CN110835621B - 一种基因工程菌及其在生产木糖醇中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基因工程菌及其在生产木糖醇中的应用。本发明通过在大肠杆菌染色体中插入一拷贝的葡萄糖脱氢基因zwf，胞内NADPH供应和木糖醇产量有所提高；再插入一拷贝的葡萄糖酸脱氢酶基因gnd，胞内NADPH供应和木糖醇产量进一步提高；最后敲除EMP路径关键酶基因pgi，胞内NADPH供应和木糖醇产量显著提高。构建的大肠杆菌基因工程菌2bzwfgndΔpgi相比出发菌株IS5‑5大幅提高木糖醇浓度、生产效率以及木糖醇对葡萄糖的产率。

Description

一种基因工程菌及其在生产木糖醇中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种基因工程菌及其在生产木糖醇中的应用。

背景技术

木糖醇作为一种天然存在的五碳糖醇，是一种白色的粉末状晶体，存在于许多植物和微生物体内，同时在人体的正常代谢中间产物中，也有木糖醇的存在。木糖醇在食品、医药、化妆品和保健品中都有广泛的应用。目前利用枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌、酵母以及大肠杆菌作为宿主生产木糖醇均有报道。木糖醇的生物技术生产是增加木质纤维素价值的有吸引力的途径，然而，辅因子供应通常限制了木糖醇生物合成的商业化。

申请人在公开号为CN105671013A的发明专利申请中公开了一种木糖还原酶突变体和基因工程菌，该木糖还原酶突变体来源为粗糙脉孢菌的木糖还原酶的8个氨基酸分别进行突变，8个氨基酸分别突变为：L102V，L107M，L109Q，I110C，V114I，KSN271-273RTT，获得的木糖还原酶突变体命名为XR-8M，经过突变后所得的木糖还原酶突变体降低了催化阿拉伯糖为阿拉伯糖醇的活性，提高了其转化木糖醇的选择性。

申请人在公开号为CN104789586A的发明专利申请中公开了：将插入序列IS5与R6K复制子、氯霉素抗性基因连接，然后与启动子P43、XR和终止子连接构建获得重组质粒pRC43。提取质粒pRC43，以HK401菌株为多拷贝整合宿主进行转化，获得的菌株再制备成感受态，导入PCP20质粒，借助FRT位点将菌体携带的氯霉素抗性基因删除，如此往复获得不同拷贝数的菌株IS5-1，IS5-2，IS5-3，IS5-4，IS5-5，IS5-6，经验证当拷贝数达到5个时，菌株生产木糖的能力较优。

然而，限于辅酶NADPH的供应，IS5-5菌株生产木糖醇速率还不够高，木糖醇浓度和木糖醇对葡萄糖得率仍有待进一步提高。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的上述不足，提供了一种基因工程菌及其在生产木糖醇中的应用。

一种基因工程菌，在大肠杆菌中过表达葡萄糖脱氢酶。过表达的方式优选为，由大肠杆菌染色体中插入一拷贝的葡萄糖脱氢酶基因得到。所述葡萄糖脱氢酶基因为zwf基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。通过在大肠杆菌染色体中插入一拷贝的葡萄糖脱氢基因zwf，胞内NADPH供应和木糖醇产量有所提高。

所述的基因工程菌，在过表达葡萄糖脱氢酶的基础上，进一步在大肠杆菌中过表达葡萄糖酸脱氢酶。过表达的方式优选为，在大肠杆菌染色体中再插入一拷贝的葡萄糖酸脱氢酶基因。所述葡萄糖酸脱氢酶基因为gnd基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。通过在大肠杆菌染色体中插入一拷贝的葡萄糖脱氢基因zwf，胞内NADPH供应和木糖醇产量有所提高；再插入一拷贝的葡萄糖酸脱氢酶基因gnd，胞内NADPH供应和木糖醇产量进一步提高

所述的基因工程菌，在过表达葡萄糖脱氢酶和葡萄糖酸脱氢酶的基础上，进一步在大肠杆菌中基因沉默或基因敲除磷酸葡萄糖异构酶基因。所述磷酸葡萄糖异构酶基因为pgi基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。通过在大肠杆菌染色体中插入一拷贝的葡萄糖脱氢基因zwf，胞内NADPH供应和木糖醇产量有所提高；再插入一拷贝的葡萄糖酸脱氢酶基因gnd，胞内NADPH供应和木糖醇产量进一步提高；最后敲除EMP路径关键酶基因pgi，胞内NADPH供应和木糖醇产量显著提高。

