JP2007202521A - 低分子量ｒｎａの分離精製方法 - Google Patents

低分子量ｒｎａの分離精製方法 Download PDF

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Abstract

【課題】ｍｉＲＮＡ分子などのＲＮＡ分子を簡便に作製する方法、および配列未知のｍｉＲＮＡ分子などのＲＮＡ分子を作製するための技術を提供することを課題とする。
【解決手段】汎用性の高いＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を用いることにより任意のｍａｔｕｒｅ ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）を作成する手法を新たに開発したことによって解決した。プロモーター領域をＲＴ−ＰＣＲの段階で導入することおよび余分な配列と相補的なプライマー（ＤＮＡ断片）をアニーリングさせ、ＲＮａｓｅ Ｈ処理およびＤＮａｓｅ処理することにより上記課題は解決された。
【選択図】なし

Description

本発明は、核酸化学の技術に関する。より詳細には、本発明は、所望の配列からなるＲＮＡの新規作製法および関連技術に関する。
近年、ゲノム上の非コード領域（ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）の解析より、塩基数が１９−２４程度の低分子量のＲＮＡ（すなわち、ｍｉｃｒｏＲＮＡと称され、本発明では、以下ｍｉＲＮＡとも呼ぶ）が急速に注目を集めている。ｍｉＲＮＡは、タンパク質に翻訳されない小型のＲＮＡ分子で、生命現象に深く関わっていることが示唆されている。しかし、現在のところ、ｍｉＲＮＡはその発現領域や発現量、さらに、ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｒｏｔｅｉｎ（本明細書において以下ＲＩＳＣタンパク質とも称する。）との作用などの解析において、主に既知にｍｉＲＮＡに関して検出（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）系の実験が行われているに過ぎず、直接的にｍｉＲＮＡの過剰発現を用いてｍｉＲＮＡに起因する可能性のある疾病の発見や診断、そして治療法の開発などもなかなか進んでいない。また、配列未知のｍｉＲＮＡの発現クローニング（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ）などによる機能スクリーニング（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）は不可能であり、「任意のｍｉＲＮＡ」を「ｍａｔｕｒｅな形で作成する手法が存在しない」ことが、ｍｉＲＮＡの生物学的機能の解明や医学的意義の理解を大きく妨げていた。
ここで、「ｍａｔｕｒｅ」（成熟型ともいう）な形のｍｉＲＮＡとは、「余分な配列を含むRNAからその余分な配列だけを酵素反応を用いて取り除き、目的の配列だけになったこと」をいう。
これまでのｍｉＲＮＡ分子を作成する手法は、まずクローニングを行い、配列を決定した後にＲＮＡ合成装置を使って機械的に合成することであったが、この手法では、合成のために莫大な時間と費用がかかり、併せて、配列未知のｍｉＲＮＡを作成することは原理的に不可能だった。
合成装置などとしては、Beckman社のoligo 1000などが挙げられる。現状では、合成装置を購入するか、もしくは１サンプル最低数万円（もちろん合成量によります）かけて企業に外注することを余儀なくされている。
最近では特別なRNAの配列を認識し、その配列部位を切断する酵素（リボザイム）が発見され、様々な配列で切断できるように改良されている。つまり本法でのpre-RNAの段階からこれらの酵素を使用することによって、目的の配列のみからなるRNAが作製可能である（非特許文献１）。しかしながら、これらはまさに発展途上の産物である。実際に酵素と認識配列が1：1ではないものも多いようであるし（一つの酵素で複数の認識配列を有する場合がある）、全ての配列に対応するだけの酵素は改良されていない。当然ながらこれらの酵素を使用する方法は未知の配列のRNAには利用出来ない。
生体内には存在するが未だに発見されていないＲＮＡ、もしくは発見されていても機能解析が十分になされていないＲＮＡ（本明細書において「未知配列」ともいう。）は、配列を決定してからでないと、合成することができない。
このような技術に関してみると、特許文献１〜３は、ｃＤＮＡの増幅に関する記載がされているが、ＲＮＡを増幅する方法は記載されていない。特に、これらの文献では、cDNAの合成に主眼が行われており、ＲＮＡについては何ら言及していない。
特許文献４〜７は、ＲＮＡの合成を目的とした技術を記載する。しかし、ｍａｔｕｒｅなＲＮＡを生産することは記載も示唆もされていない。
特許文献５では、oligodTとアニールしているpolyAの除去のためにRNaseHを使用しているが、ｍａｔｕｒｅなＲＮＡを生産することは記載も示唆もされていない。
あらゆる未知の配列のＲＮＡに対応しており、工業的、人工的に作製したいような生体内に存在しないＲＮＡ配列に対しても利用できるようなものはまだない。
特開2004-73118号公報 特開2003-70490号公報 特開2002-233379号公報 特開平7-59599号公報 特表2002-505087号公報 特開2005-224172号公報 国際公開02/004627パンフレット Lee Y, Ahn C, Han J, Choi H, Kim J, Yim J, Lee J, Provost P, Radmark O,Kim S, Kim VN. The nuclear RNase III Drosha initiates micro RNA processing.Nature. 2003 425(6956):415-9.
本発明が開示される前は、（１）既知の配列からなるｍａｔｕｒｅな形のｍｉＲＮＡを費用の嵩むＲＮＡ合成装置を使って機械的に合成するのではなく、未知の配列も含めた任意の配列からなるｍａｔｕｒｅな形のｍｉＲＮＡを汎用性のあるＲＮＡポリメラーゼ（例としてＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いる）を用いて安価に合成する必要があった。
加えて、本発明が開示される前は、（２）ＲＮＡポリメラーゼを用いて作成されたＲＮＡ（以下ｐｒｅ−ＲＮＡと呼ぶ）はｍｉＲＮＡのクローニングにおけるリンカー核酸部位と新たに導入したプロモーター領域の余分な配列が含まれるため、ｍａｔｕｒｅ ｍｉＲＮＡの形状にするために余分な配列を除去する必要があった。
従って、本発明は、ｍｉＲＮＡ分子などのＲＮＡ分子を簡便に作製する方法、および配列未知のｍｉＲＮＡ分子などのＲＮＡ分子を作製するための技術を提供することを課題とする。
上記課題は、汎用性の高いＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を用いることにより任意のｍａｔｕｒｅ ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）を作成する手法（本明細書において「後藤−浅島法」とも呼ぶ。）を新たに開発したことによって解決した。本法ではあらゆる未知の配列のＲＮＡに対応しており、工業的、人工的に作製したいような生体内に存在しないＲＮＡ配列に対しても利用できる。
本発明である「後藤−浅島法」では、汎用性の高いＲＮＡポリメラーゼを用いるにあたり、従来のクローニング法を改良し、プロモーター領域をＲＴ−ＰＣＲの段階で導入することで、上記課題（１）を解決した。また、上記課題（１）の手法だけではｍｉＲＮＡに付加されている余分なＲＮＡ配列を除けないために、余分な配列と相補的なプライマー（ＤＮＡ断片）をアニーリングさせ、ＲＮａｓｅ Ｈ処理およびＤＮａｓｅ処理することにより上記課題（２）を解決した。
（１）単離された成熟型ＲＮＡ。
（２）合成成熟型ＲＮＡ。
（３）低分子量成熟型ＲＮＡ。
（４）上記成熟型ＲＮＡは、目的の配列のみからなる、ＲＮＡ。
（５）所望の配列を有する成熟型ＲＮＡを生産する方法であって：
Ａ）上記所望の配列を有する鋳型核酸にリンカー核酸を結合させてリンカー核酸結合鋳型核酸を生産するライゲーション工程；
Ｂ）上記リンカー核酸結合鋳型核酸に基づいて核酸増幅鋳型を生産する核酸増幅鋳型生産工程；
Ｃ）上記核酸増幅鋳型に対して核酸増幅反応を行って増幅産物を生産する増幅工程；
Ｄ）上記増幅産物に対してＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡ産物を生産するＲＮＡ増幅工程；および
Ｅ）上記ＲＮＡ産物から所望でないＲＮＡ配列を除去し、それにより成熟型ＲＮＡを生産する調整工程；
を包含する、方法。
（６） 上記鋳型核酸は、ＲＮＡである、項目５に記載の方法。
（７） 上記リンカー核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを含む、項目５に記載の方法。
（８） 上記リンカー核酸は、制限酵素部位を含む、項目５に記載の方法。
（９） 上記リンカー核酸は、制限酵素部位を含まない、項目５に記載の方法。
（１０） 上記ライゲーション工程において、上記連結がリガーゼによって媒介される、項目５に記載の方法。
（１１） 上記ライゲーション工程において、上記連結がＤＮＡとＲＮＡとの連結を媒介する能力も有するリガーゼにより媒介される、項目５に記載の方法。
（１２） 上記リンカー核酸が二つ提供され、その一方の末端にリン酸が付加されていることを特徴とする、項目５に記載の方法。
（１３） 上記リンカー核酸が二つ提供され、その一方の末端がライゲーション妨害基で改変されていることを特徴とする、項目５に記載の方法。
（１４） 上記リンカー核酸が二つ提供され、そのうちの第１のリンカー核酸の一方の末端にリン酸が付加され、上記第１のリンカー核酸の他方の末端がライゲーションを妨害する基で改変されていることを特徴とする、項目５に記載の方法。
（１５） 上記ライゲーション妨害基が、ジデオキシヌクレオチドである、項目１３または１４に記載の方法。
（１６） 上記リンカーが二つ提供され、上記リンカー核酸が第１のリンカー核酸および第２のリンカー核酸の二つ提供され、そのうちの第１のリンカー核酸の一方の末端にリン酸が付加され、上記第１のリンカー核酸の他方の末端がライゲーションを妨害する基で改変されており、第２のリンカー核酸は少なくとも３’側がＲＮＡである、項目５に記載の方法。
（１７） 上記リンカーが二つ提供され、上記リンカー核酸が第１のリンカー核酸および第２のリンカー核酸の二つ提供され、そのうちの第１のリンカー核酸の一方の末端にリン酸が付加され、上記第１のリンカー核酸の他方の末端がライゲーションを妨害する基で改変されており、第２のリンカー核酸は５’側がＤＮＡであり３’側がＲＮＡである、項目５に記載の方法。
（１８） 上記Ａ）ライゲーション反応において、上記第２のリンカー核酸と上記鋳型核酸との連結をまず行って第１連結産物を得、次に上記第１のリンカー核酸と上記第１連結産物との連結を行うことを特徴とする、項目１７に記載の方法。
（１９）上記ライゲーション工程は、ｓｍａｒｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌまたはＮｅｌｓｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌにて行われる、項目５に記載の方法。
（２０） 上記鋳型核酸はＲＮＡである、項目５に記載の方法。
（２１） 上記鋳型核酸はＲＮＡであり、上記核酸増幅鋳型の生産は逆転写反応により達成され、上記核酸増幅鋳型はＤＮＡである、項目５に記載の方法。
（２２） 上記リンカー核酸結合鋳型核酸がＲＮＡとＤＮＡとのキメラ核酸である、項目５に記載の方法。
（２３） 上記リンカー核酸結合鋳型核酸がＲＮＡとＤＮＡとのキメラ核酸であり、上記核酸増幅鋳型の生産は逆転写反応により達成され、上記逆転写反応において用いられるプライマーが上記リンカー核酸結合鋳型核酸のリンカー核酸部分に相補的な配列を含む、項目５に記載の方法。
（２４） 上記核酸増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ｇａｐ ＬＣＲ、鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＳＤＡ）、Ｑβレプリカーゼ増幅、転写増幅システム（ＴＡＳ）、自己支持配列複製システム（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ；３ＳＲ）；核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）；転写媒介増幅（ＴＭＡ）、等温条件下キメラプライマー開始核酸増幅（ＩＣＡＮ；Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌｌｙ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ ｕｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）およびループ媒介性等温増幅（ＬＡＭＰ）からなる群より選択される、項目５に記載の方法。
（２５） 上記核酸増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である、項目５に記載の方法。
（２６） 上記核酸増幅反応において、プロモーター配列を含むプライマーが用いられる、項目５に記載の方法。
（２７） 上記核酸増幅反応において使用される５’側のプライマーにプロモーター配列が含まれる、項目５に記載の方法。
（２８） 上記核酸増幅反応において使用されるプライマーが、制限酵素部位の配列を含む、項目５に記載の方法。
（２９） 上記核酸増幅反応において使用されるプライマーが、マルチクローニングサイトを含む、項目５に記載の方法。
（３０） 上記核酸増幅反応において使用されるプライマーが、制限酵素部位の配列を含み、５’側のプライマーにプロモーター配列が含まれる、項目５に記載の方法。
（３１） 上記核酸増幅反応において使用されるプライマーが、リンカー核酸の配列またはその相補配列あるいはその一部を含む、項目５に記載の方法。
（３２） 上記核酸増幅反応において使用されるプライマーが、リンカー核酸の配列またはその相補配列あるいはその一部を含み、上記プライマーが、制限酵素部位の配列を含み、５’側のプライマーにプロモーター配列が含まれる、項目５に記載の方法。
（３３） Ｃ）増幅工程の後に、上記増幅産物を、ベクターにクローニングする工程をさらに包含する、項目５に記載の方法。
（３４） 上記ベクターは、上記プロモーター配列を含まないことを特徴とする、項目３１に記載の方法。
（３５） 上記増幅産物がＤＮＡであり、上記ＲＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡ依存性である、項目５に記載の方法。
（３６） 上記ＲＮＡポリメラーゼは、上記プロモーター配列を認識するものである、項目５に記載の方法。
（３７） 上記核酸増幅反応において、使用されるプライマーが、リンカー核酸の配列またはその相補配列あるいはその一部を含み、上記プライマーが、制限酵素部位の配列を含み、５’側のプライマーにプロモーター配列が含まれ
上記Ｃ）増幅工程の後に、上記増幅産物を、ベクターにクローニングする工程をさらに包含し、上記ベクターは、上記プロモーター配列を含まず、上記ＲＮＡポリメラーゼが上記プロモーター配列を認識し、かつ、３’側のプライマーの上記制限酵素部位を切断する制限酵素で消化して上記ＲＮＡポリメラーゼの鋳型として上記ＲＮＡポリメラーゼによる増幅を行うことを特徴とする、項目５に記載の方法。
（３８） ＲＮＡ増幅工程の後にＤＮＡを除去する工程をさらに包含する、項目５に記載の方法。
（３９） 上記ＤＮＡの除去は、ＤＮａｓｅにより達成される、項目３８に記載の方法。
（４０） 上記ＲＮＡ増幅工程において、存在するＲＮＡ分子の量の少なくとも２倍量のプライマーが使用される、項目５に記載の方法。
（４１） 上記ＲＮＡポリメラーゼは、オーバーハングを生じさせないＲＮＡポリメラーゼである、項目５に記載の方法。
（４２） 上記所望でないＲＮＡ配列の除去は、上記リンカー核酸結合鋳型核酸の配列のうち、上記所望の配列以外の配列と相補的な除去用プライマーを上記ＲＮＡ産物とハイブリダイズさせてハイブリダイズ産物を生成し、上記ハイブリダイズ産物に対してＤＮＡと結合している一本鎖ＲＮＡのみを選択的に分解する手段を用いて分解させて、所望の配列のみを含むＲＮＡを生産することを包含する、項目５に記載の方法。
（４３） 上記除去用プライマーは、上記所望の配列からなるＲＮＡに直接連結されている配列に対して相補的な配列を少なくとも１つ含み、上記相補的な配列は、上記ＲＮＡ産物とのハイブリダイズ形成に充分な長さを含む、項目４２に記載の方法。
（４４） 上記所望でないＲＮＡ配列の除去は、ＤＮＡと結合している一本鎖ＲＮＡのみを選択的に分解することを特徴とする、項目５に記載の方法。
（４５） 上記所望でないＲＮＡ配列の除去は、ＲＮａｓｅ Ｈにより達成される、項目５に記載の方法。
（４６） ＲＮＡを実質的に分解しないＤＮＡ分解手段によりＤＮＡを分解する工程をさらに包含する、項目５に記載の方法。
（４７） さらに、上記ＲＮＡポリメラーゼによって生じたオーバーハングを除去する工程を包含する、項目５に記載の方法。
（４８） 上記ＲＮＡポリメラーゼによって生じたオーバーハングを除去する上記工程は、電気泳動を包含する、項目４７に記載の方法。
（４９） 上記成熟型ＲＮＡは、低分子量ＲＮＡである、項目５に記載の方法。
（５０） 上記成熟型ＲＮＡは、ｍｉＲＮＡである、項目５に記載の方法。
（５１）所望の配列を有する成熟型ＲＮＡを生産するためのキットであって：
Ａ１）上記所望の配列を有する鋳型核酸に連結させるためのリンカー核酸；
Ａ２）上記リンカー核酸を上記鋳型核酸に結合させる結合手段；
Ｂ）上記鋳型核酸と上記リンカー核酸とが連結したリンカー核酸結合鋳型核酸から核酸増幅鋳型を生産する核酸増幅鋳型生産手段；
Ｃ）上記転写反応によって生じる核酸増幅鋳型に対して核酸増幅反応を生じさせる核酸増幅手段；
Ｄ）上記核酸増幅反応によって増幅された産物を鋳型としてＲＮＡを生産する手段；および
Ｅ）所望でないＲＮＡ配列を除去するＲＮＡ配列除去手段、
を備える、キット。
（５２） 上記リンカー核酸は、制限酵素部位を含むことを特徴とする、項目５１に記載のキット。
（５３） 上記リンカー核酸は、制限酵素部位を含まないことを特徴とする、項目５１に記載のキット。
（５４） 上記リンカー核酸が二つ提供され、その一方の末端にリン酸が付加されていることを特徴とする、項目５１に記載のキット。
（５５） 上記リンカー核酸が二つ提供され、その一方の末端がライゲーション妨害基で改変されていることを特徴とする、項目５１に記載のキット。
（５６） 上記リンカー核酸が二つ提供され、その一方の末端にリン酸が付加され、他方の末端がライゲーションを妨害する基で改変されていることを特徴とする、項目５１に記載のキット。
（５７） 記ライゲーション妨害基が、ジデオキシヌクレオチドである、項目５５または５６に記載のキット。
（５８） 上記リンカー核酸が二つ提供され、そのうちの第１のリンカー核酸の一方の末端にリン酸が付加され、上記第１のリンカー核酸の他方の末端がライゲーションを妨害する基で改変されていることを特徴とする、項目５１に記載のキット。
（５９） 上記リンカーが二つ提供され、上記リンカー核酸が第１のリンカー核酸および第２のリンカー核酸の二つ提供され、そのうちの第１のリンカー核酸の一方の末端にリン酸が付加され、上記第１のリンカー核酸の他方の末端がライゲーションを妨害する基で改変されており、第２のリンカー核酸は少なくとも３’側がＲＮＡである、項目５１に記載のキット。
（６０） 上記リンカーが二つ提供され、上記リンカー核酸が第１のリンカー核酸および第２のリンカー核酸の二つ提供され、そのうちの第１のリンカー核酸の一方の末端にリン酸が付加され、上記第１のリンカー核酸の他方の末端がライゲーションを妨害する基で改変されており、第２のリンカー核酸は５’側がＤＮＡであり３’側がＲＮＡである、項目５１に記載のキット。
（６１） 上記結合手段は、ＲＮＡリガーゼである、項目５１に記載のキット。
（６２） 上記結合手段は、ＤＮＡとＲＮＡとの連結を媒介する能力も有するリガーゼである、項目５１に記載のキット。
（６３） 上記結合手段は、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼである、項目５１に記載のキット。
（６４） 上記鋳型核酸はＲＮＡであり、上記核酸増幅鋳型生産手段は、逆転写酵素とプライマーを含む、項目５１に記載のキット。
（６５） 上記プライマーセットは、上記リンカー核酸結合鋳型核酸のリンカー核酸部分に相補的な配列を含むことを特徴とする、項目５１に記載のキット。
（６６） 上記核酸増幅手段は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ｇａｐ ＬＣＲ、鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＳＤＡ）、Ｑβレプリカーゼ増幅、転写増幅システム（ＴＡＳ）、自己支持配列複製システム（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ；３ＳＲ）；核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）；転写媒介増幅（ＴＭＡ）、等温条件下キメラプライマー開始核酸増幅（ＩＣＡＮ；Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌｌｙ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ ｕｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）およびループ媒介性等温増幅（ＬＡＭＰ）からなる群より選択される増幅反応のための手段を含む、項目５１に記載のキット。
（６７） 上記核酸増幅手段は、ＤＮＡポリメラーゼとプライマーセットとを含む、項目５１に記載のキット。
（６８）上記プライマーセットは、上記リンカー核酸連結鋳型核酸の一部と同一の配列および相補的な配列をそれぞれ含む、項目５１に記載のキット。
（６９）上記プライマーセットのうち少なくとも１つがプロモーター配列を含む、項目５１に記載のキット。
（７０）上記プライマーセットの両方が制限部位を含む、項目５１に記載のキット。
（７１）上記プライマーセットがマルチクローニングサイトを含む、項目５１に記載のキット。
（７２）上記プライマーセットのうち少なくとも１つがプロモーター配列を含み、上記プライマーセットの両方が制限部位を含む、項目５１に記載のキット。
（７３） Ｃ−２）上記増幅産物をクローニングするためのベクター、さらに含む、項目５１に記載のキット。
（７４） Ｃ−３）上記増幅産物に含まれる制限部位を認識し切断する制限酵素を含む、項目５１に記載のキット。
（７５）上記核酸増幅反応によって増幅された産物を鋳型としてＲＮＡを生産する手段は、ＲＮＡポリメラーゼである、項目５１に記載のキット。
（７６） 上記ＲＮＡポリメラーゼは、上記プライマーセットに含まれる上記プロモーター配列を認識するＲＮＡポリメラーゼである、項目５１に記載のキット。
（７７） 上記プロモーター配列がＴ７プロモーター、Ｓ６プロモーターまたはＴ３プロモーターであり、上記ＲＮＡポリメラーゼが上記プロモーターに対応してＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｓ６ ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ３ ＲＮＡポリメラーゼである、項目５１に記載のキット。
（７８） Ｄ−１）ＲＮａｓｅ活性のないＤＮａｓｅをさらに備える、項目５１に記載のキット。
（７９） 上記ＲＮａｓｅ活性のないＤＮａｓｅは、上記鋳型となった増幅産物であるＤＮＡを除去するために用いられる、項目５１に記載のキット。
（８０） Ｄ−２）生産されたＲＮＡを精製するための精製手段をさらに備える、項目５１に記載のキット。
（８１） 上記精製手段は、フェノール／クロロホルム抽出手段およびエタノール沈澱手段である、項目８０に記載のキット。
（８２） 上記除去手段は、ＲＮａｓｅである、項目５１に記載のキット。
（８３） 上記除去手段は、ＤＮＡと結合している一本鎖ＲＮＡのみを選択的に分解するＲＮａｓｅである、項目５１に記載のキット。
（８４） 上記除去手段は、ＲＮａｓｅ Ｈである、項目５１に記載のキット。
（８５） 上記リンカー核酸結合鋳型核酸の配列のうち、上記所望の配列以外の配列と相補的な除去用プライマーをさらに包含する、項目５１に記載のキット。
（８６） 上記除去用プライマーは、上記所望の配列からなるＲＮＡに直接連結されている配列に対して相補的な配列を少なくとも１つ含む、項目８５に記載のキット。
（８７） 上記除去用プライマーは、上記所望の配列からなるＲＮＡに直接連結されている配列に対して相補的な配列を少なくとも１つ含み、上記相補的な配列は、上記ＲＮＡ産物とのハイブリダイズ形成に充分な長さを含む、項目８５に記載のキット。
（８８） さらに、上記ＲＮＡポリメラーゼによって生じたオーバーハングを除去する手段を備える、項目５１に記載のキット。
（８９）機能を有するＲＮＡをスクリーニングするための方法であって、
Ａ）対象ＲＮＡを提供する工程；
Ｂ）Ｂ−１）上記所望の配列を有する鋳型核酸にリンカー核酸を結合させてリンカー核酸結合鋳型核酸を生産するライゲーション工程；
Ｂ−２）上記リンカー核酸結合鋳型核酸に基づいて核酸増幅鋳型を生産する核酸増幅鋳型生産工程；
Ｂ−３）上記核酸増幅鋳型に対して核酸増幅反応を行って増幅産物を生産する増幅工程；
Ｂ−４）上記増幅産物をベクターに配置し、上記ベクターで宿主を形質転換する工程；
Ｂ−５）上記宿主を増幅させる増幅された宿主からベクターを入手する工程；
Ｂ−６）上記ベクターを鋳型として用いてＲＮＡポリメラーゼを使用してＲＮＡ産物を生産するＲＮＡ増幅工程；および
Ｂ−７）上記ＲＮＡ産物から所望でないＲＮＡ配列を除去し、それにより成熟型ＲＮＡを生産する調整工程、
を行って、対象ＲＮＡを増幅生産する工程、
Ｃ）上記対象ＲＮＡを試験細胞に感染させる工程；
Ｄ）上記試験細胞が所望の機能を発現した場合、上記発現が見出される試験細胞に含まれる対象ＲＮＡに対応する宿主をさらに培養して増幅させる工程；
Ｅ）必要に応じて、Ｂ−５〜Ｂ−７、ＣおよびＤを繰り返し、単一コロニーを探索する工程、
Ｆ）上記単一コロニーに含まれるＲＮＡの配列を決定する工程；
ここで、上記決定された配列と上記機能と関連付けて、機能を有するRNAが同定される、方法。
（９０） Ｇ）上記ＲＮＡの発現パターン解析を行う工程、をさらに包含する、項目８９に記載の方法。
（９１）項目１〜４に記載のRNAまたは項目５〜８８に記載の方法によって生産されたRNAの、上記RNAの機能を利用する分析または診断のための使用。
（９２）所望の配列を含むＲＮＡから所望でないＲＮＡ配列を除去し、それにより成熟型ＲＮＡを生産する方法であって、
ａ）所望の配列を含むＲＮＡ以外の配列に相補的な少なくとも１つのＤＮＡプライマーと上記所望の配列を含むＲＮＡとをハイブリダイズさせる工程；および
ｂ）ＤＮＡ−ＲＮＡの結合のみを認識して分解する工程、
を包含する、方法。
（９３）上記ＤＮＡプライマーは、５’末端に少なくとも１つおよび３’末端に少なくとも１つ含む、項目９２に記載の方法。
（９４）所望の配列を含むＲＮＡから所望でないＲＮＡ配列を除去し、それにより成熟型ＲＮＡを生産するためのキットであって、
ａ）所望の配列を含むＲＮＡ以外の配列に相補的な少なくとも１つのＤＮＡプライマー；および
ｂ）ＤＮＡ−ＲＮＡの結合のみを認識して分解する手段、
を備える、キット。
（９５）上記ＤＮＡプライマーは、５’末端に少なくとも１つおよび３’末端に少なくとも１つ含む、項目９４に記載のキット。
本「後藤−浅島法」により、これまで実現されていなかったｍａｔｕｒｅな低分子量ｍｉＲＮＡを効率よく作成することができる。その結果、生物学的ならびに医学的現象が現れた特定のＲＮＡソースから、任意のｍａｔｕｒｅな低分子量ｍｉＲＮＡなどの任意のＲＮＡを、効率よく迅速に作成することができる。具体的には、
１．ｍｉＲＮＡの生命現象との関わりにおける機能の理解が可能になる。
２．ｍｉＲＮＡの機能不全や過剰機能発現に起因する疾病の発見や診断、そして、治療法の開発が可能になる。
また、本発明の「後藤−浅島法」は、ｍｉＲＮＡだけでなく、ｔＲＮＡ等の他のＲＮＡの作成にも適用でき、
３．広く一般に低分子量ＲＮＡの生命現象との関わりにおける機能の理解が可能になる。
４．広く一般に低分子量ＲＮＡの機能不全や過剰機能発現に起因する疾病の発見や診断、そして、治療法の開発が可能になる。
