from the viewpoint of transportation. It is preferable, and 40% by weight or more is particularly preferable.
  • the oligosaccharide content in the oligosaccharide composition is not particularly limited, but is preferably 10% by weight or more, more preferably 15% by weight or more, still more preferably 20% by weight or more, and 25% by weight, from the viewpoint of storage and transportation. By weight% or more is more preferable, and 0% by weight or more is particularly preferable.
  • the oligosaccharide composition may contain a substance derived from an alkali pretreated bagasse other than the above-mentioned substance, and the degree thereof is not particularly limited, but the oligosaccharide composition is diluted so as to have a total sugar concentration of 5 g / L.
  • the absorbance at a wavelength of 280 nm measured using a 1 cm cell is preferably 0.2 to 1.0, and more preferably 0.3 to 0.8.
  • the oligosaccharide composition may be concentrated under reduced pressure or concentrated by evaporation, if necessary, and its shape may be liquid or powder.
  • the powdered oligosaccharide can be produced by a known powdering method such as a spray-drying method using a liquid oligosaccharide.
  • the diarrhea suppressant of the present invention can be administered to humans or non-human animals to obtain a diarrhea-suppressing effect, but it is preferably administered to non-human animals.
  • the method of administration is not particularly limited, but it can be used as an ingredient or additive contained in food or feed.
  • the dose is not particularly limited, but it is preferable to add 50 to 500 ppm of oligosaccharide to food or feed, and more preferably 100. It is about 400 ppm, more preferably 100 to 300 ppm, still more preferably 100 to 200 ppm.
  • the compound feed is a feed prepared by blending necessary nutrients (protein, energy), and the components are not particularly limited.
  • the animal to be administered is not particularly limited, but domestic animals are preferable, pigs, broilers or hens are more preferable, pigs or broilers are more preferable, and pigs are particularly preferable. preferable.
  • the frequency of diarrhea is reduced by using the diarrhea suppressant of the present invention.
  • the frequency of diarrhea is expressed by the following formula (1) in the case of livestock, for example.
  • the degree of reduction in the frequency of diarrhea caused by the diarrhea suppressant of the present invention is not particularly limited, but it is preferably reduced by 0.2% or more, more preferably 0.3% or more, and further 0.4% or more.
  • 0.5% or more is more preferable, 0.7% or more is further preferable, 0.8% or more is further preferable, 1% or more is further preferable, 2% or more is further preferable, and 3%. More preferably than the above, 4% or more is even more preferable, and 5% or more is particularly preferable.
  • Feed conversion ratio indicates the amount of feed required to increase the body weight of an animal by 1 kg.
  • An improvement in feed conversion ratio means a decrease in feed conversion ratio.
  • the degree of decrease in feed conversion ratio is not particularly limited as long as it is decreased, but it is preferably decreased by 0.01 or more, more preferably 0.015 or more, further preferably 0.02 or more, and 0.025. The above is even more preferable, and 0.03 or more is particularly preferable.
  • Protein Concentration Measurement Method A commercially available protein concentration measurement reagent (Quick Start Blade protein assay, manufactured by Bio-Rad) was used. 5 ⁇ L of a filamentous fungus-derived cellulase solution diluted in 250 ⁇ L of a protein concentration measuring reagent returned to room temperature was added, and the absorbance at 595 nm after standing at room temperature for 5 minutes was measured with a microplate reader. BSA was used as a standard product, and the protein concentration was calculated against the calibration curve.
  • the method for measuring ⁇ -xylosidase activity is specifically 10 ⁇ L of an enzyme diluent in 90 ⁇ L of 50 mM acetate buffer containing 1 mM p-nitrophenyl- ⁇ -xylopyranoside (manufactured by Sigma-Aldrich Japan). After 30 minutes, 10 ⁇ L of 2M sodium carbonate was added and mixed well to stop the reaction, and the increase in absorbance at 405 nm was measured. The activity of liberating 1 ⁇ mol of p-nitrophenol per minute was defined as 1 U.
  • the blank was prepared by adding 10 ⁇ L of 2M sodium carbonate to 90 ⁇ L of 50 mM acetate buffer containing 1 mM p-nitrophenyl- ⁇ -xylopyranoside and mixing well, then adding 10 ⁇ L of enzyme diluent and reacting at 30 ° C. for 30 minutes. Then, the increase in absorbance at 405 nm was measured.
  • the method for measuring ⁇ -glucosidase activity is 10 ⁇ L of enzyme diluent in 90 ⁇ L of 50 mM acetate buffer containing 1 mM p-nitrophenyl- ⁇ -glucopyranoside (manufactured by Sigma-Aldrich Japan). After 10 minutes, 10 ⁇ L of 2M sodium carbonate was added and mixed well to stop the reaction, and the increase in absorbance at 405 nm was measured. The activity of liberating 1 ⁇ mol of p-nitrophenol per minute was defined as 1 U.
  • the blank was mixed well by adding 10 ⁇ L of 2M sodium carbonate to 90 ⁇ L of 50 mM acetate buffer containing 1 mM p-nitrophenyl- ⁇ -glucopyranoside, and then 10 ⁇ L of enzyme diluent was added and reacted at 30 ° C. for 30 minutes. Then, the increase in absorbance at 405 nm was measured.
  • the method for measuring cellobiohydrolase activity is enzyme dilution in 90 ⁇ L of 50 mM acetate buffer containing 1 mM p-nitrophenyl- ⁇ -lactopyranoside (manufactured by Sigma-Aldrich Japan). The reaction was carried out at 30 ° C. using 10 ⁇ L of the solution, and after 60 minutes, 10 ⁇ L of 2M sodium carbonate was added and mixed well to stop the reaction, and the increase in absorbance at 405 nm was measured. The activity of liberating 1 ⁇ mol of p-nitrophenol per minute was defined as 1 U.