优选的，上述基因的出发菌株为IS5-5。菌株IS5-5详见公开号为CN104789586A的发明专利申请。

本发明又提供了所述基因工程菌在生产木糖醇中的应用。生产木糖醇时使用半纤维素水解液作为原料，使用所述基因工程菌进行发酵。

zwf和gnd基因为葡萄糖PPP路径关键酶基因，pgi基因为EMP路径关键酶基因。使用磷酸戊糖途径(PPP)相关基因过表达和敲除糖酵解途径(EMP)相关基因的双重调节来重新路由葡萄糖中央代谢通量来强化大肠杆菌中的NADPH供应，从而提高由玉米芯水解液生产木糖醇的效率。

申请人发现在大肠杆菌染色体中插入一拷贝的葡萄糖PPP路径关键酶基因zwf和gnd，或者敲除EMP路径关键酶基因pgi均能够有效提高胞内NADPH/NADP⁺比例。

本发明所达到的有益效果是：摇瓶发酵结果表明，通过在大肠杆菌染色体中插入一拷贝的葡萄糖脱氢基因zwf，胞内NADPH供应和木糖醇产量有所提高；再插入一拷贝的葡萄糖酸脱氢酶基因gnd，胞内NADPH供应和木糖醇产量进一步提高；最后敲除EMP路径关键酶基因pgi，胞内NADPH供应和木糖醇产量显著提高。构建的大肠杆菌基因工程菌2bzwfgndΔpgi相比出发菌株IS5-5大幅提高木糖醇浓度、生产效率以及木糖醇对葡萄糖的产率。

附图说明

图1为出发菌株IS5-5利用玉米芯水解液15-L罐发酵生产木糖醇的浓度-时间关系曲线图。

图2为工程菌株2bzwfgndΔpgi利用玉米芯水解液15-L罐发酵生产木糖醇的浓度-时间关系曲线图。

具体实施方式

本发明是在申请号为201510196843.8、名为“大肠杆菌基因组整合载体、基因工程菌以及在生产木糖醇中的应用”发明专利申请的基础上做的进一步研究。

本实施例中用到的克隆用菌株为大肠杆菌DH5α，表达用菌株为大肠杆菌W3110，基因改造出发菌株为IS5-5(详见申请号为201510196843.8的发明专利)，均为本实验室保藏。CRISPR/Cas9基因编辑所用质粒pCas及pTargetF为中国科学院上海植生所杨晟研究员惠赠。

菌株构建所用引物如表1所示。

表1

Primers	Sequence(5’-3’)
		N20-2b-F	ttgcacggtgcttccagcaagttttagagctagaaatagcaag
N20-2b-R	ttgctggaagcaccgtgcaaactagtattatacctaggactgagc
		2bzwfUF	ggataacacaacccttggatttgccc
2bzwfUR	ggtaacatgatcttgcgcagattggcgccagaatgcgctgttgcttgag
		zwfF	ctcaagcaacagcgcattctggcgccaatctgcgcaagatcatgttaccgg
zwfR	ctgcctctgaacttgctgccgcccgcctgtgtgccgtgttaatgacaaaagc
		2bzwfDF	gtttgttttttccttttattgcaattgctggaagcaccgtgcaaggg
2bzwfDR	gcctcccattaatgacggattagccgc
		N20-2c-F	aaaggtcggtaaatcgctgagttttagagctagaaatagcaag
N20-2c-R	tcagcgatttaccgacctttactagtattatacctaggactgagc
		2cgndUF	gatgctgcgcgttatgtccccctgg
2cgndUR	cggcgtatattgcaccgggcgagagcctcgccgtgtacagggcatc
		gndF	gtacacggcgaggctctcgcccggtgcaatatacgccgggc
gndR	gaatatcctccttagttcctattccgccgtaagcatataagcatggataagc
		2cgndDF	cttatatgcttacggcggaataggaactaaggaggatattcatatggacc
2cgndDR	gttaatcctaatctgccacgcaccacgg
		N20-pgi-F	ttgtcaacgatggggtcatggttttagagctagaaatagcaag
N20-pgi-R	catgaccccatcgttgacaaactagtattatacctaggactgagc
		pgi-u-F	cagctaaagcgaccagcagattagtg
pgi-u-R	gaacggcaccacgtagtccaccctttatttataaatgtactacctgcgc
		pgi-d-F	catttataaataaagggtggactacgtggtgccgttcaaagtattcg
pgi-d-R	cctcacggtatgatttccgttaaattacagac
		Target-check	gaagggagaaaggcggacag

