CN102154323A - 降解赤霉病菌毒素基因及其表达 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种降解赤霉病菌毒素基因及其表达，其中降解赤霉病菌毒素基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还公开了该基因的表达，设计了两对引物，构建了重组质粒pMD19-T/Tri101和重组原核表达载体pGEX-4T2/Tri101，pGEX-4T2/Tri101携带有GST标签，表达得到GST-Tri101融合蛋白。本发明在大肠杆菌中对编码单端孢霉烯3-O-乙酰转化酶的Tri101基因进行了高效表达，并对其核苷酸序列和氨基酸序列进行了详细分析，为进一步研究该基因及其蛋白的生物学功能和植物基因工程奠定理论基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种降解赤霉病菌毒素基因及其表达。
背景技术
由镰刀菌(Fusarium)引起的赤霉病(Fusarium head blight，FHB)是全世界小麦和小粒谷类作物的灾害性病害，带来严重的经济损失，特别在湿度高且温暖的环境下更加严重(Parry D W，Nicholson P，Mcleod L.Fusarium ear blight(scab)in small grain cereals-a review[J].Plant Pathology，1995，44：207-238；McMullen M，Jones R，Gallenberg D.FHB of wheat and barley：a re-emerging disease of devastating impact[J].Plant Disease，1997，81：1340-1348；Windels C E.Economic and social impacts ofFusarium head blight：changing farms and rural communities in the Northern Great Plains[J].Phytopathology，2000，90：17-21.)。小麦赤霉病由多种镰刀菌引起。在世界上不同的地区，因生态地理环境的不同，引起赤霉病的优势致病菌种不同。1984年全国小麦赤霉病研究协作组从我国21个省市、自治区采集小麦赤霉病穗2450份，分离鉴定出18个镰刀菌种，主要是以下5种：禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、黄色镰刀菌(Fusarium culmorum)、燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)、梨孢镰刀菌(Fusarium poae)、雪腐镰刀菌(Microdochium nivale)，其中禾谷镰刀菌在各地均占优势，占94.5％(全国小麦抗赤霉病研究协作组.小麦品种资源抗赤霉病鉴定研究[J].作物品种资源，1984，4：2-7.)。禾谷镰刀菌属于半知菌亚门镰孢属真菌。其生命力强，寄主范围广，腐生性强，主要危害大麦、小麦、玉米等禾本科作物。侵染麦粒或玉米后，生出白色红色絮状或绒状菌丝，菌株生长形态性状不同，变化和变异较大。
赤霉病不仅使产量减少10～50％，也使质量同比下降，还以多种类型的毒素污染谷物，这些毒素对人畜都是有害的(Placinta C M，D’Mello JPF，Macdonald AMC.A review of worldwide contamination of cereal grains and animal feed with Fusarium mycotoxins[J].Animal Feed Science and Technology，1999，78：21-37；Cleveland T E，Dowd P F，Desjardins A E，et al.Pre-harvest prevention of mycotoxins and mycotoxingenic fungi in crops[J].Pest Management Science，2003，59：629-642.)，尤其是属于单端孢霉烯族类的T-2毒素和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)严重的影响着人畜健康。DON毒素被认为是病菌重要的致病因子(Proctor RH，Hohn TM，McCormick SP.Reduced virulence of Gibberella zeae caused by disruption of a trichothecene toxin biosynthetic gene.MPMI，1995，8：591-601；Proctor RH，Hohn TM，McCormick SP.Restoration of wild-type virulence to Tri5 disruption mutants of Gibberella zeaevia gene reversion andmutant complementation.Microbiology，1997，143：2583-2591.)