CN116515913A - 一种低成本生物基乙醇酸的发酵及其分离纯化技术 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种低成本生物基乙醇酸的发酵及其分离纯化技术，属于微生物培养技术领域。本发明以Mgly6‑H1菌株为工程菌株，利用改良发酵培养基进行发酵生产，发酵液中的乙醇酸含量可以达到8.44g/L，实现了产量的飞跃式突破。本发明有效利用了提取过木糖后的玉米浆水解液，实现了工业废弃物的再利用，成本低廉，单位乙醇酸成本仅4562元/吨。本发明在降低成本的同时显著提高了乙醇酸的产量，实现了高值转化。本发明进一步探索生物基乙醇酸的分离提纯方法，乙醇酸样品纯度达到99.3％，为全生物法生产乙醇酸工业化奠定了基础，在工业上具有潜在而广泛的应用价值。

Description

一种低成本生物基乙醇酸的发酵及其分离纯化技术
技术领域
本发明涉及一种低成本生物基乙醇酸的发酵及其分离纯化技术，属于微生物培养技术领域。
背景技术
大肠杆菌(Escherichia coli)作为一种生化代谢非常活跃的常见的工程菌株，通过对其进行代谢工程改造可以生产多种代谢物，其中，乙醇酸(Glycolic acid)作为大肠杆菌能够产生的一种羟基酸，是α-羟基酸家族中最小的一员。乙醇酸在分子结构上同时具有醇羟基和梭基，所以其结构特征使得乙醇酸具有高酸度和保湿的双重功能并广泛应用于多种化学工艺，如化妆品及化学清洗等领域，并作为生物聚合物的前体在医药行业及环保行业具有广阔的应用前景。
目前乙醇酸的生产方法主要有化学法和生物法。而生物法中的全生物法合成乙醇酸作为一种对环境友好的温和可持续的合成方法，近年来引起了越来越多的关注。全生物法合成乙醇酸目前产量最高的两篇报道所用培养基分别为M9发酵培养基(6.78g·L-1磷酸氢二钠，3g·L-1磷酸二氢钾，1g·L-1氯化铵，0.5g·L-1氯化钠，10g·L-1葡萄糖，0.24g·L-1硫酸镁，0.115g·L-1氯化钙，8g·L-1胰蛋白胨，2g·L-1酵母粉，8g.L-1葡萄糖)，AM1矿物盐培养基(28g·L-1葡萄糖、5.2g·L-1醋酸钠，2g·L-1酵母提取物)。上述培养基中含有的高昂氮源与碳源严重限制了生物基乙醇酸的规模化生产，因此降低发酵培养基的成本，优化培养基成分以提高微生物发酵产量是全生物法合成乙醇酸工业化的重要步骤，为了达到上述目的，亟需设计一种大肠杆菌高产乙醇酸的低廉培养基。
玉米浆(CSL)和玉米芯水解液(CCH)是玉米加工过程中产生的低廉生物质副产品。玉米浆中富含氨基酸、蛋白质和微量元素，以及各种生物素、维生素B1和一些前体，可以为生物发酵提供足够的氮源和营养因子。玉米芯水解液的主要成分是纤维素(33-35％)和半纤维素(38-40％)，是全球公认的重要可再生生物资源，其酶解产物中含有大量的葡萄糖和木糖，可作为一种廉价、高效的碳源。玉米芯水解液常常用于制高价值木糖，提取完木糖后的玉米芯水解液其成本单价进一步降低。此外，生物基乙醇酸发酵液的下游分离纯化技术的报道非常匮乏，这同样限制了乙醇酸的工业化生产应用。为了尝试解决上述问题，本研究采用一株生产乙醇酸的Mgly6-H1菌株，通过统计学方法获得了最优培养配方工艺，并采用沉淀法初步构建了下游生物分离纯化体系。
发明内容
本发明利用一株产乙醇酸工程菌株Mgly6-H1，优化大肠杆菌发酵生产乙醇酸的过程，大大的提高了乙醇酸的产量，同时降低了培养基的成本，在此基础上开展下游分离纯化，获得了高纯度的生物基乙醇酸产品。
本发明提供了一种促进菌株高产乙醇酸的培养基，所述培养基由玉米芯水解液，NH3·H2O，玉米浆，CaCl2，MgSO4·7H2O，KH2PO4，NaCl，Na2HPO4和金属离子溶液组成。
在一种实施方式中，所述金属离子溶液包括Cu2+、Mn 2+、Fe 2+或Zn 2+。