试剂：

酵母粉(Yeast extraction)及蛋白胨(Tryptone)：英国Oxoid公司，

琼脂糖：上海生工，

葡萄糖，琼脂粉：国药集团化学试剂有限公司，

异丙基硫代-P-D-半乳糖苷(IPTG)：美国GEN-VIEW公司，

氨苄青霉素，硫酸链霉素，硫酸卡纳霉素，氯霉素：美国GEN-VIEW公司，

木糖、阿拉伯糖、木糖醇、阿拉伯糖醇：上海阿拉丁生化科技股份有限公司，

3-吗啉丙磺酸(MOPS)：上海阿拉丁生化科技股份有限公司，

还原型辅酶II(NADPH)：美国GEN-VIEW公司。

常用试剂盒：

质粒小提试剂盒：康宁生命科学(吴江)有限公司，

基因组DNA抽提试剂盒：康宁生命科学(吴江)有限公司，

DNA凝胶回收试剂盒：康宁生命科学(吴江)有限公司，

大肠杆菌感受态细胞制作试剂盒：大连Takara公司，

PCR相关试剂及产品：大连Takara公司。

常用试剂和培养基配方：

1,000×Trace Metals组成(L^-1)：FeCl₃ 1.6g，CoCl₂·6H₂O 0.2g，CuCl₂ 0.1g，ZnCl₂·4H₂O 0.2g，NaMoO₄ 0.2g，H₃BO₃ 0.05g，使用0.1M HCl配制。

Luria-Bertani(LB)培养基组成(L^-1)：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，去离子水溶解后，用5M NaOH调节pH值至7.0，121℃灭菌20min。LB固体培养基添加2％琼脂粉。

摇瓶发酵培养基组成(L^-1)：Na₂HPO₄ 6g，KH₂PO₄ 3g，NH₄Cl 1g，NaCl 0.5g，1mMMgSO₄，1mM CaCl₂，酵母粉5g，1mL 1,000×Trace Metals，50mM MOPS(pH 7.4，用于维持pH稳定)。

实施例1

以IS5-5为出发菌株，采用CRISPR/Cas9方法在在其基因组的IS2b插入zwf基因，步骤如下：

1、pTarget-2bzwf质粒的构建

首先需要在目标基因上找到一个PAM位点，确定对应的N20序列，并将pTargetF质粒上的cadAspacer替换为目的基因的N20序列。以N20-2b-F/N20-2b-R为引物，pTargetF质粒为模板全质粒突变PCR构建pTarget-2bzwf质粒，并以Target-check为引物对突变序列进行验证。

2、修复模板构建

以大肠杆菌W3110基因组为模板，2bzwfUF和2bzwfUR为引物扩增上游同源臂，zwfF/zwfR为引物扩增zwf基因，2bzwfDF/2bzwfDR为引物扩增下游同源臂，跑核酸电泳并用相关试剂盒回收。然后以2bzwfUF和2bzwfDR为引物，zwf基因及上下游同源臂的等比例混合物为模板，进行重叠延伸PCR，切胶回收对应长度的片段，获得插入zwf基因的修复模板。