，也是蛋白质合成的强烈抑制因子(Wei CM and McLaughlin CS.Structure-function relationship in the 12，13-epoxytrichothences novel inhibitors of protein synthesis.Bio-chem Biophys Res Commun，1974，57：838-844.)，并且可以诱导细胞凋亡(Yang GH，Jarvis BB，Chung YJ，etal.Apoptosis induction by the satratoxins and other trichothence mycotoxins：relationship to ERK，p38 MARK，and SAPK/JNK activation.Toxicol Appl Pharmacol，2000，164：149-160.)，当人、畜、禽误食后会引起中毒，导致发热、呕吐、腹泻、眩晕等症状，严重危害人畜健康。目前常用生物方法来去除单端孢酶烯毒素的污染，减少DON在谷物中的积累。DON不仅对动植物有毒性，对产毒菌本身也有毒性。因此，为避免受自产毒素的毒害，病菌必须将毒素转化成无毒或低毒物质排出体外。而化学修饰DON是生物体自身主要的毒素转化机制，能提高赤霉病抗性，减少DON在谷物中的积累。研究表明乙酰化可以降低毒性(Thompson WL，Wannemacher RW.Structure-function relationships of 12，13-epoxytrichthecene mycotoxins in cell culture：comparison to whole animal lethality.Toxicon，1986，24：985-994.)。禾谷镰刀菌Tri101基因编码单端孢酶烯3-O-乙酰转移酶，可使DON毒素的C3位羟基乙酰化，使其转化为一种毒性较低的物质，从而降低其毒性。
国外对Tri101基因的结构、功能以及在酵母(Mccomick S P，AlexanderN J.Disruption of Tri101，the Gene Encodin Trichothecene 3-O-Acetyltransferase，from Fusarium sporptrichioid[J].Applied and Environmental Microbiology，1999，65(12)：5252-5256.)、烟草(Muhitch M J，McCormick S P，Alexander N J，et al.Transgenic expression of the TRI101 or PDR5 gene increases resistance of tobacco to the phytotoxic effects of the trichothecene 4，15-diacetoxyscirpenol[J].Plant Science，2000，157(2)：201-207.)、小麦(Okubara P A，Blechl A E，McCormick S P，et al.Engineering deoxynivalenol metabolism in wheat through the expression of a fungal trichothecene acetyltransferase gene[J].Theoretical and Applied Genetics，2002，106：74-83.)]和大麦(Manoharan M，Dahleen L S，Hohn T M，et al.Expression of 3-OH trichothecene acetyltransferase in barley(Hordeum vulgare L.)and effects on deoxynivalenol[J].Plant Science，2006，171：699-706.)中的成功表达已多有报道(Eriksen G S，Pettersson H，Lundh T.Comparative cytotoxicity of deoxynivalenol，nivalenol，their acetylated derives and de-expoxy metabolites[J].Food and Chemical Toxicology，2004，42：619-624.)。但至今还没有禾谷镰刀菌Fg0623(Fusarium graminearium 0623)Tri101基因及其表达的报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的不足，提供一种新的降解赤霉病毒素的Tri101基因及其表达
本发明的技术方案：一种降解赤霉病毒素的Tri101基因，来源于禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)Fg0623，GenBank登陆号为GQ907236，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，SEQ ID NO.2所示氨基酸序列。编码的蛋白为单端孢霉烯3-O-乙酰转化酶。编码451个氨基酸的多肽，推测分子量为49.45kDa，等电点为5.14；编码451个氨基酸残基，有其起始密码子ATG和终止密码子TAG。
