CN114350750A - 一种样品菌株鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及菌株鉴定技术领域，且公开了一种样品菌株鉴定方法，包括以下步骤：S1：基因组DNA提取，首先取1.5mL的离心管，向其中加入200μL预处理液和三颗研磨珠，然后加入菌样品，放入研磨仪中研磨充分备用；S2：混合，把研磨后的原料收集起来，然后放置混合罐中，向混合罐中加入20μL Proteinase K溶液，混合均匀；S3：加入裂解液，向混合罐中加入200μL裂解液，充分混合均匀。本发明能够彻底晾干吸附在材料中残留的漂洗液，防止漂洗液影响鉴定数据，采用组织分离法，对培养的菌株进行挑选纯化，从而方便后面的鉴定工作，提高鉴定的精准度。
Description
技术领域
本发明涉及菌株鉴定技术领域，具体为一种样品菌株鉴定方法。
背景技术
杜仲又名思仲、思仙、仙仲、木棉、丝棉树、玉丝皮等，为杜仲科杜仲属植物，是我国特有的单科单属单种的珍贵药用、经济林树种，是“活化石”植物，主要分布在我国河南、四川、陕西、湖北、云南、甘肃等地，杜仲全身是宝，被誉为“植物黄金”，杜仲皮、杜仲叶均可入药，杜仲胶是杜仲中存在的一类高分子化合物，杜仲的树皮、叶及种皮中均含有丰富的杜仲胶，其叶含杜仲胶2％～4％、树皮含6％～10％、种子含10％～18％。杜仲胶作为一种天然高分子材料，是国际上公认的能够替代传统三叶橡胶的胶源，与天然橡胶同为异戊二烯的高聚物，是反式异戊二烯的高聚体，其独特的橡-塑二重性使其成为新材料开发领域中的研究热点。
传统的化学法提取杜仲胶，由于含胶细胞的细胞壁不易被有机试剂溶解，胶体不易溶出，且溶剂对细胞壁的分解作用是有限的，因此该法在杜仲胶的提取过程中存在杜仲胶产出率低、提取工艺复杂、对环境污染严重且生产成本高等问题，经调查研究发现，杜仲林土壤中的落叶经过一定时间，其纤维及维管结构会被降解而杜仲胶丝保留并暴露出来，说明土壤中可能存在可有效降解杜仲叶提取杜仲胶丝的微生物菌种资源，对采自杜仲林下的腐殖质土进行菌种的分离和纯化，测定各菌种对杜仲叶的降解率，通过降解率对菌种进行初筛。选出优势菌株进行发酵实验并测定发酵过程中的纤维素酶及果胶酶活力，进一步筛选出具有较好产酶能力和较高的纤维类物质去除力的菌株，这些菌株在筛选出来之后还要对其进行鉴定，但是一般的鉴定方法不够精准，不能满足人们的要求，因此提出一种样品菌株鉴定方法。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种样品菌株鉴定方法，解决了一般的针对菌株的鉴定不够精准，不能满足人们的要求的问题。
(二)技术方案
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种样品菌株鉴定方法，包括以下步骤：
S1：基因组DNA提取，首先取1.5mL的离心管，向其中加入200μL预处理液和三颗研磨珠，然后加入菌样品，放入研磨仪中研磨充分备用；
S2：混合，把研磨后的原料收集起来，然后放置混合罐中，向混合罐中加入20μLProteinase K溶液，混合均匀；
S3：加入裂解液，向混合罐中加入200μL裂解液，充分混合均匀；
S4：加入无水乙醇，向混合罐中加入200μL无水乙醇，充分混合均匀，然后进行离心处理；
S5：清洗，离心后的物料通过吸附柱，用洗涤液和漂洗液进行清洗；
S6：干燥，把吸附柱在室温中放置5-10min；
S7：分析，采用HPLC分析法进行分析，然后使用纸层析法检测样品中是否有目标菌株，如果检测时检测有目标菌株，则进行下一步，否则再次培养；
S8：扩增，把收集到的溶液放入培养基上进行扩增处理；
S9：纯化，采用组织分离法，对培养的菌株进行挑选纯化1-4次，纯化后放置在检测盒中备用；
S10：检测，对分离纯化后得到的菌株通过rDNA ITS序列进行鉴定、比对，比对通过的菌株通过测序仪进行检测。
作为本发明再进一步的方案，所述S2中混合时进行颠倒混匀，然后在37℃下放置30-60min。
进一步的，所述S3中混合时进行颠倒混匀，然后在70℃下放置10min。
在前述方案的基础上，所述S4中进行离心处理时离心机的转速为10000-15000r/min。
进一步的，所述S5中用洗涤液洗涤1-2次，漂洗液漂洗1-3次。
在前述方案的基础上，所述S8中培养基成分为葡萄糖15-25g，琼脂10-15g，水100-300ml，大豆胨1-8g。
(三)有益效果
与现有技术相比，本发明提供了一种样品菌株鉴定方法，具备以下有益效果：
1、本发明通过把吸附柱在室温中放置，能够彻底晾干吸附在材料中残留的漂洗液，防止漂洗液影响鉴定数据。
2、本发明中，采用组织分离法，对培养的菌株进行挑选纯化，从而方便后面的鉴定工作，提高鉴定的精准度。
3、本发明中，采用HPLC分析法进行分析，然后使用纸层析法检测样品中是否有目标菌株，如果检测时检测有目标菌株，则进行下一步，否则再次培养，提高精准性。
附图说明
图1为本发明提出的一种样品菌株鉴定方法的流程结构示意图
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
参照图1，一种样品菌株鉴定方法，包括以下步骤：