在一种实施方式中，所述金属离子溶液为ZnCl2和MnCl2·4H2O。
在一种实施方式中，所述培养基由5～10g·L-1玉米芯水解液，1～2g·L-1NH3·H2O，10～15g·L-1玉米浆，4～10mg·L-1CaCl2，1～5mg·L-1MgSO4·7H2O，3～6g·L-1KH2PO4，0.5g·L-1NaCl，20～30g·L-1Na2HPO4，0.1～0.15mg·L-1ZnCl2和0.03～0.04mg·L-1MnCl2·4H2O组成。
在一种实施方式中，所述培养基由6.66mg·L-1CaCl2，3mg·L-1MgSO4·7H2O，0.13mg·L-1ZnCl2，0.0396mg·L-1MnCl2·4H2O，4.5g·L-1KH2PO4，8.4g·L-1玉米芯水解液，1.18g·L-1NH3·H2O，13.79g·L-1玉米浆，0.5g·L-1NaCl和25.43g·L-1Na2HPO4组成。
本发明还提供了所述培养基在化学、材料、医药领域中的应用。
本发明还提供了所述培养基在生产乙醇酸中的应用。
在一种实施方式中，所述应用为乙醇酸生产菌株接种于所述培养基中发酵生产乙醇酸。
在一种实施方式中，所述乙醇酸生产菌株为菌株Mgly6-H1。
在一种实施方式中，将乙醇酸生产菌株的种子液接种于所述培养基中，在35～38℃条件下培养15～30h。
本发明提供了一种制备高纯度生物基乙醇酸的方法，所述方法步骤如下：
(1)将乙醇酸生产菌株接种于上述培养基中发酵制备含有乙醇酸的发酵液，离心收集上清，得发酵上清液；
(2)向发酵上清液中加入活性炭进行脱色，得脱色液；
(3)在获得的脱色液中加入氨水反应，得碱性反应液；
(4)向碱性反应液中加入氢氧化钙反应，离心，得沉淀，
(5)取沉淀加入硫酸进行酸化，得酸化液；
(6)在酸化液中加入无水异丙醇，搅拌后抽滤，得滤液；
(7)将滤液进行常压脱醇，高真空回收醇，得料液；
(8)将料液降温析晶并恒温抽滤，得乙醇酸湿品；
(9)低温高真空条件处理乙醇酸湿品，得固体乙醇酸。
在一种实施方式中，步骤(1)中，所述乙醇酸生产菌株为菌株Mgly6-H1。
在一种实施方式中，步骤(1)中，将乙醇酸生产菌株的种子液接种于上述培养基中，在35～38℃条件下培养15～30h。
在一种实施方式中，步骤(2)中，活性炭添加量为1～11g/100mL，温度为40～60℃，搅拌时间为0.5～2h。
在一种实施方式中，步骤(3)中，加入脱色液体积的5～10％的氨水，搅拌反应1.～3h。
在一种实施方式中，步骤(4)中，氢氧化钙在碱性反应液的质量百分比浓度为25～35％，反应温度30～50℃，时间为4～7h。
在一种实施方式中，步骤(5)中，硫酸的终浓度为1.5～2mol/L，50～60℃搅拌1～3h。
在一种实施方式中，步骤(6)中，无水异丙醇加入量为溶液中乙醇酸质量的2～6倍。
在一种实施方式中，步骤(7)中，在2－8kPa、40～75℃条件下回收醇。
在一种实施方式中，步骤(8)中，以1℃/min条件进行降温析晶，当温度降到0～20℃时停止降温并恒温保持0.8～1.2h。
本发明还提供了所述方法在生产乙醇酸或含有乙醇酸产品中的应用。
有益效果
(1)本发明以Mgly6-H1菌株为工程菌株，首先对培养基中碳源和氮源进行优化，并且添加了各种有利于菌株生产乙醇酸的金属离子，取得了较好的优化结果。于原有的发酵培养基相比，利用改良发酵培养基进行发酵生产，在相同发酵时间内乙醇酸产量提高明显，发酵液中的乙醇酸含量可以达到8.44g/L，实现了产量的飞跃式突破。本发明有效利用了提取过木糖后的玉米浆水解液，实现了工业废弃物的再利用，并且成本低廉，单位乙醇酸成本为4562元/吨。本发明在降低成本的同时显著提高了乙醇酸的产量，实现了高值转化。