所用禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)Fg0623，利用MEGA3.1软件对编码单端孢酶烯3-O-乙酰转移酶的Tri101、Tri201和TAT基因的氨基酸序列建立系统进化树，分析结果表明，Fusarium graminearium 0623与Fusarium sporotrichioides属于同一进化枝且与Fusarium asiaticum有较近的亲缘关系，而与F.oxysporum、F.moniliforme、F.nygamai、F.nisikadoi和F.decemcellulare的亲缘关系较远。
本发明将培养好的Fg0623按韩利刚等(韩利刚，袁毅，王罡.丝状真菌组织DNA的提取[J].生物技术，1999，9(6)：38-41.)的方法收集菌体，依据RNAisoTM Plus说明书上方法提取菌体总RNA，进而反转录合成了禾谷镰刀菌Fg0623 cDNA。
本发明根据GenBank中已经登陆的其他镰刀菌的Tri101基因序列设计并合成了引物。上游引物Bp-Tri101-F：5′-GGATCCATGGCTTTCAAGATACAGCT-3′，引入了BamHI酶切位点；下游引物Bp-Tri101-R：5′-CTCGAGCTAACCAACGTACTGCGCAT-3′，引入了XhoI酶切位点。
利用上述一对引物和合成的cDNA为模板进行PCR扩增，将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析，得到特异性PCR条带。再将目的片段与pMD19-T载体连接，并转化大肠杆菌JM109菌株，经筛选、鉴定得到插入目的片段的阳性克隆。最后对阳性克隆进行DNA序列测定，利用DNAclub软件并通过NCBI网站的BLAST功能对所测定序列进行比较分析。
本发明所提供的Fg0623 Tri101基因含有一个完整的开放阅读框，阅读框架全长1356bp。该基因已在GenBank中登陆，登陆号为GQ907236。它与Kimura报道的禾谷镰刀菌Tri101基因核苷酸序列(Kimura M，Shingu Y，Yoneyama K，et al.Features of Tri101，the trichothecene 3-O-acetyltransferase gene，related to the self-defense mechanism in Fusarium graminearum[J].Biosci Biotechnol Biochem，1998，62(5)：1033-1036.)同源性最高，为99.78％，碱基序列只在444位由A变异为G，在1 173位由T变异为C，从而引起Tri101基因推导的氨基酸序列中第148位氨基酸由异亮氨酸(Ile)变异为缬氨酸(Val)，第391位氨基酸由苯丙氨酸(Phe)变异为亮氨酸(Leu)，虽然核苷酸序列的830位也由T变异为C，但该变化没有引起氨基酸的变化。该基因编码451个氨基酸残基，有其起始密码子ATG和终止密码子TAG。该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
该基因编码的蛋白为单端孢酶烯3-O-乙酰转移酶，Blast数据库分析结果表明，其属于转移酶总科。对Tri101基因编码氨基酸序列的基本特征进行分析，结果显示：该基因所预测的蛋白质分子量为49.45kDa，等电点为5.14，氨基酸组成中带正电荷氨基酸(Arg、Lys)47个，占10.42％，带负电荷氨基酸(Asp、Glu)57个，占12.64％，疏水性氨基酸217个，占48.12％，亲水性氨基酸184个，占40.80％。利用Genedoc软件，将Fg0623 Tri101基因推导的氨基酸序列进行同源比对，结果表明，它与Kimura报道的禾谷镰刀菌Tri101氨基酸序列同源性最高，为99.56％，与其它13种镰刀菌的Tri101氨基酸序列的同源性分别为97.91％～75.68％。
本发明的第二个目的是提供降解赤霉病菌毒素Tri101基因的表达。
一种重组质粒pMD19-T/Tri101，含有本发明的新基因Tri101，带有BamHI和XhoI双酶切位点，通过蓝白斑筛选，并用BamHI、XhoI双酶切鉴定阳性重组克隆。重组质粒经BamHI和XhoI双酶切为约2.7kb的载体片段和1.4kb左右的插入片段。
本发明构建了Tri101基因的原核表达载体：用BamHI、XhoI双酶切重组克隆pMD19-T/Tri101，回收1400bp左右的片段，与经同样酶切的原核表达载体pGEX-4T2进行连接，从而构建成Tri101基因的原核表达载体。原核表达载体pGEX-4T2携带GST标签。