3、热激法转入pCas质粒

a.将保存在-80℃的IS5-5划线在无抗的固体培养基平板上，过夜37℃培养。挑取单菌落于液体LB培养基中37℃，200rpm培养约10h，转接1mL菌液到装有50mL液体LB培养基的250mL三角瓶中，生长至OD₆₀₀到0.6-0.8，将菌液冰浴10min，按照Takara大肠杆菌感受态试剂盒制备化转感受态。

b.将制备好的IS5-5感受态置于冰上，融化后在无菌条件下加入2μL pCas质粒，混匀后置于冰浴放置30min。

c.42℃下水浴或金属浴热激90s，立即冰浴2min。

d.加入700μL液体LB或复苏培养基，于30℃，200rpm复苏50min。

e.吸取100μL复苏后的菌液，涂布于含有50mg/L的kan^R的固体LB平板上，30℃培养过夜。

f.挑取单克隆的菌落进行PCR或提取质粒验证，获得转化成功的大肠杆菌IS5-5pCas。

4、电转化插入zwf的pTargetF和修复模板donor DNA

a.将步骤3中得到的大肠杆菌IS5-5pCas为出发菌株，划线于50mg/L的硫酸卡那霉素抗性的平板上，30℃培养过夜后(后续培养均需加入相同浓度的同种抗生素)，挑取单菌落至液体LB中，30℃，200rpm培养10-12h，转接1mL至50mL LB中，30℃，200rpm培养1h后，加入工作浓度为0.5％灭菌的L-阿拉伯糖进行诱导表达Red重组蛋白，继续培养至OD₆₀₀至0.6～0.8(约3h左右)，冰浴10min，进行电转感受态的制备。

b.使用灭菌好的10mL Ep管，菌液分装10mL一管，4℃，4000rpm下离心5min，弃上清。

c.用1mL预冷过的灭菌的10％的甘油重悬，4℃，4000rpm下离心10min，小心的弃去上清。

d.重复c步骤2次。

e.用100μL 10％的甘油重悬，转移至灭菌的1.5mL Ep管中，立即使用或置于-80℃冰箱中备用。

f.使用制备好的感受态或从-80℃中取出预先制备的感受态，冰上放置5min，加入400ng插入zwf的pTargetF质粒(步骤1构建)和800ng修复模板(步骤2构建)。混匀后转移至无菌的2mm电转杯中，冰上放置10min，进行电转化。

g.电转条件：2.5kV，25μF，200Ω，电转时间5.0ms左右。

h.电转结束之后，立即加入1mL新鲜的液体LB，用移液枪来回吹打混匀后，转移至2mL灭菌的Ep管中。在30℃，150rpm下复苏约2h。

i.将复苏后的菌液离心浓缩后全部涂布于含有50mg/L的kan^R和50mg/L的spec^R平板，30℃过夜培养。

j.挑单菌落至含50mg/L的kan^R和0.5mM的IPTG的LB培养基中，在30℃，200rpm下培养12小时左右，消除pTarget-2bzwf质粒。

k.基因编辑的验证。对于成功插入zwf基因的阳性转化子，采用PCR产物测序的方式来鉴定。

l.菌株2bzwfpCas构建成功后，根据需要，在30℃，200rpm下培养12小时左右可消除温敏型质粒pCas。将最后得到的菌株命名为菌株2bzwf。

实施例2

以菌株2bzwf为出发菌株，采用与实施例1相同的方法，在其基因组的IS2c插入gnd基因，构建获得2bzwfgnd菌株，构建pTarget-2bzwfgnd质粒的引物为N20-2c-F/N20-2c-R；构建修复模板引物为2cgndUF/2cgndUR，gndF/gndR，2cgndDF/2cgndDR。

然后，以2bzwfgnd菌株为出发菌株，进一步敲除pgi基因，构建获得2bzwfgndΔpgi菌株(即插入了zwf基因和gnd基因，敲除了pgi基因)，构建pTarget-2bzwfgndpgi质粒的引物为N20-pgi-F/N20-pgi-R；构建修复模板引物为pgi-u-F/pgi-u-R，pgi-d-F/pgi-d-R，所用引物列于表1。

实施例3

1、摇瓶发酵

配制摇瓶发酵培养基，250mL三角瓶中装液量45mL，接种1mL的种子液，37℃，200rpm培养4h，添加5mL灭菌后的浓缩玉米芯水解液(含有200g/L木糖和100g/L的葡萄糖，计算的木糖终浓度为20g/L，葡萄糖终浓度为10g/L)。30℃，200rpm下进行摇瓶发酵，定时取样并检测相关参数变化情况。同时每组实验均包含3个平行实验。