(2)在此基础上进一步探索生物基乙醇酸的分离提纯方法，回收率达54.1％，乙醇酸样品纯度达到99.3％，为全生物法生产乙醇酸工业化奠定了基础，在工业上具有潜在而广泛的应用价值。
附图说明
图1是碳源种类对乙醇酸产量影响柱状图；
图2是氮源种类对乙醇酸产量影响柱状图；
图3是金属离子种类对乙醇酸产量影响柱状图；
图4是M9发酵培养基于本发明培养基对比产乙醇酸柱状图；
图5是乙醇酸分离纯化条件优化图；
图6乙醇酸标样和乙醇酸晶体HPLC谱图。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
玉米芯水解液：来自于易高环保投资集团提取高值木糖后的产物。
M9发酵培养基：6.78g·L-1磷酸氢二钠，3g·L-1磷酸二氢钾，1g·L-1氯化铵，0.5g·L-1氯化钠，10g·L-1葡萄糖，0.24g·L-1硫酸镁，0.115g·L-1氯化钙，8g·L-1胰蛋白胨，2g·L-1酵母粉，8g·L-1葡萄糖。
乙醇酸检测的方法：取1mL发酵液，12000g离心5min后取上清过0.22μm滤膜。利用高效液相色谱定量检测葡萄糖，乙醇酸，乙醛酸，乙酸。其中葡萄糖检测器为示差检测器，其余有机酸物质的检测用紫外检测器(210nm)。检测参数为：柱温35℃，流动相为5mM稀硫酸，流速使用0.6mL·min-1，进样量为20μL。
菌株Mgly6-H1公开于文献Xu S,Zhang L,Zhou S,Deng Y.Biosensor-BasedMultigene Pathway Optimization for Enhancing the Production of Glycolate.ApplEnviron Microbiol.2021May 26；87(12):e0011321.
实施例1碳源对乙醇酸产量的影响
菌株Mgly6-H1在M9培养基进行生长，以8g·L-1葡萄糖为对照组，将葡萄糖替换为等摩尔碳浓度的果糖，木糖，半乳糖，玉米芯水解液，麦芽糖，乳糖为实验组。从菌株Mgly6-H1单菌落分别接种到50mL液体培养基中，于37℃，250rpm进行摇瓶培养，发酵24h后，收集发酵液并检测乙醇酸的产量，考察碳源种类对乙醇酸生产与菌体生长的影响，结果如图1所示。果糖，木糖，半乳糖，玉米芯水解液作为碳源均显著提高Mgly6-H1菌株乙醇酸产量，分别提高了61％，32％，46％，35％。
表1乙醇酸的产量和生产成本
实施例2氮源对乙醇酸产量的影响
菌株Mgly6-H1在M9培养基进行生长，以1g·L-1NH4Cl为对照组，将无机氮源替换为1.23g·L-1磷酸氢二铵，1.235g·L-1硫酸铵，0.31g·L-1氨水，2.15g·L-1磷酸二氢铵，10g·L-1玉米浆为实验组。从菌株Mgly6-H1单菌落分别接种到50mL液体培养基中，于37℃，250rpm进行摇瓶培养，发酵24h后，收集发酵液并检测乙醇酸的产量，考察氮源种类对乙醇酸生产与菌体生长的影响，结果如图2所示，磷酸氢二铵，氨水，玉米浆作为氮源均显著提高Mgly6-H1菌株乙醇酸产量，分别提高了40％，58％，95％。
实施例3金属离子对乙醇酸产量的影响
以M9培养基为对照组，在此基础上额外分别添加0.425mg/L Cu2+、0.099mg/L Mn 2 +、40mg/L Fe 2+、1.636mg/L Zn 2+的M9培养基为实验组，将菌株Mgly6-H1单菌落分别接种到50mL液体培养基中，于37℃，250rpm进行摇瓶培养，发酵24h后，收集发酵液并检测乙醇酸的产量，考察金属离子对乙醇酸生产与菌体生长的影响，结果如图3所示，额外添加Mn2+能够提高Mgly6-H1菌株乙醇酸产量，提高了5％。
实施例4：制备大肠杆菌高产乙醇酸培养基