本发明用重组表达载体pGEX-4T2/Tri101转化大肠杆菌JM109，然后进行重组质粒的双酶切鉴定。提取经初步鉴定的质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，进行目的基因的IPTG诱导表达和SDS-PAGE分析。不同诱导浓度表达产物量的比较表明，IPTG终浓度为1.0mM时诱导的表达量最大。
本发明将Fg0623的Tri101基因在大肠杆菌中进行了高效表达，并对其核苷酸序列和氨基酸序列进行了详细分析，为进一步研究该基因及其蛋白的生物学功能和植物基因工程奠定理论基础，同时对研究该基因在作物上的表达来降低赤霉病的发病率，提高作物产量，降低真菌毒素水平奠定基础。
附图说明
图1为Tri101基因RT-PCR扩增电泳结果，其中，Lane M：DNA Marker DL2000；Lane 1：PCR product；
图2为重组质粒pMD19-T/Tri101酶切鉴定结果，其中，Lane M：DNA Marker DL15000；Lane 1：recombinant plasmid pMD 19-T/Tri101；
图3为Tri101氨基酸组成；
图4为Tri101蛋白质种类；
图5为FgTri101基因所推导的氨基酸序列与其它镰刀菌Tri101氨基酸序列的同源性比较，其中，FgTri101：Fusarium graminearium 0623 Tri101(ACX49121)；GzTri101：Gibberella zeae Tri101(BAA29037)；FasTri101：Fusarium asiaticum Tri101(AAG43707)；FauTri101：Fusarium austroamericanum Tri101(AAG43694)；FmerTri101：Fusarium meridionale Tri101(AAG43691)；FbrTri101：Fusarium brasilicum Tri101(AAT45949)；FvoTri101：Fusarium vorosii Tri101(ACJ70050)；FmesTri101：Fusarium mesoamericanum Tri101(AAG43695)；FcoTri101：Fusarium cortaderiae Tri101(AAT45947)；FaeTri101：Fusarium aethiopicum Tri101(ACJ70045)；FboTri101：Fusarium boothii Tri101(AAG43700)；FceTri101：Fusarium cerealis Tri101(AAG43721)；FcuTri101：Fusarium culmorum Tri101(AAG43716)；FpsTri101：Fusarium pseudograminearum Tri101(AAG43725)；FspTri101：Fusarium sporotrichioides Tri101(AAK77937)；
图6为FgTri101基因推导的氨基酸序列与其他编码单端孢酶烯3-O-乙酰转移酶基因的氨基酸序列的进化树比较；
图7为重组质粒pGEX-4T2/Tri101酶切鉴定结果，其中，Lane M：DNA Marker DL15000；Lane 1：recombinant plasmid pGEX-4T2/Tri101；
图8为pGEX-4T2/Tri101原核表达产物的SDS-PAGE分析，其中，Lane M：Protein marker；Lane 1：pGEX-4T2/Tri101 induced with IPTG；Lane 2：pGEX-4T2 induced with IPTG；Lane 3：BL21 without induction；
图9为不同IPTG浓度诱导的表达产物量的SDS-PAGE比较，其中，Lane M：Protein marker；Lane 1-5：Proteins of pGEX-4T2/Tri101 induced by IPTG at 0.4，0.6，0.8，1.0 and 1.2mM；Lane 6：pGEX-4T2 induced with IPTG；Lane 7：BL21 without induction；
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步阐述，但实施例并不对本发明做任何限定。下述实施例中所用方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例一 禾谷镰刀菌降解毒素基因Tri101的表达
1、总RNA的提取和cDNA的合成
将新鲜PDA斜面培养好的Fg0623孢子接种于液体培养基中，150rpm，28℃，振荡培养48h；吸取1mL培养好的菌液于1.5mL无菌EP管中，10000rpm离心10min；收集菌体，依据RNAisoTM Plus说明书上方法提取菌体总RNA。以提取的总RNA为模板，合成cDNA。RT1体系：RNase Free dH2O 6.5μL，dNTP-Mix(10mM)1μL，Oligo dT(50μM)2μL，Total RNA 0.5μL于PCR仪上65℃反应5min，冰上急冷。RT2体系：上述变性、退火后的反应液10μL，5×PrimeScriptTM Buffer 4μL，RNase Inhibitor(40U/μL)0.5μL，PrimeScriptTM RTase (200U/μL)1μL，RNase Free dH2O 4.5μL。反应程序：30℃ 10min，42℃60min，70℃ 15min，后4℃保持，得到cDNA。