  • the blank was mixed well by adding 10 ⁇ L of 2M sodium carbonate to 90 ⁇ L of 50 mM acetate buffer containing 1 mM p-nitrophenyl- ⁇ -lactopyranoside, and then 10 ⁇ L of enzyme diluent was added and reacted at 30 ° C. for 30 minutes. Then, the increase in absorbance at 405 nm was measured.
  • a substrate solution was prepared by suspending xylan (Xylan from Birch wood, manufactured by Fluka) in a 50 mM sodium acetate buffer (pH 5.0) so as to have a concentration of 1% by weight. 5 ⁇ L of the enzyme solution was added to the dispensed 500 ⁇ L of the substrate solution, and the reaction was carried out while rotating and mixing at 50 ° C. The reaction time was basically 30 minutes, and was appropriately changed from 10 to 60 minutes depending on the height of the enzyme activity. After the reaction, the tube was centrifuged, and the reducing sugar concentration of the supernatant component was measured by the DNS method.
  • the amount of enzyme that produces 1 ⁇ mol of reducing sugar in 1 minute in the above reaction system was defined as 1 U, and the activity value (U / mL) was calculated according to the following formula.
  • Xylan decomposition activity (U / mL) reducing sugar concentration (g / L) ⁇ 1000 ⁇ 505 ( ⁇ L) / (150.13 ⁇ reaction time (minutes) ⁇ 5 ( ⁇ L)).
  • the xylooligosaccharide described in this example refers to a xylobiose, xylobiose, xylotetraose, xylopentaose, xylohexaose having the same retention time as the standard in the method for measuring the sugar concentration.
  • Trichoderma Risei ATCC 66589 (distributed from ATCC) was inoculated into 100 mL of this pre-culture medium so as to be 1 ⁇ 10 5 cells / mL, and shake-cultured at 28 ° C. for 72 hours at 180 rpm to prepare a pre-culture (shake).
  • reaction solution was centrifuged to obtain a supernatant, and then a microfiltration membrane (GE W & PT DESALE series, material: polysulfone) having an average pore diameter of 0.04 ⁇ m was used, the operating temperature was 25 ° C., and the membrane surface velocity. It was filtered under the condition of 20 cm / sec.
  • a microfiltration membrane GE W & PT DESALE series, material: polysulfone
  • a heat-resistant ultrafiltration membrane having a molecular weight cut-off of 10,000 (GE W & PT “DURATHERM” (registered trademark) HWS UF type, material: polyether sulfone) was used, the operating temperature was 25 ° C., and the film surface velocity. Filtration was performed while controlling the operating pressure so that the flux was constant at 0.1 m / D under the condition of 20 cm / sec.
  • separation membrane A "DESAL G series GE (G-5) type” (membrane material: polyamide composite membrane, molecular weight cut-off 1,000, GE W & PT) Manufactured), was used for filtration.
  • G-5 type membrane material: polyamide composite membrane, molecular weight cut-off 1,000, GE W & PT
  • SEPA registered trademark
  • CF-II manufactured by GE W & PT, effective membrane area 140 cm 2
  • the operating temperature is 25 ° C.
  • the membrane surface line velocity is 20 cm / sec
  • the filtration pressure is 0.
  • the concentrations of the aromatic compound and the furan compound were measured for the obtained xylooligosaccharide solution according to Reference Example 7, it was 0.03% by weight with respect to the amount of the xylooligosaccharide, and the furan compound was not detected. .. Further, the total sugar concentration of the obtained xylooligosaccharide solution was adjusted to 5 g / L, and the absorbances at wavelengths of 420 nm and 280 nm measured using a 1 cm cell were 0.15 and 0.391, respectively. rice field.
  • Piglet breeding test using a commercially available xylooligosaccharide composition (derived from corn cob)
  • a corn cob-derived xylooligosaccharide composition (product food science, 70 L of xylooligosaccharide) commercially available as xylooligosaccharide is used in Reference Example 12.
  • the piglet breeding test was carried out in the same manner as in Reference Example 12 by adding the feed to the commercially available compound feed.
  • the sugar composition of this xylooligosaccharide composition measured according to Reference Example 6 is as shown in Table 1, and the xylooligosaccharide composition was added so that the amount of xylooligosaccharide added to the mixed feed was 200 ppm.
  • the breeding test results are shown in Table 2.
  • Example 1 Piglet breeding test using an alkaline pretreated bagasse-derived xylooligosaccharide composition
  • Table 2 As a result, it was found that when an alkaline pretreated bagasse-derived xylooligosaccharide was used, the frequency of diarrhea was lower than that of a commercially available xylooligosaccharide derived from corn cob, and the effect of suppressing diarrhea was excellent. Furthermore, it was found that the feed conversion ratio was also improved as compared with the corn cob-derived xylooligosaccharide.