2、工程菌株2bzwfgndΔpgi上罐发酵(1)原料及仪器

1)发酵原料：浙江华康药业提供的经离子交换脱毒的玉米芯水解液(初始pH 2.5，用1M的NaOH中和至pH 6.3后60℃真空浓缩，木糖，葡萄糖与阿拉伯糖浓度分别为：550g/L，35g/L与45g/L)；

2)LB平板固体培养基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10，琼脂粉1.8％(质量分数)；

一级种子培养基(LB培养基，g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10；

二级种子培养基(g/L)：酵母粉7.5，蛋白胨7.5，葡萄糖15，NaCl 10；

发酵培养基(g/L)：葡萄糖10，玉米浆干粉24，NaCl 0.5，KH₂PO₄ 3，Na₂HPO₄·12H₂O9，NH₄Cl 1。葡萄糖单独灭菌。

3)实验仪器：

10L旋转蒸发仪；国强15-L机械搅拌通气式发酵罐；Agilent 1260HPLC；ELSD检测器；Bio-red HPX87C分析柱(2)实验方法

1)半纤维素水解液的浓缩：采用真空减压浓缩原理，用旋转蒸发仪将水解液浓缩至木糖浓度大约为550g/L，备用。

2)菌株活化：取甘油管保藏菌株，于LB固体培养基平板划线，37℃培养～12h。

3)一级种子的制备：挑取LB平板上的单菌落，接入5mL LB培养基的试管，37℃，200rpm培养过夜。

4)二级种子的制备：吸取2mL菌液接种到含有300mL种子培养基的1L三角瓶中，37℃，200rpm培养10h，至OD₆₀₀为5左右。

5)接种：在发酵罐中装入5.5L发酵培养基(除葡萄糖)，121℃灭菌30min，冷却至30℃，调节pH至7.0。采用火焰接种法接入发酵种子(约600mL)与灭好的葡萄糖溶液，此时罐中体积约为6.5L。

6)原料的制备：取浓缩好的半纤维素水解液。根据终体积为10L左右，量取2.5L水解液(木糖质量为1600g)，115℃灭菌30min，第一次补料木糖浓度85g/L，第二次补料木糖浓度88g/L。按木糖与葡萄糖质量比为1:0.4再称量一定量葡萄糖，溶解，115℃单独灭菌30min，准备连续流加补料。

氮源的配制：称取130g玉米浆干粉两份，溶解，115℃灭菌30min。

7)补料：接种后，控制pH为7.0，温度为30℃。通气量为0.6vvm,初始转速为400rpm，初始溶氧设定为30，培养9.5h左右至OD大于18时补料。采用火焰接种法，加入配好的原料与氮源，葡萄糖采用连续流加补料。补料后控制pH为7.0，溶氧设定为20。

8)放罐：根据pH变化确定发酵终点，当pH上升、溶氧上升时，取样HPLC分析，若木糖醇浓度不再增加，则发酵停止。

3、糖和糖醇的液相检测方法

将所取的样品进行适当浓度的稀释后，使用0.22μm的过滤头进行过滤。利用Dionex UltiMate 3000高效液相系统对木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖醇和阿拉伯糖醇进行定量检测。检测器：Corona Charged Aerosol Detector(CAD)，分析柱：Aminex HPX-87C(Φ7.8mm×300mm)，流动相：超纯水，流速：0.6mL/min,柱温设定：76℃。

对照菌株IS5-5的发酵与检测方法与2bzwfgndΔpgi相似。

4、结果

以24h摇瓶发酵测定的NADPH/NAD⁺及产生的木糖醇浓度为主要指标，考察了出发菌株IS5-5，以及逐步改造的菌株2bzwf(插入了zwf基因)、2bzwfgnd(插入了zwf基因和gnd基因)及2bzwfgndΔpgi(插入了zwf基因和gnd基因，敲除了pgi基因)生产木糖醇的能力(表2)。可以看出，出发菌株IS5-5，以及逐步改造的菌株2bzwf、2bzwfgnd及2bzwfgndΔpgi的NADPH/NAD⁺分别为0.19、0.24、0.26、0.38，逐渐增大，产生的木糖醇浓度(g/L)分别为18、18.8、19、19.7，逐步提高。表明上述辅酶改造基因操作确实逐步地提高了菌株的木糖醇生产能力。