2、引物设计
根据GenBank中已经登陆的其他镰刀菌的Tri101基因序列设计并合成引物。
上游引物Bp-Tri101-F：5′-GGATCCATGGCTTTCAAGATACAGCT-3′，引入了BamHI酶切位点；
下游引物Bp-Tri101-R：5′CTCGAGCTAACCAACGTACTGCGCAT-3′，引入了XhoI酶切位点。
以上引物由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成。
3、PCR扩增及产物纯化
PCR扩增体系(25μL)：
10×Buffer(Mg2+ free) 2.5μL
MgCl2(25mM) 2.5μL
dNTP(10mM) 0.4μL
F primer(10μM) 1μL
R primer(10μM) 1μL
rTaq DNA聚合酶(0.5U/μL) 0.2μL
模板cDNA(10ng/μL) 6μL
ddH2O 11.4μL
Total 25μL
扩增条件：94℃预变性3min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，进行30个循环；72℃延伸10min，10℃保持。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测。
PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，采用U-gene公司DNA凝胶回收试剂盒回收1.4kb左右的目的片段。具体操作按照试剂盒说明书进行。纯化产物-20℃保存备用。
以Fg0623总RNA反转录后的cDNA为模板扩增的PCR产物，经琼脂糖凝胶电泳分析，结果得到1400bp左右的特异性PCR条带(图1)。
4、PCR回收产物的连接和转化
将PCR回收产物与pMD19-T vector 16℃连接过夜，具体操作按试剂盒说明书进行。
参照文献(Sambrook J，Fritsch E F，Maniatis T.Molecular cloning：A laboratory manual，2nd Edition[M].New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989.)用CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞，所用大肠杆菌为JM109菌株。
热击转化步骤如下：
(1)取出-70℃保存的大肠杆菌感受态细胞，置于冰上5min。
(2)加入10μL连接产物，轻轻混匀，冰浴30min。
(3)42℃水浴热击90s，迅速置于冰上，冰浴5min。
(4)加入790μL新鲜的LB液体培养基，37℃，150rpm，振荡培养1h。
(5)取出菌液，4℃，10 000rpm，离心2min。
(6)弃上清(约残留200μL上清液)，重悬沉淀，将其全部均匀涂布于含X-gal、IPTG的LB平板(含50mg/L Amp)上，37℃，培养约14h。
(7)将培养皿置于4℃(约1-2h)，进行显色反应。
5、质粒提取与重细质粒鉴定
(1)随机挑取阳性单克隆(白色菌落)，加入5mL LB(含50mg/L Amp)液体培养基，37℃，250rpm震荡培养至OD600为0.4-0.5(12-16h)。
(2)取3-5mL菌液，参照U-gene公司质粒提取试剂盒方法提取质粒，具体操作按照试剂盒说明书进行。-20℃保存备用。
(3)用BamHI、XhoI双酶切鉴定重组质粒pMD19-T/Tri101，按下表加入各试剂，37℃，温浴2h。
BamHI 1μL
XhoI 1μL
10×T buffer 1μL
ddH2O 3μL
重组质粒 4μL
Total 10μL
将目的片段与pMD19-T载体连接，用氯化钙法转化大肠杆菌JM109，在含有Ampicilin、X-gal、IPTG的LB平板上根据蓝白斑筛选阳性重组子，然后用BamHI和XhoI双酶切鉴定重组克隆，酶切结果见图2，质粒被切为约2.7kb的载体片段和1.4kb左右的插入片段。酶切结果表明，已得到插入目的片段的阳性克隆。
实施例二 禾谷镰刀菌降解毒素基因Tri101的序列分析
经酶切鉴定成功的阳性克隆样品送Sangon公司进行DNA序列测定。利用DNAclub软件并通过NCBI网站的BLAST功能对所测定序列进行比较分析。
