CN113999834B - 精氨酸脱亚胺酶生产菌及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种精氨酸脱亚胺酶生产菌及其构建方法。其将质粒pWB980用EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切处理，将Pg3强启动子序列整合到双酶切处理后的质粒pWB980上，得到质粒pWB980‑Pg3，再用BamHⅠ和SphⅠ对质粒pWB980‑Pg3进行酶切处理，将arcA基因整合到酶切处理后的质粒pWB980‑Pg3上，获得重组表达载体；将获得的重组表达载体导入到枯草芽孢杆菌中，构建得到精氨酸脱亚胺酶生产菌。采用本发明的生产菌发酵制备精氨酸脱亚胺酶，能够显著提高精氨酸脱亚胺酶的酶活。

Description

精氨酸脱亚胺酶生产菌及其构建方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种精氨酸脱亚胺酶生产菌及其构建方法。

背景技术

精氨酸脱亚胺酶(Arginine deiminase，EC3.5.3.6)简称ADI。ADI广泛存在于细菌、古细菌和一些真核细胞中，不同来源的ADI性质也有所不同，比酶活从5.4到140.3IU/mg，最适pH从5.6到7.6。ADI在医学上有着重要的价值，ADI已被证明是细胞增殖的抑制剂，能够阻止血管内壁细胞的扩增；而且，ADI没有明显的毒副作用，可以用于治疗白血病和恶性肿瘤。ADI还可应用于酶法生产瓜氨酸，具有广阔的市场前景。

对于ADI的克隆与表达，目前已有研究者将来源于不同生物的ADI在E.coli中表达，例如：Kim等人将来源于Lactococcus Latis ssp.Lactis ATCC7962的ADI(LADI)于E.coli BL21中表达，纯化得到LADI的分子质量约140kDa，比酶活为140U/mg。Megumi等将来源于Mycoplasma hominis的ADI克隆至pET47，并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，重组蛋白(rADI)包涵体经变性复性后，利用镍柱层析纯化，纯化后的rADI大小约为50kDa，比活为0.618U/mg。茅立华等将来源于恶臭假单胞杆菌(P.putida)的ADI编码基因分别在不同大肠杆菌中表达，构建得到基因工程菌BL21(DE3)/pET30a-cit和JM109/pBV220-cit，分别经IPTG和42℃热激诱导后表达，前者酶活最高为235.7U/ml，后者未检测到酶活。

上述ADI的克隆与表达主要是在大肠杆菌表达系统中。但是大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取困难，且内毒素很难除去。而枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是革兰氏阳性菌，细胞壁不含内毒素，能形成芽孢，是一些重要工业酶制剂的生产菌。目前还很少见有利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)表达ADI的报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种精氨酸脱亚胺酶生产菌及其构建方法。采用本发明的生产菌发酵制备精氨酸脱亚胺酶，能够显著提高精氨酸脱亚胺酶的酶活。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种精氨酸脱亚胺酶生产菌的构建方法，包括以下步骤：

(1)将质粒pWB980用EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切处理，将Pg3强启动子序列整合到双酶切处理后的质粒pWB980上，得到质粒pWB980-Pg3，再用BamHⅠ和SphⅠ对质粒pWB980-Pg3进行酶切处理，将arcA基因整合到酶切处理后的质粒pWB980-Pg3上，获得重组表达载体(pWB980-Pg3-arcA)；

(2)将获得的重组表达载体导入到枯草芽孢杆菌中，构建得到精氨酸脱亚胺酶生产菌。

优选的，步骤(1)中，Pg3强启动子序列如SEQ ID NO.3所示。

优选的，步骤(1)中，质粒pWB980-Pg3的序列如SEQ ID NO.4所示。

优选的，步骤(1)中，所述arcA基因经密码子优化处理，优化后的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

优选的，步骤(2)中，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽胞杆菌168，购自中国微生物菌种查询网(https://www.biobw.org/China-strain/bio-81799.html)，菌种的编号为bio-81799。

本发明的第二方面，提供上述方法构建得到的精氨酸脱亚胺酶生产菌。

本发明的第三方面，提供上述精氨酸脱亚胺酶生产菌在如下(1)或(2)中的应用：

(1)发酵生产精氨酸脱亚胺酶；

(2)发酵生产瓜氨酸。

本发明的有益效果：

(1)本发明首次利用枯草芽孢杆菌构建得到精氨酸脱亚胺酶生产菌，与大肠杆菌表达系统相比，枯草芽孢杆菌具有非致病性，对人畜无害；细胞壁的组成简单，只含有肽聚糖和磷壁质，在分泌的蛋白质产品中不会混有内毒素。因此，利用枯草芽孢杆菌构建的生产菌在外源蛋白表达方面具有显著的优势。