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Abstract

アルカリ前処理バガス由来オリゴ糖組成物は優れた下痢抑制作用を有し、下痢抑制剤の有効成分として利用できる。

Description

下痢抑制剤
　本発明は、アルカリ前処理バガス由来のオリゴ糖を有効成分とする下痢抑制剤に関する。
　家畜やペットなどの飼料は、一般的に加熱処理等は行われないため、消化吸収率が低くなり、飼料効率が悪く、下痢などの症状を引き起こすという問題がある。そのため、抗生物質を家畜飼料に添加して家畜が下痢や感染症に感染することを防ぐことで効率的な畜産物生産に寄与すると考えられ、抗生物質は使用されてきた。一方で、抗生物質を使用することで家畜中に薬剤耐性菌が出現して環境中に拡散し、ヒトにも水平伝搬することが懸念されている。そこで、欧州では成長促進を目的とした家畜飼料への抗生物質添加を禁止している。このようなことから、抗生物質に代わる有用物質に期待が寄せられている。
　キシロオリゴ糖は、キシロース単位がβ－グリコシド結合により複数個結合したオリゴ糖の総称である。キシロオリゴ糖は、優れた整腸作用を示すことなどから機能性食品用の素材としても用いられている（非特許文献１）。
　キシロオリゴ糖は、セルロース系バイオマスに含まれるキシランを加水分解することで得ることができ、加水分解の方法としては、水熱処理する方法（非特許文献２）、酸加水分解する方法（非特許文献３）、酵素処理する方法（特許文献１）が知られている。
　一方、キシロオリゴ糖の原料であるセルロース系バイオマスとしては様々なバイオマスが使用されており、パルプやトウモロコシの穂軸から製造されている（特許文献２）。
特開２０１９－１９５３０３号公報 特開２０００－３３３６９２号公報
Ａｙｙａｐｐａｎ　ＡＡら，Ｃｏｍｐｒｅ．Ｒｅｖ．Ｆｏｏｄ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ　Ｓａｆ．１０，２－１６（２０１１） Ｐａｔｒｉｃｉａ　Ｍら，Ｉｎｄ．Ｃｒｏｐｓ．Ｐｒｏｄ．６２，４６０－４６５（２０１４） Ｏｚｌｅｍ　Ａら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３４４，６６０－６６６（２００９）
　本発明は、既存のキシロオリゴ糖よりも優れた下痢抑制作用を有する下痢抑制剤を提供することを目的とする。
　本発明者らが鋭意検討した結果、アルカリ前処理バガス由来のオリゴ糖は、市販されているコーンコブ由来のキシロオリゴ糖よりも下痢抑制効果が高いことを見出した。
　すなわち、本発明は以下の（１）～（１０）の通りである。
（１）アルカリ前処理バガス由来オリゴ糖組成物を有効成分とする、下痢抑制剤。
（２）前記オリゴ糖組成物が、アルカリ前処理バガスの加水分解酵素処理物由来である、（１）に記載の下痢抑制剤。
（３）前記オリゴ糖がキシロオリゴ糖である、（１）または（２）に記載の下痢抑制剤。
（４）前記キシロオリゴ糖が、キシロビオース、キシロトリオース、キシロテトラオース、キシロペンタオースおよびキシロヘキサオースからなる群から選択される１種または２種以上の混合物である、（３）に記載の下痢抑制剤。
（５）（１）から（４）のいずれかに記載の下痢抑制剤を含有する、飼料。
（６）（１）から（４）のいずれかに記載の下痢抑制剤を含有する、家畜飼料。
（７）アルカリ前処理バガス由来オリゴ糖組成物を有効成分とする、動物の成長促進剤。
（８）アルカリ前処理バガス由来オリゴ糖組成物をヒトまたはヒト以外の動物に投与する、下痢抑制方法。
（９）アルカリ前処理バガス由来オリゴ糖組成物をヒト以外の動物に投与する、動物の成長促進方法。
（１０）アルカリ前処理バガス由来オリゴ糖組成物をヒト以外の動物に投与する、動物の飼料要求率改善方法。
　本発明によれば、アルカリ前処理由来のオリゴ糖組成物は下痢抑制効果に優れており、下痢抑制剤の有効成分として有用である。
　本発明の下痢抑制剤の有効成分であるオリゴ糖組成物は、アルカリ前処理バガスを加水分解反応することにより得られる。
　バガスのアルカリ前処理において、アルカリ処理に使用するアルカリ性溶液に特に限定はされないが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、アンモニアを用いることができる。安価で扱いやすいという観点で、水酸化ナトリウムが好ましい。アルカリ処理条件としては、バガス固形分濃度がアルカリ水溶液と混合した状態で０．１～５０重量％、好ましくは１～２０重量％、さらに好ましくは５～１０重量％の範囲に設定する。バガス固形分濃度が０．１重量％未満であると、水の使用量が極端に多くなり、経済的に不利になる。一方、バガス固形分濃度が５０重量％を超えると、バガスがアルカリ溶液に浸らなくなり、前処理の効果が十分に得られないことがある。
　アルカリ前処理でのアルカリ添加量としては、例えば、水酸化ナトリウム水溶液を用いる場合、水酸化ナトリウムの添加量がバガス固形分に対して０．１～１００重量％、好ましくは１～５０重量％、さらに好ましくは５～１５重量％の範囲で添加する。添加するアルカリ量が０．１重量％未満であると、後段での加水分解が進行しにくくなり、十分なキシロオリゴ糖収量が得られないことがある。一方、添加量が１００重量％を超えると、アルカリ量が増大することに加え、加水分解反応を行う際のｐＨ調整に使用する酸量が増大し、経済的に不利になる。
　アルカリ処理を行う温度は１０～２００℃が好ましく、加水分解における糖収率の観点から、２５～１２０℃がより好ましく、８０～１００℃がさらに好ましく、８５～１００℃が特に好ましい。
　アルカリ処理の時間は、アルカリ量等に応じて適宜設定でき、通常、０．５時間～２４時間程度である。
　アルカリ前処理は常温下、加圧下のどちらで行われても良いが、好ましくは常圧下で行われるのが良い。
　アルカリ前処理後の前処理物は、そのまま加水分解反応に供してもよいが、加水分解反応の前に固液分離し、得られた固体分を前処理物として加水分解に供することが好ましい。固液分離の手法としては、スクリューデカンタなどの遠心分離法、加圧・吸引濾過などの濾過法、または精密濾過などの膜濾過法など公知の手法を用いることができる。また、前処理バガスの固体分を固液分離の前後で純水により洗浄してもよい。洗浄することにより、リグニン分解物などの酵素反応阻害物質をさらに低減でき、加水分解反応の際のｐＨ調整に必要な酸の量も低減できるため好ましい。