さらに、本「後藤−浅島法」は、低分子量ＲＮＡ以外のＲＮＡに対しても、５’、３’両末端部分に余剰配列を残さないので、機能解析の時に細胞内での最終的な形状（ｍａｔｕｒｅな形）が必要なＲＮＡの作成の全てに適用でき、そのように作成された
５．ｍａｔｕｒｅな形のＲＮＡの生命現象との関わりにおける機能の理解が可能になる。
６．ｍａｔｕｒｅな形のＲＮＡの機能不全や過剰機能発現に起因する疾病の発見や診断、そして、治療法の開発が可能になる。
以下に本発明を、必要に応じて、添付の図面を参照して例示の実施例により記載する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
（用語）
本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸分子」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、増幅反応を阻害しない限り「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」を含む。
本明細書において、「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８（１９９４））。タンパク質などをコードする遺伝子は、通常、このポリヌクレオチド形態をとる。
本明細書で用いる「ヌクレオチド」という用語は、糖部分（五炭糖）、リン酸基および含窒素複素環式塩基からなるＤＮＡまたはＲＮＡの単量体単位を指す。塩基は配糖体炭 素（五炭糖の１’炭素）を介して糖部分と結合しており、この塩基と糖の組み合わせがヌクレオシドである。ヌクレオシドが五炭糖の３’位または５’位に結合したリン酸基を含む場合、これはヌクレオチドと呼ばれる。機能的に結合したヌクレオチドの配列を、本明細書では一般に「ヌクレオチド配列」およびそれらの文法的等価物として言及され、これは左から右の方向が５’末端から３’末端への通常の向きであるような定則によって表される。
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「ヌクレオチド誘導体」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのようなヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのようなヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。本発明の方法では、工程に応じてこれらの誘導体またはアナログを用いることができるが、最終産物は通常ＲＮＡである。
伸長反応に使用される場合、ヌクレオチドは、三リン酸の形態を採ることができる。ヌクレオシド三リン酸としては、ＲＮＡ構成成分であるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、イノシン三リン酸（ＩＴＰ）などが挙げられるがそれらに限定されない。特に言及しない場合、本発明において、「ヌクレオチド」と「ヌクレオチド三リン酸」とは互換可能に使用されることが理解される。
本明細書において「ｍａｔｕｒｅ」なＲＮＡとは、「余分な配列を含むＲＮＡからその余分な配列だけを酵素反応を用いて取り除き、目的の配列だけになったこと」をいう。例えば、ｍｉＲＮＡが対象となるのであれば、対象となるｍｉＲＮＡのみの配列を有することをいう。
本明細書においてヌクレオチドは、「標識」され得る。そのような標識としては、例えば、蛍光、放射能、燐光、ビオチン、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、酵素および化学発光を利用した任意の標識を挙げることができるがそれらに限定されない。
本明細書において「標識」とは、目的となる分子または物質を他から識別するための存在（たとえば、物質、エネルギー、電磁波など）をいう。そのような標識方法としては、ＲＩ（ラジオアイソトープ）法、蛍光法、ビオチン法、化学発光法等を挙げることができる。このような標識を有するＲＮＡなどのヌクレオチドもまた、本明細書において等価であると解され得る。
本明細書において「断片」または「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または加減としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。
ヌクレオチドは、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。アミノ酸もまた、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。
その文字コードは以下のとおりである。
アミノ酸
３文字記号 １文字記号 意味
Ａｌａ Ａ アラニン
Ｃｙｓ Ｃ システイン
Ａｓｐ Ｄ アスパラギン酸
Ｇｌｕ Ｅ グルタミン酸
Ｐｈｅ Ｆ フェニルアラニン
Ｇｌｙ Ｇ グリシン
Ｈｉｓ Ｈ ヒスチジン
Ｉｌｅ Ｉ イソロイシン
Ｌｙｓ Ｋ リジン
Ｌｅｕ Ｌ ロイシン
Ｍｅｔ Ｍ メチオニン
Ａｓｎ Ｎ アスパラギン
Ｐｒｏ Ｐ プロリン
Ｇｌｎ Ｑ グルタミン
Ａｒｇ Ｒ アルギニン
Ｓｅｒ Ｓ セリン
Ｔｈｒ Ｔ トレオニン
Ｖａｌ Ｖ バリン
Ｔｒｐ Ｗ トリプトファン
Ｔｙｒ Ｙ チロシン
Ａｓｘ アスパラギンまたはアスパラギン酸
Ｇｌｘ グルタミンまたはグルタミン酸
Ｘａａ 不明または他のアミノ酸。
塩基
記号 意味
ａ アデニン
ｇ グアニン
ｃ シトシン
ｔ チミン
ｕ ウラシル
ｒ グアニンまたはアデニンプリン
ｙ チミン／ウラシルまたはシトシンピリミジン
ｍ アデニンまたはシトシンアミノ基
ｋ グアニンまたはチミン／ウラシルケト基
ｓ グアニンまたはシトシン
ｗ アデニンまたはチミン／ウラシル
ｂ グアニンまたはシトシンまたはチミン／ウラシル
ｄ アデニンまたはグアニンまたはチミン／ウラシル
ｈ アデニンまたはシトシンまたはチミン／ウラシル
ｖ アデニンまたはグアニンまたはシトシン
ｎ アデニンまたはグアニンまたはシトシンまたはチミン／ウラシル、不明、または他の塩基。
本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いて算出される。同一性の検索は例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ ２．２．９（２００４．５．１２ 発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記ＢＬＡＳＴを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメーターの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。
本明細書において「増幅産物」または「ＰＣＲ産物」とは、核酸増幅反応によって得られる産物をいい、通常、核酸分子である。ある核酸分子を増幅して得られる増幅産物は、その核酸分子と実質的に同一の配列を含む。増幅産物は、二本鎖であることが多く、本明細書において、二本鎖の形態の場合特に二本鎖増幅産物ともいう。また、２以上の核酸分子が連結された増幅産物をいう場合、「連結核酸増幅産物」ともいう。
本明細書において「鋳型核酸」とは、反応のもと（鋳型）となるべく、所望の配列を有する核酸をいう。核酸がＲＮＡの場合、「鋳型核酸」は、「鋳型ＲＮＡ」と呼ばれ得る。
本明細書において「リンカー核酸」とは、本発明において、第１の核酸（例えば、鋳型核酸）と第二の核酸（例えば、プロモーター配列の核酸）とを連結させる目的で使用される核酸をいう。好ましい実施形態では、リンカー核酸は、特定の制限酵素(エンドヌクレアーゼ)の認識する部位（制限酵素部位）を含む。リンカー核酸は、制限酵素部位を含んでいても良く、含んでいなくても良い。
本明細書において「リンカー核酸結合鋳型核酸」とは、リンカー核酸が結合した鋳型核酸をいう。リンカー核酸結合鋳型核酸は、鋳型核酸にリンカー核酸を連結させることによって生産することができる。あるいは、そのような配列を有する核酸を最初から合成することによってもこのようなリンカー核酸結合鋳型核酸が提供される。１つの実施形態では、鋳型核酸は、代表的にはＲＮＡであり、リンカー核酸は代表的にはＤＮＡであるが、そのような場合においては、リンカー核酸連結鋳型核酸は、ＤＮＡ−ＲＮＡのキメラ核酸であり得る。
本明細書において「ライゲーション」または「連結」とは、複数の核酸分子を相互に結合させる行為または現象をいう。ライゲーションは、通常「リガーゼ」という酵素を媒介にして実現される。
本明細書において「リガーゼ」とは、核酸の生合成の場合のポリヌクレオチド接続酵素をいい、通常、ヌクレオシド三リン酸の関与を必要とし，ヌクレオシド三リン酸は二リン酸または一リン酸となる。核酸がＲＮＡの場合、ＲＮＡリガーゼと呼び、核酸がＤＮＡの場合、ＤＮＡリガーゼと呼ぶ。ＲＮＡとＤＮＡとをライゲーションさせるときは、ＲＮＡとＤＮＡとの両方に反応するリガーゼを用いることが好ましいがこれに限定されない。ＲＮＡとＤＮＡとの両方に反応するリガーゼの例としては、例えば、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ、ＴｈｅｒｍｏＰｈａｇｅ Ｓｉｎｇｌｅ − Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（フナコシ）などを挙げることができるがそれらに限定されない。
本明細書において例示されるＴ４ ＲＮＡリガーゼは、ＡＴＰに依存して一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡの分子間および分子内の連結を行い、１本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡの５’末端のリン酸基と３’末端の水酸基を結合する（Ｓｉｌｂｅｒ，Ｒ．，Ｍａｌａｔｈｉ，Ｂ．Ｇ．ａｎｄ Ｈｕｒｗｉｔｚ，Ｊ．（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９，３００９）。同様に、一本鎖ＲＮＡに［５’−３２Ｐ］ヌクレオシド３’，５’−ビス（ホスフェート）を付加する反応も媒介することが知られている。
他の形態としては、例えば、リンカー核酸の連結末端（例えば、５’末端）にリン酸（例えば、アデニル化（ｒＡｐｐ））を付加することによって結合を所望する部位のみの反応を促進させることが考えられる。リンカー核酸の連結末端にこのようにリン酸を付加することによってＡＴＰ非存在下での反応を行うことができ、鋳型ＲＮＡ同士の結合を防ぐことができる。
加えて、リンカー核酸の連結を所望しない末端（例えば、３’末端）を連結を起こしにくい基（例えば、ジデオキシ基（例えば、ｄｄＣなど）；本明細書において「ライゲーション妨害基」という。）で改変させることによって、リンカー核酸同士の結合を防ぐことができる。そのようなライゲーション妨害基としては、例えば、ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＴ，ｄｄＡ、ｄｄＣ、ｄｄＧなど）等を挙げることができる。
ＲＮＡリガーゼは、ＡＴＰを利用して一本鎖核酸配列の５’末端をアデニル化する。次に、このように活性化されたアデニル化核酸（例えば、オリゴマー）を第二の配列の３’末端の−ＯＨに連結する。ピロホスフェート結合を有するアデニル化核酸（例えば、アデニル化オリゴヌクレオチド）は、ＡＴＰの非存在下で本発明において代表的に利用されるＴ４ ＲＮＡリガーゼの基質となる（Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｔ．Ｅ．，Ｇｕｍｐｏｒｔ，Ｒ．Ｉ．，ａｎｄ Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，Ｏ．Ｃ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，７４：４８３９−４２（１９７７））。Ｕｎｒａｕ，Ｐ．Ｊ．らの方法（Ｕｎｒａｕ，Ｐ．Ｊ．，ａｎｄ Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．Ｐ．Ｎａｔｕｒｅ，３９５：２６０−６３ （１９９８））を用いることによって、アデニル化核酸を大量に合成することができる。このような方法は、ｍｉＲＮＡの構築に用いられてきた（Ｌａｕ，Ｎ．Ｃ．，Ｌｉｍ，Ｌ．Ｐ．，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｅ．Ｇ．，ａｎｄ Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．Ｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４：８５８−６２ （２００１））。このような特殊なリンカー核酸としては、例えば、ＩＤＴ社が販売するｍｉＲＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｌｉｎｋｅｒを挙げることができるがそれに限定されない。このようなリンカー核酸は、予め製造され凍結乾燥状態で提供されることが通常であるが、その場で合成してもよい。凍結乾燥状態で提供される場合は、１００μＭなどの濃度で水または適切な緩衝液（例えば、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．０，０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁して使用し得る。
本明細書において「アニーリング」とは、二本鎖の核酸を変性して一本鎖にしたものを再び二本鎖にもどすことをいう。従って、核酸増幅反応では、アニーリングとハイブリダイズとは、同様の意味で用いることができる。例えば、ＤＮＡを加熱またはアルカリ処理などにより一本鎖に解離させた後、徐冷または中和すると再び二本鎖の状態にもどる。この現象をアニーリングといい、この性質を用いて核酸鎖間の塩基配列の相補性を調べることができる。ここでアニーリングする場合は、本発明の増幅方法において使用可能な程度の相補性を有すると判定することができる。
本明細書において、「特異的」とは、核酸配列について用いられる場合、ある核酸配列が、一般的な核酸配列よりも高いレベルで基準となる標準核酸配列と相互作用（例えば、ハイブリダイゼーション）することをいう。特異的な配列は、１つまたは複数存在し得る。また、ある特異的な配列存在するとき、それよりも特異性が高い配列が存在していてもよい。好ましくは特異的な配列は、ある部位においてのみ特異的に相互作用することをいう。
本明細書において、「ハイブリダイズする」とは、一定の条件下で、ある核酸分子と別の核酸分子とが特異的に相互作用してハイブリッドを形成することをいう。具体的には、核酸増幅反応において、目的となる核酸またはその等価物と、増幅手段に該当する核酸等価物とがハイブリッドを形成し、その後の増幅反応に続く工程をいう。本明細書において特に言及する場合は、ハイブリダイズは、「アニーリング」ともいう。増幅反応におけるハイブリダイズについては、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ ａｎｎｕａｌ ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ等を参照のこと。
本明細書において「ハイブリダイズ可能」な核酸またはポリヌクレオチドとは、上記ハイブリダイズ条件下で別の核酸またはポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる核酸またはポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能な核酸として具体的には、配列表で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有する核酸、好ましくは８０％以上の相同性を有する核酸、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する核酸を挙げることができる。核酸配列の相同性は、たとえばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０（１９９０））が開発したアルゴリズムを使用した検索プログラムＢＬＡＳＴを用いることにより、ｓｃｏｒｅで類似度が示される。
本明細書において「高度にストリンジェントな条件」は、核酸配列において高度の相補性を有するＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、そしてミスマッチを有意に有するＤＮＡのハイブリダイゼーションを除外するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、および他の添加剤の条件によって決定される。このようなハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、６５〜６８℃などである。このような高度にストリンジェントな条件については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ，Ｙ．１９８９）、同第３版（２００１）；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ハイブリダイゼーション：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＶ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）．Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄを参照のこと。必要により、よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、他の添加物の存否など）を、使用してもよい。他の薬剤が、非特異的なハイブリダイゼーションおよび／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少する目的で、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液に含まれ得る。そのような他の薬剤の例としては、ゼラチン、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００などであるが、他の適切な薬剤もまた、使用され得る。これらの添加物の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション条件としては、通常、ｐＨ６．８〜７．４が挙げられるが；代表的なイオン強度条件において、ハイブリダイゼーションの速度は、ほとんどｐＨ独立である。ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ ａｎｎｕａｌ ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ等を参照のこと。一般的なハイブリダイゼーションについては、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第４章、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照のこと。
核酸の二本鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さおよび塩基対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、当業者によって調整され得、これらの変数を適用させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にする。完全に一致したＤＮＡ二本鎖の融解温度は、以下の式によって概算され得る。
Tm（℃）＝81.5+16.6(log[Na+])+0.41(%G+C)−600／N−0.72（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二本鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセンテージである。不完全に一致したハイブリッドに関して、融解温度は、各１％不一致（ミスマッチ）に対して約１℃ずつ減少する。なお、核酸増幅においては、ホルムアミドは核酸増幅においては、使用されないことが好ましい。従って、核酸増幅におけるハイブリダイゼーション条件の考慮は、上記一般式から当業者は、使用する増幅反応に応じて改変して用いることができる。
ＲＮＡ、ＰＮＡなどを利用したときは、当業者は、そのヌクレオチドに適切な関係式を利用することができる。ＲＮＡについては、例えば、Ｆｒｅｉｅｒ Ｓ．Ｍ．（１９９３）Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｄｒｕｇｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｅｄｓ．Ｇｒｏｏｋｅ Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ Ｂ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，６７−８２を参照のこと。
当業者は、上述のような関係式を用いて、標識または検出などに適切な条件を見出すことができることが理解される。
ハイブリダイズする核酸分子は、相互に実質的に相補的または完全に相補的であることが多い。
本明細書において、「相補（的）」であるとは、核酸について言及するとき、核酸の塩基配列において，各塩基をワトソン−クリック結合で対になる塩基でおきかえた塩基配列（核酸）をいう。通常、ＡとＴ（Ｕ）と、およびＣとＧとが互いに相補的であるといわれる。
本明細書中で使用される場合、用語「相補的」または「実質的に相補的」とは、別の核酸分子に対して、特異的にハイブリダイズし得る、核酸配列を表す。相補的な核酸配列は、一方の配列をワトソンクリックの塩基対に基づき変換した配列が、他方の配列と比較して、好ましくは７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％、９９％以上または１００％の配列同一性を有し得る。ここで、この配列同一性が１００％である場合、完全に相補的であるともいう。
本明細書中で使用される場合、用語「核酸」、「核酸分子」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」は、特に言及する場合を除き交換可能に使用され、一連のヌクレオチドからなる高分子（重合体）を指す。本明細書中において、オリゴヌクレオチドは、特に言及しない限り、一本鎖オリゴヌクレオチドを指す。
本明細書において「核酸の分離」とは、ある核酸の集合を別の性質を有する核酸の集合から離すことをいう。そのような分離は、分子量、標識、親和性などを手がかりに行うことができる。分子量を手がかりに分離する場合は、電気泳動を行うことによって分離することができる。分子ふるいを用いても分子量による分離を行うことができる。
本発明では、標識の検出は、直接または間接的に行うことができる。直接行う場合は、例えば、放射能をガイガーカウンターなどで検出し、または蛍光を直接肉眼またはカメラなどで検出することができる。間接的に行う場合は、例えば、別に標識されたものをその標識に結合することによって、その別の標識を検出し、または標識を活性化する因子を付与してその活性化により標識（ビオチン、ストレプトアビジンなどの使用）を検出することなどにより検出を行うことが可能である。
本明細書において使用される「オートラジオグラフ」または「オートラジオグラフィー」とは、Ｘ線写真フィルムあるいは乾板を使って，生体内における放射性物質(トレーサー)の取込みを観察し、生体内物質の分布、移動、代謝を細胞化学、組織化学的に調べる方法をいう。オートラジオグラフには、マクロオートラジオグラフ法（可視オートラジオグラフ法）・ミクロオートラジオグラフ法（光顕オートラジオグラフ法）・ウルトラミクロオートラジオグラフ法（電顕オートラジオグラフ法）などが挙げられ、本発明においては、その目的に応じて任意に選択して使用することができる。
本明細書において、プライマー対として使用される核酸分子は、「順方向一本鎖核酸分子」と「逆方向一本鎖核酸分子」とから構成される。通常、ある核酸分子を増幅するために、順方向は、一本鎖またはセンス鎖の５’末端から３’末端向きの方向をいい、逆方向とは、その逆をいう。
本明細書における「プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質またはＲＮａｓｅの分解を促進する物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）が用いられ得る。プライマーの長さは、通常１００塩基以下、より好ましくは８塩基〜８０塩基、さらにより好ましくは１０塩基〜４０塩基であるが、これらに限定されない。プライマーは、制限酵素部位、マルチクローニングサイト（様々な制限酵素に認識される配列が存在する部位であってもよい。これを適当な制限酵素で切断し、外来のDNA配列を挿入する。）と呼ばれる汎用の配列を有していても良い。そのようなマルチクローニングサイトは任意の物を使用することができる。
遺伝子工学分野において通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と特異的なハイブリダイゼーション条件（通常核酸増幅条件）で標的となる核酸分子とハイブリダイズする、好ましくは実質的に相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましく１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは１１の連続するヌクレオチド長の、１２の連続するヌクレオチド長の、１３の連続するヌクレオチド長の、１４の連続するヌクレオチド長の、１５の連続するヌクレオチド長の、１６の連続するヌクレオチド長の、１７の連続するヌクレオチド長の、１８の連続するヌクレオチド長の、１９の連続するヌクレオチド長の、２０の連続するヌクレオチド長の、２５の連続するヌクレオチド長の、３０の連続するヌクレオチド長の、４０の連続するヌクレオチド長の、５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、９０％相同な、９５％相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成（増幅）が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータプログラム（例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ，ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ，ＤＮＡＳｔａｒ）を用いて行ってもよい。このようなプライマーを用いて本発明に用いる増幅産物を作製することができる。
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、ホルモン、サイトカインの情報伝達機能など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。
本明細書において「鋳型」とは、核酸増幅反応において、増幅される対象となる配列を含む核酸分子またはその等価物をいう。本明細書では、核酸増幅反応の鋳型を「核酸増幅反応鋳型」と呼び、これは例えば、逆転写反応によって生産することができる。
ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）へのリンカー核酸結合の代表的な方法としては、例えば、Ｓｍａｒｔプロトコル（U.S. Patent Nos.5,962,271& 5,962,272）、Ｎｅｌｓｏｎプロトコルなどを挙げることができる。
ここで、Ｎｅｌｓｏｎプロトコルを説明する。
（第I工程）３’リンカー核酸をＲＮＡに連結する。出発材料としてのＲＮＡは、どのようなものでもよく、例えば、総ＲＮＡを用いてもよく、あるいは、総ＲＮＡから調製されたサイズ分画したＲＮＡを用いて行うこともでき、ここでは、適切なサイズマーカーを用いてゲル精製してもよい。
アデニル化オリゴヌクレオチド（「ｍｏｄｂａｎ」（IDT DNA Technologies，idtdna.comから入手可能）等）を用いてＡＴＰをライゲーション工程において不要とさせる。これにより、ＲＮＡの環化を防ぐことができる。
一例として２０μｌのライゲーション反応を例示する。
１３μｌ ５−５０μｇの総ＲＮＡ水溶液（または５−５０μｇの総ＲＮＡから精製した約２２ｎｔのＲＮＡ）
