CN114891782A - 一种利用酚氯仿法纯化rna的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种利用酚氯仿法纯化RNA的方法，通过酚氯仿法优化实验步骤，通过变性作用抑制RNaseA和DNaseI活性，除去RNaseA和DNaseI后获得纯化的RNA双链。具体包括：利用Trizol试剂提取总RNA；添加DNaseI试剂去除基因组DNA；在反应体系中加入RNaseA去除单链RNA；利用酚氯仿法纯化dsRNA；对dsRNA进行反转录反应；设计特异性引物并进行PCR扩增；琼脂糖凝胶电泳。本发明通过酚氯仿法优化实验步骤，通过变性作用抑制RNaseA和DNaseI活性，避免反转录和RT‑PCR过程中RNA降解、cDNA/DNA产物降解的影响。

Description

一种利用酚氯仿法纯化RNA的方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种利用酚氯仿法纯化RNA的方法。

背景技术

目前，在生物体中，反义长链非编码RNA(Antisense long non-coding RNA，ASlncRNA)可以通过碱基互补配对与正义基因的mRNA结合形成互补双链，掩盖掉mRNA的分子作用位点，从而防止mRNA被小RNA或者其他核糖核酸酶降解，增加mRNA的稳定性。通过核糖核酸酶保护实验验证AS lncRNA与正义基因的mRNA是否形成双链核糖核酸(Double-stranded RNA，dsRNA)相互作用是广泛使用的一种方法。

但是，传统RPA未对实验中用到的RNaseA和DNase I进行处理，这会对后续的反转录和RT-PCR产生一定程度影响并导致实验误差。因此，亟需设计一种新的纯化RNA的方法。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：传统RPA未对实验中的RNaseA和DNase I进行处理，影响后续的反转录和RT-PCR，并导致实验误差。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种利用酚氯仿法纯化RNA的方法，尤其涉及一种核糖核酸酶保护实验的优化方法。

本发明是这样实现的，一种利用酚氯仿法纯化RNA的方法，所述利用酚氯仿法纯化RNA的方法包括：

通过酚氯仿法优化实验步骤，通过变性作用抑制RNaseA和DNase I活性，除去RNaseA和DNase I后获得纯化的RNA双链。

进一步，所述利用酚氯仿法纯化RNA的方法包括以下步骤：

步骤一，利用Trizol试剂提取总RNA；

步骤二，通过添加DNase I试剂去除基因组DNA；

步骤三，在反应体系中加入RNaseA去除单链RNA；

步骤四，利用酚氯仿法纯化dsRNA；

步骤五，对纯化的dsRNA进行反转录反应；

步骤六，设计特异性引物并进行PCR扩增；

步骤七，进行琼脂糖凝胶电泳。

进一步，所述步骤一中的提取总RNA包括：

利用Trizol试剂进行总RNA提取，对获得的RNA进行质量分析和浓度检测，选择质量合格的样品进行后续分析。

进一步，所述步骤二中的去除基因组DNA包括：

通过添加1μL DNase I试剂去除RNA样品中的基因组DNA，在37℃下反应30min。

所述步骤三中的去除单链RNA包括：

向步骤二的反应体系中加入2μL RNase A去除反应体系中的单链RNA，将反应体系在37℃下反应60min。

进一步，所述DNase I的浓度为3units/μL，所述RNase A的浓度为20μg/μL。

进一步，所述步骤四中的纯化dsRNA包括：

(1)对反应产物通过酚氯仿法进行RNA的纯化；加入200μL氯仿试剂，上下震荡15s，而后室温静置3min；

(2)12000g，4℃，离心15min，离心后溶液分为可见的二层，吸取上层无色水相到新的离心管；

(3)每管加入500μL异丙醇试剂，颠倒混匀后，室温静置10min；

(4)12000g，4℃，离心10min，离心后管底出现少量絮状沉淀，弃上清；

(5)加入1mL 75％乙醇溶液，轻轻颠倒混匀后，7500g，4℃，离心5min，离心后弃上清，并在冰上干燥5～10min；

(6)向RNA沉淀中加入30μL RNase Free水，用移液枪轻轻吹打混匀。

进一步，所述步骤五中的dsRNA反转录包括：

基于All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for PCR，对纯化的RNA产物进行反转录反应。

进一步，所述步骤六中的设计特异性引物并进行PCR扩增包括：

利用Primer 5.0软件针对AS lncRNA与正义基因的互补与非互补重叠区域分别设计特异性引物；通过High Fidelity PCR SuperMix分别对互补与非互补重叠的区域进行PCR扩增，按94℃预变性3min，重复35个循环，72℃5min终止延伸的反应条件进行。