根据培养基成分对乙醇酸产量的影响以及成本，选择显著影响因素进行PB实验和CCD实验，优化得到改良发酵培养基具体成分：6.66mg·L-1CaCl2，3mg·L-1MgSO4·7H2O，0.13mg·L-1ZnCl2，0.0396mg·L-1MnCl2·4H2O，4.5g·L-1KH2PO4，8.4g·L-1玉米芯水解液，1.18g·L-1NH3·H2O，13.79g·L-1玉米浆，0.5g·L-1NaCl，25.43g·L-1Na2HPO4。
改良发酵培养基的制备：
1)按照配方称取Na2HPO4，KH2PO4，NaCl以去离子水溶解，定容，灭菌得到基础培养基。
2)按照配方量取对应体积玉米芯水解液，于115℃，15min灭菌，量取对应体积玉米浆于115℃，30min灭菌。
3)按照配方以去离子水配置上述各金属离子×1000倍母液，并过孔径为0.22μm的滤膜，收集滤液。
4)将上述1)，2)，3)步骤中的成分按比例混匀，得到大肠杆菌高产乙醇酸培养基。
实施例5：大肠杆菌发酵产乙醇酸
种子培养基(g/L)：5g·L-1酵母粉，10g·L-1胰蛋白胨，10g·L-1NaCl，pH 7.0；在种子培养基的基础上添加1.8％琼脂粉即为LB固体培养基。
改良发酵培养基(g/L)：6.66mg·L-1CaCl2，3mg·L-1MgSO4·7H2O，0.13mg·L- 1ZnCl2，0.0396mg·L-1MnCl2·4H2O，4.5g·L-1KH2PO4，8.4g·L-1玉米芯水解液，1.18g·L- 1NH3·H2O，13.79g·L-1玉米浆，0.5g·L-1NaCl，25.43g·L-1Na2HPO4。
将事先甘油管保藏的菌株在LB固体培养基上划线培养，置于30℃恒温培养箱过夜培养，随后挑取单菌落至20mL种子培养基中，37℃，250rpm培养过夜培养种子液。
将种子液以2％(v/v)的接种量接种于50mL改良发酵培养基或M9培养基中，并添加相应的抗生素，37℃，250rpm条件下培养，根据实验需要定时取样。
结果如图4所示，利用改良发酵培养基发酵生产乙醇酸，发酵液中的乙醇酸含量可以达到8.44g/L，是基于M9培养基发酵生产乙醇酸的6.34倍，且OD值无明显变化。
实施例6：乙醇酸发酵液分离纯化条件探究
(1)发酵液脱色
发酵结束后，将发酵液121℃灭菌20min，10 000r/min离心20min，收集发酵上清液，加入6g/100mL的活性炭，在40℃、1000r/min条件下反应60min，真空抽滤后测定滤液的吸光度和乙醇酸浓度，计算脱色率和乙醇酸损失率。
(2)脱色步骤的优化
在步骤(1)的基础上，依次探究活性炭添加量、脱色温度、脱色时间对脱色率、乙醇酸损失率的影响(图5)。
调整活性炭的添加量分别为1、2、3、4、5、7、9、11g/100mL，结果显示，当活性炭添加量为5g/100mL时，乙醇酸脱色率为78.3％，损失率仅有6.7％。
在活性炭添加量为5g/100mL的基础上，调整脱色温度分别为20、30、40、50、60、70℃，结果显示，当脱色温度为50℃时，乙醇酸脱色率为88.5％，损失率仅有6.8％。
在活性炭添加量为5g/100mL、脱色温度为50℃的基础上，调整脱色时间分别为0.5、1、2、3、4h，结果显示，当脱色时间为2h时，乙醇酸脱色率为94％，损失率仅有6.7％。
因此当活性炭添加量为5g/100mL，脱色温度为50℃，脱色时间为2h的条件下乙醇酸脱色率较高、损失率较低。
(3)脱色后的发酵液进一步纯化
取50mL脱色后的乙醇酸发酵液加入4mL氨水，室温搅拌2h。加入1.97g氢氧化钙(30％wt)，40℃反应6h，取沉淀加入14mL硫酸(1.84mol/L)进行酸化，55℃搅拌2h，离心取50mL酸化上清液加入乙醇酸质量3倍的无水异丙醇，于室温下搅拌0.5h后进行抽滤，将滤液进行常压脱醇，至料温40～75℃后进行高真空(2－8kPa)回收醇，回收完成后经HPLC检测计算最终回收率为54.1％。