２μｌ １０×Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ緩衝液（５００ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．５，１００ ｍＭ ＭｇＣｌ２，１００ ｍＭ ＤＴＴ；１０ｍＭ ＡＴＰ，６００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ；製造業者から供給）
２μｌ ＤＭＳＯ
１μｌ １００μＭ ＲＮＡ３’リンカー核酸オリゴヌクレオチド（例えば、“modban”、AMP-5’p-5’p/CTGTAGGCACCATCAATジデオキシC-3’(配列番号１)）
２μｌ Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ（２０ユニット，Amersham)。
（工程）３７℃で１時間インキュベートしてライゲーションを進行させる。ライゲーションは、２０μｌの変性ゲルサンプル緩衝液（例えば、９５％ホルムアルデヒド、２０ｍＭ ＥＤＴＡ）を加えることによって停止させる。停止したライゲーション反応物は、−２０℃で保存することができ、あるいは、ゲル電気泳動で即座に処理しても良い。この反応物はまた、フェノールで抽出し、エタノールで沈降させ、ついで再度ゲル電気泳動の前にサンプル緩衝液中に再溶解する。
（第II工程）ＲＮＡ−３’リンカー核酸ライゲーション生成物のゲル精製
１．４ｃｍ幅、１．５ｍｍ厚で８ｃｍ長の１２．５％アクリルアミド、８Ｍ尿素ゲルを、１ｃｍ幅のレーンを有するコームを用いて調製する（TheBio-RadProtean II minigel systemまたはそれと同等のものが推奨されるがこれに限定されない。）。以下を混合する：
7.5 ml Sequagel Concentrate (National Diagnostics)
6 ml Sequagel Diluent
1.5 ml Sequagel Buffer
次いで、１分にわたり減圧下において脱気する。ついで、以下を加える：
150 μl 10% 過硫酸アンモニウム
3.5 μl TEMED
これらを緩やかに混合し、そしてゲルに注ぐ。
２．サンプルを６５℃に５分加熱し、チューブを氷上で冷却し、そしてゲルにロードする。
マーカーレーンには１５μｇの４０マー一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含ませる。電気泳動を１８ボルト／ｃｍ２（８ｃｍのゲルでは１５０ボルト）で行い、最速の色素がゲルの端部に到達するまで続ける。
３．４０ヌクレオチドマーカーをＵＶシャドウイングにより可視化し、そしてその位置をマークする。これは、ライゲーション生成物の予測位置（１８ヌクレオチドのＭｏｄｂａｎ＋約２２小ＲＮＡ）である。連結されたＲＮＡ（４０ｎｔ）をアクリルアミドのスライスから以下のように溶出させる（が、ライゲーション生成物の標識されたバンドの上下３−４ｍｍのゲルを余分に含める。）。
４．ゲルスライスを、きれいな１．５ｍｌの遠心分離管にいれ、そして１０００μｌのプラスチックピペットの先端の小さな末端などを用いてブンゼンバーナーまたはアルコールバーナーの炎中にその小さな先端を通過させることなどによって均質化する。ゲルスライスは、非常に小さな粒子にまで粉砕するべきである。
５．２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（pH 8.0) 1 mM EDTA 0.4M 酢酸アンモニウム 0.5% SDSを６００μｌ（少なくともゲルスライスの４倍量の容積）を加え、管に蓋をしてきつく閉め、そしてはげしく室温で少なくとも２時間攪拌する（一晩）。
６．ゲルスライスをＮａｎｏｓｅｐ１００フィルターなどのアクリルアミドフラグメントをトラップするのに適したフィルター中に通し均質化する。
７．溶出物をプールし、そして１μｌの２０μｇ／ｍｌのグリコーゲン、３体積分の１００％エタノールを加える。これを−２０℃まで１０分間冷却し、次いで冷蔵型微小遠心分離器中で遠心分離を４℃で１０分間行い、上清を捨てる。ペレットを７０％エタノールで３回完全に洗浄し、ペレットを乾燥させ（ほぼ完成させた状態でよい）、そして７μｌの水に再溶解し、−８０℃で保存する。あるいは、必要に応じて以下の工程を行う。
８．１００μｌの水中にこのペレットを溶かし、３０μｌの酢酸ナトリウム、３００μｌエタノールを加える。これを、冷蔵型微小遠心分離機中で１０分間遠心分離し、ペレットを再度洗浄し、これをほぼ乾燥の状態にまでさせ、そして７μｌの水に再溶解する。これを−８０℃で保存する。
（第ＩＩＩ工程）（５’リンカー核酸のＲＮＡライゲーション：Ｎｅｌｓｏｎプロトコル）
この工程は、Ｎｅｌｓｏｎ Ｌａｕの方法に従う。ここでは、ダイサー生成物が５’一リン酸とともに選択されるように設計された。
１．２０μｌライゲーション反応物を準備する。
11μl 3’ライゲーション生成物 (上記第２節)
２μｌ 10X T4 RNA ライゲーション緩衝液
２μｌ ６０μＭ ＡＴＰ
２μｌ ＤＭＳＯ
１μｌ １００μＭ RNA 5’リンカー核酸オリゴヌクレオチド
“Nelsonリンカー核酸” 5’ATCGTrArGrGrCrArCrCrUrGrArArA 3’ (配列番号２）。
２μｌ T4 RNAリガーゼ (20ユニット，Amersham)。
これを、３７℃で１時間インキュベートする
これに、１００μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．４Ｍ 酢酸アンモニウムを加え、フェノール抽出を行い、クロロホルム抽出を行う。１０μｇのグリコーゲンを加え、３容積（３００μｌ）の１００％エタノールを加える。−２０℃に冷却し、１２，０００×ｇで遠心分離を２０分間、４℃で行う。
ペレットを７０％エタノールで洗浄し、ペレットを乾燥させ、７μｌのＨ２Ｏに溶解させる。
（第ＩＶ工程：逆転写反応）
逆核酸増幅鋳型生産工程には２種類代表的に選択肢がある。１つ目は、スマート型(Clontech-style “SMART” protocol)を用いて３’リンカー核酸（第II工程）のみを含むＲＮＡに使用することである。この場合において、５’一リン酸は、ＲＮＡをクローニングするのには必要ない。他の選択肢としては、Ｎｅｌｓｏｎ型のものがあり、これは、３’リンカー核酸と５’リンカー核酸とを両方ＲＮＡに用いるものである（第III工程）。この段階以降は、２つの方法では、逆転写反応において用いられるプライマーが違うのみである（下記参照）。
１．以下のアニール工程を設定する：
6.3 μl RNA ライゲーション生成物(上記第II工程および第III工程)
4.2 μl オリゴヌクレオチド混合物：
ＳＭＡＲＴプロトコル用（第II工程）：
５μＭ Ｓｍａｒｔｂａｎ5’-ATCGTAGGCACCTGAAAGGG-3’（配列番号３）
５μＭ BanOne: 5’-ATTGATGGTGCCTACAG-3’（配列番号４）。
Ｎｅｌｓｏｎプロトコル用（第III工程）：
５μＭ BanOne: 5’-ATTGATGGTGCCTACAG-3’ （配列番号４）
---------
合計 10.5 μl
２分間７２℃インキュベーションし、
１分間２０℃で遠心分離し、
２分間氷上で冷却する。
２．以下を加えて合計１８．９μｌとする。
８．４μｌの「ＲＴ Ｍｉｘ」
ＲＴ Ｍｉｘのストック：30 μl ５×第一鎖緩衝液
15 μl 20 mM DTT
各15 μl dNTPs (各10mM)。
３．サンプルを２つのチューブに分割し、各々９μｌずつとする。
＋ＲＴ：１μｌ（２００Ｕ）のＲＮａｓｅ Ｈ− ＲＴ（Invitrogen Superscript(R))
−ＲＴ：１μｌの水
を加える。
４．これを４２℃で１時間インキュベートする。
（第Ｖ工程）ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅
１．以下の１００μｌのＰＣＲ反応を準備する。
２μｌ 第一鎖ｃＤＮＡまたは「−ＲＴコントロール」（上記において調製）。
６６μｌ 水
１０μｌ １０×ＰＣＲ緩衝液
１０μｌ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ（各々２ｍＭ）
６μｌ ２５ｍＭ ＭｇＣｌ２
２μｌ ５０μＭ ５’ＰＣＲプライマーBanTwo: 5’-ATCGTAGGCACCTGAAA-3’（配列番号６）
２μｌ ５０μＭ ３’ＰＣＲプライマーBanOne: 5’-ATTGATGGTGCCTACAG-3’（配列番号４）
２μｌ ２．５Ｕ／ｍｌ Ｔａｑポリメラーゼ
内容物をチューブを軽くたたきながらゆっくりと混合する。
軽く遠心分離をして、チューブの底に内容物を収集する。
必要に応じてミネラルオイルを２−３滴添加する（好ましくは、熱いボンネットおよび対応するチューブを備えるサーモサイクラーを用いる）。チューブに蓋をし、これを予熱した（９５℃）サーマルサイクラーに配置する。
２．以下のPCRプログラムを実行する。
第１工程：９６℃ １分
第２工程：９６℃ １０秒
第３工程：５０℃ ６０秒
第４工程：７２℃ ２０秒
第５工程：第２工程まで２６サイクル行う。
第６工程：７２℃ ３分
第７工程：１０℃で使用時まで。
３．ＰＣＲ反応物を０．４Ｍ塩の存在下フェノール抽出およびクロロホルム抽出し、そして３容積のエタノールで沈降させる。
４．室温で２０分間１２，０００ｒｐｍですぐに遠心分離する。
５．上清を捨て、ペレットを７０％エタノールで洗い、廃液を捨てるが、完全にペレットを乾燥させずに４０μｌのＴＥ緩衝液４０μｌ中に再懸濁する。
（第ＶＩ工程）ｃＤＮＡのゲル精製
この工程は、任意であり、ＰＣＲ産物が単一のインサートクローンとして直接クローニングされ得る（第ＶＩＩ工程）か、またはｂａｎ−１を用いて消化して、コンカタマー化させ（第ＶＩＩＩ工程）てもよい。ゲル精製は、いかなるプライマーダイマーＰＣＲ産物も過剰の長さの生成物をも除去するという利点がある。
１．１０ｃｍ長の２％低融点（６５℃）アガロースゲル（1X TAE ，0.5 μg/ml エチジウムブロミド）を調製する。
２．ゲルにｃＤＮＡをロードし、１０μｌの（１μｇの）ＨａｅＩＩＩ消化したＰｈｉ−Ｘ ＤＮＡサイズマーカーを隣にロードし、そして「−ＲＴコントロール」をその隣にロードする。４５℃で８０ボルトで電気泳動する。
低融点ゲルが高電流で融解することを避けるために、電気泳動の電圧は、８０ボルトに制限する。低融点アガロースからＤＮＡを抽出する際には、ＴＢＥゲルランニング緩衝液ではなくではなくＴＡＥ緩衝液を使用し、ＤＮＡのエタノール沈澱の間の硼化物沈澱の可能性を回避する。
３．ゲル中のＤＮＡフラグメントを、長波長ＵＶソースを用いた照明下で暗室で観察する。ＰＣＲ産物の位置にマークし（約７０ｎｔ）、これをきれいなスカルペルで切除する。
４．ＤＮＡバンドをレーザー刃またはスカルペルで切り出し、ゲルスライスを予め秤量した１．５ｍｌ反応チューブに移す。ゲルスライスが２５０ｍｇより重い場合、アガロースバンドを２つのチューブに分割する。少なくとも１容積（ｖ／ｗ）の０．４Ｍ ＮａＣｌを加えて、最終容量を５００μｌとする。チューブを７０℃で１０分間インキュベートしてゲルスライスを融解させ、これに５００μｌの７０℃で予熱し緩衝化した水飽和フェノール（ｐＨ７．８）を加える。この溶液を激しくボルテックスし、即座に室温になじませた５分間にわたり卓上型遠心分離にて最高速度で相を分離させる。アガロースは、インターフェース中に蓄積するはずである。アガロースの上の相を収集し、水相をもう一度６５℃のフェノールで抽出する。
６．４００μｌの溶離物について、２０μｌのグリコーゲン、１ｍｌのエタノールを加える。−２０℃に少なくとも１時間冷却し、そして遠心分離により沈降物を回収する。ペレットを７０％エタノールで洗浄し、そして３０−５０μｌのＴＥ緩衝液中に溶解する。ここでは、ペレットを完全に乾燥させないことが好ましい。なぜなら、ＤＮＡが変性するからである。また、配列の異種集団であるから、相補鎖は適切に再アニールしないかもしれないからである。ペレットを水に再懸濁するのではなく、同じ理由で緩衝液中に再懸濁する。
（第ＶＩＩ工程：単一インサートｃＤＮＡのクローニング）
配列データを得るための最も迅速な方法の一つは、ＰＣＲ生成物を直接クローニングすることである。しかし、ほんの少しのＲＮＡ配列が各々のクローンについて得られることから、これは、コンカタマーｃＤＮＡの配列決定（第Ｘ工程）に比べてあまり経済的とはいえない。しばしば、小さな単一インサートクローンのライブラリーを作製し、これらのうち数十程度の配列を決定し、ライブラリーの品質を評価して、その後、コンカタマー化工程に進むことが好ましい。
１．例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＴＯＰＯクローニングキットを製造業者の指示書に基づいて用いてｃＤＮＡをクローニングする。標準的な方法を用いて配列決定を行う。ここでは、リンカーオリゴヌクレオチド配列は、以下のように元のＲＮＡ配列を迷い無く確立することに留意。
5’-ATCGTAGGCACCTGAAAGGG-(RNA 5’-to-3’)-CTGTAGGCACCATCAATC- 3’（配列番号８）
SMARTban cDNA insert chiban
（第ＶＩＩＩ工程）コンカタマーｃＤＮＡのクローニング
このアプローチに関しては、ｃＤＮＡをできるだけ多く用意して実験することが重要である。これは、４００−５００μｌのＰＣＲ反応（第ＶＩＩ工程）を設定し、生成物をプールすることによって達成され得る。
１．各々のＰＣＲ反応物１００μｌについて、ＰＣＲ生成物を５０μｌの１×ＢａｎＩ緩衝液中に溶解する。３μｌ（消化していないサンプル）を取り出して、後のゲル分析に使用する。
ＤＮＡ変性を避けるために、ペレットを乾燥させてはならない。同様の理由でペレットは水ではなく、緩衝液中に溶解する。
２．３μｌのＢａｎＩエンドヌクレアーゼを加え、そして３７℃で少なくとも３時間にわたりインキュベートする。制限消化が完了したかを、３μｌの消化サンプルおよび３μｌの消化していないサンプルを２％の標準的なアガロースゲル中で上記のように流すことによって確認する。
３．５μｌの５Ｍ ＮａＣｌを加え、次いで１回のフェノール／クロロホルム抽出およ９び１回のクロロホルム抽出を行うことによって反応を停止させる。３容量の無水エタノールを加え、そして１時間にわたり氷上で員キュベーションすることによってＤＮＡを沈降させる。
４．ｂａｎ−１で消化したＤＮＡペレットを収集し、７０％エタノールで洗浄し、そしてペレットを１０μｌの２×ＮＥＢ Ｑｕｉｃｋ−Ｌｉｇａｔｉｏｎ緩衝液中に溶解し、Ｔ４ Ｑｕｉｃｋ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅに使用する。
５．３μｌの５０μＭ ｂａｎＯｎｅプライマーおよび３μｌの５０μＭ ｂａｎＴｗｏプライマーを加え、そして３μｌの水も加える。これを６５℃で２分間インキュベートし、室温に冷却する。
この工程は、コンカタマー化工程において１２ｂｐのＢａｎＩ消化フラグメントが再連結することを防ぐ意味で重要である。６５℃で、長いＤＮＡではなく１２ｂｐフラグメントを変性させ、そして冷却して過剰なＰＣＲプライマーに対して競合的な様式でハイブリダイズする。１２ｂｐＢａｎＩ消化したフラグメントの再連結が存在した場合、コンカタマー化工程は機能しない。
６．１μｌのＴ４ Ｑｕｉｃｋ ＤＮＡリガーゼを加え、２２℃で５分間インキュベートする。２μｌの反応物を取り出して、２％のアガロースゲルにおいてコンカタマー化が完了しているかどうかをチェックする。そして、連結物を−２０℃で凍結してプレップゲルで分画する。ここでは、インキュベーション時間が５分を超えると、組み換えプラスミドでの形質転換効率をアッセイした場合の良好な連結生成物が減少するようである。
７．２％の低融点アガロースゲル上で連結物を直接ロードし、電気泳動し、６００−１０００ｂｐの範囲の物質を切り出し、そしてＤＮＡをアガロースから熱フェノール抽出およびエタノール沈澱により精製する（ＩＶ工程参照）。通常のアガロースおよび標準的なゲル抽出キットを用いて（例えば、Ｑｉａｇｅｎのキット）実施することもできる。
（第ＩＸ工程）Ｔベクターライゲーションのためのコンカタマーの末端のテーリング
ここでは、充分な物質量が確保されていれば即座にコンカタマーをテーリングおよびクローニングすることができる。コンカタマーが充分量確保されていない場合、精製されたコンカタマーをＢａｎＯｎｅおよびＢａｎＴｗｏを用いて増幅させることができる。そして、６００−１０００ｂｐのバンドを再度精製する。このように増幅された物質を直接クローニングできる。
１．ＤＮＡペレットを収集する（第ＩＩＸ工程ステップ７）。ペレットを１５μｌのＰＣＲミックス（１×ｄＮＴＰ、１×ＰＣＲ緩衝液および０．１５μｌのＴａｑポリメラーゼを含む）中に溶解する。
２．反応混合物を７２℃で３０分間インキュベートして酵素による３’テーリングを行う。
３．必要に応じて、２％アガロースゲル上で３μｌのサンプルを分析することによってコンカタマーの収率をチェックする。
４．ＴＯＰＯ ＴＡクローニングを製造業者の記載するように実施する（Invitrogen，pCR2.1-TOPOベクター有り).
このようにして種々のＮｅｌｓｏｎ工程が実施される。
ＳｍａｒｔＴＭ ｐｒｏｔｏｃｏｌはＲＴ−ＰＣＲにおいて使用される方法であり、逆転写反応に引き続きｄＣを転写産物に付加する。その後３’末端にＧＧＧを含有するプライマーをＰＣＲ時点で上流プライマーとして使用する方法である。米国特許第5,962,271号および同5,962,272号を参照。具体的には以下の通りである。
ポリＡ＋ＲＮＡを鋳型にしてＣＤＳプライマーを用いて第１鎖の合成を逆転写酵素（ＲＴ）にて行う。この際、３’末端にＧＧＧを有するプライマーを上流プライマーとして使用する。合成後、逆転者酵素によりｄＣがテーリングされる。この後、鋳型をスイッチし、逆転写酵素によって伸長する。次にｃＤＮＡをＬＤ ＰＣＲによりＰＣＲプライマーを用いて増幅すると二本鎖ｃＤＮＡが生産される。詳しくは、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈから入手されるSuperSMART PCR cDNA Synthesis Kitなどに添付されるマニュアルを参照。これらのキットをもちいてＳｍａｒｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌを使用することができる。
本明細書において「制限酵素部位」または「制限部位」とは、制限酵素が切断することができる配列を言う。そのような制限部位は、制限酵素が一旦与えられたならば、当業者はその制限酵素に対する配列を認識できる。本明細書において使用される代表的な制限酵素部位は、例えば、以下の通りである。
6base cutterとしてEcoRI（GAATTC認識）、HindIII（AAGCTT認識）など
8base cutterとしてNotI（GCGGCCGC認識）、PmeI（GTTTAAAC認識）など。
本明細書において「マルチクローニングサイト」とは、種々の制限酵素に認識される配列が存在する部位をいう。これを適切な制限酵素で切断し、外来のDNA配列を挿入することができる。
本明細書において使用される核酸増幅法は、核酸分子を増幅させることができる限り、任意の方法を利用することができ、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ｇａｐ ＬＣＲ、鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＳＤＡ）、Ｑβレプリカーゼ増幅、転写増幅システム（ＴＡＳ）、自己支持配列複製システム（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ；３ＳＲ）；核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）；転写媒介増幅（ＴＭＡ）、等温条件下キメラプライマー開始核酸増幅（ＩＣＡＮ；Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌｌｙ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ ｕｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）およびループ媒介性等温増幅（ＬＡＭＰ）などを挙げることができる。
「ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）」とは、DNA 2 本鎖の解離，オリゴヌクレオチドとのアニーリング (annealing)、プライマーおよびDNA ポリメラーゼを利用しての相補鎖合成の3反応を繰り返すことにより増幅が起こる増幅反応をいう。その具体的な例は、本明細書において実施例に例示されている。最もよく使用される核酸増幅技術である。SaikiR.K.et al.(1985)，Science，vol.230，1350-1354；Saiki R.K. et al.(1988)，Science，vol.239，487-491；ＵＳ４，６８３，２０２、ＵＳ４，６８３，１９５、ＵＳ４，９６５，１８８を参照。ＰＣＲ反応において、一本鎖プライマー（通常１２から２４ヌクレオチド鎖長を有するオリゴヌクレオチド）は、相補的な一本鎖ＤＮＡ配列とアニールする。れらのプライマーは、二本鎖ＤＮＡを得るためにＤＮＡポリメラーゼとデオキシリボヌクレオシド三リン酸塩（ｄＮＴＰ、すなわちｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）の存在下で連続的に伸長される。その二本鎖ＤＮＡは、加熱することによって一本鎖に分離される。その温度はプライマーアニーリングの新しい工程を可能にするように十分に減少される。これらプライマーは再度二本鎖ＤＮＡに伸長される。一本鎖ＤＮＡのほとんどの各分子が増幅の各回で二本鎖ＤＮＡに形質転換され、次回の増幅のための鋳型として再度使用される二つの一本鎖ＤＮＡに分割されるように反応条件が適合されるので、上記の工程を繰り返すことにより、開始ＤＮＡの指数関数的な増幅が可能になる。
リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）とは、リガーゼを用いた核酸増幅反応であり、標的ＤＮＡに相補的な隣接する３０ｎｔ長のプローブ４個を耐熱性ＤＮＡリガーゼの存在した、温度サイクルにかけると、標的ＤＮＡ依存的に隣接するプローブ同士の連結反応が繰り返し起こり、連結プローブが指数関数的に増加する。リガーゼ連鎖反応（ligasechainreaction：LCR）法は、耐熱性のDNAリガーゼを用いて温度サイクリング反応（熱処理と冷却の繰り返し反応）を行うことにより標的遺伝子配列を増幅、検出する方法である。本法では、熱処理により解離したDNAの二重らせんの双方にそれぞれに冷却して結合する２種類の隣りあった遺伝子断片、計４種類の遺伝子断片を用いて反応を行う。具体的には、２本鎖DNAを94−99℃で熱処理して、それぞれを１本鎖に解離させる。続く50−70℃での冷却操作により、１本鎖に分離した標的DNAに２種類の隣りあった遺伝子断片が結合する。さらに、正常な配列であった場合、耐熱性DNAリガーゼによって隣り合う遺伝子断片が連結するが、１塩基でも異常があった場合は連結しない。この一連の反応を繰り返すことによって、正常DNA配列の場合、遺伝子断片の連結産物が指数関数的に増幅されるが、異常DNA配列は増幅されない。Landegren U. etal.(1988)，Science，vol.241，1077-1080；Barany F.(1991)，Proc. Natl. Acad.Sci.USA，vol.88，189-193；特表平５−５０８７６４、特開２００１−２６９１８７を参照。
ｇａｐ ＬＣＲとは、リガーゼを用いる核酸増幅の一つであり、連結末端に数塩基のギャップを導入、プローブ同士の平滑末端連結による偽陽性を防止、結合したプローブ間のギャップをＤＮＡポリメラーゼで埋めリガーゼで連結する。MarshallR.L.et al.(1994)，PCR Methods Appl.，vol.4，80-84；特許３３３０５９９号を参照。
鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＳＤＡ）とは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＤＮＡポリメラーゼ，制限酵素を用いた核酸増幅反応であり、・制限酵素による一本鎖ニックによりＤＮＡポリメラーゼにより伸長しうるプライマーが生じる、置換されたＤＮＡ 鎖が次の複製の鋳型として機能する反応である。HincII認識部位をもったターゲットの複製とＳＤＡ反応増幅サイクルの２段階からなっている。ＳＤＡ法は単一温度の下で核酸の増幅を図るので、反応系を高温にさらす必要がなく、同時に複数のターゲットを増幅できることから自動化が容易である。ＳＤＡ法は、検出対象となる病原細菌のＤＮＡに制限酵素で切れ目を入れ、切れ目をもつＤＮＡ断片を順番に置換していくＤＮＡポリメラーゼの作用を用いてＤＮＡを増幅する技術であり、この技術は米国BectonDickinson（ＢＤ社）によって遺伝子を増幅する方法として開発された。WalkerG.T. et al.(1992)，Proc. Natl. Acad.Sci. USA，vol.89，392-396；Walker G.T. etal.(1992)，Nucleic Acids Res.，vol.20，1691-1696；特公平７−１１４７１８を参照。
Ｑβレプリカーゼ増幅（Ｑβ ｒｅｐｌｉｃａｓｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）とは、ＲＮＡ指向性ＲＮＡポリメラーゼ（Ｑβレプリカーゼ）を用いた核酸増幅反応であり、Ｑβ レプリカーゼの認識部位を含むＲＮＡプローブを標的にハイブリダイズ、結合していないプローブを除去後、結合したプローブをＱβレプリカーゼで複製増幅する反応である。MieleE.A.et al.(1983)，J. Mol. Biol.，vol.171，281-295；Lizardi P.M. et al.(1988)，Biotechnology，vol.6，1197-1202；US4,786,600、特許2710159、特許3240151を参照。
転写増幅システム（ＴＡＳ）とは、逆転写酵素、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いた核酸増幅反応であり、標的ＲＮＡと同一配列のフォワードプライマー、標的ＲＮＡ と相補的で５’側にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列の付いたリバースプライマーを用い、鋳型ＲＮＡから転写産物を得る工程と、得られた転写産物を鋳型としてさらに転写産物を合成する工程を組み合わせる反応である。KwohD.Y.et al.(1989)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，vol.86 1173-1177；特許２８４３５８６を参照。
自己支持配列複製システム（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ；３ＳＲ）とは、ＴＡＳと同様の核酸増幅反応であるが、ＴＡＳ にＲＮａｓｅＨ を加えることにより、ｃＤＮＡ とＲＮＡ コピーの増幅が起こりともに次の反応の鋳型となる反応である。GuatelliJ.C.et al.(1990)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，vol.87，1874-1878；特許３１５２９２７を参照。
核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）とは、逆転写酵素，ＲＮａｓｅ Ｈ，ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いる反応をいう。標的ＲＮＡ と同一配列のフォワードプライマー、標的ＲＮＡ と相補的で５’側にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列の付いたリバースプライマーを用い、鋳型ＲＮＡから転写産物を得る工程と、得られた転写産物を鋳型としてさらに転写産物を合成する工程を組み合わせる反応である。ComptonJ.(1991)，Nature，vol.350，91-92；KievitsT.(1991)，J. Virol. Methods，vol.35，273-286；特許２６４８８０２、特許２６５０１５９を参照。
転写媒介増幅（ＴＭＡ）とは、ＲＮａｓｅ Ｈ 活性を有する逆転写酵素，ＲＮＡポリメラーゼを使用する核酸増幅反応であり、標的ＲＮＡ と同一配列のフォワードプライマー、標的ＲＮＡ と相補的で５’側にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列の付いたリバースプライマーを用い、鋳型ＲＮＡから転写産物を得る工程と、得られた転写産物を鋳型としてさらに転写産物を合成する工程を組み合わせる反応である。特許3241717、特開平11-46778、特開2000-350592を参照。