表2

菌株	NADH/NAD<sup>+</sup>比值	NADPH/NADP<sup>+</sup>比值	Xylitol浓度(g/L)
				IS5-5	0.18±0.02	0.19±0.04	18.0
2bzwf	0.18±0.02	0.24±0.03	18.8
				2bzwfgnd	0.17±0.02	0.26±0.03	19.0
2bzwfgndΔpgi	0.09±0.02	0.38±0.03	19.7

工程菌株2bzwfgndΔpgi和对照菌株IS5-5分别采用15-L罐分批补料进行发酵，利用脱毒的玉米芯水解液发酵生产木糖醇。对照菌株IS5-5发酵78h生产了143g/L的木糖醇，生产速率为1.83g/L，木糖醇对木糖的收率为0.91g/g，木糖醇对葡萄糖的收率为1.49g/g(图1)。工程菌株2bzwfgndΔpgi发酵76h生产了161.6g/L的木糖醇，生产速率为2.13g/L，木糖醇对木糖的收率为1.02g/g，木糖醇对葡萄糖的收率为2.50g/g(图2)。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种基因工程菌及其在生产木糖醇中的应用

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1476

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 1

atggcggtaa cgcaaacagc ccaggcctgt gacctggtca ttttcggcgc gaaaggcgac 60

cttgcgcgtc gtaaattgct gccttccctg tatcaactgg aaaaagccgg tcagctcaac 120

ccggacaccc ggattatcgg cgtagggcgt gctgactggg ataaagcggc atataccaaa 180

gttgtccgcg aggcgctcga aactttcatg aaagaaacca ttgatgaagg tttatgggac 240

accctgagtg cacgtctgga tttttgtaat ctcgatgtca atgacactgc tgcattcagc 300

cgtctcggcg cgatgctgga tcaaaaaaat cgtatcacca ttaactactt tgccatgccg 360

cccagcactt ttggcgcaat ttgcaaaggg cttggcgagg caaaactgaa tgctaaaccg 420

gcacgcgtag tcatggagaa accgctgggg acgtcgctgg cgacctcgca ggaaatcaat 480

gatcaggttg gcgaatactt cgaggagtgc caggtttacc gtatcgacca ctatcttggt 540

aaagaaacgg tgctgaacct gttggcgctg cgttttgcta actccctgtt tgtgaataac 600

tgggacaatc gcaccattga tcatgttgag attaccgtgg cagaagaagt ggggatcgaa 660

gggcgctggg gctattttga taaagccggt cagatgcgcg acatgatcca gaaccacctg 720

ctgcaaattc tttgcatgat tgcgatgtct ccgccgtctg acctgagcgc agacagcatc 780

cgcgatgaaa aagtgaaagt actgaagtct ctgcgccgca tcgaccgctc caacgtacgc 840

gaaaaaaccg tacgcgggca atatactgcg ggcttcgccc agggcaaaaa agtgccggga 900

tatctggaag aagagggcgc gaacaagagc agcaatacag aaactttcgt ggcgatccgc 960

gtcgacattg ataactggcg ctgggccggt gtgccattct acctgcgtac tggtaaacgt 1020

ctgccgacca aatgttctga agtcgtggtc tatttcaaaa cacctgaact gaatctgttt 1080

aaagaatcgt ggcaggatct gccgcagaat aaactgacta tccgtctgca acctgatgaa 1140

ggcgtggata tccaggtact gaataaagtt cctggccttg accacaaaca taacctgcaa 1200

atcaccaagc tggatctgag ctattcagaa acctttaatc agacgcatct ggcggatgcc 1260

tatgaacgtt tgctgctgga aaccatgcgt ggtattcagg cactgtttgt acgtcgcgac 1320

gaagtggaag aagcctggaa atgggtagac tccattactg aggcgtgggc gatggacaat 1380

gatgcgccga aaccgtatca ggccggaacc tggggacccg ttgcctcggt ggcgatgatt 1440

acccgtgatg gtcgttcctg gaatgagttt gagtaa 1476

<210> 2

<211> 1407

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 2

atgtccaagc aacagatcgg cgtagtcggt atggcagtga tgggacgcaa ccttgcgctc 60

aacatcgaaa gccgtggtta taccgtctct attttcaacc gttcccgtga gaagacggaa 120

gaagtgattg ccgaaaatcc aggcaagaaa ctggttcctt actatacggt gaaagagttt 180

gtcgaatctc tggaaacgcc tcgtcgcatc ctgttaatgg tgaaagcagg tgcaggcacg 240

gatgctgcta ttgattccct caaaccatat ctcgataaag gagacatcat cattgatggt 300

ggtaacacct tcttccagga cactattcgt cgtaatcgtg agctttcagc agagggcttt 360

aacttcatcg gtaccggtgt ttctggcggt gaagaggggg cgctgaaagg tccttctatt 420

atgcctggtg gccagaaaga agcctatgaa ttggtagcac cgatcctgac caaaatcgcc 480