　前記オリゴ糖組成物に含まれるオリゴ糖の種類は特に限定されないが、キシロオリゴ糖であることが好ましい。キシロオリゴ糖は、キシロース単位が２～６個で共有結合した構造であることが好ましいが、限定はされず、側鎖が含まれていても良い。キシロース同士はβ－グリコシド結合で連結している。これらは、キシロース単位の数に応じて、キシロビオース（２糖）、キシロトリオース（３糖）、キシロテトラオース（４糖）、キシロペンタオース（５糖）、キシロヘキサオース（６糖）と呼ばれる。下痢抑制剤の有効成分としてはこれらのうちの１種または２種以上の混合物であればよいが、３種以上の混合物であることがより好ましく、４種以上の混合物であることがより好ましく、キシロビオース、キシロトリオース、キシロテトラオースおよびキシロペンタオースの混合物が含まれることが特に好ましい。
　本発明の下痢抑制剤の有効成分であるオリゴ糖組成物は、アルカリ前処理バガスの前処理物の加水分解反応によって得られ、好ましくは、アルカリ前処理バガスの前処理物の酵素による加水分解によって得られる。
　アルカリ前処理バガスの前処理物の加水分解反応に使用する酵素としては特に限定はされないが、セルラーゼ組成物を使用することが好ましい。セルラーゼ組成物は、β－１，４－グルカンのグリコシド結合を加水分解する種々の加水分解酵素の混合物である。セルラーゼ組成物に含まれる加水分解酵素とは例えば、セロビオハイドラーゼ、キシラナーゼ、エンドグルカナーゼ、β－グルコシダーゼ、β－キシロシダーゼ、アラビノフラノシダーゼ、キシランエステラーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、α－グルクロニダーゼ、キトサナーゼ、キチナーゼ、マンナナーゼ、マンノシダーゼ、α－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼなどが挙げられる。加水分解反応で用いるセルラーゼ組成物にはこのうち、バガスに対して加水分解時において少なくともキシラナーゼ、セオビロハイドラーゼおよびβ－グルコシダーゼの活性を有しており、かつβ－キシロシダーゼの活性を実質的に有していないセルラーゼ組成物がキシロオリゴ糖生産の観点から好ましく使用される。また、これらの酵素活性の由来は、特に限定されない。このようなセルラーゼ組成物の調製例は、ＷＯ２０１７／１７０９１９号またはＷＯ２０１７／１７０９１７号に記載されている。また、微生物を培養して得られた培養液をセルラーゼ組成物としてそのまま用いてもよいし、培養液から精製された酵素、他の市販の酵素製品、を混合して本発明に用いることもできる。
　微生物に由来するセルラーゼ組成物を用いる場合、微生物としては、真菌を好ましく用いることができる。真菌の具体例としては、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、セルロモナス属（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）、クロストリジウム属（Ｃｈｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、イルペックス属（Ｉｒｐｅｘ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）などの微生物を例示することができる。これら真菌の中でもトリコデルマ属、アスペルギルス属真菌が好ましい。
　トリコデルマ属真菌の具体例としては、トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ＱＭ９４１４）、トリコデルマ・リーセイＱＭ９１２３（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ＱＭ９１２３）、トリコデルマ・リーセイＲｕｔＣ－３０（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ＲｕｔＣ－３０）、トリコデルマ・リーセイＰＣ３－７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ＰＣ３－７）、トリコデルマ・リーセイＣＬ－８４７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ＣＬ－８４７）、トリコデルマ・リーセイＭＣＧ７７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　
ＭＣＧ７７）、トリコデルマ・リーセイＭＣＧ８０（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ＭＣＧ８０）、トリコデルマ・ビリデＱＭ９１２３（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｖｉｒｉｄｅ　ＱＭ９１２３）を例示することができる。これらトリコデルマ属真菌の中でも、トリコデルマ・リーセイが好ましい。また、上記のセルラーゼ組成物を生産する真菌に変異剤または紫外線照射などで変異処理を施すことによりセルラーゼ組成物の生産性が向上した変異株や、β－キシロシダーゼの活性が低下した変異株も好ましく用いることができる。
　また、アスペルギルス属真菌の具体例としては、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・アクレアータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｔｅｒｒｅｕｓ）を例示することができる。
　セルラーゼ組成物として、上記の真菌のうち１種類の真菌由来のセルラーゼ組成物を用いてもよいし、複数の真菌由来のセルラーゼ組成物を混合して用いてよい。複数の真菌由来のセルラーゼ組成物を用いる場合、組み合わせは特に限定されないが、例えばトリコデルマ属真菌由来のセルラーゼ組成物と、アスペルギルス属真菌由来のセルラーゼ組成物を混合して用いても良い。具体的には、アスペルギルス属真菌由来のβ－グルコシダーゼとして、“Ｎｏｖｏｚｙｍｅ１８８”（ノボザイムズ社）、“β－Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ　ｆｒｏｍ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ”（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社）、“スミチームＢＧＡ”（新日本化学工業株式会社）などを例示することができる。なお、β－グルコシダーゼ活性成分は、上記したアスペルギルス属真菌のβ－グルコシダーゼ活性成分を含むことが好ましい。