等温条件下キメラプライマー開始核酸増幅（ＩＣＡＮ）とは、鎖置換（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）活性を有するＤＮＡポリメラーゼ，ＲＮａｓｅ Ｈを用いた核酸増幅反応であり、ＲＮＡ−ＤＮＡからなるキメラプライマーを用い、鎖置換反応、鋳型交換反応、ニック導入反応により増幅を行う反応である。NotomiT.et al.(2000)，Nucleic Acids Res.，vol.28，e63；Nagamine K. et al.(2001)，Clin.Chem.，vol.47，1742-1743；特許３３１３３５８、特開２００１−３４７９０を参照。
ループ媒介性等温増幅（ＬＡＭＰ）とは、鎖置換（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）活性を有するＤＮＡ ポリメラーゼを用いた核酸増幅反応であり、合成されたＤＮＡ の３’末端が常にループを形成して次のＤＮＡ の合成起点となるようプライマーを設計する反応である。http://www.takara.co.jp/news/2000/07-09/00-i-019.htm；ＷＯ２０００−５６８７７を参照。
本明細書において使用される「核酸増幅条件」とは、使用されるべき核酸増幅法において、核酸増幅が生じる任意の条件をいう。そのような条件は、上記文献を参酌して、当業者は、容易に選択することができる。
本明細書において「逆転写反応」または「逆転写酵素反応」、とは、RNAに依存してDNAを合成する酵素である逆転写酵素（リバーストランスクリプターゼ、RNA依存性DNAポリメラーゼとも呼ばれる）により媒介される反応をいう。一本鎖RNAを鋳型としてこれと相補的なヌクレオチド配列をもつDNAが合成される。逆転写反応は、その次にＰＣＲと組み合わされて、逆転写反応−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）として汎用される。従って、ＲＴ−ＰＣＲは、逆転写酵素を用いてRNAを鋳型としたDNA合成を行い、そのDNAを今度は鋳型にしてPCR反応を行うことになる。ＲＴ−ＰＣＲは、例えば、GIBCOBRL社のキット（Super ScriptTM Preamplification System（Cat. No. 18089-011)等）を用いることができる。
ＲＴ−ＰＣＲにおいては、RNase free の調製が好ましい。RNase free であることと同様に重要なのが、DEPC を完全に除去することである。DEPCによって以下の反応の多くが阻害されてしまうからである。可能であれば、試薬は使用する前に臭いを嗅ぎ、DEPC臭がしないことを必ず確認することが重要である。
逆転写反応を説明する。逆転写反応後に生じるＤＮＡ／ＲＮＡ ２本鎖はＤＮＡ／ＤＮＡよりも結合が強いので、これを鋳型としたＰＣＲは反応が起きにくいと一般的に言われている。そのため、ＲＮａｓｅＨを用いてＲＮＡを分解する反応をｃＤＮＡ 合成後に付け加えるのが通常であるが、その反応を省略しても問題ない。好ましくは、４２℃９０ｍｉｎ の逆転写反応終了後、ＲＮａｓｅ Ｈ を１μｌ加え、３７℃、２０ｍｉｎ インキュベートし、−２０℃保存するとよいがそれに限定されない。また、ＰＣＲ 反応を行うとき、ＲＴ 産物は希釈して使用するが、反応を半量にスケールダウンしても支障は無いので、実験コストを下げるため、半量系で行ってもよい。
本発明の方法に用いうるＤＮＡポリメラーゼには、本発明のＤＮＡ増幅反応を行うすべてのＤＮＡポリメラーゼが含まれる。このようなポリメラーゼは、本明細書に記載する通り、相補的なヌクレオチド配列を持つ末端を有する、２つの線状ＤＮＡ分子を連結する能力に関してアッセイすることによって同定しうる。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼは、ワクシニアウイルスＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片からなる群より選択される。ＤＮＡポリメラーゼの選択に際しては、合成（伸長）反応の正確性を考慮することが特に重要である。従って、特にタグの領域において、３‘→５’エキソヌクレアーゼ活性が強くhigh-fidelityを示すα型酵素（例えば、KOD-plus-：TOYOBO）が望ましい。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼとしては、KOD-plus-：TOYOBOなどの正確性が高い酵素が使用される。各線状ＤＮＡ分子の相補的ヌクレオチド配列の長さは、約５から約１００ヌクレオチドの間、好ましくは約８から約５０ヌクレオチドの間、最も好ましくは約１０から３５ヌクレオチドの間でありうる。インキュベーション混合物に公知の種々の刺激因子を加えてもよい。このような刺激因子は、反応の効率を向上させ、かつ所望の反応産物、例えば一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を安定化させる因子が使用され得る。
反応の効率を高めるため、および／または反応産物を安定化するために、さまざまな公知の刺激因子をインキュベーション混合物に加えてもよい。適した刺激因子には一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質が含まれる。用いうる一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の中には、ワクシニアおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の一本鎖結合タンパク質、単純ヘルペスウイルスＩＣＰ８タンパク質、ならびに酵母およびヒトの複製プロテインＡ（例えば、ｙＲＰＡおよびｈＲＰＡ）を含むが、これらに限定されないものもある。当業者は、本発明の方法においてＤＮＡポリメラーゼと組み合わせて有用に用いうる、他の適した刺激因子を容易に同定しうると考えられる。本発明の１つの実施形態において、ワクシニア一本鎖結合タンパク質を用いて、ワクシニアＤＮＡポリメラーゼを用いるＤＮＡ連結反応の収率を高める。
線状ＤＮＡ分子の末端間の相補性の程度は、約５から約１００ヌクレオチドの間、好ましくは約８から約５０ヌクレオチドの間、最も好ましくは約１０から３５ ヌクレオチドの間を変動しうる。本発明の方法を用いて連結されうる線状ＤＮＡ分子は、制限酵素切断を用いて、原核生物または真核生物のゲノムのゲノムＤＮＡ、ならびにプラスミド、コスミド、ファージ、ＢＡＣなどを含む種々のベクターから入手してもよい。または、線状ＤＮＡ分子を、例えば自動合成などを用いる化学的手法によって合成してもよい。ＤＮＡ分子は任意の種由来のｍＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｒＲＮＡなどのＲＮＡ種に由来してもよく、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）（下記）に記載された通りに、まず逆転写酵素によってｃＤＮＡに変換して増幅することができる。
核酸増幅条件は、以下を考慮すべきである。
適切な緩衝溶液は、前記２価陽イオンを結合する緩衝剤を更に含有し、前記２価陽イオンは好ましくはＭｎ２＋であり、前記緩衝剤の２０℃かつ０．１Ｍのイオン強度における２価陽イオン結合反応のＫＭは、１０および１０６の間、好ましくは１０２および１０４の間、より好ましくは１０２．５および１０３．５の間である。前記緩衝剤は、好ましくは水素イオン緩衝作用を与える両性イオン性化合物であり、前記緩衝溶液の２０℃かつ０．１Ｍのイオン強度におけるｐＫａは、７および９の間、好ましくは７．５および８．５の間である。好ましい実施態様において、前記緩衝溶液は、更にＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシンまたはＮ［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシンを含んでなり、更に好ましくは、前記緩衝溶液は、更に酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウムおよび酢酸リチウムからなる群から選択される酢酸塩を含んでなる。最も好ましい実施態様において、緩衝溶液は酢酸マンガン（Ｍｎ（ＯＡｃ）２またはＭｎ（ＣＨ３ＣＯ２）２とも記される）、ビシン−ＫＯＨ（ビシンはＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシンである）および酢酸カリウム（ＫＯＡｃまたはＫＣＨ３ＣＯ２とも記される）を含んでなる。前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、好ましくはＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼまたはＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＤＮＡポリメラーゼ、最も好ましくは組換えＴｔｈＤＮＡポリメラーゼである。好ましい実施態様において、工程（ａ）の温度は、４０℃および８０℃の間である。
本明細書において「逆転写反応混合物」とは、標的ＲＮＡの逆転写のために使用される種々の試薬を含む水溶液を指す。これらは、酵素、水性緩衝剤、塩類、オリゴヌクレ オチドプライマー、標的核酸、およびヌクレオシド三リン酸を含む。状況に依存して、該混合物は完全または不完全逆転写反応混合物のいずれであってもよい。
本明細書において「緩衝液」とは、緩衝剤または緩衝剤混合物、および場合により２価陽イオンおよび１価陽イオンを含む溶液を指す。
本明細書において「増幅反応混合物」とは、標的核酸の増幅のために使用される種々の試薬を含む水溶液を指す。これらは、酵素、水性緩衝剤、塩類、増幅プライマー、標 的核酸、およびヌクレオシド三リン酸を含む。状況に依存して、該混合物は完全または増幅反応混合物のいずれであってもよい。本発明の好ましい実施態様において、増幅系はＰＣＲであり、増幅反応混合物はＰＣＲ混合物である。
本発明は、多くの供給源に由来するＲＮＡを逆転写・増幅するために好適である。ＲＮＡテンプレートは、ウイルスまたは細菌性核酸調製物等の微生物由来の 核酸調製物中に含まれてよい。該調製物は、細胞残渣および他の成分、精製全ＲＮＡ、または精製ｍＲＮＡを含んでよい。該ＲＮＡテンプレートは、試料中の異種的ＲＮＡ分子の母集団または特定の標的ＲＮＡ分子であってよい。ＲＮＡは、ＷＯ９１／０９９４４に引用されているような種々の方法のいずれにより調製されてもよい。
プライマー伸長を起こさせるためには、このプライマーがＲＮＡテンプレートにアニールしなければならない。逆転写を起こすためには、プライマーのすべてのヌクレオチドがテンプレートにアニールする必要はない。プライマー配列は、テンプレートの正確な配列を反映する必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチド断片をプライマーの５’末端に連結し、プライマー配列の残る部分をＲＮＡに相補的としてもよい。他の方法として、プライマー配列がＲＮＡテンプレートとハイブリダイズするために充分に相補的であって、かつ相補ＤＮＡ鎖の合成を可能とする限り、プライマー中に非相補的塩基を分散させてもよい。
加熱条件は、緩衝溶液、塩濃度、および変性される核酸に依存する。当然のことながら、ｍＲＮＡの逆転写についてテンプレート分子は一般に単鎖であり、従って高温度の変性工程が不要であることは認識される。しかしながら、二本鎖ＲＮＡも、最初の変性または鎖分離工程に続く逆転写／増幅方法のための好ましいテンプレートを与える。
ＲＮＡ不安定化の温度は、典型的には５０〜８０℃の範囲である。プライマー伸長の第１のサイクルは、上述した変性および増幅に適した二本鎖テンプレートを 与える。核酸変性の温度は、典型的には約９０〜約１００℃の範囲であり、変性が起こるに充分な時間は核酸長、塩基成分、試料中に存在する単鎖配列間の相補性に依存するが、典型的には約１０秒から４分間である。
熱安定性または熱活性ＤＮＡポリメラーゼは、好ましくは約４０℃以上、例えば ６０−８０℃の温度で至適活性を有する。４２℃よりかなりな高温度では、熱安定性または熱活性ＤＮＡポリメラーゼ以外のＤＮＡおよびＲＮＡ−依存ポリメラーゼは、不活性化する。ここに参考として取り入れるＳｈｉｍｏｍａｖｅおよびＳａｌｖａｔｏ、１９８９、ＧｅｎｅＡｎａｌ．Ｔｅｃｈｎ．６：２５−２８は、ＡＭＶ−ＲＴは、４２℃において最大活性を有することを記述している。５０℃において該酵素は５０％の活性を有し、５５℃においてはＡＭＶ−ＲＴは活性最大水準の僅かに１０％を保持するにすぎない。従って、ＡＭＶ−ＲＴはＲＮＡテンプレートを使用する高温度ボリマー化反応を触媒するには不適当である。本発明では、このような熱活性ＤＮＡポリメラーゼを用いても良い。
プライマーのテンプレートに対するハイブリダイゼーションは、組成およびプライマーの長さに加えて塩濃度に依存する。熱安定性または熱活性ポリメラーゼを使用する場合には、ハイブリダイゼーションは高温度（例えば４５−７０℃）にて起こり得て、これは選択性の増大および／またはプライミングの高い厳密性のために好適である。ポリメラーゼ酵素についての高温度の至適性は、プライマーハイブリダイゼーション工程での選択性のためにＲＮＡ逆転写および引き続く増幅がより高い特異性を持って進むことを可能とする。好ましくはＲＮＡ逆転写の至適温度は、約５５−７５℃、更に好ましくは６０−７０℃の範囲である。
核酸増幅の交差夾雑を最小化する特定の方法が、ここに参考として取り入れるＰＣＴ特許公開ＷＯ９２／０１８１４および米国特許５，０３５，９９６に記述されている。該方法は、ｄＵＴＰ等の非慣用ヌクレオチド塩基を増幅生成物に導入し、持ち越し生成物を酵素的および／または物理化学的処理に付して生成物ＤＮＡを次の増幅についてテンプレートとして機能し得ないようにすることを含む。例えば、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼまたはＵＮＧとしても知られているウラシルＤＮＡグリコシラーゼは、ウラシル塩基を含むＰＣＲ生成物からウラシル残基を除去する。該酵素処理は、夾雑するＰＣＲ生成物を分解し、増幅反応物をクリーンにする作用をする。
一般に、トリス緩衝溶液中でＭｇＣｌ２を使用するＰＣＲにおいてｄＮＴＰ濃度は、各ｄＮＴＰにつぃて２０−２００μＭの範囲である。ｄＵＴＰの取り込みのためには、上昇させたヌクレオチド濃度において増幅効率が改善される。
熱安定性ポリメラーゼを使用する逆転写のためには、Ｍｎ２＋が２価陽イオンとして好ましく、典型的には例えば塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）、酢酸マンガン（Ｍｎ（ＯＡＣ）２）または硫酸マンガン（ＭｎＳＯ４）等の塩として含まれる。ＭｎＣｌ２が、１０ｍＭトリス緩衝溶液を含む反応物に含まれる場合に、ＭｎＣｌ２は一般に０．５−７．０ｍＭの濃度で存在し、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰおよびｄＣＴＰをそれぞれ２００μＭ使用する場合、０．８−１．４ｍＭが好ましく、１．２ｍＭ ＭｎＣｌ２が最も好ましい。本発明の一実施態様において、Ｍｎ（ＯＡｃ）２、ビシン−ＫＯＨおよびＫＯＡｃを含む反応用緩衝溶液が、ＭｎＣｌ２、トリス、ＫＣｌ緩衝溶液に代えて使用される。Ｍｎ（ＯＡｃ）２として供給されるＭｎ２＋が１．２〜２．５ｍＭの範囲の濃度で使用されるビシン／アセテート緩衝溶液が使用され得る。ＲＴ／ＰＣＲにおいては、３．６ｍＭおよび３．５ｍＭの濃度が代表的に使用され得るがそれに限定されない。
増幅の標的は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド分子であり得る。該標的は、単鎖または二本鎖核酸であり得る。上述のＰＣＲ法は、二本鎖標的を仮定して記述した が、これは必要条件ではない。単鎖ＤＮＡ標的の第１の増幅サイクルの後、該反応物は、単鎖標的および新たに合成された相補鎖からなる二本鎖ＤＮＡ分子を含む。同様に、ＲＮＡ／ｃＤＮＡ標的の第１の増幅サイクルに次いで、該反応混合物は二本鎖ｃＤＮＡ分子を含む。この点において、増幅の引き続くサイクルは、上述したように進行する。本発明の方法において、増幅の標的は単鎖ＲＮＡであり、第１の増幅サイクルは、逆核酸増幅鋳型生産工程である。別の方法として、出発のテンプレートが二本鎖ＲＮＡである場合には、最初の高温度変性工程が単鎖ＲＮＡテンプレートの調製のために使用される。
熱安定性ポリメラーゼは、多くの供給元から入手可能である。酵素は、天然または組換えタンパク質であってよい。好ましい熱安定性酵素は、Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから精製されるＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓＤＮＡポリメラーゼである（ここに参考として取り入れるＰＣＴ特許出願公開ＷＯ９１／０９９５０参照）。別の方法として、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼは、組換え宿主細胞から生成され、該宿主細胞は、ＷＯ９１／０９９４４二記述されているように、下記プライマーを使用して調製されうる。
組換えＴｔｈポリメラーゼは、ｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼと記される。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼもまた本発明の実施に好適である。ＴａｑＤＮＡポリメラー ゼは、Ｈｏｆｆｍａｎｎ−ＬａＲｏｃｈｅＩｎｃ．により開発および製造され、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴから市販されている組換え製品またはＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓから天然ＴａｑＤＮＡポリメラーゼとして生成されたものが商業的に入手可能である。ここにおいて使用されるように、組換えＴａｑＤＮＡポリメラーゼはｒＴａｑＤＮＡポリメラーゼと記されてよく、また天然ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは、ｎＴａｑＤＮＡポリメラーゼとして記されてもよい。更に、Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＡｒｌｉｎｇｔｏｎＨｅｉｇｈｔｓ，ＩＬから“Ｈｏｔ Ｔｕｂ”ＤＮＡポリメラーゼとして入手可能なＴ．ｆｌａｖｕｓ（Ｔｆｌ）ＤＮＡポリメラーゼが好適であり得る。逆転写および核酸増幅へのＴｔｈＤＮＡポリメラーゼの使用の詳細については、ＷＯ９１／０９９４４に見いだされる。
プライマーは、その５’末端またはその近傍に位置する便利な制限酵素認識配列を伴って設計されうる。ｃＤＮＡ転写物の形成において、プライマーの３’末端 が標的配列に水素結合している限り、得られた二本鎖ｃＤＮＡ分子は特定の制限酵素認識配列を含む。ｃＤＮＡをテンプレートとして使用して増幅後、該制限部位は例えばクローニング等の別の処理を容易にするために使用されうる。
別の方法において、慣用されないヌクレオチドは、ＰＣＲ生成物の変性温度に影響を与えるために有用である。例えば、ヒドロキシメチルｄＵＴＰ（Ｈｍｄｕｔｐ） は、ＳＰ０１ファージＤＮＡ中にチミンに代えて５’ヒドロキシメチルウラシル（ＨｍＵｒａ）として天然に生じる（Ｋａｌｌｅｎら、１９６２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５：２４８−２５０、ならびにＬｅｖｙおよびＴｅｅｂｏｒ、１９９１，Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９（１２）：３３３７、両者をここに参考として取り入れる）。ＨｍＵｒａを含むゲノムは、対応するチミンを含むＤＮＡより１０℃低い温度で融解する。ＨｍｄＵＴＰのｃＤＮＡへの取り込みは、逆転写生成物およびＰＣＲ二本鎖ＤＮＡ生成物の両者の変性温度を、類似するチミン含有ＤＮＡの変性温度に比べて効果的に低下させる。ＤＮＡ生成物のＴｍに効果を及ぼしうる他の修飾ヌクレオチド三リン酸（例えば、ｃ７ｄＧＴＰ、７−デアザ−２’デオキシグアノシン５’−三リン酸またはα−ホスホロチオエートｄＮＴＰ）は、類似するＲＮＡおよびＤＮＡテンプレートを区別するために好適である。
ＤＮＡポリメラーゼは、触媒活性のために２価陽イオンを必要とする。ここに参考として取り入れるＴａｂｏｒおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ、１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：４０７６−４０８０は、ＤＮＡ配列決定法においてＭｇ２＋をＭｎ２＋に置換可能であることを報告している。これらの方法ではＤＮＡテンプレートおよびＴ７ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼＩが必要である。
この方法において使用するために好ましいＲＮＡは、特定の標的ＲＮＡを含むことが予想される生物学的試料中に含まれてよい。生物学的試料は、例えば血液試料 または生検組織試料等のＲＮＡが該試料の小部分である異種的試料であってよい。従って、この方法は、臨床検査および診断のために有用である。ＲＮＡは、特定の疾患または感染物質を示すものであり得る。
本明細書において「ＲＮＡポリメラーゼ」とは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたは転写酵素とも称され、ＤＮＡを鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）とし，基質リボヌクレオシド三燐酸を燐酸ジエステル結合で重合してＲＮＡを合成する反応を触媒する酵素をいう。胞内で遺伝子ＤＮＡのもつ遺伝情報をＲＮＡに転写する段階に関与することから，転写酵素ともよばれる。特異的塩基対の形成により，鋳型ＤＮＡ鎖に正確に相補的な塩基配列をもつＲＮＡを合成する。反応は，（１）ＤＮＡと酵素との結合，（２）ＲＮＡの５’末端となる基質（通常ＡＴＰまたはＧＴＰ）と２番目の基質との間の燐酸ジエステル結合の形成，（３）５’側から３’側へのＲＮＡ鎖伸長反応，（４）ＲＮＡ合成の停止，などの素反応からなる。
本明細書において「オーバーハング」とは、二本鎖核酸において突出した一本鎖をいう。
本明細書において使用されるＲＮＡポリメラーゼとしては、オーバーハングを生じさせないものが好ましいがそれに限定されない。
本明細書において使用されるＲＮＡ配列の除去のための手段としては、例えば、ＲＮａｓｅを挙げることができる。好ましいＲＮａｓｅとしては、ＤＮＡと結合している一本鎖ＲＮＡのみを選択的に分解するものがよい。そのような特殊なＲＮａｓｅの例としては、ＲＮａｓｅ Ｈなどを挙げることができる。
従来の合成装置を用いる方法でもラベルされたＲＮＡは合成は可能ではあるが、それは困難である。本発明では、ｐｒｅ−ＲＮＡを作製する段階は一般に取られている方法であり、標識、非標識の違いはＲＮＡの材料となるｒＮＴＰ（ｒＡＴＰ，ｒＣＴＰ，ｒＧＴＰ，ｒＵＴＰ）がラベルされているものを用いたかどうかだけの違いであり標識を容易に導入することができることが理解される。その反応において特別に別の手法（酵素を代えたりなど）は必要ないことから、本発明の方法では、ｐｒｅ−ＲＮＡの合成時にラベルされた塩基を加えて反応を行えば標識ＲＮＡの合成は可能である。従って、本発明は、通常のＲＮＡの合成のみならず、標識が導入されたＲＮＡの増幅においても従来の技術よりはるかに優れた方法を提供することになる。
本明細書において遺伝子操作について言及する場合、「ベクター」または「組み換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体などの宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。
本明細書において、ベクターのうち、クローニングに適したベクターを「クローニングベクター」という。そのようなクローニングベクターは通常、制限酵素部位を複数含むマルチプルクローニング部位を含む。そのような制限酵素部位およびマルチプルクローニング部位は、当該分野において周知であり、当業者は、目的に合わせて適宜選択して使用することができる。そのような技術は、本明細書に記載される文献（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、下記）に記載されている。
本明細書において「発現ベクター」とは、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカーおよび、エンハンサーを含み得る。生物（例えば、動物）の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
原核細胞に対する組換えベクターとしては、ｐｃＤＮＡ３（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ（＋／−）、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ｐＥＧＦＰ、ｐＨＡＴ、ｐＵＣ１８、ｐＦＴ−ＤＥＳＴＴＭ４２ＧＡＴＥＷＡＹ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などが例示される。
動物細胞に対する組換えベクターとしては、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＣＤＭ８（いずれもフナコシより市販）、ｐＡＧＥ１０７［特開平３−２２９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２−２２７８７（１９９３）］、マウス幹細胞ウイルス（Ｍｕｒｉｎｅ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｖｉｒｕｓ）（ＭＳＣＶ）に基づいたレトロウイルス型発現ベクター、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ｐＥＧＦＰなどが例示される。
植物細胞に対する組換えベクターとしては、ｐＰＣＶＩＣＥｎ４ＨＰＴ、ｐＣＧＮ１５４８、ｐＣＧＮ１５４９、ｐＢＩ２２１、ｐＢＩ１２１などが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
本明細書において、核酸分子を細胞に導入する技術は、どのような技術でもよく、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクションなどが挙げられる。 そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．およびその第三版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。
また、ベクターの導入方法としては、細胞にＤＮＡを導入する上述のような方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換など（例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）、リポフェクション法、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法が挙げられる。
本明細書において「遺伝子導入試薬」とは、核酸（通常遺伝子をコードするが、それに限定されない）の導入方法において、導入効率を促進するために用いられる試薬をいう。そのような遺伝子導入試薬としては、例えば、カチオン性高分子、カチオン性脂質、ポリアミン系試薬、ポリイミン系試薬、リン酸カルシウムなどが挙げられるがそれらに限定されない。トランスフェクションの際に利用される試薬の具体例としては、種々なソースから市販されている試薬が挙げられ、例えば、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ｃａｔ．ｎｏ．３０１４２５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ），ＴｒａｎｓＦａｓｔＴＭ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅ２４３１，Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ），ＴｆｘＴＭ−２０ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅ２３９１，Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ），ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（３０１３０５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ），ＰｏｌｙＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（３０１１０５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ），ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ２０００ Ｒｅａｇｅｎｔ（１１６６８−０１９，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＣＡ），ＪｅｔＰＥＩ（×４）ｃｏｎｃ．（１０１−３０，Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）およびＥｘＧｅｎ ５００（Ｒ０５１１，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｉｎｃ．，ＭＤ）などが挙げられるがそれらに限定されない。本発明においては、本発明の核酸分子を細胞に導入する際にこのような遺伝子導入試薬が使用され得る。