gccgtagctg aagacggtga accatgcgtt acctatattg gtgccgatgg cgcaggtcac 540

tatgtgaaga tggttcacaa cggtattgaa tacggcgata tgcagctgat tgctgaagcc 600

tattctctgc ttaaaggtgg cctgaacctc accaacgaag aactggcgca gacctttacc 660

gagtggaata acggtgaact gagcagttac ctgatcgaca tcaccaaaga tatcttcacc 720

aaaaaagatg aagacggtaa ctacctggtt gatgtgatcc tggatgaagc ggctaacaaa 780

ggtaccggta aatggaccag ccagagcgcg ctggatctcg gcgaaccgct gtcgctgatt 840

accgagtctg tgtttgcacg ttatatctct tctctgaaag atcagcgtgt tgccgcatct 900

aaagttctct ctggtccgca agcacagcca gcaggcgaca aggctgagtt catcgaaaaa 960

gttcgtcgtg cgctgtatct gggcaaaatc gtttcttacg cccagggctt ctctcagctg 1020

cgtgctgcgt ctgaagagta caactgggat ctgaactacg gcgaaatcgc gaagattttc 1080

cgtgctggct gcatcatccg tgcgcagttc ctgcagaaaa tcaccgatgc ttatgccgaa 1140

aatccacaga tcgctaacct gttgctggct ccgtacttca agcaaattgc cgatgactac 1200

cagcaggcgc tgcgtgatgt cgttgcttat gcagtacaga acggtattcc ggttccgacc 1260

ttctccgcag cggttgccta ttacgacagc taccgtgctg ctgttctgcc tgcgaacctg 1320

atccaggcac agcgtgacta ttttggtgcg catacttata agcgtattga taaagaaggt 1380

gtgttccata ccgaatggct ggattaa 1407

<210> 3

<211> 1650

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 3

atgaaaaaca tcaatccaac gcagaccgct gcctggcagg cactacagaa acacttcgat 60

gaaatgaaag acgttacgat cgccgatctt tttgctaaag acggcgatcg tttttctaag 120

ttctccgcaa ccttcgacga tcagatgctg gtggattact ccaaaaaccg catcactgaa 180

gagacgctgg cgaaattaca ggatctggcg aaagagtgcg atctggcggg cgcgattaag 240

tcgatgttct ctggcgagaa gatcaaccgc actgaaaacc gcgccgtgct gcacgtagcg 300

ctgcgtaacc gtagcaatac cccgattttg gttgatggca aagacgtaat gccggaagtc 360

aacgcggtgc tggagaagat gaaaaccttc tcagaagcga ttatttccgg tgagtggaaa 420

ggttataccg gcaaagcaat cactgacgta gtgaacatcg ggatcggcgg ttctgacctc 480

ggcccataca tggtgaccga agctctgcgt ccgtacaaaa accacctgaa catgcacttt 540

gtttctaacg tcgatgggac tcacatcgcg gaagtgctga aaaaagtaaa cccggaaacc 600

acgctgttct tggtagcatc taaaaccttc accactcagg aaactatgac caacgcccat 660

agcgcgcgtg actggttcct gaaagcggca ggtgatgaaa aacacgttgc aaaacacttt 720

gcggcgcttt ccaccaatgc caaagccgtt ggcgagtttg gtattgatac tgccaacatg 780

ttcgagttct gggactgggt tggcggccgt tactctttgt ggtcagcgat tggcctgtcg 840

attgttctct ccatcggctt tgataacttc gttgaactgc tttccggcgc acacgcgatg 900

gacaagcatt tctccaccac gcctgccgag aaaaacctgc ctgtactgct ggcgctgatt 960

ggcatctggt acaacaattt ctttggtgcg gaaactgaag cgattctgcc gtatgaccag 1020

tatatgcacc gtttcgcggc gtacttccag cagggcaata tggagtccaa cggtaagtat 1080

gttgaccgta acggtaacgt tgtggattac cagactggcc cgattatctg gggtgaacca 1140

ggcactaacg gtcagcacgc gttctaccag ctgatccacc agggaaccaa aatggtaccg 1200

tgcgatttca tcgctccggc tatcacccat aacccgctct ctgatcatca ccagaaactg 1260

ctgtctaact tcttcgccca gaccgaagcg ctggcgtttg gtaaatcccg cgaagtggtt 1320

gagcaggaat atcgtgatca gggtaaagat ccggcaacgc ttgactacgt ggtgccgttc 1380

aaagtattcg aaggtaaccg cccgaccaac tccatcctgc tgcgtgaaat cactccgttc 1440

agcctgggtg cgttgattgc gctgtatgag cacaaaatct ttactcaggg cgtgatcctg 1500

aacatcttca ccttcgacca gtggggcgtg gaactgggta aacagctggc gaaccgtatt 1560

