CN105624152B - 一种用于核酸扩增的酵母样真菌总dna无仪器提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及真菌分子生物学领域，具体是一种用于核酸扩增的酵母样真菌总DNA无仪器快速提取方法，所述方法将化学裂解法和酶裂解法两大酵母破壁方法巧妙整合，结合抽吸装置、过滤装置以及核酸提取注射器，无需供电设备在1.5到3小时内完成DNA提取，是目前唯一的酵母菌无仪器DNA高效提取方法。本发明的提取方法具有快速简便、灵敏、无毒、低成本等优点，可适用于绝大部分酵母样真菌。

Description

一种用于核酸扩增的酵母样真菌总DNA无仪器提取方法

技术领域

本发明涉及真菌的分子生物学研究领域，具体地说，是一种用于核酸扩增的酵母样真菌总DNA无仪器提取方法。

背景技术

近几十年来，生物医学领域的巨大进步促进了人类疾病防控能力的显著提升。然而，随着造血干细胞和实体器官移植、肿瘤化疗、免疫抑制剂、广谱抗生素、各种置管技术的广泛使用及HIV在全球的持续蔓延，各种侵袭性真菌感染的发病率及死亡率在全球呈显著上升趋势。酵母样病原真菌既包括新生隐球菌(Cryptococcus.neoformans)、格特隐球菌(Cryptococcus.gattii)、白念珠菌(Candida albicans)等酵母菌，也包括一些温度变化型双向真菌(Thermally Dimorphic Fungi)，比如组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)在常温(22-28℃)下为菌丝形态，而在人体37℃状态下呈现酵母形态。由于上述酵母菌和双向真菌菌的组织形态具有很大的相似性，对于没有系统深厚病原真菌学基础的检验人员，难以通过形态学确诊，并且真菌感染疾病谱正发生变化，不同病种治疗药物差异较大，非基于病原体确诊的经验性抗真菌治疗效果有限。直接镜检通常敏感性不够高，存在一定的假阳性和假阴性。真菌培养往往需要很长时间(一周到一个月)，而临床急诊的救治工作争分夺秒，确诊时常常错过最佳诊治时机。血清学检测是临床侵袭性真菌感染的重要检测方法，然而其影响因素较多，存在不同程度的假阳性和假阴性结果。与传统方法相比，分子生物学检测手段因其高灵敏度、高特异性及检测时间短等优点，为不易培养病原真菌的快速检测和鉴定、抗真菌药物抗性检测以及宿主组织体液的直接性快速检测带来了希望，是未来真菌感染性疾病诊断的新趋势，具有重大的发展前景。

传染病的早期诊断对于治疗策略的选择以及患者的预后其决定作用。研究发现，在某些情况下，无论是什么病原菌侵袭性感染，延误诊断一小时病死率增加7％。同时，早期诊断可以降低后续的治疗成本，减轻患者经济负担。分子诊断的出现，满足了传染病早期快速的要求。一般检测仅需2个小时就能得出检测结果，而常规病原体检测(比如病原体培养)则需要几天时间。现在分子诊断主流的市场是高端人群，主要应用于富裕国家或者地区的大型医学中心或者中心实验室。一般该检测需要配套大型自动化仪器，比如核酸提取需要用到离心机、细胞破碎仪等、核酸扩增需要用到PCR仪等；同时需要配备经过额外培训的操作人员，所以运行成本以及检测费用也相应较高。

相比于发达国家或者地区，发展中国家一直是传染病肆虐的重灾区，发病率高，病死率高，治疗费用难以负担。然而，在我国以及世界上很多发展中国家以及地区，基层医疗场所难以提供大型诊断仪器，更是无法负担大型诊断仪器的运转和维护；患者也无法承担高昂的检查费用。故现今在早期诊断方向的大量科研成果，尤其是分子诊断技术，无法惠及该人群，而这些诊断技术恰恰是这部分人最需要的。同时，大型仪器携带不便，限制了分子诊断技术在现场调查的应用。所以，诊断和治疗手段的缺乏导致了传染病扩散、疫情恶性加剧。