Fg0623Tri101基因序列测定结果表明，Fg0623Tri101基因含有一个完整的开放阅读框，阅读框架全长1356bp。该基因已在GenBank中登陆，登陆号为GQ907236。它与Kimura报道的禾谷镰刀菌Tri101基因核苷酸序列(Kimura M，Shingu Y，Yoneyama K，et al.Features of Tri101，the trichothecene 3-O-acetyl-transferase gene，related to the self-defense mechanism in Fusarium graminearum[J].Biosci Biotechnol Biochem，1998，62(5)：1033-1036.)同源性最高，为99.78％，碱基序列只在444位由A变异为G，在1 173位由T变异为C，从而引起Tri101基因推导的氨基酸序列中第148位氨基酸由异亮氨酸(Ile)变异为缬氨酸(Val)，第391位氨基酸由苯丙氨酸(Phe)变异为亮氨酸(Leu)，虽然核苷酸序列的830位也由T变异为C，但该变化没有引起氨基酸的变化。该基因编码451个氨基酸残基，有其起始密码子ATG和终止密码子TAG。Tri101基因的核苷酸序列及对应的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
实施例三 Tri101基因编码氨基酸序列分析
由http://www.expasy.org/tools/#translate网站提供的蛋白分析软件对Tri101基因编码氨基酸序列的基本特征进行分析，结果显示：该基因所预测的蛋白质分子量为49.45kDa，等电点为5.14，氨基酸组成中带正电荷氨基酸(Arg、Lys)47个，占10.42％，带负电荷氨基酸(Asp、Glu)57个，占12.64％，疏水性氨基酸217个，占48.12％，亲水性氨基酸184个，占40.80％，见表1和图3。
表1 Tri101蛋白氨基酸含量
注：*疏水氨基酸，#亲水氨基酸
该基因编码的蛋白为单端孢酶烯3-O-乙酰转移酶，Blast数据库分析结果表明，其属于转移酶总科，如图4。
利用http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html网站和Genedoc软件，将Fg0623 Tri101基因推导的氨基酸序列进行同源比对，结果表明(图5)，它与Kimura报道的禾谷镰刀菌Tri101氨基酸序列同源性最高，为99.56％，与其它13种镰刀菌的Tri101氨基酸序列的同源性分别为97.91％～75.68％。
利用MEGA3.1软件对编码单端孢酶烯3-O-乙酰转移酶的Tri101、Tri201和TAT基因的氨基酸序列建立系统进化树(图6)，分析结果表明，Fusarium graminearium 0623与Fusarium sporotrichioides属于同一进化枝且与Fusarium asiaticum有较近的亲缘关系，而与F.oxysporum、F.moniliforme、F.nygamai、F.nisikadoi和F.decemcellulare的亲缘关系较远。
实施例四 Tri101基因原核表达载体的构建
用BamHI、XhoI双酶切插入目的片段的阳性克隆pMD19-T/Tri101，回收1400bp左右的片段，与经同样酶切的携带有GST标签的原核表达载体pGEX-4T2连接，在T4连接酶的作用下于16℃过夜连接。同时转化大肠杆菌JM109，过夜培养，然后进行重组表达载体的转化及重组质粒的双酶切鉴定。酶切鉴定结果表明，成功获得重组表达质粒pGEX-4T2/Tri101(如图7)；序列测定表明Tri101基因全长为1356bp，已按正确的读码框插入到pGEX-4T2载体上，未产生突变。
实施例五 Tri101基因的诱导表达和SDS-PAGE分析
提取经初步鉴定的质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，然后涂平板过夜培养，挑单菌落于10mL含有Amp的LB培养基中，5个重复，振荡培养至OD600达0.3左右，分别加入不同浓度的IPTG(异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷)，使终浓度分别为0.4、0.6、0.8、1.0和1.2mM，37℃、150r/min诱导过夜。收集菌液，取诱导过的菌液1.5mL，10 000×g离心1min，弃上清液，在每管沉淀中加入1×SDS-PAGELoadingBuffer混匀，在沸水中煮10min，后12 000×g离心10min，取10μL上样或-20℃保存备用。
配制10％分离胶和5％浓缩胶，SDS-PAGE检测蛋白是否表达。
含有重组质粒的工程菌经IPTG诱导后，样品经SDS-PAGE分离，表达载体pGEX-4T2(阳性对照)产生26kD大小的蛋白条带，表达蛋白为目的蛋白(分子量约49.45kD)和GST(分子量约26kD)的融合体，大约为75.45kD的蛋白条带，而BL21工程菌(阴性对照)则无相应的条带(如图8)，说明pGEX-4T2/Tri101基因得到正确表达。
不同诱导浓度表达产物量的比较表明(图9)，IPTG终浓度为1.0mM时诱导的表达量最大。
Claims (10)
1.一种降解赤霉病毒素的Tri101基因，来源于禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)Fg0623，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，SEQ ID NO.2所示氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的Tri101基因，其特征在于，编码451个氨基酸的多肽，推测分子量为49.45kDa，等电点为5.14；编码451个氨基酸残基，有其起始密码子ATG和终止密码子TAG。