S1：基因组DNA提取，首先取1.5mL的离心管，向其中加入200μL预处理液和三颗研磨珠，然后加入菌样品，放入研磨仪中研磨充分备用；
S2：混合，把研磨后的原料收集起来，然后放置混合罐中，向混合罐中加入20μLProteinase K溶液，混合均匀；
S3：加入裂解液，向混合罐中加入200μL裂解液，充分混合均匀；
S4：加入无水乙醇，向混合罐中加入200μL无水乙醇，充分混合均匀，然后进行离心处理；
S5：清洗，离心后的物料通过吸附柱，用洗涤液和漂洗液进行清洗；
S6：干燥，把吸附柱在室温中放置6min；
S7：分析，采用HPLC分析法进行分析，然后使用纸层析法检测样品中是否有目标菌株，如果检测时检测有目标菌株，则进行下一步，否则再次培养；
S8：扩增，把收集到的溶液放入培养基上进行扩增处理；
S9：纯化，采用组织分离法，对培养的菌株进行挑选纯化2次，纯化后放置在检测盒中备用；
S10：检测，对分离纯化后得到的菌株通过rDNA ITS序列进行鉴定、比对，比对通过的菌株通过测序仪进行检测。
本发明的S2中混合时进行颠倒混匀，然后在37℃下放置40min，S3中混合时进行颠倒混匀，然后在70℃下放置10min，S4中进行离心处理时离心机的转速为10000r/min去除管盖内壁液滴，S5中用洗涤液洗涤1次，漂洗液漂洗2次。
尤其的，S8中培养基成分为葡萄糖20g，琼脂12g，水120ml，大豆胨5g。
实施例2
参照图1，一种样品菌株鉴定方法，包括以下步骤：
S1：基因组DNA提取，首先取1.5mL的离心管，向其中加入200μL预处理液和三颗研磨珠，然后加入菌样品，放入研磨仪中研磨充分备用；
S2：混合，把研磨后的原料收集起来，然后放置混合罐中，向混合罐中加入20μLProteinase K溶液，混合均匀；
S3：加入裂解液，向混合罐中加入200μL裂解液，充分混合均匀；
S4：加入无水乙醇，向混合罐中加入200μL无水乙醇，充分混合均匀，然后进行离心处理；
S5：清洗，离心后的物料通过吸附柱，用洗涤液和漂洗液进行清洗；
S6：干燥，把吸附柱在室温中放置8min；
S7：分析，采用HPLC分析法进行分析，然后使用纸层析法检测样品中是否有目标菌株，如果检测时检测有目标菌株，则进行下一步，否则再次培养；
S8：扩增，把收集到的溶液放入培养基上进行扩增处理；
S9：纯化，采用组织分离法，对培养的菌株进行挑选纯化3次，纯化后放置在检测盒中备用；
S10：检测，对分离纯化后得到的菌株通过rDNA ITS序列进行鉴定、比对，比对通过的菌株通过测序仪进行检测。
本发明的S2中混合时进行颠倒混匀，然后在37℃下放置40min，S3中混合时进行颠倒混匀，然后在70℃下放置10min，S4中进行离心处理时离心机的转速为10000r/min去除管盖内壁液滴，S5中用洗涤液洗涤2次，漂洗液漂洗3次。
尤其的，S8中培养基成分为葡萄糖22g，琼脂13g，水150ml，大豆胨6g。
在该文中的描述中，需要说明的是，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (6)
1.一种样品菌株鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：基因组DNA提取，首先取1.5mL的离心管，向其中加入200μL预处理液和三颗研磨珠，然后加入菌样品，放入研磨仪中研磨充分备用；
S2：混合，把研磨后的原料收集起来，然后放置混合罐中，向混合罐中加入20μLProteinase K溶液，混合均匀；
S3：加入裂解液，向混合罐中加入200μL裂解液，充分混合均匀；
S4：加入无水乙醇，向混合罐中加入200μL无水乙醇，充分混合均匀，然后进行离心处理；
S5：清洗，离心后的物料通过吸附柱，用洗涤液和漂洗液进行清洗；
S6：干燥，把吸附柱在室温中放置5-10min；
S7：分析，采用HPLC分析法进行分析，然后使用纸层析法检测样品中是否有目标菌株，如果检测时检测有目标菌株，则进行下一步，否则再次培养；
S8：扩增，把收集到的溶液放入培养基上进行扩增处理；
S9：纯化，采用组织分离法，对培养的菌株进行挑选纯化1-4次，纯化后放置在检测盒中备用；
S10：检测，对分离纯化后得到的菌株通过rDNA ITS序列进行鉴定、比对，比对通过的菌株通过测序仪进行检测。
2.根据权利要求1所述的一种样品菌株鉴定方法，其特征在于，所述S2中混合时进行颠倒混匀，然后在37℃下放置30-60min。
3.根据权利要求1所述的一种样品菌株鉴定方法，其特征在于，所述S3中混合时进行颠倒混匀，然后在70℃下放置10min。
4.根据权利要求3所述的一种样品菌株鉴定方法，其特征在于，所述S4中进行离心处理时离心机的转速为10000-15000r/min。
5.根据权利要求1所述的一种样品菌株鉴定方法，其特征在于，所述S5中用洗涤液洗涤1-2次，漂洗液漂洗1-3次。
6.根据权利要求1所述的一种样品菌株鉴定方法，其特征在于，所述S8中培养基成分为葡萄糖15-25g，琼脂10-15g，水100-300ml，大豆胨1-8g。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20220415 |