　前記オリゴ糖組成物は、アルカリ前処理物の加水分解によりオリゴ糖を含む糖液として得られるが、糖液中に含まれるグルコース、キシロースなどの単糖類からオリゴ糖を後工程で選択的に分離または濃縮することが好ましい。分離または濃縮の方法としては、特に限定はされないが、膜分離が好ましく使用される。また、膜分離に使用する膜の種類は特に限定はされないが、ポリアミド製分離膜が好ましく使用される。また、ポリアミド製分離膜の分画分子量も特に限定はされないが、分画分子量２００～１０００の範囲のものが好ましく使用される。分画分子量３００～１，０００の範囲のポリアミド製分離膜に通じて濾過する際には、非透過側にキシロオリゴ糖は選択的に濃縮される。
　前記糖液を分画分子量３００～１，０００のポリアミド製分離膜に通じて濾過する前工程として、分画分子量２，０００～１００，０００の分離膜に通じて濾過を行ってもよい。前工程で用いる分画分子量２，０００～１００，０００の分離膜は、その後使用するポリアミド製分離膜の分画分子量よりも大きく、また、キシロビオースをはじめとするキシロオリゴ糖を透過し、酵素などの高分子成分を透過しないものであれば特に制限はないが、分画分子量５，０００～５０，０００の範囲がより好ましく、さらに好ましくは分画分子量１０，０００～３０，０００の範囲である。分画分子量２，０００～１００，０００の分離膜に通じて得られる透過液からは、前記糖液の調製に使用した酵素成分などを除くことができ、オリゴ糖濃縮液中の不純物を減少させるとともに、後工程で使用するポリアミド製分離膜への負荷を低減することができる。分画分子量２，０００～１００，０００の分離膜の素材としては、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリスルホン（ＰＳ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリフッ化ビニルデン（ＰＶＤＦ）、再生セルロース、セルロース、セルロースエステル、スルホン化ポリスルホン、スルホン化ポリエーテルスルホン、ポリオレフィン、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタクリレート、ポリ４フッ化エチレンなどを使用することができる。ただし、前記糖液をバイオマスの酵素処理により調製する場合、酵素剤にセルロース分解に関わる酵素群が含まれていることがあり、再生セルロース、セルロース、セルロースエステルが分解を受けるため、ＰＥＳ、ＰＶＤＦなどの合成高分子を素材とした分離膜を使用することが好ましい。
　分画分子量２，０００～１００，０００の分離膜の具体例としては、ＧＥ　Ｗ＆ＰＴ社製ＤＥＳＡＬブランドのＭシリーズ、Ｐシリーズ、ＧシリーズのＧＨ（Ｇ－１０）タイプ、ＧＫ（Ｇ－２０）タイプ、ＧＭ（Ｇ－５０）タイプ、“ＤＵＲＡＴＨＥＲＭ”（登録商標）シリーズのＨＷＳ　ＵＦタイプ、ＳＴＤ　ＵＦタイプや、Ｓｙｎｄｅｒ社製のＶＴ、ＭＴ、ＳＴ、ＳＭ、ＭＫ、ＭＷ、ＬＹ、ＢＮ、ＢＹ、旭化成株式会社製の“マイクローザ”（登録商標）ＵＦシリーズ、日東電工株式会社製のＮＴＲ－７４１０、ＮＴＲ－７４５０などがある。
　また、分画分子量２，０００～１００，０００の分離膜による濾過の前に糖液を精密濾過膜に通じて濾過して微粒子を取り除くことが好ましい。精密濾過膜は、平均細孔径が０．０１～１０μｍ程度の分離膜が好ましく用いられる。
　前記オリゴ糖組成物は、アルカリ前処理バガス由来の着色があっても良い。着色の程度は特に限定はされないが、総糖濃度が５ｇ/Ｌになるように希釈して１ｃｍのセルを使用して測定した波長４２０ｎｍの吸光度が０．１～１．０であることが好ましく、０．１５～０．８であることがより好ましい。
　前記オリゴ糖組成物には、アルカリ前処理バガス由来のリグニン分解物、具体例として、ＨＭＦ、フルフラールなどのフラン系化合物や、バニリンなどの芳香族化合物が本発明の効果を阻害しない範囲であれば含まれていてもよいが、バガス前処理時の前処理物を純水で洗浄することで低減できるため、できるだけ低減させることが好ましい。具体的には、オリゴ糖組成物に含まれるリグニン分解物量は、オリゴ糖量に対して０．１重量％以下が好ましく、０．０８重量％以下がさらに好ましく、０．０６重量％以下がさらに好ましく、０．０５重量％以下がさらに好ましく、０．０４重量％以下がさらに好ましく、０．０３重量％以下がさらに好ましく、０．０２重量％以下が特に好ましい。
　前記オリゴ糖組成物の主成分となる糖はオリゴ糖であるが、アルカリ前処理バガス由来のグルコース、キシロースなどの単糖類が含まれても良い。また、組成物中の総糖濃度は特に限定はされないが、輸送上の観点から２０重量％以上が好ましく、２５重量％以上がさらに好ましく、３０重量％以上がさらに好ましく、３５重量％以上がさらに好ましく、４０重量％以上が特に好ましい。
　前記オリゴ糖組成物中のオリゴ糖含有量は特に限定はされないが、保管上、輸送上の観点から１０重量%以上が好ましく、１５重量％以上がさらに好ましく、２０重量％以上がさらに好ましく、２５重量％以上がさらに好ましく、０重量％以上が特に好ましい。
　前記オリゴ糖組成物には、前述の物質以外のアルカリ前処理バガス由来の物質が含まれていてもよく、その程度は特に限定はされないが、総糖濃度が５ｇ/Ｌになるように希釈して１ｃｍのセルを使用して測定した波長２８０ｎｍの吸光度が０．２～１．０であることが好ましく、０．３～０．８であることがより好ましい。
　前記オリゴ糖組成物は、必要に応じて減圧濃縮や蒸発濃縮を行ったりしてもよく、また、その形状は液状または粉末状であっても良い。粉末状のオリゴ糖は、液状のオリゴ糖を用いてスプレードライ法など公知の粉末化方法により製造することができる。
　本発明の下痢抑制剤は、ヒトまたはヒト以外の動物に投与することにより下痢抑制効果を得ることができるが、ヒト以外の動物に投与することが好ましい。投与の方法については特に限定はされないが、食品または飼料に含まれる成分または添加物として使用することができる。
　本発明の下痢抑制剤をヒトまたはヒト以外の動物に投与する場合、投与量としては特に限定はされないが、オリゴ糖を食品や飼料に対して５０～５００ｐｐｍ添加するのが好ましく、さらに好ましくは１００～４００ｐｐｍであり、さらに好ましくは１００～３００ｐｐｍであり、さらに好ましくは１００～２００ｐｐｍである。配合飼料とは、必要な栄養分（タンパク質、エネルギー）を配合して作った飼料であり、成分について特に限定はない。
　本発明の下痢抑制剤をヒト以外の動物に投与する場合、投与する動物は特に限定はされないが、家畜が好ましく、ブタ、ブロイラーまたは採卵鶏がより好ましく、ブタまたはブロイラーがさらに好ましく、ブタが特に好ましい。