本明細書において「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生命体の全部または一部（組織など）をいう。形質転換体としては、原核生物、酵母、動物、植物、昆虫などの細胞などの生命体の全部または一部（組織など）が例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれる。本発明において用いられる細胞は、形質転換体であってもよい。
本発明において遺伝子操作などにおいて原核生物細胞が使用される場合、原核生物細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属などに属する原核生物細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１が例示される。あるいは、本発明では、天然物から分離した細胞も使用することができる。
本明細書において遺伝子増幅・操作などにおいて使用され得る動物細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ヒト白血病細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ヒト結腸癌細胞株などを挙げることができる。マウス・ミエローマ細胞としては、ｐｓ２０、ＮＳＯなど、ラット・ミエローマ細胞としてはＹＢ２／０など、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）など、ヒト白血病細胞としてはＢＡＬＬ−１など、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ヒト結腸癌細胞株としてはＨＣＴ−１５、ヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−５Ｙ、マウス神経芽細胞腫Ｎｅｕｒｏ２Ａなどが例示される。あるいは、本発明では、初代培養細胞も使用することができる。
本明細書において遺伝子操作などにおいて使用され得る植物細胞としては、カルスまたはその一部および懸濁培養細胞、ナス科、イネ科、アブラナ科、バラ科、マメ科、ウリ科、シソ科、ユリ科、アカザ科、セリ科などの植物の細胞が挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において遺伝子発現（たとえば、ｍＲＮＡ発現、ポリペプチド発現）の「検出」または「定量」は、例えば、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。アレイ（例えば、ＤＮＡアレイ、プロテインアレイ）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。ＤＮＡアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．２００２ Ｄｅｃ；３２ Ｓｕｐｐｌ：５２６−３２に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＡＣＥ法、ＳＳＣＰ法、免疫沈降法、ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステム、インビトロ翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法・中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔 羊土社（２００２）などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。
本明細書において「キット」とは、通常２つ以上の区画に分けて、提供されるべき部分（例えば、試薬、酵素、鋳型核酸、標準など）が提供されるユニットをいう。混合されて提供されるべきでなく、使用直前に混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分（例えば、試薬、酵素、ヌクレオチド、標識されたヌクレオチド、伸長反応を止めるヌクレオチドなど（およびその三リン酸）、鋳型核酸、標準など）をどのように処理すべきかを記載する説明書を備えていることが有利である。本明細書においてキットが試薬キットとして使用される場合、キットには、通常、試薬成分、緩衝液、塩濃縮液、使用するための補助手段、使用方法を記載した指示書などが含まれる。
本明細書において「指示書」は、本発明の試薬の使用方法、反応方法などを使用者に対して記載したものである。この指示書は、本発明の酵素反応などの手順を指示する文言が記載されている。この指示書は、必要に応じて本発明が実施される国の監督官庁が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、瓶に貼り付けられたフィルム、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ（ウェブサイト）、電子メール）のような形態でも提供され得る。
ＲＮＡソースは何でもよい。本発明の方法では、あらゆる配列に対して本法は実施可能であるからである。クローニング段階で用いるＲＮＡのソース（動物種）を変えるだけで、もしくはＰＣＲの段階でそれぞれの動物種のＲＮＡの配列に対応したプライマーを用いれば問題ない。実際に実施例で行われたもののうち最初の例として挙げられているアフリカツメガエルのＲＮＡ配列もデータバンクに登録されている例として実施したのであり、それに限定する趣旨ではない。従って、例えば、マウスの配列に変えればマウスのＲＮＡで行ったことと変わりない。これは、実際に後の実施例において実証され得ることからも明らかである（例えば、ｍｉｒ−１（マイクロＲＮＡの一種）の配列（実施例を参照））。このように、様々な動物種でほとんど共通な配列が保存されているのが理解される。
本明細書において特に対象とされるのは「ｍｉＲＮＡ」である。「ｍｉＲＮＡ」とは、マイクロＲＮＡとも呼ばれ、１８−２５塩基の小さなＲＮＡであり、他の遺伝子の発現を調節する機能を有すると考えられている。ｍｉＲＮＡの元になるＤＮＡ配列はｍｉＲＮＡより長く、ｍｉＲＮＡの配列と、それにほぼ相補的な逆向きの配列とを含む。このＤＮＡ配列が１本鎖ＲＮＡに転写されると、ｍｉＲＮＡ配列とその逆相補配列は相補的に結合して２本鎖になり、全体としてはヘアピンループ構造（ｔＲＮＡに似た形）をとる。これをｐｒｉｍａｒｙ ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）という。核内にあるＤｒｏｓｈａと呼ばれる酵素がこのｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ分子の一部を切断してｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ（ ｍｉＲＮＡの直接の前駆体）を作る。次いでｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ分子はＥｘｐｏｒｔｉｎ−５と呼ばれるキャリアタンパク質によって核外に輸送され、これからダイサー（Ｄｉｃｅｒ：ＲＮＡｉを参照）により２０−２５塩基のｍｉＲＮＡ配列が切り出される（植物ではｐｒｉ−ｍｉＲＮＡが直接ダイサーによって処理される）。ｍｉＲＮＡの機能は遺伝子の調節にあると思われる。ｍｉＲＮＡ は一部のｍＲＮＡ（大抵は３’側非翻訳領域）に相補的な配列を有する。このｍＲＮＡとｍｉＲＮＡとの結合により、翻訳が阻害される場合（下述のｓｔＲＮＡ）、またＲＮＡｉのようにｍＲＮＡの分解を惹き起こす場合があると考えられている。miRNAの活性は、実験的には人工合成核酸であるモルホリノアンチセンスオリゴを用いて阻害できる。miRNAの命名・分類についての指針は、以下を参照のこと：VictorAmbros, Bonnie Bartel, David P. Bartel, Christopher B. Burge, JamesC.Carrington, Xuemei Chenand, Gideon Dreyfuss, Sean R. Eddy, SamGriffiths-Jones,Mhairi Marshall, Marjori Matzke, Gary Ruvkun and Thomas Tuschl(2003) "Auniform system for microRNA annotation", RNA, 9: 277-279；およびhttp://microrna.sanger.ac.uk/sequences/index.shtml
（ｍｉＲＮＡ）
（転写）
ｍｉＲＮＡは、最初、一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）と命名された転写物の一部として発現される（Lee Y，Jeon K，Lee JT，Kim S，KimVN(2002) MiRNA maturation: stepwise processing and subcellular localization.EMBOJ 21: 4663-4670）。ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって転写されるようであり、５’キャップと３’ポリ（Ａ）テールを含む（SmalheiserNR.(2003) EST analyses predict the existence of a population of chimeric microRNAprecursor-mRNA transcripts expressed in normal human and mouse tissues. GenomeBiol 4(7): 403. Epub；Cai X，Hagedorn CH，Cullen BR. (2004) Human microRNAs areprocessed from capped，polyadenylated transcripts that can also function asmRNAs. RNA. Nov 3 [Epub ahead of print])。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ転写物のｍｉ部分は、ｄｓＲＮＡ特異的なヌクレアーゼ開裂のシグナルを有するヘアピンを形成するようである。
（２ 核でのヘアピン遊離）
ｄｓＲＮＡ特異的なリボヌクレアーゼＤｒｏｓｈａは、ヌクレアーゼ中のｐｒｉ−ｍｉＲＮＡを消化してヘアピン前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）を遊離する（LeeY，AhnC，Han J，Choi H，Kim J，Yim J，Lee J，Provost P，Radmark O，Kim S，Kim VN (2003)Thenuclear RNase III Drosha initiates miRNA processing. Nature 425: 415-419）。Ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、１〜４ヌクレオチド（ｎｔ）の３’オーバーハング（突出）、約２５−３０ｂｐのステム、および比較的小さなループを含むおよそ７０ヌクレオチドのＲＮＡであるといわれている。Ｄｒｏｓｈａはまた、成熟型（ｍａｔｕｒｅ）ｍｉＲＮＡの５’末端または３’末端のいずれかを生成する。これは、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのどの鎖がＲＩＳＣによって選択されるかによる（LeeY，AhnC，Han J，Choi H，Kim J，Yim J，Lee J，Provost P，Radmark O，Kim S，Kim VN (2003)Thenuclear RNase III Drosha initiates miRNA processing. Nature 425: 415-419；YiR，QinY，Macara IG，Cullen BR (2003) Exportin-5 mediates the nuclear exportofpre-microRNAs and short hairpin RNAs. Genes Dev 17: 3011-3016）。
（細胞質への輸送）
エクスポルティン−５（Exportin-5）(Exp5)は、核から細胞質へのｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの輸送を担うようである。Ｅｘｐ５は、正確にプロセッシングされたｐｒｅ−ｍｉＲＮＡに直接かつ特異的に結合することが示されている。ｍｉＲＮＡ生合成には、核および細胞質のプロセシングステップの調整が必要だとされる(LundE，Guttinger S，Calado A，Dahlberg JE，Kutay U. (2003) Nuclear Export of Micro RNAPrecursors. Science. 2003 Nov 20 [Epub ahead of print]；Yi R，Qin Y，Macara IG，CullenBR(2003) Exportin-5 mediates the nuclear export of pre-microRNAs and shorthairpin RNAs. Genes Dev 17: 3011-3016)。
（ダイサープロセッシング）
ダイサーは、二座配位子のヌクレアーゼのＲＮａｓｅ ＩＩＩスーパーファミリーのメンバーであって、線虫、昆虫および植物におけるＲＮＡ干渉における役割が示唆されている。一旦細胞質に存在すると、ダイサーは、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを、Ｄｒｏｓｈａの切断部位からおよそ１９ｂｐ分で切断する（LeeY，AhnC，Han J，Choi H，Kim J，Yim J，Lee J，Provost P，Radmark O，Kim S，Kim VN (2003)Thenuclear RNase III Drosha initiates miRNA processing. Nature 425: 415-419；YiR，QinY，Macara IG，Cullen BR (2003) Exportin-5 mediates the nuclear export ofpre-microRNAs and short hairpin RNAs. Genes Dev 17: 3011-3016)。得られた二本鎖ＲＮＡは、１４ヌクレオチドの３’オーバーハングを何れかの端に有する(LundE，GuttingerS，Calado A，Dahlberg JE，Kutay U. (2003) Nuclear Export of Micro RNA Precursors.Science. 2003 Nov 20 [Epub ahead of print])。一旦二本鎖のうちの一つがｍａｔｕｒｅ ｍｉＲＮＡになると、いくつかのｍａｔｕｒｅ ｍｉＲＮＡは、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ転写物のリーディング鎖から誘導され、そして他方のｍｉＲＮＡとともにラギング鎖がｍａｔｕｒｅ ｍｉＲＮＡとなる。
（ＲＩＳＣによる鎖選択）
標的ｍＲＮＡの翻訳をコントロールするために、ダイサーによって生成した二本鎖ＲＮＡの鎖を分離せねばならない。そして、一本鎖のｍａｔｕｒｅ ｍｉＲＮＡは、ＲＩＳＣと会合せねばならない（HutvagnerG，Zamore PD (2002) A miRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex.Science297，2056-2060)。ｄｓＲＮＡからの活性化鎖の選択は、ｄｓＲＮＡの二つの端部の末端基の安定性におもに依存するようである(SchwarzDS，Hutvagner G，Du T，Xu Z，Aronin N，Zamore PD. (2003) Asymmetry in the assemblyof the RNAi enzyme complex. Cell 115(2): 199-208；Khvorova A，Reynolds A，JayasenaSD. (2003)Functional siRNAs and miRNAs exhibit strand bias. Cell 115(2):209-16)。二本鎖の５’末端の２−４ヌクレオチドの低い安定性の塩基対合をともなう鎖は、優先的にＲＩＳＣと会合することにより、活性型ｍｉＲＮＡとなる(SchwarzDS，Hutvagner G，Du T，Xu Z，Aronin N，Zamore PD. (2003) Asymmetry in the assemblyof the RNAi enzyme complex. Cell 115(2): 199-2083)。
本明細書において核酸の「少なくとも一方の先端」とは、その核酸の３’末端または５’末端の少なくとも一方を意味する。
本明細書において「核酸合成酵素」とは、核酸を合成する能力を有する任意の酵素をいう。本明細書では、ポリメラーゼともいう。ヌクレオチドを縮合させてポリヌクレオチドにする反応を触媒する酵素の総称である。このような核酸合成酵素としては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）、ＲＮＡポリメラーゼ、などを挙げることができるがそれらに限定されない。
ポリメラーゼとしては、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼなどを挙げることができる。また、どちらのポリメラーゼでも、検出するのはＤＮＡ，ＲＮＡを問わないことが理解される。鋳型がどちらか（あるいは両方か）という違いだけである。（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡも鋳型にする。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとして売られているものの中にも、ＲＮＡ依存性活性も持つものが有る）。このようなポリメラーゼとしては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ由来のＤＮＡポリメラーゼI、ＤＮＡポリメラーゼIクレノウフラグメント、Ｔａｑポリメラーゼ、ＫＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼなどを挙げることができるがそれらに限定されない。
本明細書において「伸長反応」とは、核酸について言及するとき、その核酸が少なくとも１ヌクレオチド伸びるような任意の反応をいう。ポリメラーゼを用いた伸長反応を行う場合、通常、鋳型に基づいてヌクレオチドが導入されることから、特定の配列が標識対象核酸などの伸長すべき核酸において伸長することになる。
伸長反応は、（ｉ）標的核酸およびその相補鎖と核酸プライマーおよび核酸 プローブとのハイブリダイゼーション（アニーリング）反応と、（ii）核酸合成酵素によるプライマー鎖の伸長反応及びプローブの分解反応からなりこれら反応（ｉ）および（ii）は、例えばトリス塩酸緩衝液等の適当な緩衝液を含む水溶液中で実施することができる。このハイブリダイゼーション反応は、代表的には、５５〜７５℃で実施することができるがそれに限定されない。酵素反応は、代表的には、３７℃で実施することができるがそれに限定されない。
プライマー伸長産物の変性は、上記伸長反応で得られるプライマー鎖伸長産物を含む溶液を、例えば９４〜９５℃で０．５〜１分間加熱処理するなどを行うことによって実施することができる。
標的核酸の増幅は、例えば、その標的核酸（標識対象核酸）が所望の量になるまで、工程上記伸長反応および変性を上記と同様の条件下で複数回繰り返せばよい。上記工程をｎ回行えば、理論的には標的核酸量は当初の２ｎ−１倍にまで増幅されることとなる。
このような伸長反応は、市販のＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）のための装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから販売されている）を用いれば、簡便かつ効率的に実施することができる。
混合物からの核酸の取り出しは、当該分野において任意の方法を用いて行うことができる。そのような取り出しとしては、例えば、電気泳動、クロマトグラフィー、変性、アルコール沈澱、アフィニティー精製、抗体などを用いることができるがそれらに限定されない。
本発明の方法において用いられる核酸の提供工程は、当該分野において周知の任意の技法（例えば、化学合成、遺伝子工学の利用、生体からの抽出）を利用して行うことができる。
本発明の方法において用いられる核酸複合体の生成は、当該分野において周知の任意の技法を用いて行うことができる。例えば、本明細書において別の場所において説明したような通常使用されるハイブリダイゼーションの条件を適宜選択することによって、複合体生成を行うことができることが理解される。
本発明の方法において用いられる伸長反応は、当該分野において周知の任意の技法を用いて行うことができる。伸長反応には、伸長反応の触媒（例えば、核酸合成酵素）、触媒が反応することができる条件を提供する物質（例えば、緩衝液など）、伸長の際に入るべきヌクレオチド（標識、非標識など）を考慮することができる。また、反応条件をコントロールするために、温度などを調節する装置（例えば、恒温槽）を使用しても良い。
伸長反応の後、混合物から標識が導入された核酸を取り出す工程もまた、当該分野において周知の任意の技法を用いて行うことができる。そのような取り出す工程は、核酸を精製または分離するために通常使用される技術であれば、どのようなものであっても使用することができる。
本発明の方法において、標的核酸に対応する伸長産物が存在するか検出する工程では、検出は、当該分野において周知の任意の技法を用いて、標識を直接または間接的に任意の方法で実施することができることが理解される。ここで、伸長産物の存在は、上記標的核酸の存在の指標であることが理解される。伸長産物は、伸長される前の未知核酸が存在しない限り、検出されないからである。ただし、伸長される前の未知核酸は、複数種類存在することが考えられることから、伸長産物の配列を決定することによって、より詳細な検出をすることができる。そのような伸長産物の配列決定は、当該分野において公知の任意の技法を用いて行うことができる。
ハイブリダイズされるべき核酸分子同士の相補性は、伸長反応が進捗するに十分である程度であることが好ましい。そのような相補性の程度は、長さ、伸長反応条件などによって異なり、また、３’末端付近が伸長反応に適していることが好ましい。特に、３’末端の１〜２ヌクレオチドは、完全な相補性を有していることが好ましくあり得る。あるいは、短い方の核酸を基準として、通常、少なくとも５０％の相同性を有していることが好ましく、より好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％の相同性を有していることがさらに好ましくあり得る。あるいは、標識対象核酸全部と相補的であってもよい。
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔ ＥＳａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ ａｎｎｕａｌ ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
本明細書において核酸の存在を確認するには、放射能法、蛍光法、ノーザンブロット法、ドットブロット法、ＰＣＲ法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価され得る。
（スクリーニング）
本明細書において「スクリーニング」とは、目的とするある特定の性質をもつ生物または物質などの標的を、特定の操作／評価方法で多数を含む集団の中から選抜することをいう。スクリーニングのために、本発明の方法または核酸構築物を使用することができる。本発明では、任意の核酸（ＲＮＡ）構築物を自在に作製することができることから、本発明はスクリーニングにおいても顕著な効果を発揮する。
（遺伝子治療）
本発明の用途としては、自在に作製された核酸分子を修飾して細胞に遺伝子治療を施す遺伝子を組込むことが挙げられる。
遺伝子治療に使用することが可能な遺伝子配列は公知のデーターベース、例えばＧｅｎＢａｎｋ、ＤＤＢＪ、ＥＭＢＬ等において検索し、入手できる。
さらに、本発明は、ライブラリーで作業するまたはそれをスクリーニングするための工程の一部として、配列の機能を評価するため、またはタンパク質発現をスクリーニングするため、または特定の細胞タイプに対する特定のタンパク質または特定の発現制御領域に対する効果を評価するために利用することができる。
（ｍｉＲＮＡのクローニング法）
以下に具体的に、まず従来のｍｉＲＮＡのクローニング法について述べる。なお、ｍｉＲＮＡのクローニング法については、ｓｍａｒｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌとＮｅｌｓｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌがあるが、ｍｉＲＮＡのクローニング法としてＮｅｌｓｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌをここでは説明する。すなわち、Ｎｅｌｓｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌによれば、産物はＲＮＡ リガーゼ（ｌｉｇａｓｅ）を用いることによって、以下に示すように、５’，３’の両端にリンカー核酸配列を有したＤＮＡ／ＲＮＡ／ＤＮＡのキメラ構造を取っている。以後、本明細書においてこの節では、大文字でＤＮＡを、また小文字でＲＮＡを表すものとする。
（RNA リガーゼ反応）
5’側 Nelson リンカー核酸: 5’-ATCGT-aggcaccugaaa-3’（配列番号９）
3’側 miRNA cloningリンカー核酸: 5rApp/CTGTAGGCACCATCAAT/3ddC（配列番号１０）
注：miRNA cloningリンカー核酸は、IDT社の市販品を用いた。
RNA リガーゼ反応を3’、5’の順序で行うことにより、DNA（下線）-RNA（二重下線）-miRNA-DNA（下線）というキメラ構造を持つ産物が得られる。
キメラ構造
ATCGT-aggcacugaaa-miRNA-CTGTAGGCACCATCAATC（配列番号１１）
DNA RNA DNA
ここで、5rAppはATP非存在下でのRNA リガーゼ反応に必要であり、ddCはセルフライゲーションを防ぐのに必要である。次にリンカー核酸部位でprimerを作製し、RT-PCRを行って、得られたPCR産物のリンカー核酸配列内のBanIsite（GGCACC）（図のキメラ構造中の網掛け部分）を用いてクローニングする。リンカー核酸部位の配列を含有するプライマーを用いてRT、そしてPCRを行うがBanI部位でクローニングしていない。クローニングに必要な制限酵素部位はPCR時点で使用するプライマーの5‘末端に追加させる。
本発明では、このクローニング方法を改良した上で、新たに任意のmature RNA（例えば、miRNA）を効率良く作成できる新手法を開発した。なお、本手法は、miRNAだけでなく、塩基数が約70-90のtRNAなど他の低分子量RNAおよび低分子量でないRNAにも適用できる。最近の研究によれば、ミトコンドリアのtRNAもmiRNAと同様に、転写や翻訳の調節の関わる可能性も示唆されてきている。したがって、本発明はmiRNAだけでなくtRNAなども網羅する発明なので、任意の低分子量RNAのみならず、ｍＲＮＡなどＲＮＡ一般に原理的には利用可能である。
（好ましい実施形態）
以下に本発明の最良の形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