3.如权利要求1所述的Tri101基因，其特征在于，禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)Fg0623与Fusarium sporotrichioides属于同一进化枝且与Fusarium asiaticum有较近的亲缘关系，而与F.oxysporum、F.moniliforme、F.nygamai、F.nisikadoi和F.decemcellulare的亲缘关系较远。
4.一种降解赤霉病毒素的Tri101基因所编码的蛋白，其特征是：推测的蛋白质分子量为49.45kDa，等电点为5.14，氨基酸组成中带正电荷氨基酸47个，占10.42％，带负电荷氨基酸57个，占12.64％，疏水性氨基酸217个，占48.12％，亲水性氨基酸184个，占40.80％。
5.如权利要求4所述的蛋白，其特征在于，与Kimura报道的禾谷镰刀菌Tri101氨基酸序列同源性最高，为99.56％。
6.一种重组质粒pMD19-T/Tri101，其特征是：含有权利要求1所述的Tri101基因，带有BamHI和XhoI双酶切位点。
7.如权利要求7所述的重组质粒pMD19-T/Tri101，其特征在于，经BamHI和XhoI双酶切，切为约2.7kb的载体片段和1.4kb左右的插入片段。
8.一种重组原核表达载体pGEX-4T2/Tri101，其特征是：由用BamHI、XhoI双酶切重组克隆pMD19-T/Tri101，回收得到的1400bp左右的片段，与经同样酶切的原核表达载体pGEX-4T2进行连接而构建成。
9.如权利要求9所述的重组原核表达载体pGEX-4T2/Tri101，其特征在于，转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导表达得到GST-Tri101融合蛋白，其分子量为75.45kDa。
10.一种对引物，根据权利要求1所述镰刀菌的Tri101基因序列设计并合成：上游引物Bp-Tri101-F：5′-GGATCCATGGCTTTCAAGATACAGCT-3′，引入了BamHI酶切位点；下游引物Bp-Tri101-R：5′-CTCGAGCTAACCAACGTACTGCGCAT-3′，引入了XhoI酶切位点。
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Cited By (3)
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|---|---|---|---|---|
| CN102796694A (zh) * | 2012-09-11 | 2012-11-28 | 国家粮食局科学研究院 | 高效降解两种真菌毒素的工程菌及应用 |
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1715915A (zh) * | 2004-07-02 | 2006-01-04 | 华中农业大学 | 一种镰刀菌毒素的分子检测方法 |
-
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|---|---|---|---|---|
| CN1715915A (zh) * | 2004-07-02 | 2006-01-04 | 华中农业大学 | 一种镰刀菌毒素的分子检测方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 《植物病理学报》 20101031 闫海霞 等 降解赤霉病菌毒素Tri101基因的原核表达及抗体制备 469-474 1-10 第40卷, 第5期 * |
| 《生物技术通报》 20100126 闫海霞 等 禾谷镰刀菌降解毒素基因Tri101的克隆和序列分析 128-135 1-7,10 , * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102796694A (zh) * | 2012-09-11 | 2012-11-28 | 国家粮食局科学研究院 | 高效降解两种真菌毒素的工程菌及应用 |
| KR101816560B1 (ko) | 2015-10-22 | 2018-01-09 | 대한민국 | 붉은곰팡이 및 ｂ형 트라이코쎄신 생성 근연종 검출용 프라이머쌍 및 이를 이용한 검출방법 |
| CN112725362A (zh) * | 2020-12-01 | 2021-04-30 | 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） | 一种露湿漆斑菌a553抗单端孢霉烯自我保护基因gnat11及其应用 |
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