　本発明の下痢抑制剤を使用することで下痢の発生頻度が低下する。下痢の発生頻度は、例えば、家畜の場合は以下の式（１）で表される。本発明の下痢抑制剤による下痢の発生頻度の低下程度は特に限定はされないが、０．２％以上低下していることが好ましく、０．３％以上がより好ましく、０．４％以上がさらに好ましく、０．５％以上がよりさらに好ましく、０．７％以上がよりさらに好ましく、０．８％以上がよりさらに好ましく、１％以上がよりさらに好ましく、２％以上がよりさらに好ましく、３％以上よりさらに好ましく、４％以上がよりさらに好ましく、５％以上が特に好ましい。
（下痢症状のある頭数／日の合計）／(全頭数×日数)×１００・・・式（１）。
　アルカリ前処理由来オリゴ糖をヒト以外の動物、好ましくは家畜に使用すると、飼料要求率の改善効果が得られるため、成長促進剤として好ましく使用される。飼料要求率とは動物の体重を１ｋｇ増加させるのに必要な飼料量ｋｇを示す。飼料要求率の改善とは、飼料要求率が低下することを指す。本発明の下痢抑制剤を使用すると、本発明の下痢抑制剤を添加していないコントロール、また市販のコーンコブ由来キシロオリゴ糖組成物を添加した場合と比較して、飼料要求率が低下する。飼料要求率の低下の程度は低下していれば特に限定はされないが、０．０１以上低下していることが好ましく、０．０１５以上がより好ましく、０．０２以上がさらに好ましく、０．０２５以上がよりさらに好ましく、０．０３以上が特に好ましい。
　以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
　（参考例１）タンパク質濃度測定方法
　市販のタンパク質濃度測定試薬（Ｑｕｉｃｋ　Ｓｔａｒｔ　Ｂｒａｄｆｏｒｄプロテインアッセイ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ製）を使用した。室温に戻したタンパク質濃度測定試薬２５０μＬに希釈した糸状菌由来セルラーゼ溶液を５μＬ添加し、室温で５分間静置後の５９５ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。標準品としてＢＳＡを使用し、検量線に照らし合わせてタンパク質濃度を算出した。
　（参考例２）β－キシロシダーゼ活性測定方法
　β－キシロシダーゼ活性測定方法は具体的には１ｍＭｐ－ニトロフェニル－β－キシロピラノシド（シグマアルドリッチジャパン社製）を含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬ中で酵素希釈液１０μＬを用いて３０℃で反応を行い、３０分後に２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合して反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定した。１分間あたり１μｍｏｌのｐ－ニトロフェノールを遊離する活性を１Ｕと定義した。ブランクは、１ｍＭｐ－ニトロフェニル－β－キシロピラノシドを含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬに２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合し、その後酵素希釈液１０μＬを添加し３０℃で３０分間反応させた。その後、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定した。
　（参考例３）β－グルコシダーゼ活性測定方法
　β－グルコシダーゼ活性測定方法は具体的には１ｍＭｐ－ニトロフェニル－β－グルコピラノシド（シグマアルドリッチジャパン社製）を含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬ中で酵素希釈液１０μＬを用いて３０℃で反応を行い、１０分後に２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合して反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定した。１分間あたり１μｍｏｌのｐ－ニトロフェノールを遊離する活性を１Ｕと定義した。ブランクは、１ｍＭｐ－ニトロフェニル－β－グルコピラノシドを含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬに２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合し、その後酵素希釈液１０μＬを添加し３０℃で３０分間反応させた。その後、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定した。
　（参考例４）セロビオハイドロラーゼ活性測定方法
　セロビオハイドロラーゼ活性測定方法は具体的には１ｍＭｐ－ニトロフェニル－β－ラクトピラノシド（シグマアルドリッチジャパン社製）を含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬ中で酵素希釈液１０μＬを用いて３０℃で反応を行い、６０分後に２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合して反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定した。１分間あたり１μｍｏｌのｐ－ニトロフェノールを遊離する活性を１Ｕと定義した。ブランクは、１ｍＭｐ－ニトロフェニル－β－ラクトピラノシドを含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬに２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合し、その後酵素希釈液１０μＬを添加し３０℃で３０分間反応させた。その後、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定した。
　（参考例５）キシラン分解活性
　５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に、１重量％になるようキシラン（Ｘｙｌａｎ　ｆｒｏｍ　Ｂｉｒｃｈ　ｗｏｏｄ、Ｆｌｕｋａ社製）を懸濁したものを基質溶液とした。分注した５００μＬの基質溶液に酵素液５μＬを添加し、５０℃で回転混和しながら反応させた。反応時間は３０分間を基本とし、酵素活性の高さに応じて１０～６０分間まで適宜変更した。反応後、チューブを遠心分離し、その上清成分の還元糖濃度をＤＮＳ法により測定した。上記反応系にて１分間に１μｍｏｌの還元糖を生成する酵素量を１Ｕと定義し、活性値（Ｕ／ｍＬ）を下記式に従って算出した。
キシラン分解活性（Ｕ／ｍＬ）＝還元糖濃度（ｇ／Ｌ）×１０００×５０５（μＬ）／（１５０．１３×反応時間（分）×５（μＬ））。
　（参考例６）糖濃度の測定