进一步，所述PCR扩增条件为：94℃变性30sec，50～60℃退火30sec，72℃延伸1min。

进一步，所述步骤七中的琼脂糖凝胶电泳包括：

制作2％的琼脂糖凝胶，将PCR产物加到点胶孔，在120V电压环境下跑胶进行产物的检测，并在Bio-rad凝胶成像分析系统拍照记录。

结合上述的技术方案和解决的技术问题，请从以下几方面分析本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：

第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：

本发明通过酚氯仿法优化了实验步骤，除去RNaseA和DNase I后获得了纯化的RNA双链；酚氯仿法可以通过变性作用抑制RNaseA和DNase I活性，避免了反转录和RT-PCR过程中RNA降解、cDNA/DNA产物降解等影响。

第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：

使用本发明提供的优化后的实验方法，能够得到高质量的纯化RNA和良好的RT-PCR产物。本发明提供的利用酚氯仿法纯化RNA的方法对AS lncRNA作用机制的分析确定具有重要意义。

第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：

(1)本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：

该方法可获得高质量的纯化dsRNA并借助核糖核酸酶保护分析实验对AS lncRNA作用机制进行验证，这有助研究lncRNA在生物体不同生命进程中的重要作用，也能为某些临床疾病的治疗提供理论技术参考。

(2)本发明的技术方案填补了国内外业内技术空白：

该优化后的实验方法能够获取到高纯度的dsRNA，增加了核糖核酸酶保护实验的准确性，同时避免了由于RNaseA和DNase I的存在可能带来的实验误差，这是在国内外以前的研究中未见报道的。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的利用酚氯仿法纯化RNA的方法流程图。

图2是本发明实施例提供的高质量纯化的dsRNA示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种利用酚氯仿法纯化RNA的方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。

一、解释说明实施例。为了使本领域技术人员充分了解本发明如何具体实现，该部分是对权利要求技术方案进行展开说明的解释说明实施例。

本发明实施例提供的利用酚氯仿法纯化RNA的方法包括：

通过酚氯仿法优化实验步骤，通过变性作用抑制RNaseA和DNase I活性，除去RNaseA和DNase I后获得纯化的RNA双链。

如图1所示，本发明实施例提供的利用酚氯仿法纯化RNA的方法包括以下步骤：

S101，利用Trizol试剂提取总RNA；

S102，通过添加DNase I试剂去除基因组DNA；

S103，在反应体系中加入RNaseA去除单链RNA；

S104，利用酚氯仿法纯化dsRNA；

S105，对纯化的dsRNA进行反转录反应；

S106，设计特异性引物并进行PCR扩增；

S107，进行琼脂糖凝胶电泳。

本发明实施例提供的步骤S101中的提取总RNA包括：

利用Trizol试剂进行总RNA提取，对获得的RNA进行质量分析和浓度检测，选择质量合格的样品进行后续分析。

本发明实施例提供的步骤S102中的去除基因组DNA包括：

通过添加1μL浓度为3units/μL的DNase I试剂去除RNA样品中的基因组DNA，在37℃下反应30min。

本发明实施例提供的步骤S103中的去除单链RNA包括：

向S102的反应体系中加入2μL浓度为20μg/μL的RNase A去除反应体系中的单链RNA，将反应体系在37℃下反应60min。

本发明实施例提供的步骤S104中的纯化dsRNA包括：

(1)对反应产物通过酚氯仿法进行RNA的纯化；加入200μL氯仿试剂，上下震荡15s，而后室温静置3min；

(2)12000g，4℃，离心15min，离心后溶液分为可见的二层，吸取上层无色水相到新的离心管；

(3)每管加入500μL异丙醇试剂，颠倒混匀后，室温静置10min；

(4)12000g，4℃，离心10min，离心后管底出现少量絮状沉淀，弃上清；

(5)加入1mL 75％乙醇溶液，轻轻颠倒混匀后，7500g，4℃，离心5min，离心后弃上清，并在冰上干燥5～10min；

(6)向RNA沉淀中加入30μL RNase Free水，用移液枪轻轻吹打混匀。

本发明实施例提供的步骤S105中的dsRNA反转录包括：

基于All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for PCR，对纯化的RNA产物进行反转录反应。