(2)基于枯草芽孢杆菌表达系统，本发明选择pWB980作为质粒载体，一方面是因为pWB980为枯草芽孢杆菌表达载体；另一方面，pWB980质粒中含有“ATGAACATCA AAAAGTTTGCAAAACAAGCAACAGTATTAACCTTTACTACCGCACTGCTGGCAGGAG GCGCAACTCAAGCTTTTGCC”这一段信号肽序列，本发明研究发现，其能保证arcA的酶活及正常胞外分泌。

本发明还将pWB980质粒中的启动子进行了替换，将Pg3强启动子整合到pWB980质粒中，替换原启动子P43，Pg3强启动子只有在加入IPTG后才开始表达，因此，将启动子进行替换后，菌株前期生长快，进入稳定期所需时间短，进而提高了ADI的表达量。

(3)由于枯草芽孢杆菌本身的翻译系统可能会不能满足外源基因表达的需要，有些外源蛋白往往得不到有效的表达。为了使arcA基因能够更适用于枯草芽孢杆菌表达系统，本发明还对arcA基因进行了密码子优化，采用优化后的编码基因进行表达，进一步提高了ADI的表达量。

附图说明

图1：优化前arcA基因的密码子相对适应度图。

图2：优化后arcA基因的密码子相对适应度图。

图3：质粒pWB980的结构示意图。

图4：对质粒pWB980中的P43启动子进行酶切的结构示意图。

图5：将Pg3强启动子序列整合到双酶切处理后的质粒pWB980上的结构示意图。

图6：将arcA基因整合到质粒pWB980-Pg3上的结构示意图。

图7：重组表达载体pWB980-Pg3-arcA的酶切验证结果；图中，M为Marker，泳道1为pWB980，泳道2为pWB980-Pg3，泳道3为arcA，泳道4为pWB980-Pg3-arcA。

图8：精氨酸脱亚胺酶生产菌的Western bolt检测结果；图中，M为Marker，泳道1为目的基因arcA所表达的蛋白。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例和对比例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。其中：

本实施例和对比例中所使用的枯草芽孢杆菌购自中国微生物菌种查询网(https://www.biobw.org/China-strain/bio-81799.html)，菌种的编号为bio-81799，菌株名称为枯草芽胞杆菌168。

质粒pWB980购自北京天恩泽基因科技有限公司，其结构图谱如图3所示。

需要说明的是，本发明精氨酸脱亚胺酶生产菌的构建方法，是本领域技术人员能够重复实施的方法，故无需对生产菌进行生物保藏。

实施例1：密码子优化

发明人从现有数据库中获得的arcA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。为了使arcA基因能够更适用于枯草芽孢杆菌表达系统，本发明对arcA基因的核苷酸序列组成进行了密码子优化。

经密码子优化后的arcA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；优化前的密码子相对适应度图如图1所示；优化后的密码子相对适应度图如图2所示。

由图2可以看出，经密码子优化后的arcA基因的密码子相对适应度最高可以达到1.0，显著提高了蛋白编码基因在枯草芽孢杆菌表达系统中的适应性。

实施例2：重组表达载体的构建

将质粒pWB980(图3所示)用EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切处理(图4)，将Pg3强启动子序列(SEQ ID NO.3所示)整合到双酶切处理后的质粒pWB980上，得到质粒pWB980-Pg3(图5)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

再用BamHⅠ和SphⅠ对质粒pWB980-Pg3进行酶切处理，将经密码子优化后的arcA基因(SEQ ID NO.2所示)整合到酶切处理后的质粒pWB980-Pg3上(图6)，获得重组表达载体(pWB980-Pg3-arcA)。

将构建的重组表达载体用BamHⅠ和SphⅠ两个酶进行酶切验证，结果如图7所示。结果表明：arcA基因(SEQ ID NO.2所示)已成功整合到质粒pWB980-Pg3上。

实施例3：精氨酸脱亚胺酶生产菌的构建

将实施例2构建的重组表达载体(pWB980-Pg3-arcA)导入到到枯草芽胞杆菌168中，获得转化子。将转化子在含有30μg/ml卡那霉素(kan)的LB平板上涂布，挑出能够长的单菌落，将其作为阳性转化子。

将阳性转化子接种至含有30μg/ml卡那霉素的甘油琼脂培养基中，37℃培养至OD₆₀₀＝0.6，缓慢降温至28℃，加入IPTG(使IPTG的终浓度为0.2mmol/L)，诱导培养16h。诱导培养结束后，超声破菌，离心，分离上清液，采用Western bolt检测，其结果如图8所示。在50.4KDa处有表达条带，与外源插入的目的基因arcA所表达蛋白的理论计算得到的分子量一致。

由此证明：本实施例已成功构建得到精氨酸脱亚胺酶生产菌。

对比例1：

将SEQ ID NO.1所示的arcA基因通过常规基因工程的手段整合到质粒pWB980中，构建得到重组表达载体；然后将构建的重组表达载体导入到枯草芽胞杆菌168中，获得转化子，按实施例3的方法筛选阳性转化子，并进行验证，构建得到精氨酸脱亚胺酶生产菌A。