但是，病原体“无仪器检测技术”的出现(无仪器核酸提取、恒温扩增技术)，架起了先进的病原体分子诊断技术和贫困地区人群的桥梁，为传染病防控提供了新的途径。由于无需大型医疗仪器，甚至无需供电设备，无仪器分子诊断技术可以在贫困、边远地区普及，有极大改善传染病的防控和治疗现状的潜力。无仪器核酸诊断分两个步骤，即临床样本核酸提取以及后续的核酸恒温扩增检测。恒温扩增方面已有大量的技术突破，比如杭州优思达生物技术有限公司开发的我国唯一自主知识产权的交叉引物扩增技术(CPA)以及日本荣研生物科技公司开发的环介导等温扩增(LAMP)等，已经能够实现“仅通过一杯温水就能实现疾病检测”。如中国发明专利ZL 200810084367.0，中国发明专利申请201510410272.3所述，细菌的无仪器核酸提取已经实现，但是该专利未提供用于酵母菌的核酸提取方法，尤其是可以和无仪器提取仪器相匹配的破壁方法。不同于其他微生物，酵母菌的细胞壁由几丁质、葡聚糖、甘露聚糖、糖蛋白组成，十分坚固厚实，难以通过简单的物理或者化学方法去除。在酵母样真菌无仪器DNA提取技术的研发中，在无供电设备的条件下，寻找廉价、高速、无毒、方便的菌体破壁策略，并且和无仪器提取器械最佳匹配，是最为关键的技术难点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于核酸扩增的酵母样真菌总DNA无仪器提取方法，所述方法将化学裂解法(chemical lysis)和酶解法(enzymatic lysis)两大酵母破壁方法巧妙整合，结合注射器过滤器以及核酸提取注射器等无仪器提取器械，在1.5到3小时内完成DNA提取，是目前唯一的酵母菌无仪器DNA高效提取方法。

本发明的第一方面，提供一种用于核酸扩增的酵母样真菌总DNA无仪器提取方法，本发明的提取方法所需材料和仪器：真菌裂解液，清洗液，无水乙醇，蛋白酶K，抽吸装置(比如医用注射器)，过滤装置(注射器过滤器)，保温杯(或者其他保温装置，如水浴锅等)，无仪器核酸提取注射器(杭州优思达生物技术有限公司)，离心管。

所述的酵母样真菌包括：隐球菌、念珠菌、胶红酵母、毛孢子菌等酵母菌，以及双向真菌的酵母形态(如组织胞浆菌)。

所述的用于核酸扩增的酵母样真菌总DNA无仪器提取方法包括以下步骤：

A、用抽吸装置抽取酵母样真菌菌液。

此处所述的酵母样真菌菌液可以是酵母培养菌液，也可以是经过预处理的临床液化样本。所述的预处理的临床液化样本，是将除了包含酵母样真菌，还包含人体组织或者其他微生物(如细菌)菌体的临床样本，经液化预处理，由于酵母细胞壁坚固，所以液化预处理过程中人体组织或者其他微生物菌体分解，但是酵母细胞仍然完整保存。

所述的液化预处理的具体步骤包括：将生物样本中先加入氢氧化钠溶液，然后加入裂解液进行裂解，得到裂解反应液；所述的裂解液中含有胍盐、乙二胺四乙酸二钠、表面活性剂、核酸助沉剂和缓冲剂。所述氢氧化钠溶液的浓度为1～4wt％，优选3～4wt％，最优选4wt％；裂解液中含有胍盐4～8mol/L(胍盐选自硫氰酸胍或盐酸胍)、乙二胺四乙酸二钠10～30mmol/L、糖原0.015～0.15mmol/L、三羟甲基氨基甲烷20～80mmol/L、聚乙二醇辛基苯基醚0.6～1.4v/v％；更优选的，裂解液中含有硫氰酸胍5～7mol/L、乙二胺四乙酸二钠15～25mmol/L、糖原0.03～0.12mmol/L、三羟甲基氨基甲烷40～60mmol/L、聚乙二醇辛基苯基醚0.8～1.2v/v％。

B、抽吸装置连接过滤装置(孔径小于1μm，优选0.22μm)，推出滤液，而酵母菌体留在过滤装置中，进行后续无仪器核酸提取。

若处理的是临床样本，由于人体组织以及细菌菌体在样本液化预处理阶段已经完成破裂，所以滤液可用于细菌以及人体组织核酸提取以及核酸扩增。

C、抽吸装置经过过滤装置吸取胍盐裂解液。可重复抽吸过程，从而保证过滤器上大部分菌体得以重悬。

D、取下过滤装置，将酵母-裂解液混合液推出，放入90-100℃中保温10-15分钟，优选为15分钟。

E、冷却后，加入蛋白酶K。最终工作浓度是50-100μg/ml，优选100μg/ml。孵育温度为55至65℃，优选温度为58℃，孵育时间为15分钟至48小时，优选时间为2小时。

F、连接新的过滤装置，推出裂解液到EP管。

G、加入核酸沉淀剂(比如加入裂解液1/10体积的醋酸钠，或者其他商业化核酸沉淀剂)，混匀后加入2倍体积的95％-100％浓度乙醇，优选为100％无水乙醇，静置15-30分钟，优选20分钟。