本发明实施例提供的步骤S106中的设计特异性引物并进行PCR扩增包括：

利用Primer 5.0软件针对AS lncRNA与正义基因的互补与非互补重叠区域分别设计特异性引物；通过High Fidelity PCR SuperMix分别对互补与非互补重叠的区域进行PCR扩增，按94℃预变性3min，重复35个循环，72℃5min终止延伸的反应条件进行；其中，PCR扩增条件为：94℃变性30sec，50～60℃退火30sec，72℃延伸1min。

本发明实施例提供的步骤S107中的琼脂糖凝胶电泳包括：

制作2％的琼脂糖凝胶，将PCR产物加到点胶孔，在120V电压环境下跑胶进行产物的检测，并在Bio-rad凝胶成像分析系统拍照记录。

二、应用实施例。为了证明本发明的技术方案的创造性和技术价值，该部分是对权利要求技术方案进行具体产品上或相关技术上的应用实施例。

根据优化的实验方法得到高质量纯化的dsRNA后，针对lncRNA于mRNA的序列互补区域和非互补区域进行引物设计(图2的A)，并进行PCR反应，再将产物进行琼脂糖凝胶电泳并于Bio-rad凝胶成像分析系统拍照。可见，通过优化的实验方法，可以获得清晰、单一的条带，并成功验证了lncRNA以形成二链体的方式作用于靶基因(图2的B)。因此，该优化的实验方法有助于核糖核酸酶保护分析实验，对研究lncRNA的作用机制具有重要意义。

三、实施例相关效果的证据。本发明实施例在研发或者使用过程中取得了一些积极效果，和现有技术相比的确具备很大的优势，下面内容结合试验过程的数据、图表等进行描述。

1.实验原理

核糖核酸酶保护实验(Ribonuclease protection assay，RPA)是将标记的特异RNA探针(32P或生物素)与待测的RNA样品液相杂交，标记的特异RNA探针按碱基互补的原则与目的基因特异性结合，形成双链RNA；未结合的单链RNA经RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸，而待测目的基因与特异RNA探针结合后形成双链RNA，免受RNA酶的消化。

核糖核酸酶保护实验在AS lncRNA与正义基因mRNA形成dsRNA的研究与上述略有不同，主要体现在针对AS lncRNA与正义基因序列的互补和非互补重叠区域分别设计PCR引物，再利用DNase I去除总RNA中残留的基因组DNA、RNase A去除总RNA中所有的单链RNA，剩余的则是AS lncRNA与正义基因mRNA形成的dsRNA，再将dsRNA进行反转录并加入不同区域的引物进行RT-PCR反应，对产物进行琼脂糖凝胶电泳。若使用互补区域引物进行PCR的产物出现条带，而非互补区域的未见条带，则说明AS lncRNA与正义基因mRNA形成了dsRNA；若互补和非互补区域引物进行PCR的产物均未出现条带，则不存在dsRNA。核糖核酸酶保护实验对AS lncRNA作用机制的探究具有重要意义。

2.实验流程(见表1)

表1实验流程

3.实验具体步骤

(1)总RNA提取参考Trizol(Code#15596018，Invitrogen，USA)的试剂说明书进行，对获得的RNA进行质量分析和浓度检测，选择质量合格的样品进行后续分析；

(2)通过添加1μL DNase I(3units/μL)试剂来去除RNA样品中的基因组DNA，在37℃下反应30min；

(3)再向上步的反应体系中加入2μL RNase A(20μg/μL)来去除反应体系中的单链RNA，将反应体系在37℃下反应60min；

(4)对上步反应产物通过酚氯仿法进行RNA的纯化。加入200μL氯仿试剂，上下震荡15s，而后室温静置3min；

(5)12000g，4℃，离心15min，离心后溶液分为可见的二层，吸取上层无色水相到新的离心管；

(6)每管加入500μL异丙醇试剂，颠倒混匀后，室温静置10min；

(7)12000g，4℃，离心10min，离心后管底出现少量絮状沉淀，弃上清；

(8)加入1mL 75％乙醇溶液，轻轻颠倒混匀后，7500g，4℃，离心5min，离心后弃上清，并在冰上干燥5～10min；

(9)向RNA沉淀中加入30μL RNase Free水，用移液枪轻轻吹打混匀；

(10)对纯化的RNA产物进行反转录反应，参考All-in-One First-Strand cDNASynthesis SuperMix forPCR进行(Code#AT321-01，Transgene，China)；

(11)利用Primer 5.0软件针对AS lncRNA与正义基因的互补与非互补重叠区域分别设计特异性引物；通过High Fidelity(HiFi)PCR SuperMix(Code#AS131-01，Transgene，China)分别对互补与非互补重叠的区域进行PCR扩增，按94℃预变性3min，重复35个循环(94℃变性30sec，50～60℃退火30sec，72℃延伸1min)，72℃5min终止延伸的反应条件进行。