（成熟型ＲＮＡ）
１つの局面において、本発明は、単離された成熟型ＲＮＡを提供する。成熟型RNAを単離した形で生産することはこれまで実質的に不可能であった。本発明が提供する方法によって、いかなる成熟型RNA（特にmiRNAなどの低分子量RNA）を生産することができるようになったことによってこの課題は解決された。
別の局面では、本発明は、合成された成熟型RNAを提供する。合成により成熟型RNAを生産することは事実上困難であったことから、本発明は従来存在しない物を提供するという画期的な発明である。
特に、本発明の成熟型RNAは、目的の配列のみからなることが特徴である。
（所望の配列を有する成熟型ＲＮＡを生産する方法）
別の局面において、本発明は、所望の配列を有する成熟型ＲＮＡを生産する方法を提供する。この方法は、
Ａ）該所望の配列を有する鋳型核酸にリンカー核酸を結合させてリンカー核酸結合鋳型核酸を生産するライゲーション工程；
Ｂ）該リンカー核酸結合鋳型核酸に基づいて核酸増幅鋳型を生産する核酸増幅鋳型生産工程；
Ｃ）該核酸増幅鋳型に対して核酸増幅反応を行って増幅産物を生産する増幅工程；
Ｄ）該増幅産物に対してＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡ産物を生産するＲＮＡ増幅工程；および
Ｅ）該ＲＮＡ産物から所望でないＲＮＡ配列を除去し、それにより成熟型ＲＮＡを生産する調整工程を包含する。
以下に各工程を説明する。
所望の配列を有する鋳型核酸にリンカー核酸を結合させてリンカー核酸結合鋳型核酸を生産するライゲーション工程は、材料となる鋳型核酸とリンカー核酸とが結合される様式であれば、どのような様式であってもよい。
本発明の方法において使用される鋳型核酸（クローニング開始時）は、通常、ＲＮＡである。増幅を試みるための対象として例えば、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡなどを挙げることができるがそれに限定されない。本発明の方法は、ｍＲＮＡ以外のＲＮＡでも任意の合成できることが特徴であり、その意味で対象となる鋳型核酸には制限はない。所望の配列を有している限り他の核酸（ＤＮＡ，ＰＮＡなど）であっても良いことが理解される。ただし、好ましくはこれらの鋳型核酸は一本鎖であることが有利である。そのような場合は、他の核酸に適した増幅系、転写系を使用することができ、これらは当業者が適宜選択することができる。
本発明の方法において使用されるリンカー核酸は、通常ＤＮＡを含み、RNA、DNA-RNAハイブリッドであってもよい。通常ＤＮＡからなる。具体的な配列設計においては、クローニングの便宜を考慮する。従って、使用が予定される制限酵素部位を用いることが好ましい。あるいは、便宜的にマルチクローニング部位を用いることができる。そのようなマルチクローニング部位は当該分野において周知であり、特に特定のものには限定されない。
本発明の方法のライゲーション工程において、連結は、通常リガーゼによって媒介される。このリガーゼは、核酸分子の連結を意図するものであれば何でもよく、好ましくは、ＤＮＡとＲＮＡとの連結を媒介する能力も有するリガーゼがよい。本明細書では、ＲＮＡのほかにＤＮＡも通常使用されることから、その両方を認識して連結することができるリガーゼが好ましいからである。そのようなリガーゼとしては、例えば、Ｔ４ リガーゼなどを挙げることができるがそれに限定されない。
１つの実施形態では、リンカー核酸は、二つ提供される。これは、鋳型核酸の両端に結合させるためである。リンカーは、ＤＮＡまたはＲＮＡあるいはそれらの混合物（キメラを含む）であり得る。リンカー核酸は、例えば、５’側としては、ＮｅｌｓｏｎリンカーなどのｍｉＲＮＡへのリンカー結合に使用されるような任意のリンカーが用いられ得る。Ｎｅｌｓｏｎリンカーは、５’側にＤＮＡが結合し、３’側にはＲＮＡが結合したキメラ構造を示す。本発明において用いられる３’側のリンカーとしては、ｍｉＲＮＡクローニングリンカーなどのリンカーを用いることができる。例えば、そのようなｍｉＲＮＡクローニングリンカーは、末端にリン酸（好ましくはｒＡｐｐリボアデノシルジホスフェート）が結合していることが好ましい。リン酸基が結合することによって、リガーゼが酵素反応に必要とするＡＴＰが不要となり、反応が容易になるからであるが、これに限定されるわけではない。ｒＡｐｐは、５’末端に付加されていることが好ましい。３'側のリンカーはまた、他方の末端がリガーゼ反応を阻害するような基（例えば、ｄｄＣのようなジデオキシヌクレオチド）が結合されていることが好ましい。従って、この実施形態では、リンカーが二つ提供され、リンカー核酸が第１のリンカー核酸および第２のリンカー核酸の二つ提供され、そのうちの第１のリンカー核酸の一方の末端にリン酸が付加され、該第１のリンカー核酸の他方の末端がライゲーションを妨害する基で改変されており、第２のリンカー核酸は少なくとも３’側がＲＮＡであり、好ましくは、５’側がＤＮＡであり３’側がＲＮＡである。これにより、自己環化を防ぐことができるからである。上述のような好ましい実施形態では、ＡＴＰ非存在下で反応が行われるので、ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）同士の結合は起こらなくなるので効率よいＲＮＡ合成が期待できる。また、リンカーの３’側をリガーゼ反応が進まないような基（ライゲーション妨害基）で修飾することにより、リンカー同士の結合も防ぐことができるので好ましいがそれに限定されない。ここで、ライゲーション妨害基は、ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＣ、ｄｄＴ、ｄｄＡ、ｄｄＧなど）等であり得る。RNAリガーゼを用いていることから、RNA-RNAの結合を優先に考える。したがってプライマーの3‘末端側がRNAであれば好ましいということになる。ということで５’末端がDNAである必要は無く、RNAのみからなるリンカーでも可能である。また３‘末端がDNAである場合でもRNA-RNAの結合よりはかなり劣るが、RNAリガーゼはDNA-RNA結合も可能であるので5-DNA、3-RNAという限定ではない。
１つの実施形態では、本発明で用いられるリンカー核酸が二つ提供され、そのうちの第１のリンカー核酸の一方の末端にリン酸が付加され、該第１のリンカー核酸の他方の末端がライゲーションを妨害する基で改変されていることを特徴とする。
１つの実施形態では、本発明の方法におけるライゲーション反応において、前記第２のリンカー核酸と前記鋳型核酸との連結をまず行って第１連結産物を得、次に前記第１のリンカー核酸と該第１連結産物との連結を行うことを特徴とする。
１つの実施形態では、ライゲーションは、ｓｍａｒｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌまたはＮｅｌｓｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌにて行われる。ｓｍａｒｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌおよびＮｅｌｓｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌは、本明細書において記載されている。
以下に、リンカー核酸結合鋳型核酸に基づいて核酸増幅鋳型を生産する核酸増幅鋳型生産工程（Ｂ工程）を説明する。
１つの実施形態では、鋳型核酸はＲＮＡである。鋳型核酸は、通常、標的となるので、実験の対象となるｍｉＲＮＡなどを挙げることができる。しかし、最終産物がＲＮＡであればよく、そのＲＮＡが目的の配列のみからなることを目的としていることから、鋳型核酸は必ずしもＲＮＡである必要は無いことに留意すべきである。
１つの実施形態では、鋳型核酸がＲＮＡである場合、転写反応は逆転写反応であり、核酸増幅鋳型はＤＮＡである。このような逆転写反応はどのような反応であっても利用することができることが理解される。
１つの実施形態では、リンカー核酸結合鋳型核酸がＲＮＡとＤＮＡとのキメラ核酸である。上述のように５’側がＤＮＡ−ＲＮＡのキメラを用い、３’側がＤＮＡを用いる場合、鋳型核酸がＲＮＡであれば、ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡの構造をとるリンカー核酸結合鋳型核酸が使用されることになる。
別の実施形態では、リンカー核酸結合鋳型核酸がＲＮＡとＤＮＡとのキメラ核酸であり、前記転写反応が逆転写反応であり、この逆転写反応において用いられる少なくとも１つのプライマーがリンカー核酸結合鋳型核酸のリンカー核酸部分に相補的な配列を含み得る。マルチクローニング部位はパリンドローム構造を取りやすいのでリンカーでは使用しないことが好ましい。
以下に核酸増幅鋳型に対して核酸増幅反応を行って増幅産物を生産する増幅工程を説明する。
本明細書において使用され得る核酸増幅反応は、核酸が増幅され得る限りどのようなものであっても良いことが理解される。そのような核酸増幅反応としては、例えば、ＰＣＲ、ＬＣＲ、ｇａｐ ＬＣＲ、ＳＤＡ、Ｑβレプリカーゼ増幅、ＴＡＳ、３ＳＲ、ＮＡＳＢＡＴＭＡ、ＩＣＡＮおよびＬＡＭＰ等を挙げることができる。
好ましくは、核酸増幅反応としてはポリメラーゼ連鎖反応が使用される。
１つの好ましい実施形態では、核酸増幅反応において、プロモーター配列を含むプライマーが用いられる。このプロモーター配列は、ＲＮＡ増幅反応において用いられるＲＮＡポリメラーゼが認識できる配列であることが好ましい。これにより、最終のＲＮＡ増幅反応において、特定されたＲＮＡ産物を生産することができるからである。従って、例えば、Ｔ７リガーゼが認識するプロモーターであれば、Ｔ７プロモーターの配列は、例えば、TAATACGACTCACTATAGG（配列番号１２）等を挙げることができる。好ましくは、核酸増幅反応において使用される５’側のプライマーにプロモーター配列が含まれることが有利である。
１つの好ましい実施形態では、核酸増幅反応において使用されるプライマーは、制限酵素部位の配列を含む。より好ましくは、核酸増幅反応において使用されるプライマーは、制限酵素部位の配列を含み、５’側のプライマーにプロモーター配列が含まれる。１つの別の実施形態では、核酸増幅反応において使用されるプライマーが、リンカー核酸の配列またはその相補配列あるいはその一部を含む。
より好ましい実施形態では、核酸増幅反応において使用されるプライマーが、リンカー核酸の配列またはその相補配列あるいはその一部を含み、該プライマーが、制限酵素部位の配列を含み、５’側のプライマーにプロモーター配列が含まれる。
必須ではないが、通常は、上記増幅工程の後に、上記増幅産物をベクターにクローニングし、さらに大量に目的となる産物を増やしても良い。このようなクローニングシステムについては、当該分野において公知の任意の手法を使用することができることが理解される。このクローニングベクターは、上記プロモーター配列（すなわち、ＲＮＡ増幅工程において使用されるＲＮＡポリメラーゼが認識するプロモーター配列）と実質的に相同の配列を含まないことが好ましい。
以下に増幅産物に対してＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡ産物を生産するＲＮＡ増幅工程（Ｄ）を説明する。
１つの実施形態において、ＲＮＡ増幅工程において用いられる（鋳型となる）増幅産物は通常ＤＮＡであり、ＲＮＡポリメラーゼは通常、ＤＮＡ依存性である。
好ましい実施形態では、使用されるＲＮＡポリメラーゼは、前記プロモーター配列を認識するＲＮＡポリメラーゼであることが有利である。ＲＮＡポリメラーゼとそれが認識するプロモーターの配列の組み合わせは周知である。その組み合わせとしては、以下
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ Ｔ７プロモーター（TAATACGACTCACTATAGGG
（配列番号１３））
ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ ＳＰ６プロモーター（A TTTAGGTGAC ACTATAGA（配列番号１４））
Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ Ｔ３プロモーター（AATTAACCCTCACTAAAGG（配列番号１５））
等を挙げることができる。
核酸増幅反応において、使用されるプライマーが、リンカー核酸の配列またはその相補配列あるいはその一部を含み、プライマーが、制限酵素部位の配列を含み、５’側のプライマーにプロモーター配列が含まれ
Ｃ）増幅工程の後に、増幅産物を、ベクターにクローニングする工程をさらに包含し、該ベクターは、プロモーター配列を含まず、ＲＮＡポリメラーゼが該プロモーター配列を認識し、かつ、３’側のプライマーの制限酵素部位を切断する制限酵素で消化して該ＲＮＡポリメラーゼの鋳型として該ＲＮＡポリメラーゼによる増幅を行うことを特徴としてもよい。
１つの実施形態では、好ましくは、本発明の方法は、ＲＮＡ増幅工程の後にＤＮＡを除去する工程をさらに包含する。ＤＮＡの除去は、例えば、ＤＮａｓｅにより達成される。ここでは、ＤＮａｓｅは、ＲＮＡを分解する活性を実質的に有しない物を用いることが好ましい。生産されたＲＮＡが破壊されることを防ぐためである。ＲＮＡ増幅工程では、通常プライマーとしてＤＮＡが用いられることから、そのようなプライマーを除去することにより、目的の配列からなるＲＮＡを生産することに資するからである。
１つの実施形態では、ＲＮＡ増幅工程において、存在するＲＮＡ分子の量よりも多くのプライマーが用いられる。ここで使用されるプライマーは、好ましくは存在するＲＮＡ分子の量の少なくとも２倍量、少なくとも３倍量、少なくとも４倍量、少なくとも５倍量などのプライマーが使用されるがそれに限定されない。
１つの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、オーバーハングを生じさせないＲＮＡポリメラーゼであるが、これに限定されない。オーバーハング（例えば、ｕｕなど）を生じさせるＲＮＡポリメラーゼを使用した場合は、その後に、そのような短いヌクレオチドを除去（例えば、サイズなどによる除去）を行うことによって、目的の配列のみからなるＲＮＡを生産することができる。
以下にＲＮＡ産物から所望でないＲＮＡ配列を除去し、それにより成熟型ＲＮＡを生産する調整工程（Ｅ）を説明する。
１つの実施形態では、所望でないＲＮＡ配列の除去は、リンカー核酸結合鋳型核酸の配列のうち、所望の配列以外の配列と相補的な除去用プライマーをＲＮＡ産物とハイブリダイズさせてハイブリダイズ産物を生成し、そのハイブリダイズ産物に対してＤＮＡと結合している一本鎖ＲＮＡのみを選択的に分解する手段を用いて分解させて、所望の配列のみを含むＲＮＡを生産することを包含する。このような方法は、従来の技術では、想定すらされていなかった。しかも、このような方法を用いれば、所望の配列を有する任意のＲＮＡを生産することができることが理解される。
１つの実施形態において、除去用プライマーは、前記所望の配列からなるＲＮＡに直接連結されている配列に対して相補的な配列を少なくとも１つ含み、該相補的な配列は、前記ＲＮＡ産物とのハイブリダイズ形成に充分な長さを含むことが好ましい。このような方法は、従来の技術では、想定すらされていなかった。しかも、このような方法を用いれば、所望の配列を有する任意のＲＮＡを生産することができることが理解される。なお、ハイブリダイズ形成に充分な長さは、ハイブリダイズの条件を設定することによって任意に変更することができることが理解される。ハイブリダイズの条件は、本明細書に記載されている条件を考慮するかまたは周知の文献に記載されているものを参照することができる。全長であれば、確実に相補性が担保される。実質的に全長といえる長さであっても良い。ハイブリダイズ可能であれば、変異が入っていても良い。少なくとも所望の配列からなるＲＮＡに直接連結されるＲＮＡがＤＮＡと結合していればよい。
従って、１つの実施形態において、所望でないＲＮＡ配列の除去は、ＤＮＡと結合している一本鎖ＲＮＡのみを選択的に分解することによって達成することが好ましい。具体的な実施形態では、このような所望でないＲＮＡ配列の選択的な除去は、ＲＮａｓｅ Ｈにより達成される。
本発明の方法は、最終工程において、ＲＮＡを実質的に分解しないＤＮＡ分解手段によりＤＮＡを分解する工程をさらに包含することが好ましい。ＲＮａｓｅなどによって遊離したＤＮＡが不純物として残っており、これらを除去することが好ましいからであるがこの工程は必須というわけではない。
さらに、本発明は、ＲＮＡポリメラーゼによって生じたオーバーハングを除去する工程を包含してもよい。
１つの実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼによって生じたオーバーハングを除去する工程は、電気泳動を行うことを包含する。電気泳動によって、サイズ分画が可能となり、通常の所望の配列からなるＲＮＡであれば、非常に小さなオーバーハングと分離することができるからである。このような電気泳動によって分離されたＲＮＡは、その後当該分野において周知の技法を用いることによって精製することができることに留意すべきである。
１つの実施形態では、本願が対象とする成熟型ＲＮＡは、低分子量ＲＮＡである。このような低分子量ＲＮＡは、通常１００ヌクレオチド長以下のものであり、例えば、６０ヌクレオチド長以下などのものを挙げることができるがそれらに限定されない。低分子量ＲＮＡの代表例としては、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡなどを挙げることができる。従来ｍｉＲＮＡを効率よく合成できる方法は知られていなかったことから、本発明は、microRNAなど立体構造などまでが重要な場合のRNAの合成（修飾）を初めて達成したという点において顕著な効果を示すべきと考えられる。
（所望の配列を有する成熟型ＲＮＡを生産するためのキット）
１つの局面において、本発明は、所望の配列を有する成熟型ＲＮＡを生産するためのキットを提供する。このキットは、所望の配列を有する成熟型ＲＮＡを生産するために必要な構成要素を備える。そのような構成要素としては、例えば、Ａ１）該所望の配列を有する鋳型核酸に連結させるためのリンカー核酸；Ａ２）該リンカー核酸を該鋳型核酸に結合させる結合手段；Ｂ）該鋳型核酸と該リンカー核酸とが連結したリンカー核酸結合鋳型核酸に対して転写反応を生じさせる転写手段；Ｃ）該転写反応によって生じる核酸増幅鋳型に対して核酸増幅反応を生じさせる核酸増幅手段；Ｄ）該核酸増幅反応によって増幅された産物を鋳型としてＲＮＡを生産する手段；およびＥ）所望でないＲＮＡ配列を除去するＲＮＡ配列除去手段を挙げることができる。これらのすべてを備えていてもよく、ばら売りで別々の組み合わせまたは一つの構成要素がキットとして含まれていても良い。
Ａ１）所望の配列を有する鋳型核酸に連結させるためのリンカー核酸の形態を説明する。リンカー核酸は、鋳型核酸に結合する能力を有せば、どのような形の核酸であってもよいことが理解される。
使用されるリンカー核酸は、本発明のキットにおいても本明細書上記（所望の配列を有する成熟型ＲＮＡを生産する方法）において記載されるような任意の実施形態を使用することができることが理解される。
１つの具体的な実施形態において、本発明において使用されるリンカー核酸は、実施例に記載されるような配列が挙げられるがこれに限定されず、任意の配列が使用されることが理解される。
Ａ２）リンカー核酸を鋳型核酸に結合させる結合手段を説明する。本発明では、リンカー核酸と鋳型核酸とを結合させることができる限り任意の手段を用いることができることが理解される。例えば、酵素が代表的な手段である。そのような酵素としては、ＲＮＡリガーゼなどのリガーゼを挙げることができる。このようなＲＮＡリガーゼとしては、ＤＮＡとＲＮＡとの連結を媒介する能力も有するリガーゼであることが好ましい。本発明で使用される核酸はＤＮＡとＲＮＡとを通常包含するからである。そのようなＲＮＡリガーゼの具体的な例としては、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼなどを挙げることができることが理解される。使用され得るリンカー核酸を鋳型核酸に結合させる結合手段としては、本発明のキットにおいても本明細書上記（所望の配列を有する成熟型ＲＮＡを生産する方法）において記載されるような任意の実施形態を使用することができることが理解される。
次に、Ｂ）該鋳型核酸と該リンカー核酸とが連結したリンカー核酸結合鋳型核酸に対して転写反応を生じさせる転写手段を説明する。本発明では、リンカー核酸結合鋳型核酸に対して転写反応を生じさせることができる限り、任意の手段を用いることができることが理解される。使用される転写手段としては、本発明のキットにおいても本明細書上記（所望の配列を有する成熟型ＲＮＡを生産する方法）において記載されるような任意の実施形態を使用することができることが理解される。
次に、Ｃ）該転写反応によって生じる核酸増幅鋳型に対して核酸増幅反応を生じさせる核酸増幅手段を説明する。本発明では、転写反応によって生じる核酸増幅鋳型に対して核酸増幅反応を生じさせることができる限り、任意の手段を用いることができることが理解される。使用される増幅手段としては、本発明のキットにおいても本明細書上記（所望の配列を有する成熟型ＲＮＡを生産する方法）において記載されるような任意の実施形態を使用することができることが理解される。
具体的な実施形態では、核酸増幅手段は、ＤＮＡポリメラーゼとプライマーセットとを含み得る。ここで、好ましい実施形態では、核酸増幅手段中で使用されるプライマーセット（核酸増幅プライマー（セット）ともいう）は、前記リンカー核酸連結鋳型核酸の一部と同一の配列および相補的な配列をそれぞれ含む。より好ましい実施形態では、核酸増幅手段中で使用されるプライマーセットのうち少なくとも１つがプロモーター配列を含む。
１つの好ましい実施形態では、核酸増幅手段中で使用されるプライマーセットの両方が制限部位を含む。さらに好ましくは、プライマーセットのうち少なくとも１つがプロモーター配列を含み、プライマーセットの両方が制限部位を含む。
具体的なプライマーセットの配列は、以下の通りである。
5’- ccccaagcttTAATACGACTCACTATAGGGATCGTaggcacctgaaa（配列番号１６）
5’- ccccgaattcTAATACGACTCACTATAGGGATCGTaggcacctgaaa（配列番号１７）
3’- aaaaaagcggccgcGATTGATGGTGCCTACAG（配列番号１８）。
１つの実施形態において、本発明のキットは、上記に加え、Ｃ−２）増幅産物をクローニングするためのベクター、さらに備えていても良い。このようなベクターは、目的とする配列と使用する宿主において使用することができる限り、本明細書において記載されるように任意の公知のベクターであり得る。このベクターは、キットにおいて使用するＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーター配列を含まないことが有利である。ＲＮＡポリメラーゼによる最終増幅において所望されない配列が増幅されるのを防御するからである。
１つの実施形態では、本発明のキットは、Ｃ−３）前記増幅産物に含まれる制限部位を認識し切断する制限酵素をさらに含んでいても良い。
次に、Ｄ）該核酸増幅反応によって増幅された産物を鋳型としてＲＮＡを生産するＲＮＡ生産手段を説明する。本発明では、核酸増幅反応によって増幅された産物を鋳型としてＲＮＡを生産することができる限り、任意の手段を用いることができることが理解される。使用されるＲＮＡ生産手段としては、本発明のキットにおいても本明細書上記（所望の配列を有する成熟型ＲＮＡを生産する方法）において記載されるような任意の実施形態を使用することができることが理解される。
さらに好ましい実施形態では、本発明のキットは、Ｄ−１）ＲＮａｓｅ活性のないＤＮａｓｅをさらに備えることが有利である。余分なＤＮＡを除去することができるからである。このようなＲＮａｓｅ活性のないＤＮａｓｅは、鋳型となった増幅産物であるＤＮＡを除去するために用いられる。
さらに好ましい実施形態では、本発明のキットは、Ｄ−２）生産されたＲＮＡを精製するための精製手段をさらに備えていてもよい。このような精製手段を用いることによって、所望の配列のみからなるＲＮＡのみを単離することができる。
１つの実施形態としては、精製手段としては、任意の手段を用いることができるが、例えば、フェノール／クロロホルム抽出手段およびエタノール沈澱手段であってもよいがこれに限定されない。
次に、Ｅ）所望でないＲＮＡ配列を除去する除去手段を説明する。本発明では、所望でないＲＮＡ配列を除去することができる限り、任意の手段を用いることができることが理解される。使用される除去手段としては、本発明のキットにおいても本明細書上記（所望の配列を有する成熟型ＲＮＡを生産する方法）において記載されるような任意の実施形態を使用することができることが理解される。この除去手段は、それ自体が、新規かつ自明でないことにも留意すべきである。
従って、例えば、使用される除去手段としては、ＲＮａｓｅであって、特に、ＤＮＡと結合している一本鎖ＲＮＡのみを選択的に分解するＲＮａｓｅ（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ）であることが有利である。ここで、このようなＲＮａｓｅを使用する場合には、リンカー核酸結合鋳型核酸の配列のうち、所望の配列以外の配列と相補的な除去用プライマーが使用され、キットに包含されていてもよい。このような除去用プライマーは、前記所望の配列からなるＲＮＡに直接連結されている配列に対して相補的な配列を少なくとも１つ含む。
このような除去用プライマーは、前記所望の配列からなるＲＮＡに直接連結されている配列に対して相補的な配列を少なくとも１つ含み、該相補的な配列は、前記ＲＮＡ産物とのハイブリダイズ形成に充分な長さを含む。
１つの実施形態では、本発明のキットは、さらに、前記ＲＮＡポリメラーゼによって生じたオーバーハングを除去する手段を備えていてもよい。
上述のように、除去方法のみが新規でありかつ自明でないことから本発明の１つの局面では、以下もまた提供される。
従って、本発明は、所望の配列を含むＲＮＡから所望でないＲＮＡ配列を除去し、それにより成熟型ＲＮＡを生産する方法を提供する。この方法は、ａ）所望の配列を含むＲＮＡ以外の配列に相補的な少なくとも１つのＤＮＡプライマーと該所望の配列を含むＲＮＡとをハイブリダイズさせる工程；およびｂ）ＤＮＡ−ＲＮＡの結合のみを認識して分解する工程、を包含する。ここで使用される各々の工程は、上記（所望の配列を有する成熟型ＲＮＡを生産する方法）などにおいて説明されている形態を利用することができることが理解される。好ましくは、ＤＮＡプライマーは、５’末端に少なくとも１つおよび３’末端に少なくとも１つ含む。
従って、別の局面では、本発明は、所望の配列を含むＲＮＡから所望でないＲＮＡ配列を除去し、それにより成熟型ＲＮＡを生産するためのキットを提供する。ここで、このキットは、ａ）所望の配列を含むＲＮＡ以外の配列に相補的な少なくとも１つのＤＮＡプライマー；およびｂ）ＤＮＡ−ＲＮＡの結合のみを認識して分解する手段、を備える。キットには、説明書が備えられていても良い。ここで使用される各々の手段は、上記（所望の配列を有する成熟型ＲＮＡを生産する方法）および（所望の配列を有する成熟型ＲＮＡを生産するためのキット）などにおいて説明されている形態を利用することができることが理解される。好ましくは、ＤＮＡプライマーは、５’末端に少なくとも１つおよび３’末端に少なくとも１つ含み、これらは同一配列であっても異なる配列であってもよい。同一除去プライマーを用いる場合でも最初のリンカーの方は5‘末端と3’末端では通常異なる。
（スクリーニング法）
別の局面において、本発明は、機能を有するＲＮＡをスクリーニングするための方法を提供する。この方法は、Ａ）対象ＲＮＡを提供する工程；Ｂ）Ｂ−１）該所望の配列を有する鋳型核酸にリンカー核酸を結合させてリンカー核酸結合鋳型核酸を生産するライゲーション工程；Ｂ−２）該リンカー核酸結合鋳型核酸に基づいて核酸増幅鋳型を生産する核酸増幅鋳型生産工程；Ｂ−３）該核酸増幅鋳型に対して核酸増幅反応を行って増幅産物を生産する増幅工程；Ｂ−４）該増幅産物をベクターに配置し、該ベクターで宿主を形質転換する工程；−５）該宿主を増幅させる増幅された宿主からベクターを入手する工程；Ｂ−６）該ベクターを鋳型として用いてＲＮＡポリメラーゼを使用してＲＮＡ産物を生産するＲＮＡ増幅工程；およびＢ−７）該ＲＮＡ産物から所望でないＲＮＡ配列を除去し、それにより成熟型ＲＮＡを生産する調整工程、を行って、対象ＲＮＡを増幅生産する工程、Ｃ）該対象ＲＮＡを試験細胞に感染させる工程；Ｄ）該試験細胞が所望の機能を発現した場合、該発現が見出される試験細胞に含まれる対象ＲＮＡに対応する宿主をさらに培養して増幅させる工程；Ｅ）必要に応じて、Ｂ−５〜Ｂ−７、ＣおよびＤを繰り返し、単一コロニーを探索する工程、Ｆ）該単一コロニーに含まれるＲＮＡの配列を決定する工程を包含する。ここでは、該決定された配列と該機能と関連付けて、機能を有するRNAが同定される。ここで、ＲＮＡの増幅までの工程では、（所望の配列を有する成熟型ＲＮＡを生産する方法）および（所望の配列を有する成熟型ＲＮＡを生産するためのキット）などにおいて説明されている形態を利用することができることが理解される。また、他の工程における例えば、培養などの工程は、当業者に公知の任意の手法を用いることができることが理解される。