H、用核酸提取注射器缓慢吸入混合液全部，缓慢推出液体，完成核酸吸附。

I、用核酸清洗液完成滤膜上蛋白等杂质的清洗。清洗液配方：无水乙醇90％体积+3M NaAC 10％体积，pH＝5.2，用HAc调节pH值。

J、用核酸洗脱液(双蒸水或者TE缓冲液)完成核酸洗脱。

所述的步骤C中的胍盐裂解液中异硫氰酸胍的浓度为2.0-8.0M，优选3.0M。

所述的胍盐裂解液具体配方为：

每1000ml裂解液中，包含：

三羟甲基氨基甲烷(Tris) 0.047mol

乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na) 0.020mol

异硫氰酸胍 2.0-8.0mol(最优值3.0mol)

Triton X-100 11.3ml

用水补足 1000ml

用盐酸将pH调至6.53，将溶液转移至储存容器，贴上标签，室温避光保存。

本发明特点在于：

1、使用蛋白酶K作为裂解酶，而非蜗牛酶、Zymolase酶等特异性的真菌细胞壁裂解酶。原因如下：①蛋白酶K是一种广谱高活性的丝氨酸蛋白酶，主要用于切割细胞蛋白的丝氨酸位点，无论是在原核生物还是真核生物，该位点广泛存在。所以，不同于蜗牛酶、Zymolase酶等特异性的真菌细胞壁裂解酶只能选择性的作用于某些特定敏感真菌的细胞壁，由于丝氨酸位点的广泛存在，如果切割位点充分暴露，蛋白酶K在大部分真菌均能起到很好的裂解效果。②蛋白酶K在在较广的pH范围内(pH 4-12.5)均有活性，最佳活性PH值为8.0。③蛋白酶K在某些化学裂解液中不仅不会失活，反而具有更好的裂解效果。这些化学裂解系统包括：十二烷基硫酸钠(SDS)，胍盐，尿素，肌酸、曲拉通X-100，吐温20、柠檬酸盐、碘乙酸、乙二酸四乙胺(EDTA)等。据相应研究报道，上述体系通过裂解暴露蛋白酶K作用位点，而增强其作用。根据下表所示，蛋白酶K在胍盐裂解液中效果最佳。故本发明选用基于异硫氰酸胍的裂解液。

表1蛋白酶K在不同缓冲液下的活性

缓冲液(pH＝8.0,50℃,1.25μg/mL蛋白酶K,孵育15分钟)	蛋白酶K活性(％)
		30mM Tris·Cl	100
30mM Tris·Cl；30mM乙二胺四乙酸；5％吐温20；0.5％曲拉通X-100；800mM胍盐	313
		36mM Tris·Cl；36mM乙二胺四乙酸；5％吐温20；0.36％曲拉通X-100；735mM胍盐	301
10mM Tris·Cl；25mM乙二胺四乙酸；100mM NaCl；0.5％SDS	128
		10mM Tris·Cl；100mM乙二胺四乙酸；20mM NaCl；1％酰基氨酸	74
10mM Tris·Cl；50mM KCl；1.5mM MgCl<sub>2</sub>；0.45％吐温20；0.5％曲拉通X-100	106
		10mM Tris·Cl；100mM乙二胺四乙酸；0.5％SDS	120
30mM Tris·Cl；10mM乙二胺四乙酸；1％SDS	203

2、本发明选用异硫氰酸胍裂解液，原因如下：①蛋白酶K起到最佳裂解效果。②该裂解液可以在高温水浴(90℃以上)下不失活性，且裂解效果佳。③核酸提取注射器在胍盐裂解液系统中表现佳。

3、本方法首先在高温下用化学裂解系统快速失活酵母菌，减少在现场缺少保护的条件下，致病微生物对于操作人员的潜在威胁；高温以及化学腐蚀同时部分破坏酵母细胞壁以及荚膜，暴露蛋白酶K切割位点，酶解细胞膜从而暴露核酸。

4、本发明的方法具体的优点在于：时间短(仅需不到3个小时)；无刺激性气味(其他商用试剂盒大多使用了巯基乙醇，苯酚、氯仿、异戊醇等，危害操作人员健康)；提取得率高(10⁸菌提取得到将近700ng/μl，等同于大部分商用试剂盒)；敏感度高(即能够提取样本量极小的酵母，具体是能够成功提取总量为10个酵母菌(1ml浓度为10¹/ml菌液)，并通过实时定量PCR验证，有临床推广的潜质)。