将回收的料液以1℃/min开始降温析晶，当温度降到0～20℃时停止降温，在此温度下恒温保持1h，随后进行恒温抽滤，所得滤饼用少许冰水淋洗，即为乙醇酸湿品，进而低温高真空条件下获得高纯度的固体乙醇酸，经HPLC测定结果如图6所示，所得乙醇酸样品纯度为99.3％。
对比例1
以实施例5中的改良发酵培养基为基础进行菌株Mgly6-H1生产制备乙醇酸，区别在于，将培养基中的玉米浆替换为2.76g·L-1酵母粉、11g·L-1蛋白胨，将菌株Mgly6-H1单菌落分别接种到50mL液体培养基中，于37℃，250rpm进行摇瓶培养，发酵24h后，收集发酵液并检测乙醇酸的产量。结果显示，乙醇酸产量为3.6g·L-1，仅达到乙醇酸改良发酵培养产量的42.65％。
对比例2
以实施例5中的改良发酵培养基为基础进行菌株Mgly6-H1生产制备乙醇酸，区别在于，将培养基中的玉米芯水解液分别替换为8.4g·L-1葡萄糖，将菌株Mgly6-H1单菌落分别接种到50mL液体培养基中，于37℃，250rpm进行摇瓶培养，发酵24h后，收集发酵液并检测乙醇酸的产量。结果显示，乙醇酸产量为4.55g·L-1，仅达到乙醇酸改良发酵培养产量的53.9％。
需要说明的是，本发明权利要求书中采用的步骤方法与上述实施例相同，为了防止赘述，本发明的描述了优选的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种促进菌株高产乙醇酸的培养基，其特征在于，所述培养基由玉米芯水解液，NH3·H2O，玉米浆，CaCl2，MgSO4·7H2O，KH2PO4，NaCl，Na2HPO4和金属离子溶液组成。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述金属离子溶液包括Cu2+、Mn 2+、Fe 2+或Zn 2+。
3.根据权利要求1或所述的培养基，其特征在于，所述培养基由5～10g·L-1玉米芯水解液，1～2g·L-1NH3·H2O，10～15g·L-1玉米浆，4～10mg·L-1CaCl2，1～5mg·L-1MgSO4·7H2O，3～6g·L-1KH2PO4，0.5g·L-1NaCl，20～30g·L-1Na2HPO4，0.1～0.15mg·L-1ZnCl2和0.03～0.04mg·L-1MnCl2·4H2O组成。
4.权利要求1～3任一所述培养基在化学、材料、医药领域中的应用。
5.权利要求1～3任一所述培养基在生产乙醇酸中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用为将乙醇酸生产菌株接种于权利要求1～3任一所述培养基中发酵生产乙醇酸。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，将乙醇酸生产菌株的种子液接种于权利要求1～3任一所述培养基中，在35～38℃条件下培养15～30h。
8.根据权利要求5～7任一所述的应用，其特征在于，所述乙醇酸生产菌株包括Mgly6-H1。
9.一种制备高纯度生物基乙醇酸的方法，其特征在于，所述方法步骤如下：
(1)将乙醇酸生产菌株接种于权利要求1～3任一所述培养基中发酵制备含有乙醇酸的发酵液，离心收集上清，得发酵上清液；
(2)向发酵上清液中加入活性炭进行脱色，得脱色液；
(3)在获得的脱色液中加入氨水反应，得碱性反应液；
(4)向碱性反应液中加入氢氧化钙反应，离心，得沉淀，
(5)取沉淀加入硫酸进行酸化，得酸化液；
(6)在酸化液中加入无水异丙醇，搅拌后抽滤，得滤液；
(7)将滤液进行常压脱醇，高真空回收醇，得料液；
(8)将料液降温析晶并恒温抽滤，得乙醇酸湿品；
(9)低温高真空条件处理乙醇酸湿品，得固体乙醇酸。
10.权利要求9所述的方法在生产乙醇酸或含有乙醇酸产品中的应用。
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