(12)制作2％的琼脂糖凝胶，将PCR产物加到点胶孔，在120V电压环境下跑胶进行产物的检测，并在Bio-rad凝胶成像分析系统拍照记录。

4.实验器材及试剂

(1)主要实验器材：PCR扩增仪、高速冷冻离心机、微量移液器、电子天平、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像分析系统。

(2)主要实验试剂：Trizol、DNase I、RNase A、氯仿、异丙醇、无水乙醇、RNaseFree水、反转录试剂盒、PCR试剂盒、琼脂糖、核酸染料。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种利用酚氯仿法纯化RNA的方法，其特征在于，所述利用酚氯仿法纯化RNA的方法包括：通过酚氯仿法优化实验步骤，通过变性作用抑制RNase A和DNase I活性，除去RNaseA和DNase I后获得纯化的RNA双链。

2.如权利要求1所述利用酚氯仿法纯化RNA的方法，其特征在于，所述利用酚氯仿法纯化RNA的方法包括以下步骤：

步骤一，利用Trizol试剂提取总RNA；

步骤二，通过添加DNase I试剂去除基因组DNA；

步骤三，在反应体系中加入RNaseA去除单链RNA；

步骤四，利用酚氯仿法纯化dsRNA；

步骤五，对纯化的dsRNA进行反转录反应；

步骤六，设计特异性引物并进行PCR扩增；

步骤七，进行琼脂糖凝胶电泳。

3.如权利要求2所述利用酚氯仿法纯化RNA的方法，其特征在于，所述步骤一中的提取总RNA包括：

利用Trizol试剂进行总RNA提取，对获得的RNA进行质量分析和浓度检测，选择质量合格的样品进行后续分析。

4.如权利要求2所述利用酚氯仿法纯化RNA的方法，其特征在于，所述所述步骤二中的去除基因组DNA包括：

通过添加1μL DNase I试剂去除RNA样品中的基因组DNA，在37℃下反应30min；

所述步骤三中的去除单链RNA包括：

向步骤二的反应体系中加入2μL RNase A去除反应体系中的单链RNA，将反应体系在37℃下反应60min。

5.如权利要求4所述利用酚氯仿法纯化RNA的方法，其特征在于，所述所述DNase I的浓度为3units/μL，所述RNase A的浓度为20μg/μL。

6.如权利要求2所述利用酚氯仿法纯化RNA的方法，其特征在于，所述所述步骤四中的纯化dsRNA包括：

(1)对反应产物通过酚氯仿法进行RNA的纯化；加入200μL氯仿试剂，上下震荡15s，而后室温静置3min；

(2)12000g，4℃，离心15min，离心后溶液分为可见的二层，吸取上层无色水相到新的离心管；

(3)每管加入500μL异丙醇试剂，颠倒混匀后，室温静置10min；

(4)12000g，4℃，离心10min，离心后管底出现少量絮状沉淀，弃上清；

(5)加入1mL 75％乙醇溶液，轻轻颠倒混匀后，7500g，4℃，离心5min，离心后弃上清，并在冰上干燥5～10min；

(6)向RNA沉淀中加入30μL RNase Free水，用移液枪轻轻吹打混匀。

7.如权利要求2所述利用酚氯仿法纯化RNA的方法，其特征在于，所述所述步骤五中的dsRNA反转录包括：

基于All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for PCR，对纯化的RNA产物进行反转录反应。

8.如权利要求2所述利用酚氯仿法纯化RNA的方法，其特征在于，所述所述步骤六中的设计特异性引物并进行PCR扩增包括：

利用Primer 5.0软件针对AS lncRNA与正义基因的互补与非互补重叠区域分别设计特异性引物；通过High Fidelity PCR SuperMix分别对互补与非互补重叠的区域进行PCR扩增，按94℃预变性3min，重复35个循环，72℃5min终止延伸的反应条件进行。

9.如权利要求8所述利用酚氯仿法纯化RNA的方法，其特征在于，所述所述PCR扩增条件为：94℃变性30sec，50～60℃退火30sec，72℃延伸1min。

10.如权利要求2所述利用酚氯仿法纯化RNA的方法，其特征在于，所述所述步骤七中的琼脂糖凝胶电泳包括：

制作2％的琼脂糖凝胶，将PCR产物加到点胶孔，在120V电压环境下跑胶进行产物的检测，并在Bio-rad凝胶成像分析系统拍照记录。

Images