5、本发明无需大型仪器，甚至无需供电设备。仅需要温水(55至65℃)、热水或者沸水(90℃以上)，保温杯，核酸提取注射器，医用注射器，注射器过滤装置等。

6、本发明的方法可适用于绝大部分酵母样真菌。高温裂解、化学裂解以及蛋白酶K裂解对不同的酵母无选择性，不同菌之间的提取结果较为一致、稳定。

附图说明

图1.本发明的方法可用于微量酵母菌的抽提，并用RT-PCR证明提取成功。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1：提取DNA效果：

具体的优选的提取方法：

A、用3ml注射器抽取2ml均匀酵母培养菌液，浓度为10⁸-10¹/ml。

B、注射器连接孔径为0.22μm注射器过滤器，推弃滤液，将酵母菌体留在过滤器内侧。

C、注射器吸入胍盐裂解液1ml(配方见下文)，可重复抽吸过程，从而保证过滤器上大部分菌体得以重悬。

D、取下过滤器，将菌体-裂解液推入EP管，放入盛有95℃以上热水的保温杯中15分钟。

E、室温冷却10分钟，注射器吸入合适体积的蛋白酶溶液，使其浓度为100μg/ml，放入58度保温杯中保温2小时。

F、连接新的过滤器，推出裂解液到5ml EP管。

G、加入100μl醋酸钠(约为1/10裂解液体积)，混匀后加入2mL无水乙醇，静置20分钟。

H、优思达核酸提取注射器吸入全部混合液，然后缓慢推弃，注射器前段的核酸吸附膜完成核酸吸附。

I、吸入2ml清洗液，然后缓慢推弃。

J、缓慢空推注射器活塞5次，充分出去吸附膜中残留液体。

K、取下核酸提取注射器前端的核酸富集部分，安装到1ml注射器上。操作时动作轻柔，并保持核酸富集器前段向下倾斜，以免核酸亲和膜脱落。

L、吸取50μl洗脱液，静置一分钟，推出洗脱的核酸模板至0.6ml离心管用于扩增检测。

选取五种酵母菌进行DNA抽提。

总量为10⁶-10¹的上述菌株用无仪器法提取DNA后，使用NS5与NS6真菌通用引物进行实时荧光定量PCR(RT-PCR)的结果，均扩增成功。无模板对照(NTC)未见扩增。

引物序列：

NS5：AACTTAAAGGAATTGACGGAAG(SEQ ID NO.1)

NS6：GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC(SEQ ID NO.2)

扩增体系为：

Premix Ex Taq^TM II(Tli RNaseH Plus)(takara) 12.5μl

NS5 1μl

NS6 1μl

DNA模板 10.5μl

共25μl

扩增条件

95℃30秒-{95℃5秒-55℃30秒-72℃60秒}共40个循环-95℃5秒-60℃30秒

表2本方法对于大量酵母的提取效果

本发明的方法可用于微量真菌的抽提，并用RT-PCR证明提取成功，见图1。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (3)

1.一种用于核酸扩增的酵母样真菌总DNA无仪器提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、用抽吸装置抽取酵母样真菌菌液；

B、抽吸装置连接过滤装置，推出滤液，而菌体留在过滤装置中，进行后续无仪器核酸提取；

C、抽吸装置经过过滤装置吸取胍盐裂解液；

D、取下过滤装置，将菌体-裂解液混合液推出，放入90-100℃中保温10-15分钟；

E、冷却后，加入蛋白酶K；最终工作浓度是50-100μg/ml；孵育温度为55至65℃；孵育时间为2小时；

F、连接新的过滤装置，推出裂解液到EP管；

G、加入裂解液1/10体积的核酸沉淀剂，混匀后加入2倍体积的95％-100％浓度乙醇，静置15-30分钟；

H、用核酸提取注射器缓慢吸入混合液全部，缓慢推出液体，完成核酸吸附；

I、用核酸清洗液完成滤膜上杂质的清洗；

J、用核酸洗脱液完成核酸洗脱；

所述的过滤装置中的滤膜孔径小于1μm；

所述的步骤C中的胍盐裂解液配方为：每1000ml裂解液中，包含：三羟甲基氨基甲烷0.047mol，乙二胺四乙酸二钠0.020mol，异硫氰酸胍3.0mol，Triton X-100 11.3ml，用水补足1000ml，用盐酸将pH调至6.53。

2.根据权利要求1所述的用于核酸扩增的酵母样真菌总DNA无仪器提取方法，其特征在于，所述的步骤I中的清洗液为：90％体积的无水乙醇加入10％体积的3M NaAC，所述的清洗液的pH为5.2，用HAc调节pH值。

3.根据权利要求1所述的用于核酸扩增的酵母样真菌总DNA无仪器提取方法，其特征在于，所述的步骤J中的洗脱液为双蒸水或者TE缓冲液。