ctgccagagc tgaaagatga taaagaaatc agcagccacg atagctcgac caatggtctg 1620

attaaccgct ataaagcgtg gcgcggttaa 1650

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttgcacggtg cttccagcaa gttttagagc tagaaatagc aag 43

<210> 5

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttgctggaag caccgtgcaa actagtatta tacctaggac tgagc 45

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggataacaca acccttggat ttgccc 26

<210> 7

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggtaacatga tcttgcgcag attggcgcca gaatgcgctg ttgcttgag 49

<210> 8

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctcaagcaac agcgcattct ggcgccaatc tgcgcaagat catgttaccg g 51

<210> 9

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctgcctctga acttgctgcc gcccgcctgt gtgccgtgtt aatgacaaaa gc 52

<210> 10

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtttgttttt tccttttatt gcaattgctg gaagcaccgt gcaaggg 47

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gcctcccatt aatgacggat tagccgc 27

<210> 12

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aaaggtcggt aaatcgctga gttttagagc tagaaatagc aag 43

<210> 13

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tcagcgattt accgaccttt actagtatta tacctaggac tgagc 45

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gatgctgcgc gttatgtccc cctgg 25

<210> 15

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cggcgtatat tgcaccgggc gagagcctcg ccgtgtacag ggcatc 46

<210> 16

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gtacacggcg aggctctcgc ccggtgcaat atacgccggg c 41

<210> 17

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gaatatcctc cttagttcct attccgccgt aagcatataa gcatggataa gc 52

<210> 18

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cttatatgct tacggcggaa taggaactaa ggaggatatt catatggacc 50

<210> 19

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gttaatccta atctgccacg caccacgg 28

<210> 20

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ttgtcaacga tggggtcatg gttttagagc tagaaatagc aag 43

<210> 21

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

catgacccca tcgttgacaa actagtatta tacctaggac tgagc 45

<210> 22

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

cagctaaagc gaccagcaga ttagtg 26

<210> 23

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gaacggcacc acgtagtcca ccctttattt ataaatgtac tacctgcgc 49

<210> 24

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

catttataaa taaagggtgg actacgtggt gccgttcaaa gtattcg 47

<210> 25

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

cctcacggta tgatttccgt taaattacag ac 32

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gaagggagaa aggcggacag 20

Claims (2)

1.一种基因工程菌，其特征在于，出发菌株为IS5-5，

由大肠杆菌染色体中插入一拷贝的葡萄糖脱氢酶基因得到，所述葡萄糖脱氢酶基因为zwf基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

在大肠杆菌染色体中再插入一拷贝的葡萄糖酸脱氢酶基因，所述葡萄糖酸脱氢酶基因为gnd基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

在大肠杆菌中基因沉默或基因敲除磷酸葡萄糖异构酶基因，所述磷酸葡萄糖异构酶基因为pgi基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.如权利要求1所述基因工程菌在生产木糖醇中的应用。

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