对比例2：

将SEQ ID NO.1所示的arcA基因通过常规基因工程的手段整合到质粒pWB980-Pg3(按实施例2的方法构建)中，构建得到重组表达载体；然后将构建的重组表达载体导入到枯草芽胞杆菌168中，获得转化子，按实施例3的方法筛选阳性转化子，并进行验证，构建得到精氨酸脱亚胺酶生产菌B。

对比例3：

将SEQ ID NO.2所示的arcA基因通过常规基因工程的手段整合到质粒pWB980中，构建得到重组表达载体；然后将构建的重组表达载体导入到枯草芽胞杆菌168中，获得转化子，按实施例3的方法筛选阳性转化子，并进行验证，构建得到精氨酸脱亚胺酶生产菌C。

试验例：

1.发酵培养生产精氨酸脱亚胺酶：

将实施例3、对比例1-对比例3构建的精氨酸脱亚胺酶生产菌接入同样组成的发酵培养基中，发酵培养基的组成为：蛋白胨12g/L、酵母膏8g/L、氯化钠3g/L、硫酸铵2.5g/L、三水磷酸氢二钾4g/L、柠檬酸铁铵0.3g/L、柠檬酸2.1g/L、甘油10g/L、七水硫酸镁0.5g/L、硫酸卡那霉素100ppm。

在相同条件下进行发酵培养，发酵培养的初始温度为37℃，pH为6.9-7.0，发酵培养至发酵液稀释100倍后的OD₆₀₀值为0.4时，降温至28℃，向体系中加入IPTG，使IPTG在体系中的终浓度为0.2mmol/L，诱导培养16h。

培养结束后采用相同的条件进行破菌处理，离心，分离上清液。

2.精氨酸脱亚胺酶的酶活检测：

对不同精氨酸脱亚胺酶生产菌在相同条件下培养后得到的上清液中的精氨酸脱亚胺酶的酶活进行检测，具体检测方法如下：

酶活的定义：37℃时，每分钟转化1μmol精氨酸生成瓜氨酸的酶量定义为1U酶活。

配制系列浓度梯度的L-瓜氨酸溶液，按文献(二乙酰一肟-氨基硫脲比色法测定酶转化液中的L-瓜氨酸[J].中国医药工业杂志，2007，38(7)：519-522)的方法测定吸光值，绘制吸光值-瓜氨酸浓度的标准曲线。

取1ml培养液，加入9ml底物(0.2M L-精氨酸，0.2M PBS，pH6.0)，37℃水浴反应30min，立即沸水浴灭酶5min，离心取上清稀释一定倍数后按文献(二乙酰一肟-氨基硫脲比色法测定酶转化液中的L-瓜氨酸[J].中国医药工业杂志，2007，38(7)：519-522)的方法测定吸光值，根据标准曲线计算其中瓜氨酸含量，计算酶活。

结果见表1。

表1：

生产菌	精氨酸脱亚胺酶的酶活
		实施例3构建的精氨酸脱亚胺酶生产菌	260U/ml
对比例1构建的精氨酸脱亚胺酶生产菌A	8U/ml
		对比例2构建的精氨酸脱亚胺酶生产菌B	18U/ml
对比例3构建的精氨酸脱亚胺酶生产菌C	65U/ml

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 新泰市佳禾生物科技有限公司,汕头市佳禾生物科技有限公司

<120> 精氨酸脱亚胺酶生产菌及其构建方法

<130> 2021

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1263

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

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<210> 2

<211> 1271

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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<210> 3

<211> 365

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

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<213> 人工序列

<400> 4

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Claims (7)

1.一种精氨酸脱亚胺酶生产菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将质粒pWB980用EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切处理，将Pg3强启动子序列整合到双酶切处理后的质粒pWB980上，得到质粒pWB980- Pg3，再用BamHⅠ和SphⅠ对质粒pWB980- Pg3进行酶切处理，将arcA基因整合到酶切处理后的质粒pWB980- Pg3上，获得重组表达载体；

（2）将获得的重组表达载体导入到枯草芽孢杆菌中，构建得到精氨酸脱亚胺酶生产菌。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）中，Pg3强启动子序列如SEQID NO.3所示。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）中，质粒pWB980- Pg3的序列如SEQ ID NO.4所示。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）中，所述arcA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2中第7-1266位核苷酸所示。

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（2）中，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽胞杆菌168。

6.由权利要求1-5任一项所述的构建方法构建的精氨酸脱亚胺酶生产菌。

7.权利要求6所述的精氨酸脱亚胺酶生产菌在如下（1）或（2）中的应用：

（1）发酵生产精氨酸脱亚胺酶；

（2）发酵生产瓜氨酸。

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