１つの実施形態では、本発明は、Ｇ）ＲＮＡの発現パターン解析を行う工程、をさらに包含する。具体的にはPCRの段階で逆向きに増幅させたRNA配列に対して、その合成時に標識rNTPを加えれば「プローブ」の作製が可能であるということである。
１つの局面において、本発明は、機能を有するＲＮＡをスクリーニングするためのキットを提供する。このキットは、Ａ）対象ＲＮＡを提供する手段；Ｂ）Ｂ−１）該所望の配列を有する鋳型核酸にリンカー核酸を結合させてリンカー核酸結合鋳型核酸を生産するライゲーション手段；Ｂ−２）該リンカー核酸結合鋳型核酸に基づいて核酸増幅鋳型を生産する転写手段；Ｂ−３）該核酸増幅鋳型に対して核酸増幅反応を行って増幅産物を生産する増幅手段；Ｂ−４）該増幅産物をベクターに配置し、該ベクターで宿主を形質転換する手段；−５）該宿主を増幅させる増幅された宿主からベクターを入手する手段；Ｂ−６）該ベクターを鋳型として用いてＲＮＡポリメラーゼを使用してＲＮＡ産物を生産するＲＮＡ増幅手段；およびＢ−７）該ＲＮＡ産物から所望でないＲＮＡ配列を除去し、それにより成熟型ＲＮＡを生産する調整を行って、対象ＲＮＡを増幅生産する手段、Ｃ）該対象ＲＮＡを試験細胞に感染させる手段；Ｄ）該試験細胞が所望の機能を発現した場合、該発現が見出される試験細胞に含まれる対象ＲＮＡに対応する宿主をさらに培養して増幅させる手段；Ｅ）単一コロニーを探索する手段、Ｆ）該単一コロニーに含まれるＲＮＡの配列を決定する手段を包含する。ここで、（所望の配列を有する成熟型ＲＮＡを生産するためのキット）などにおいて説明されている形態を利用することができることが理解される。また、他の手段における例えば、培養などの手段は、当業者に公知の任意の手法を用いることができることが理解される。
（使用）
本発明は、本発明のＲＮＡまたは本発明の方法によって生産されたＲＮＡ（したがって、所望の配列のみからなるＲＮＡ）の、該RNAの機能を利用する分析または診断のための使用を提供する。分析または診断は、提供されるＲＮＡに応じて変動することが理解される。
（他の形態）
本発明の方法の一部または全体を自動化するための装置もまた、本発明の範囲内である。
本発明の１つの実施形態において、連結される所望の核酸分子の少なくとも１つは、ベクターの配列を有する。本発明に好ましいベクターとしては、プラスミド、およびウイルスが挙げられる。核酸分子の１つとしてベクター（特にクローニングベクター）を用いる場合、本発明は、遺伝子クローニング技術として用いられ得る。
クローニングベクターとしては、例えば、ｐＵＣ１１８／１１９ タイプベクター、ｐＵＣ１８／１９ タイプベクター、ｐＴＷＶ２２８／２２９ ＤＮＡ、ｐＢＲ３２２ ＤＮＡなどを挙げることができ、それらは、例えば、Ｒｏｃｈｅ，ＴａＫａＲａなどから入手可能である。
本発明の１つの実施形態において、本発明によって構築された核酸構築物を導入された細胞もまた、本発明に含まれ得る。これらの細胞としては、細菌（例えば、大腸菌）、真菌（例えば、酵母）、動物細胞（例えば、ヒト、類人猿、ウシ、ウマ、ブタおよびげっ歯類などの哺乳動物細胞ならびに非哺乳動物細胞）、植物細胞（例えば、被子植物および裸子植物）の細胞が、挙げられる。細胞に核酸構築物を導入する方法としては、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションなどの方法が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明に従う核酸構築物は、薬学的組成物中に組み込まれ得、ヒトまたは他の動物に投与され得る。これらの薬学的組成物は、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む、丸剤、錠剤、シロップ剤、カプセルなどの経口薬、注射または輸液（皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内など）によって投与される滅菌の溶液剤、鼻腔内投与されるエアロゾル剤、座剤などであり得るが、これらに限定されない。
また、本発明に従う核酸構築物を導入された細胞をヒトまたは他の動物に投与することによる、遺伝子治療の方法が、本発明によって提供され得る。
また、本発明によって、本発明に従う方法によって構築された核酸構築物を導入された細胞を移植された動物または植物もまた、提供される。本発明に従う核酸構築物を導入した動物または植物の利用方法としては、例えば、本発明に従う核酸構築物または本発明に従う核酸構築物によってコードされるペプチドを乳として分泌するウシ、ウマ、ヒツジおよびヤギなどの哺乳動物、本発明に従う核酸構築物または本発明に従う核酸構築物または本発明に従う核酸構築物によってコードされるペプチドを可食部分（例えば、実、地下茎、葉など）に蓄える食用の植物（例えば、芋類、果物類、野菜類など）が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、請求の範囲によってのみ限定される。
以下、実施例により、本発明の構成をより詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。以下において使用した試薬類は、特に言及した場合を除いて、和光純薬、Ｓｉｇｍａ、東洋紡、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、アマシャム、Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ、フナコシ、ニッポンジーンなどから市販されているものを使用した。合成ＤＮＡは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎに生産を依頼したが、当業者は当該分野において周知の技法を用いてそのようなＤＮＡおよびＲＮＡを合成することができることが理解される。
（手法）
本発明のプロトコルを図1に示した。なお、以下の手順説明では、ｍｉＲＮＡを例示しているが、本明細書に記載されているように、他のＲＮＡ（例えば、ミトコンドリアＲＮＡ，ｔＲＮＡなど）であっても同様の手順で合成できることが理解される。また、リンカー核酸などの配列についても適宜別の配列に変更することができることが理解される。
（1. miRNAへのリンカー核酸の結合）
１つの実施形態では、本過程は既に確立されているNelson protocolをそのまま踏襲したが、他のプロトコルも使用できることが理解される。
得られる反応産物は次の通りである
キメラ構造
ATCGT-aggcacugaaa-miRNA-CTGTAGGCACCATCAATC（配列番号１９）
DNA RNA DNA
（2. 逆転写酵素反応）
キメラ構造の3’末端と相補的な下記のプライマーで逆転写反応（RT-PCR）を行う。
逆転写反応プライマー:
5’-GATTGATGGTGCCTACAG-3’（配列番号２０）
キメラ構造:
ATCGT-aggcacugaaa-miRNA-CTGTAGGCACCATCAATC（配列番号２１）
反応方向←-----GACATCCGTGGTAGTTAG（配列番号２２）
（3. PCR反応）
逆転写反応後に下記のプライマーで通常のPCR反応を行う。この反応で、5’側プライマーにあらかじめプロモーター配列を入れることで、後の反応（４pre-RNAの作成）で必ず順方向のmiRNA配列を含むpre-RNAが合成される。
5’側プライマー:
5’-CCCCGAAGCTTTAATACGACTCACTATAGGGATCGTAGGCACCTGAAA-3’（配列番号２３）
AAGCTT: HindIII 部位
TAATACGACTCACTATAGGG: T7 プロモーター認識部位（下線部）（配列番号２４）
ATCGTAGGCACCTGAAA: Nelson リンカー核酸部位（配列番号２５）
3’側プライマー:
5’-AAAAAAAGCGGCCGCGATTGATGGTGCCTACAG-3’（配列番号２６）
GCGGCCGC: Not I site
GATTGATGGTGCCTACAG: IDTリンカー核酸部位（相補配列）（配列番号２７）
PCR産物（配列番号２８）:
PCR産物に存在する制限酵素Hind IIIと制限酵素Not I に対するsiteを用いてベクターにクローニングする。ただしPCR産物にT7 プロモーター配列が含まれるので、ベクターとしてはT7プロモーターを含まないものを用いる。ただし、本発明で用いられる制限酵素およびRNAプロモーター配列とそれに相当するポリメラーゼは、それらに限定されるものでなく、他の制限酵素や他のプロモーター配列とそれを認識するRNAポリメラーゼでもよい。
（4. pre-RNAの作成と精製）
クローニングされたプラスミドをNot Iで切断し、これを鋳型としてT7 RNA ポリメラーゼでRNA合成を行う。このRNA産物をpre-RNAと呼ぶ。ここで、RNAの合成開始点はT7プロモーター配列の19番目のGなので、先頭部分にgggという余分な配列を持った下記のRNAが合成される。
合成されるRNA:
gggaucguaggcaccugaaa-miRNA-cuguaggcaccaucaaucgc-uu（配列番号２９）
ここで、ggccgcuuuuuu（配列番号３０）は、Not I消化後なので、もはや存在しない。ただし、ポリメラーゼの特性上、uがオーバーハングする場合がある。RNA合成後に鋳型のDNAをDNaseで除去することにより、反応チューブ内にはRNAのみが存在する。反応産物をフェノールクロロホルム処理とエタノール沈殿により精製する。
（5. 余剰RNA部位の除去）
この過程が本発明の要点である。すなわち、得られる産物は、目的とするmiRNAだけでなく、その両端に余分なRNA配列を含むが、RNase H処理とDNase 処理を組み合わせることにより、この余分なRNA配列だけを特異的に除去して、目的のmiRNA配列だけを作成する。
はじめに、精製されたRNAの5’、3’各々の余分な配列と相補的なprimerをアニーリングさせる（通常、primer添加量はRNA分子量の2倍以上とする）。
5’側プライマー:
5’-TTTCAGGTGCCTACGATCCC-3’（配列番号３１）
3’側プライマー:
5’-GCGATTGATGGTGCCTACAG-3’（配列番号３２）
生成物（配列番号３３）
この状態で次にRNase H処理を行う（注：RNase HはDNAと結合している１本鎖RNAのみを選択的に分解する）。
RNase H分解産物（配列番号３４、４４）
ここで、DNase処理を行うと、これにより添加した過剰の相補的primerが分解され、miRNAの部分だけが残る。
-miRNA- -uu
オーバーハングしたUUは無視出来る。（酵素の種類によってはオーバーハングを抑えられるものもあるので、そのような酵素を使用してもよい）
（実施例１：アフリカツメガエルのミトコンドリアおよび体細胞のメチオニンtRNAの作成）
上述した手順に基づいて、アフリカツメガエルのミトコンドリアおよび体細胞メチオニンｔRNAの作製を行った。なお、鋳型の調製は以下のようにして行った。なお、以後の実験方法でも同じであるが、既知の配列に関してはRT-PCRの段階から始める（本発明の方法の骨子はRNaseHなどの独特の除去系を使用するところにあり、クローニングからは始める必要は必ずしもない）。
（鋳型となるアフリカツメガエルのミトコンドリアのRNAの調製およびその後手順）
まずアフリカツメガエル胚からISOGENなどを利用しRNAを抽出する。
抽出したRNAの逆転写反応を行う。
プライマーは
ミトコンドリアMettRNA
agtaaagtcagctaaaaaagcttttgggcccataccccaaacatgttggttaaaccccttcctttacta（配列番号３５）
に対して
3‘末端プライマー
aaaaaagcggccgcGATTGATGGTGCCTACAGtagtaaaggaaggggtttaa（配列番号３６）
を使用する。
逆転写反応後に
5‘末端側プライマー
ccccaagcttTAATACGACTCACTATAGGGATCGTaggcacctgaaaagtaaagtcagctaaaaaag（配列番号３７）
と上記の3‘末端側プライマーでPCRを行う。
PCR産物をT7プロモーター配列の含まないベクターに
HindIII（AAGCTT）、NotI（GCGGCCGC）の制限酵素部位でクローニングする。
クローニングされたプラスミドをNotIで切断し、T7 RNA ポリメラーゼ、DNaseを使用してpre-RNAを合成する。
合成されたpre-RNAに対して
5‘末端側プライマー
tttcaggtgcctACGATCCC（配列番号３８）
3‘末端側プライマー
gcGATTGATGGTGCCTACAG（配列番号３９）
をハイブリッドさせRNaseH処理、エキソヌクレアーゼI処理を行いmatureなミトコンドリアMettRNAを得る。
（鋳型となる体細胞のメチオニンtRNAの調製およびその後の手順）
RT-PCRで使用するプライマーは下記のものを使用する。
Met tRNA
agcagagtggcgcagcggaagcgtgctgggcccataacccagaggtcgatggatcgaaaccattctctgctacca（配列番号４０）
に対して
3‘末端プライマー
aaaaaagcggccgcGATTGATGGTGCCTACAGtggtagcagagaatggtttc（配列番号４１）
を使用する。
逆転写反応後に
5‘末端側プライマー
ccccaagcttTAATACGACTCACTATAGGGATCGTaggcacctgaaaagcagagtggcgcagcggaa（配列番号４２）
と上記の3‘末端側プライマーでPCRを行う。
（結果）
図2 アフリカツメガエルのミトコンドリアおよび体細胞のメチオニン（Met）tRNAの作成。RNAの作成はT7 RNA ポリメラーゼを用いて行なった。レーン1、マーカー；レーン2、ミトコンドリアMettRNAのpre-RNA；レーン3、ミトコンドリアMettRNA；レーン４、Met RNAのpre-NA；レーン5、Met tRNA。図中の白矢頭はpre-RNAを、また白点はｔRNAを示す。
このように、ｔＲＮＡであれミトコンドリアＲＮＡであれ、本発明である「後藤−浅島法」は、クローニングされた低分子量ＲＮＡに対して、新たなプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、ｐｒｅ−ＲＮＡの作成と精製、ＲＮａｓｅ Ｈ／ＤＮａｓｅ処理を行なうことで、ｍａｔｕｒｅな低分子量ＲＮＡを効率よく作成するものであることが実証された。
（実施例２：アフリカツメガエルの体細胞の２種類のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ−１とｍｉＲＮＡ−４２７）の作製）
上述した手順に基づいて、アフリカツメガエルの体細胞の２種類のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ−１とｍｉＲＮＡ−４２７）の作製を行った。なお、鋳型の調製は以下のようにして行った。
（鋳型となるアフリカツメガエルの体細胞の２種類のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ−１とｍｉＲＮＡ−４２７）の調製およびその後の手順）
実施例１および２に準じるが、これらとは異なり配列が短いのでプライマーに配列を含みPCRから反応を行う。
（配列）
Xenopus laevis microRNA miR-1 アフリカツメガエル
tggaatgtaaagaagtatgtat （配列番号４３）
に対して
5‘末端側プライマー
ATCGTAGGCACCTGAAATGGAATGTAAAGAAGTATGT（配列番号４５）
3‘末端プライマー
AAAAAAGCGGCCGCGATTGATGGTGCCTACAGATACATACTTCTTTACATTC（配列番号４６）
を用いてPCRを行う。
miRNA-427
aaagtgcttcctgttttgggcgt（配列番号４７）
に対して
5‘末端側プライマー
ATCGTAGGCACCTGAAAAAAGTGCTTCCTGTTTTGGG（配列番号４８）
3‘末端プライマー
AAAAAAGCGGCCGCGATTGATGGTGCCTACAGACGCCCAAAACAGGAAGCAC（配列番号４９）
を用いてPCRを行う。
同一配列の除去プライマーを用いる場合は、
Xenopus laevismicroRNA mir-124
taaggcacgcggtgaataccaa（配列番号６０）
に対して、
5‘末端側プライマー
CCCCGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTTTCTTCATGTTGCTAAGGCACGCGGTGAATACCAA（配列番号６１）
3‘末端側プライマー
AAAAAAGCGGCCGCAACATGAAGAAAGCCCTTGGTATTCACCGCGTGCCTTA（配列番号６２）
を用いてPCRを行う。
この場合は、除去用プライマー配列は
GCAACATGAAGAAAGCCC（配列番号６３）
を３’側および５’側の両方に使用する。
（結果）
図３ アフリカツメガエルのｍｉＲＮＡ−１（ｍｉｒ−１と呼ぶ）とｍｉＲＮＡ−４２７（ｍｉｒ−４２７と呼ぶ）の作成。ＲＮＡの作成はＴ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて行なった。レーン１、マーカー；レーン２、ｍｉｒ−１のｐｒｅ−ＲＮＡ；レーン３、ｍａｔｕｒｅ ｍｉｒ−１；レーン４、ｍｉｒ−４２７のｐｒｅ−ＲＮＡ；レーン５、ｍａｔｕｒｅ ｍｉｒ−４２７。図中の白矢頭はｐｒｅ−ＲＮＡを、また白点はｔＲＮＡを示す。
このように、ｍｉＲＮＡであっても、本発明である「後藤−浅島法」は、クローニングされた低分子量ＲＮＡに対して、新たなプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、ｐｒｅ−ＲＮＡの作成と精製、ＲＮａｓｅ Ｈ／ＤＮａｓｅ処理を行なうことで、ｍａｔｕｒｅな低分子量ＲＮＡを効率よく作成するものであることが実証された。
同一除去配列を用いる場合でも、同様に、効率よく除去することができることが明らかになる。
（実施例３:マウスの例）
以下の３種のｍｉＲＮＡについて、上記実施例と同様の実験を行って、matureな低分子量RNAを効率よく生産できるかどうかを確認する。
上述した手順に基づいて、マウスｍｉＲＮＡの作製を行った。なお、鋳型の調製は以下のようにして行った。
（鋳型となるマウスｍｉＲＮＡの調製およびその後の手順）
と同様にPCRから反応を行う
miR-1b
tggaatgtaaagaagtatgtaa（配列番号５０）
に対して
5‘末端側プライマー
ATCGTaggcacctgaaaTGGAATGTAAAGAAGTATGTAA（配列番号５１）
3‘末端プライマー
aaaaaagcggccgcGATTGATGGTGCCTACAGttacatacttctttacatt（配列番号５２）
を用いてPCRを行う。以下は上記実施例を同じである。
（配列）
Mus musculus microRNA miR-1b マウス
tggaatgtaaagaagtatgtaa （配列番号５０）
Mus musculus microRNA miR-1c マウス
tggaatgtaaagaagtatgtac （配列番号５３）
Mus musculus microRNA miR-1d マウス
tggaatgtaaagaagtatgtatt （配列番号５４）
（結果）
合成した結果を観察すると、別の動物種のｍｉＲＮＡであっても、本発明である「後藤−浅島法」は、クローニングされた低分子量ＲＮＡに対して、新たなプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、ｐｒｅ−ＲＮＡの作成と精製、ＲＮａｓｅ Ｈ／ＤＮａｓｅ処理を行なうことで、ｍａｔｕｒｅな低分子量ＲＮＡを効率よく作成するものであることが実証される。
（実施例４:ラットの例）
以下のｍｉＲＮＡについて、上記実施例と同様の実験を行って、matureな低分子量RNAを効率よく生産できるかどうかを確認する。
上述した手順に基づいて、ラットｍｉＲＮＡの作製を行った。なお、鋳型の調製は以下のようにして行った。
（鋳型となるラットｍｉＲＮＡの調製）
マウスの実施例と同様の方法にてｍｉＲＮＡの調製を行う。
（配列）
Rattus norvegicus microRNA miR-1 ラット
tggaatgtaaagaagtgtgta （配列番号５５）
（結果）
合成した結果を観察すると、別の動物種のｍｉＲＮＡであっても、本発明である「後藤−浅島法」は、クローニングされた低分子量ＲＮＡに対して、新たなプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、ｐｒｅ−ＲＮＡの作成と精製、ＲＮａｓｅ Ｈ／ＤＮａｓｅ処理を行なうことで、ｍａｔｕｒｅな低分子量ＲＮＡを効率よく作成するものであることが実証される。
（実施例５:トロピカリスの例）
以下のｍｉＲＮＡについて、上記実施例と同様の実験を行って、matureな低分子量RNAを効率よく生産できるかどうかを確認する。
上述した手順に基づいて、トロピカリスｍｉＲＮＡの作製を行った。なお、鋳型の調製は以下のようにして行った。
（鋳型となるトロピカリスｍｉＲＮＡの調製）
マウスの実施例と同様の方法にてｍｉＲＮＡの調製を行う。
（配列）
Xenopus tropicalis microRNA miR-1 トロピカリス
tggaatgttaagaagtatgta （配列番号５６）
（結果）
合成した結果を観察すると、別の動物種のｍｉＲＮＡであっても、本発明である「後藤−浅島法」は、クローニングされた低分子量ＲＮＡに対して、新たなプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、ｐｒｅ−ＲＮＡの作成と精製、ＲＮａｓｅ Ｈ／ＤＮａｓｅ処理を行なうことで、ｍａｔｕｒｅな低分子量ＲＮＡを効率よく作成するものであることが実証される。
（実施例６:ゼブラフィッシュの例）
以下のｍｉＲＮＡについて、上記実施例と同様の実験を行って、matureな低分子量RNAを効率よく生産できるかどうかを確認する。
上述した手順に基づいて、ゼブラフィッシュｍｉＲＮＡの作製を行った。なお、鋳型の調製は以下のようにして行った。
（鋳型となるゼブラフィッシュｍｉＲＮＡの調製）
マウスの実施例と同様の方法にてｍｉＲＮＡの調製を行う。
（配列）
Danio rerio microRNA miR-1 ゼブラフィッシュ
tggaatgtaaagaagtatgta （配列番号５７）
（結果）
合成した結果を観察すると、別の動物種のｍｉＲＮＡであっても、本発明である「後藤−浅島法」は、クローニングされた低分子量ＲＮＡに対して、新たなプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、ｐｒｅ−ＲＮＡの作成と精製、ＲＮａｓｅ Ｈ／ＤＮａｓｅ処理を行なうことで、ｍａｔｕｒｅな低分子量ＲＮＡを効率よく作成するものであることが実証される。
（実施例７:線虫の例）
以下のｍｉＲＮＡについて、上記実施例と同様の実験を行って、matureな低分子量RNAを効率よく生産できるかどうかを確認する。
上述した手順に基づいて、線虫ｍｉＲＮＡの作製を行った。なお、鋳型の調製は以下のようにして行った。
（鋳型となる線虫ｍｉＲＮＡの調製）
マウスの実施例と同様の方法にてｍｉＲＮＡの調製を行う。
（配列）
Caenorhabditis elegans microRNA mir-1 線虫
tggaatgtaaagaagtatgta （配列番号５８）
（結果）
合成した結果を観察すると、別の動物種のｍｉＲＮＡであっても、本発明である「後藤−浅島法」は、クローニングされた低分子量ＲＮＡに対して、新たなプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、ｐｒｅ−ＲＮＡの作成と精製、ＲＮａｓｅ Ｈ／ＤＮａｓｅ処理を行なうことで、ｍａｔｕｒｅな低分子量ＲＮＡを効率よく作成するものであることが実証される。
（実施例８:ショウジョウバエの例）
以下のｍｉＲＮＡについて、上記実施例と同様の実験を行って、matureな低分子量RNAを効率よく生産できるかどうかを確認する。
上述した手順に基づいて、ショウジョウバエｍｉＲＮＡの作製を行った。なお、鋳型の調製は以下のようにして行った。
（鋳型となるショウジョウバエｍｉＲＮＡの調製）
マウスの実施例と同様の方法にてｍｉＲＮＡの調製を行う。
（配列）
Drosophila melanogaster microRNA miR-1 ショウジョウバエ
tggaatgtaaagaagtatggag （配列番号５９）
（結果）
合成した結果を観察すると、別の動物種のｍｉＲＮＡであっても、本発明である「後藤−浅島法」は、クローニングされた低分子量ＲＮＡに対して、新たなプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、ｐｒｅ−ＲＮＡの作成と精製、ＲＮａｓｅ Ｈ／ＤＮａｓｅ処理を行なうことで、ｍａｔｕｒｅな低分子量ＲＮＡを効率よく作成するものであることが実証される。
なお、上述のｍｉＲＮＡは以下のアラインメント結果からも明らかなように相同性が高いことが知られている。
［化３］
mouse mir-1b tggaatgtaaagaagtatgtaa
mouse mir-1c tggaatgtaaagaagtatgtac
mouse mir-1d tggaatgtaaagaagtatgtatt
rat mir-1 tggaatgtaaagaagtgtgta
laevis mir-1 tggaatgtaaagaagtatgtat
trop mir-1 tggaatgttaagaagtatgta
zebra mir-1 tggaatgtaaagaagtatgta
C.elegans mir-1 tggaatgtaaagaagtatgta
dro mir-1 tggaatgtaaagaagtatggag
********.*******.**.*
（実施例９）
次にスクリーニングをした例として、癌原因因子としての機能的miRNAのスクリーニングを実証する。
実質的には、上記実施例に記載されているＲＮＡ合成法を用いる。プロトコルとしては以下を用いる。
（プロトコル）
1、任意の癌細胞よりmiRNAを抽出する
2、miRNAをNelson法（上記実施例において示されている前半部分）と本法で使用するプライマーを用いてRT-PCRを行う
3、PCR産物を所定の制限酵素サイトを使用してベクターにクローニング（ライゲーション）する
4、クローニングされたベクタープラスミド（複数の未知miRNA配列を含有する）を大腸菌に形質転換する。
5、形質転換された個々のシングルコロニーのレプリカを取り、50-200ずつを１サンプルとして計20のサンプルの大腸菌溶液を培養し、プラスミドを精製する。
１サンプル（50-200）×20=（1000-4000）のクローンからの絞りこみ
6、各サンプルから精製されたプラスミドより本法を利用してmiRNA（50-200種類/サンプル）を作製する
7、作製されたmiRNAを正常細胞にインフェクションし、培養する。
8、あるサンプルからのmiRNAが正常細胞を癌化した場合、そのサンプルのもとになった大腸菌コロニー（レプリカから大腸菌）を新たに１サンプルに5-20のコロニーが含まれるようにして培養する（現段階で50-200に絞り込まれた）
１サンプル（5-20）×10=（50-200）のクローンからの絞り込み
9、6-8の工程を繰り返し、最終的に単一のシングルコロニーを探索し、そのプラスミドに含まれるmiRNAの配列情報を得る
その結果は、以下の通りである。
10、以上より癌原因miRNAが解明され、以後はこのmiRNAの発現パターン等の解析を行い、癌原因となることの検証実験に移る。
以上のように9の段階まではどのようなmiRNAの配列では未知でも構わないことが分かる。
発見されたmiRNAの発現量が癌細胞と正常細胞の間で異なることが分かるはずである。つまりある種のmiRNAが癌細胞で多いのであれば、それを抑制するような対処を取れば正常に戻る可能性を示唆することになる。
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
本発明によって提供される方法は、従来法と比較して簡便、迅速、正確かつ費用効果の高い方法であり、あらゆる核酸に適用可能である。一局面において、本発明の方法は、従来法より格段に簡便かつ迅速なスクリーニング方法に使用され得る。また、本発明の方法は、分子生物学、組織および器官の再生、再生医学および再生医療、遺伝子治療、診断学、ならびに医薬品開発などの分野で幅広く活用可能である。本発明の方法によって構築される核酸構築物は、医薬品の製造、遺伝子治療などに幅広く使用され得る。従って、本発明は、産業上の利用可能性が極めて高いといえる。