　キシロオリゴ糖、グルコース、キシロースは、高速液体クロマトグラフ“ＬａＣｈｒｏｍ　Ｅｉｔｅ”（株式会社日立製作所）を用いて、以下の条件で定量分析した。キシロオリゴ糖であるキシロビオース、キシロトリオース、キシロテトラオース、キシロペンタオース、キシロヘキサオース、およびグルコース、キシロースの標品で作製した検量線をもとに、定量分析した。なお、本実施例で記すキシロオリゴ糖とは、本糖濃度測定方法にて標品のキシロビオース、キシロトリオース、キシロテトラオース、キシロペンタオース、キシロヘキサオースとリテンションタイムが一致したキシロオリゴ糖を指す。
カラム：ＫＳ８０２、ＫＳ８０３（Ｓｈｏｄｅｘ）
移動相：水
検出方法：ＲＩ
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
温度：７５℃。
　（参考例７）フラン系・芳香族系化合物の濃度の測定方法
　糖液に含まれるフラン系化合物（ＨＭＦ、フルフラール）および芳香族系化合物（バニリンなど）の濃度は、以下に示す条件でＨＰＬＣにより分析し、標品との比較により定量した。
カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉ　ＨｉｄｒｏＲＰ　４．６ｍｍ×２５０ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ製）
移動相：アセトニトリル－０．１％Ｈ３ＰＯ４（流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）検出方法：ＵＶ（２８３ｎｍ）
温度：４０℃。
　（参考例８）アルカリ前処理バガスの作製
　バガス５ｇを量りとり、１０５℃になるまで加熱した。このときの重量変化をもとにバガスの固形分率を算出した。含水状態のバガスに固形分率を乗じたものを固形分重量とした。バガス１００ｇを固形分重量が水酸化ナトリウム溶液と混合した状態で８重量％、バガス固形分に対する水酸化ナトリウム添加量が１０重量％になるように、水酸化ナトリウム水溶液に浸し、８５℃にて３時間前処理した。前処理後、ザルで固形分を荒く分離した後、バガス固形分重量が５重量％になるまで純水で洗浄を実施した。その後、遠心分離（３，０００Ｇ、１０分）にて固液分離し、溶液成分と固体分に分離した。固体分を純水で洗浄したものを前処理物として以下の実験に使用した。
　（参考例９）セルラーゼ組成物の調製
　［前培養］
　コーンスティップリカー５％（ｗ／ｖｏｌ）、グルコース２％（ｗ／ｖｏｌ）、酒石酸アンモニウム０．３７％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸アンモニウム０．１４（ｗ／ｖｏｌ）、リン酸二水素カリウム０．２％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化カルシウム二水和物０．０３％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸マグネシウム七水和物０．０３％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化亜鉛０．０２％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化鉄(ＩＩＩ)六水和物０．０１％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸銅(ＩＩ)五水和物０．００４％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化マンガン四水和物０．０００８％（ｗ／ｖｏｌ）、ホウ酸０．０００６％（ｗ／ｖｏｌ）、七モリブデン酸六アンモニウム四水和物０．００２６％（ｗ／ｖｏｌ）となるよう蒸留水に添加して、１００ｍＬを５００ｍＬバッフル付き三角フラスコに張り込み、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、これとは別にそれぞれ１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌したＰＥ－ＭとＴｗｅｅｎ８０をそれぞれ０．０１％（ｗ／ｖｏｌ）添加し、前培養培地とした。この前培養培地１００ｍＬにトリコデルマ・リーセイＡＴＣＣ６６５８９（ＡＴＣＣより分譲）を１×１０５個／ｍＬになるように植菌し、２８℃、７２時間、１８０ｒｐｍで振とう培養し、前培養とした（振とう装置：ＴＡＩＴＥＣ社製　ＢＩＯ－ＳＨＡＫＥＲ　ＢＲ－４０ＬＦ）。
　［本培養］
　コーンスティップリカー５％（ｗ／ｖｏｌ）、グルコース２％（ｗ／ｖｏｌ）、セルロース（アビセル）１０％（ｗ／ｖｏｌ）、酒石酸アンモニウム０．３７％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸アンモニウム０．１４％（ｗ／ｖｏｌ）、リン酸二水素カリウム０．２％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化カルシウム二水和物０．０３％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸マグネシウム七水和物０．０３％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化亜鉛０．０２％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化鉄(ＩＩＩ)六水和物０．０１％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸銅(ＩＩ)五水和物０．００４％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化マンガン四水和物０．０００８％（ｗ／ｖｏｌ）、ホウ酸０．０００６％（ｗ／ｖｏｌ）、七モリブデン酸六アンモニウム四水和物０．００２６％（ｗ／ｖｏｌ）となるよう蒸留水に添加して、２．５Ｌを５Ｌ容撹拌ジャー（ＡＢＬＥ社製　ＤＰＣ－２Ａ）容器に張り込み、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、これとは別にそれぞれ１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌したＰＥ－ＭとＴｗｅｅｎ８０をそれぞれ０．１％添加し、本培養培地とした。この本培養培地２．５Ｌにあらかじめ前記の前培養培地で前培養したトリコデルマ・リーセイＰＣ３－７を２５０ｍＬ接種した。その後、２８℃、８７時間、３００ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍにて培養を行い、遠心分離後、上清を膜濾過（ミリポア社製　ステリカップ－ＧＶ　材質：ＰＶＤＦ）した。この調製した培養液に対し、β－グルコシダーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ１８８）をタンパク質重量比として、１／１００量添加し、セルラーゼ組成物を得た。
　（参考例１０）β－キシロシダーゼ活性を選択的に低減したセルラーゼ組成物の調製
　参考例９で得られたセルラーゼ組成物のｐＨを１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．５～８．０に調整し、水によりタンパク質濃度４ｇ／Ｌまで希釈後、４０～５０℃の温度範囲で保温した。参考例２，３，４、５に記載の方法でセロビオハイドラーゼの活性、β－グルコシダーゼの活性、キシラン分解活性、β－キシロシダーゼの活性を測定した結果より、酵素活性の最適ｐＨにおけるβ－キシロシダーゼの活性は、バイオマスに対する加水分解時に実質的に活性を有さない値（２００Ｕ／－ｐｒｏｔｅｉｎ以下）にまで低減され、セロビオハイドラーゼの活性、β－グルコシダーゼの活性、キシラン分解活性は６０％以上残存していることから、β－キシロシダーゼ活性が選択的に失活していた。
　（参考例１１）キシロオリゴ糖液の製造
　参考例８のアルカリ前処理バガスを乾燥重量５重量％になるように仕込み、希塩酸を加えてｐＨ７．０に調製した。ｐＨを調製した前処理バガスに参考例９のβ－キシロシダーゼ活性が選択的に低減したセルラーゼ組成物を８ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－バイオマスになるように添加し、ハイブリダイゼーションローテータを用いてｐＨ７．０、４０℃で８時間回転混和した。その後、反応液は遠心分離で上清を得た後、平均細孔径０．０４μｍの精密濾過膜（ＧＥ　Ｗ＆ＰＴ社製　ＤＥＳＡＬ　Ｅシリーズ、材質：ポリサルホン）を用い、操作温度２５℃、膜面線速度２０ｃｍ／ｓｅｃの条件下にて濾過した。
　次に、分画分子量１０，０００の耐熱性限外濾過膜（ＧＥ　Ｗ＆ＰＴ社製　“ＤＵＲＡＴＨＥＲＭ”（登録商標）ＨＷＳ　ＵＦタイプ、材質：ポリエーテルスルホン）を用い、操作温度２５℃、膜面線速度２０ｃｍ／ｓｅｃの条件下でフラックスが０．１ｍ／Ｄで一定となるように操作圧力を制御しながら濾過を行った。その後、キシロオリゴ糖と単糖類を分離するため、分離膜として、分離膜Ａ：“ＤＥＳＡＬ　ＧシリーズＧＥ（Ｇ－５）タイプ”（膜材質：ポリアミド複合膜、分画分子量１，０００、ＧＥ　Ｗ＆ＰＴ社製）、を使用し、濾過を行った。膜分離装置は“ＳＥＰＡ”（登録商標）　ＣＦ－ＩＩ（ＧＥ　Ｗ＆ＰＴ社製、有効膜面積１４０ｃｍ２）を使用し、操作温度は２５℃、膜面線速度は２０ｃｍ／ｓｅｃとし、濾過圧０．５ＭＰａの条件下で濾過処理を行い、非透過液を回収し、キシロオリゴ糖を選択的に濃縮した。その後、減圧濃縮を行うことでキシロオリゴ糖液を製造した。参考例６に従って測定したキシロオリゴ糖液に含まれる糖の組成を表１に示す。キシロオリゴ糖液中のキシロオリゴ糖含有量は１７重量％であった。
　また、得られたキシロオリゴ糖液について参考例７に従って芳香族系化合物とフラン系化合物の濃度を測定したところ、キシロオリゴ糖量に対して０．０３重量％であり、フラン系化合物は検出されなかった。さらに、得られたキシロオリゴ糖液の総糖濃度を５ｇ／Ｌになるように調製し、１ｃｍのセルを使用して測定した波長４２０ｎｍおよび２８０ｎｍの吸光度は、それぞれ０．１５および０．３９１であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（参考例１２）オリゴ糖を使用しない子豚飼育試験
　体重約８ｋｇの子豚を１８頭（雄９頭、雌９頭）について、市販の配合飼料を用いて飼育試験を実施した。試験中、下痢症状のある子豚をカウントし、また体重増加と飼料摂取量について記録し、下痢の発生頻度と２８日後の飼料要求率を算出した。飼育試験結果を表２に示す。
　（比較例１）市販キシロオリゴ糖組成物（コーンコブ由来）を使用した子豚飼育試験
　キシロオリゴ糖として市販されているコーンコブ由来のキシロオリゴ糖組成物（物産フードサイエンス、キシロオリゴ糖７０Ｌ）を参考例１２で使用した市販の配合飼料に添加し、参考例１２と同様に子豚飼育試験を実施した。参考例６に従って測定した本キシロオリゴ糖組成物の糖組成は表１に示す通りであり、配合飼料に対するキシロオリゴ糖添加量が２００ｐｐｍとなるようキシロオリゴ糖組成物を添加した。飼育試験結果を表２に示す。
　（実施例１）アルカリ前処理バガス由来キシロオリゴ糖組成物を使用した子豚飼育試験
　参考例１１で製造したアルカリ前処理バガス由来キシロオリゴ糖組成物を使用する以外は比較例１と同様の方法で子豚飼育試験を実施した。飼育試験結果を表２に示す。これにより、アルカリ前処理バガス由来のキシロオリゴ糖を使用した場合には、コーンコブ由来の市販キシロオリゴ糖と比較して、下痢の発生頻度が低くなり、下痢抑制の効果が優れることが判明した。さらに、飼料要求率に関してもコーンコブ由来のキシロオリゴ糖と比較して改善されていることが判明した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002

Claims (10)

  1. 　アルカリ前処理バガス由来オリゴ糖組成物を有効成分とする、下痢抑制剤。
  2. 　前記オリゴ糖組成物が、アルカリ前処理バガスの加水分解酵素処理物由来である、請求項１に記載の下痢抑制剤。
  3. 　前記オリゴ糖がキシロオリゴ糖である、請求項１または２に記載の下痢抑制剤。
  4. 　前記キシロオリゴ糖が、キシロビオース、キシロトリオース、キシロテトラオース、キシロペンタオースおよびキシロヘキサオースからなる群から選択される１種または２種以上の混合物である、請求項３に記載の下痢抑制剤。
  5. 　請求項１から４のいずれか１項に記載の下痢抑制剤を含有する、飼料。
  6. 　請求項１から４のいずれか１項に記載の下痢抑制剤を含有する、家畜飼料。
  7. 　アルカリ前処理バガス由来オリゴ糖組成物を有効成分とする、動物の成長促進剤。
  8. 　アルカリ前処理バガス由来オリゴ糖組成物をヒトまたはヒト以外の動物に投与する、下痢抑制方法。
  9. 　アルカリ前処理バガス由来オリゴ糖組成物をヒト以外の動物に投与する、動物の成長促進方法。
  10. 　アルカリ前処理バガス由来オリゴ糖組成物をヒト以外の動物に投与する、動物の飼料要求率改善方法。
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