本「後藤−浅島法」により、これまで実現されていなかったmatureな低分子量miRNAを効率よく作成することができる。その結果、生物学的ならびに医学的現象が現れた特定のRNAソースから、任意のmatureな低分子量miRNAを、効率よく迅速に作成することができる。具体的には、以下の通りである。
1. miRNAの生命現象との関わりにおける機能の理解が可能になる。
2. miRNAの機能不全や過剰機能発現に起因する疾病の発見や診断、そして、治療法の開発が可能になる。
また、本「後藤−浅島法」は、miRNAだけでなく、tRNA等の他の低分子量RNAの作成にも適用でき、
3. 広く一般に低分子量RNAの生命現象との関わりにおける機能の理解が可能になる。
4. 広く一般に低分子量RNAの機能不全や過剰機能発現に起因する疾病の発見や診断、そして、治療法の開発が可能になる。
さらに、本「後藤−浅島法」は、低分子量RNA以外のRNAに対しても、5’、3’両末端部分に余剰配列を残さないので、機能解析の時に細胞内での最終的な形状（matureな形）が必要なRNAの作成の全てに適用でき、そのように作成された
5. matureな形のRNAの生命現象との関わりにおける機能の理解が可能になる。
6. matureな形のRNAの機能不全や過剰機能発現に起因する疾病の発見や診断、そして、治療法の開発が可能になる。
図1は、本発明のプロトコルである。ただし、miRNAへのリンカー核酸の結合までの方法はNelson protocolを使用した。 アフリカツメガエルのミトコンドリアおよび体細胞のメチオニン（Met）tRNAの作成。RNAの作成はT7 RNA polymeraseを用いて行なった。レーン1、マーカー；レーン2、ミトコンドリアMettRNAのpre-RNA；レーン3、ミトコンドリアMettRNA；レーン４、Met RNAのpre-NA；レーン5、Met tRNA。図中の白矢頭はpre-RNAを、また白点はｔRNAを示す。 アフリカツメガエルのmiRNA-1（mir-1と呼ぶ）とmiRNA-427（mir-427と呼ぶ）の作成。RNAの作成はT7 RNApolymeraseを用いて行なった。レーン1、マーカー；レーン2、mir-1のpre-RNA；レーン3、maturemir-1；レーン４、mir-427のpre-RNA；レーン5、maturemir-427。図中の白矢頭はpre-RNAを、また白点はtRNAを示す。
（大文字はＤＮＡ，小文字はＲＮＡ）
配列番号１ “modban”、AMP-5’p-5’p/CTGTAGGCACCATCAATジデオキシC- 3’
配列番号２ Nelsonリンカー核酸5’ATCGTrArGrGrCrArCrCrUrGrArArA3’
配列番号３ Ｓｍａｒｔｂａｎ5’-ATCGTAGGCACCTGAAAGGG-3’
配列番号４ BanOne:5’-ATTGATGGTGCCTACAG-3’
配列番号５ BanOneの相補鎖
配列番号６ 5’ＰＣＲプライマーBanTwo: 5’-ATCGTAGGCACCTGAAA-3’
配列番号４ 3’ＰＣＲプライマーBanTwoの相補鎖
配列番号８ SMARTbancDNA insert chiban 5’-ATCGTAGGCACCTGAAAGGG-(RNA 5’-to-3’)-CTGTAGGCACCATCAATC-3’
配列番号９ 5’側 Nelsonリンカー核酸: 5’-ATCGT-aggcaccugaaa-3’
配列番号１０ 3’側 miRNAcloningリンカー核酸: 5rApp/CTGTAGGCACCATCAAT/3ddC
配列番号１１ キメラ構造 ATCGT-aggcacugaaa-miRNA-CTGTAGGCACCATCAATC
配列番号１２ Ｔ７プロモーター配列１TAATA CGACTCACTA TAGG
配列番号１３ Ｔ７プロモーター配列２TAATACGACTCACTATAGGG
配列番号１４ ＳＰ６プロモーター配列A TTTAGGTGAC ACTATAGA
配列番号１５ Ｔ３プロモーター配列AATTAACCCTCACTAAAGG
配列番号１６ 具体的なプライマーセット１ ccccaagcttTAATACGACTCACTATAGGGATCGTaggcacctgaaa
配列番号１７ 具体的なプライマーセット２ ccccgaattcTAATACGACTCACTATAGGGATCGTaggcacctgaaa
配列番号１８ 具体的なプライマーセット３ aaaaaagcggccgcGATTGATGGTGCCTACAG
配列番号１９ キメラ構造ATCGT-aggcacugaaa-miRNA-CTGTAGGCACCATCAATC
配列番号２０ 逆転写反応プライマー: 5’-GATTGATGGTGCCTACAG-3’
配列番号２１ キメラ構造: ATCGT-aggcacugaaa-miRNA-CTGTAGGCACCATCAATC
配列番号２２ 反応方向←-----GACATCCGTGGTAGTTAG
配列番号２３ 5’側プライマー:5’-CCCCGAAGCTTTAATACGACTCACTATAGGGATCGTAGGCACCTGAAA-3’
配列番号２４ TAATACGACTCACTATAGGG:T7 プロモーター認識部位（下線部）
配列番号２５ ATCGTAGGCACCTGAAA:Nelson リンカー核酸部位
配列番号２６ 3’側プライマー:5’-AAAAAAAGCGGCCGCGATTGATGGTGCCTACAG-3’
配列番号２７ GATTGATGGTGCCTACAG:IDTリンカー核酸部位
配列番号２８ PCR産物（化１）
配列番号２９ 合成されるRNA gggaucguaggcaccugaaa-miRNA-cuguaggcaccaucaaucgc-uu
配列番号３０ NotI消化後に存在しない配列ggccgcuuuuuu
配列番号３１ 5’側プライマー:5’-TTTCAGGTGCCTACGATCCC-3’
配列番号３２ 3’側プライマー:5’-GCGATTGATGGTGCCTACAG-3’
配列番号３３ 生成物（化２）
配列番号３４ RNaseH分解産物（配列番号３４）（化３）
配列番号３５ ミトコンドリアMet tRNA agtaaagtcagctaaaaaagcttttgggcccataccccaaacatgttggttaaaccccttcctttacta
配列番号３６ 3‘末端プライマー：aaaaaagcggccgcGATTGATGGTGCCTACAGtagtaaaggaaggggtttaa
配列番号３７ 5‘末端側プライマーccccaagcttTAATACGACTCACTATAGGGATCGTaggcacctgaaaagtaaagtcagctaaaaaag
配列番号３８ pre-RNAに対する5‘末端側プライマーtttcaggtgcctACGATCCC
配列番号３９ pre-RNAに対する3‘末端側プライマーgcGATTGATGGTGCCTACAG
配列番号４０ MettRNA
agcagagtggcgcagcggaagcgtgctgggcccataacccagaggtcgatggatcgaaaccattctctgctacca
配列番号４１ MettRNA3‘末端プライマー
aaaaaagcggccgcGATTGATGGTGCCTACAGtggtagcagagaatggtttc
配列番号４２ MettRNA5‘末端側プライマー
ccccaagcttTAATACGACTCACTATAGGGATCGTaggcacctgaaaagcagagtggcgcagcgga
配列番号４３ Xenopuslaevis microRNA miR-1 アフリカツメガエルtggaatgtaaagaagtatgtat
配列番号４４ RNaseH分解産物
配列番号４５ miRNA-15‘末端側プライマー ATCGTAGGCACCTGAAATGGAATGTAAAGAAGTATGT
配列番号４６ miRNA-13‘末端プライマー AAAAAAGCGGCCGCGATTGATGGTGCCTACAGATACATACTTCTTTACATTC
配列番号４７ miRNA-427 aaagtgcttcctgttttgggcgt
配列番号４８ miRNA-4275‘末端側プライマー ATCGTAGGCACCTGAAAAAAGTGCTTCCTGTTTTGGG
配列番号４９ miRNA-4273‘末端プライマー AAAAAAGCGGCCGCGATTGATGGTGCCTACAGACGCCCAAAACAGGAAGCAC
配列番号５０ Musmusculus microRNA miR-1b tggaatgtaaagaagtatgtaa
配列番号５１ miR-1b5‘末端側プライマー ATCGTaggcacctgaaaTGGAATGTAAAGAAGTATGTAA
配列番号５２ miR-1b3‘末端プライマー aaaaaagcggccgcGATTGATGGTGCCTACAGttacatacttctttacatt
配列番号５３ Musmusculus microRNA miR-1c マウス tggaatgtaaagaagtatgtac
配列番号５４ Musmusculus microRNA miR-1d マウス tggaatgtaaagaagtatgtatt
配列番号５５ Rattusnorvegicus microRNA miR-1 ラット tggaatgtaaagaagtgtgta
配列番号５６ Xenopus tropicalis microRNA miR-1 トロピカリス tggaatgttaagaagtatgta
配列番号５７ Daniorerio microRNA miR-1 ゼブラフィッシュ tggaatgtaaagaagtatgta
配列番号５８ Caenorhabditis elegans microRNA mir-1 線虫 tggaatgtaaagaagtatgta
配列番号５９ Drosophila melanogaster microRNA miR-1 ショウジョウバエ tggaatgtaaagaagtatggag
配列番号６０ Xenopuslaevis microRNA mir-124 taaggcacgcggtgaataccaa
配列番号６１ 例示の同一配列の除去プライマーのための5‘末端側プライマー CCCCGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTTTCTTCATGTTGCTAAGGCACGCGGTGAATACCAA
配列番号６２ 例示の同一配列の除去プライマーのための3‘末端側プライマー AAAAAAGCGGCCGCAACATGAAGAAAGCCCTTGGTATTCACCGCGTGCCTTA
配列番号６３ 例示の同一配列の除去用プライマー配列 GCAACATGAAGAAAGCCC

Claims (95)

  1. 単離された成熟型ＲＮＡ。
  2. 合成成熟型ＲＮＡ。
  3. 低分子量成熟型ＲＮＡ。
  4. 前記成熟型ＲＮＡは、目的の配列のみからなる、ＲＮＡ。
  5. 所望の配列を有する成熟型ＲＮＡを生産する方法であって：
    Ａ）該所望の配列を有する鋳型核酸にリンカー核酸を結合させてリンカー核酸結合鋳型核酸を生産するライゲーション工程；
    Ｂ）該リンカー核酸結合鋳型核酸に基づいて核酸増幅鋳型を生産する核酸増幅鋳型生産工程；
    Ｃ）該核酸増幅鋳型に対して核酸増幅反応を行って増幅産物を生産する増幅工程；
    Ｄ）該増幅産物に対してＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡ産物を生産するＲＮＡ増幅工程；および
    Ｅ）該ＲＮＡ産物から所望でないＲＮＡ配列を除去し、それにより成熟型ＲＮＡを生産する調整工程；
    を包含する、方法。
  6. 前記鋳型核酸は、ＲＮＡである、請求項５に記載の方法。
  7. 前記リンカー核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを含む、請求項５に記載の方法。
  8. 前記リンカー核酸は、制限酵素部位を含む、請求項５に記載の方法。
  9. 前記リンカー核酸は、制限酵素部位を含まない、請求項５に記載の方法。
  10. 前記ライゲーション工程において、前記連結がリガーゼによって媒介される、請求項５に記載の方法。
  11. 前記ライゲーション工程において、前記連結がＤＮＡとＲＮＡとの連結を媒介する能力も有するリガーゼにより媒介される、請求項５に記載の方法。
  12. 前記リンカー核酸が二つ提供され、その一方の末端にリン酸が付加されていることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
  13. 前記リンカー核酸が二つ提供され、その一方の末端がライゲーション妨害基で改変されていることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
  14. 前記リンカー核酸が二つ提供され、そのうちの第１のリンカー核酸の一方の末端にリン酸が付加され、該第１のリンカー核酸の他方の末端がライゲーションを妨害する基で改変されていることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
  15. 前記ライゲーション妨害基が、ジデオキシヌクレオチドである、請求項１３または１４に記載の方法。
  16. 前記リンカーが二つ提供され、前記リンカー核酸が第１のリンカー核酸および第２のリンカー核酸の二つ提供され、そのうちの第１のリンカー核酸の一方の末端にリン酸が付加され、該第１のリンカー核酸の他方の末端がライゲーションを妨害する基で改変されており、第２のリンカー核酸は少なくとも３’側がＲＮＡである、請求項５に記載の方法。
  17. 前記リンカーが二つ提供され、前記リンカー核酸が第１のリンカー核酸および第２のリンカー核酸の二つ提供され、そのうちの第１のリンカー核酸の一方の末端にリン酸が付加され、該第１のリンカー核酸の他方の末端がライゲーションを妨害する基で改変されており、第２のリンカー核酸は５’側がＤＮＡであり３’側がＲＮＡである、請求項５に記載の方法。
  18. 前記Ａ）ライゲーション反応において、前記第２のリンカー核酸と前記鋳型核酸との連結をまず行って第１連結産物を得、次に前記第１のリンカー核酸と該第１連結産物との連結を行うことを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記ライゲーション工程は、ｓｍａｒｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌまたはＮｅｌｓｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌにて行われる、請求項５に記載の方法。
  20. 前記鋳型核酸はＲＮＡである、請求項５に記載の方法。
  21. 前記鋳型核酸はＲＮＡであり、前記核酸増幅鋳型の生産は逆転写反応により達成され、前記核酸増幅鋳型はＤＮＡである、請求項５に記載の方法。
  22. 前記リンカー核酸結合鋳型核酸がＲＮＡとＤＮＡとのキメラ核酸である、請求項５に記載の方法。
  23. 前記リンカー核酸結合鋳型核酸がＲＮＡとＤＮＡとのキメラ核酸であり、前記核酸増幅鋳型の生産は逆転写反応により達成され、該逆転写反応において用いられるプライマーが該リンカー核酸結合鋳型核酸のリンカー核酸部分に相補的な配列を含む、請求項５に記載の方法。
  24. 前記核酸増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ｇａｐ ＬＣＲ、鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＳＤＡ）、Ｑβレプリカーゼ増幅、転写増幅システム（ＴＡＳ）、自己支持配列複製システム（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ；３ＳＲ）；核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）；転写媒介増幅（ＴＭＡ）、等温条件下キメラプライマー開始核酸増幅（ＩＣＡＮ；Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌｌｙ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ ｕｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）およびループ媒介性等温増幅（ＬＡＭＰ）からなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
  25. 前記核酸増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項５に記載の方法。
  26. 前記核酸増幅反応において、プロモーター配列を含むプライマーが用いられる、請求項５に記載の方法。
  27. 前記核酸増幅反応において使用される５’側のプライマーにプロモーター配列が含まれる、請求項５に記載の方法。
  28. 前記核酸増幅反応において使用されるプライマーが、制限酵素部位の配列を含む、請求項５に記載の方法。
  29. 前記核酸増幅反応において使用されるプライマーが、マルチクローニングサイトを含む、請求項５に記載の方法。
  30. 前記核酸増幅反応において使用されるプライマーが、制限酵素部位の配列を含み、５’側のプライマーにプロモーター配列が含まれる、請求項５に記載の方法。
  31. 前記核酸増幅反応において使用されるプライマーが、リンカー核酸の配列またはその相補配列あるいはその一部を含む、請求項５に記載の方法。
  32. 前記核酸増幅反応において使用されるプライマーが、リンカー核酸の配列またはその相補配列あるいはその一部を含み、該プライマーが、制限酵素部位の配列を含み、５’側のプライマーにプロモーター配列が含まれる、請求項５に記載の方法。
  33. Ｃ）増幅工程の後に、前記増幅産物を、ベクターにクローニングする工程をさらに包含する、請求項５に記載の方法。
  34. 前記ベクターは、前記プロモーター配列を含まないことを特徴とする、請求項３１に記載の方法。
  35. 前記増幅産物がＤＮＡであり、前記ＲＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡ依存性である、請求項５に記載の方法。
  36. 前記ＲＮＡポリメラーゼは、前記プロモーター配列を認識するものである、請求項５に記載の方法。
  37. 前記核酸増幅反応において、使用されるプライマーが、リンカー核酸の配列またはその相補配列あるいはその一部を含み、該プライマーが、制限酵素部位の配列を含み、５’側のプライマーにプロモーター配列が含まれ
    前記Ｃ）増幅工程の後に、前記増幅産物を、ベクターにクローニングする工程をさらに包含し、該ベクターは、前記プロモーター配列を含まず、前記ＲＮＡポリメラーゼが該プロモーター配列を認識し、かつ、３’側のプライマーの該制限酵素部位を切断する制限酵素で消化して該ＲＮＡポリメラーゼの鋳型として該ＲＮＡポリメラーゼによる増幅を行うことを特徴とする、請求項５に記載の方法。
  38. ＲＮＡ増幅工程の後にＤＮＡを除去する工程をさらに包含する、請求項５に記載の方法。
  39. 前記ＤＮＡの除去は、ＤＮａｓｅにより達成される、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記ＲＮＡ増幅工程において、存在するＲＮＡ分子の量の少なくとも２倍量のプライマーが使用される、請求項５に記載の方法。
  41. 前記ＲＮＡポリメラーゼは、オーバーハングを生じさせないＲＮＡポリメラーゼである、請求項５に記載の方法。
  42. 前記所望でないＲＮＡ配列の除去は、前記リンカー核酸結合鋳型核酸の配列のうち、前記所望の配列以外の配列と相補的な除去用プライマーを前記ＲＮＡ産物とハイブリダイズさせてハイブリダイズ産物を生成し、該ハイブリダイズ産物に対してＤＮＡと結合している一本鎖ＲＮＡのみを選択的に分解する手段を用いて分解させて、所望の配列のみを含むＲＮＡを生産することを包含する、請求項５に記載の方法。
  43. 前記除去用プライマーは、前記所望の配列からなるＲＮＡに直接連結されている配列に対して相補的な配列を少なくとも１つ含み、該相補的な配列は、前記ＲＮＡ産物とのハイブリダイズ形成に充分な長さを含む、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記所望でないＲＮＡ配列の除去は、ＤＮＡと結合している一本鎖ＲＮＡのみを選択的に分解することを特徴とする、請求項５に記載の方法。
  45. 前記所望でないＲＮＡ配列の除去は、ＲＮａｓｅ Ｈにより達成される、請求項５に記載の方法。
  46. ＲＮＡを実質的に分解しないＤＮＡ分解手段によりＤＮＡを分解する工程をさらに包含する、請求項５に記載の方法。
  47. さらに、前記ＲＮＡポリメラーゼによって生じたオーバーハングを除去する工程を包含する、請求項５に記載の方法。
  48. 前記ＲＮＡポリメラーゼによって生じたオーバーハングを除去する前記工程は、電気泳動を包含する、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記成熟型ＲＮＡは、低分子量ＲＮＡである、請求項５に記載の方法。
  50. 前記成熟型ＲＮＡは、ｍｉＲＮＡである、請求項５に記載の方法。
  51. 所望の配列を有する成熟型ＲＮＡを生産するためのキットであって：
    Ａ１）該所望の配列を有する鋳型核酸に連結させるためのリンカー核酸；
    Ａ２）該リンカー核酸を該鋳型核酸に結合させる結合手段；
    Ｂ）該鋳型核酸と該リンカー核酸とが連結したリンカー核酸結合鋳型核酸から核酸増幅鋳型を生産する核酸増幅鋳型生産手段；
    Ｃ）該転写反応によって生じる核酸増幅鋳型に対して核酸増幅反応を生じさせる核酸増幅手段；
    Ｄ）該核酸増幅反応によって増幅された産物を鋳型としてＲＮＡを生産する手段；および
    Ｅ）所望でないＲＮＡ配列を除去するＲＮＡ配列除去手段、
    を備える、キット。
  52. 前記リンカー核酸は、制限酵素部位を含むことを特徴とする、請求項５１に記載のキット。
  53. 前記リンカー核酸は、制限酵素部位を含まないことを特徴とする、請求項５１に記載のキット。
  54. 前記リンカー核酸が二つ提供され、その一方の末端にリン酸が付加されていることを特徴とする、請求項５１に記載のキット。
  55. 前記リンカー核酸が二つ提供され、その一方の末端がライゲーション妨害基で改変されていることを特徴とする、請求項５１に記載のキット。
  56. 前記リンカー核酸が二つ提供され、その一方の末端にリン酸が付加され、他方の末端がライゲーションを妨害する基で改変されていることを特徴とする、請求項５１に記載のキット。
  57. 記ライゲーション妨害基が、ジデオキシヌクレオチドである、請求項５５または５６に記載のキット。
  58. 前記リンカー核酸が二つ提供され、そのうちの第１のリンカー核酸の一方の末端にリン酸が付加され、該第１のリンカー核酸の他方の末端がライゲーションを妨害する基で改変されていることを特徴とする、請求項５１に記載のキット。
  59. 前記リンカーが二つ提供され、前記リンカー核酸が第１のリンカー核酸および第２のリンカー核酸の二つ提供され、そのうちの第１のリンカー核酸の一方の末端にリン酸が付加され、該第１のリンカー核酸の他方の末端がライゲーションを妨害する基で改変されており、第２のリンカー核酸は少なくとも３’側がＲＮＡである、請求項５１に記載のキット。
  60. 前記リンカーが二つ提供され、前記リンカー核酸が第１のリンカー核酸および第２のリンカー核酸の二つ提供され、そのうちの第１のリンカー核酸の一方の末端にリン酸が付加され、該第１のリンカー核酸の他方の末端がライゲーションを妨害する基で改変されており、第２のリンカー核酸は５’側がＤＮＡであり３’側がＲＮＡである、請求項５１に記載のキット。
  61. 前記結合手段は、ＲＮＡリガーゼである、請求項５１に記載のキット。
  62. 前記結合手段は、ＤＮＡとＲＮＡとの連結を媒介する能力も有するリガーゼである、請求項５１に記載のキット。
  63. 前記結合手段は、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼである、請求項５１に記載のキット。
  64. 前記鋳型核酸はＲＮＡであり、前記核酸増幅鋳型生産手段は、逆転写酵素とプライマーを含む、請求項５１に記載のキット。
  65. 前記プライマーセットは、該リンカー核酸結合鋳型核酸のリンカー核酸部分に相補的な配列を含むことを特徴とする、請求項５１に記載のキット。
  66. 前記核酸増幅手段は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ｇａｐ ＬＣＲ、鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＳＤＡ）、Ｑβレプリカーゼ増幅、転写増幅システム（ＴＡＳ）、自己支持配列複製システム（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ；３ＳＲ）；核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）；転写媒介増幅（ＴＭＡ）、等温条件下キメラプライマー開始核酸増幅（ＩＣＡＮ；Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌｌｙ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ ｕｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）およびループ媒介性等温増幅（ＬＡＭＰ）からなる群より選択される増幅反応のための手段を含む、請求項５１に記載のキット。
  67. 前記核酸増幅手段は、ＤＮＡポリメラーゼとプライマーセットとを含む、請求項５１に記載のキット。
  68. 前記プライマーセットは、前記リンカー核酸連結鋳型核酸の一部と同一の配列および相補的な配列をそれぞれ含む、請求項５１に記載のキット。
  69. 前記プライマーセットのうち少なくとも１つがプロモーター配列を含む、請求項５１に記載のキット。
  70. 前記プライマーセットの両方が制限部位を含む、請求項５１に記載のキット。
  71. 前記プライマーセットがマルチクローニングサイトを含む、請求項５１に記載のキット。
  72. 前記プライマーセットのうち少なくとも１つがプロモーター配列を含み、該プライマーセットの両方が制限部位を含む、請求項５１に記載のキット。
  73. Ｃ−２）前記増幅産物をクローニングするためのベクター、さらに含む、請求項５１に記載のキット。
  74. Ｃ−３）前記増幅産物に含まれる制限部位を認識し切断する制限酵素を含む、請求項５１に記載のキット。
  75. 前記核酸増幅反応によって増幅された産物を鋳型としてＲＮＡを生産する手段は、ＲＮＡポリメラーゼである、請求項５１に記載のキット。
  76. 前記ＲＮＡポリメラーゼは、前記プライマーセットに含まれる前記プロモーター配列を認識するＲＮＡポリメラーゼである、請求項５１に記載のキット。
  77. 前記プロモーター配列がＴ７プロモーター、Ｓ６プロモーターまたはＴ３プロモーターであり、前記ＲＮＡポリメラーゼが該プロモーターに対応してＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｓ６ ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ３ ＲＮＡポリメラーゼである、請求項５１に記載のキット。
  78. Ｄ−１）ＲＮａｓｅ活性のないＤＮａｓｅをさらに備える、請求項５１に記載のキット。
  79. 前記ＲＮａｓｅ活性のないＤＮａｓｅは、前記鋳型となった増幅産物であるＤＮＡを除去するために用いられる、請求項５１に記載のキット。
  80. Ｄ−２）生産されたＲＮＡを精製するための精製手段をさらに備える、請求項５１に記載のキット。
  81. 前記精製手段は、フェノール／クロロホルム抽出手段およびエタノール沈澱手段である、請求項８０に記載のキット。
  82. 前記除去手段は、ＲＮａｓｅである、請求項５１に記載のキット。
  83. 前記除去手段は、ＤＮＡと結合している一本鎖ＲＮＡのみを選択的に分解するＲＮａｓｅである、請求項５１に記載のキット。
  84. 前記除去手段は、ＲＮａｓｅ Ｈである、請求項５１に記載のキット。
  85. 前記リンカー核酸結合鋳型核酸の配列のうち、前記所望の配列以外の配列と相補的な除去用プライマーをさらに包含する、請求項５１に記載のキット。
  86. 前記除去用プライマーは、前記所望の配列からなるＲＮＡに直接連結されている配列に対して相補的な配列を少なくとも１つ含む、請求項８５に記載のキット。
  87. 前記除去用プライマーは、前記所望の配列からなるＲＮＡに直接連結されている配列に対して相補的な配列を少なくとも１つ含み、該相補的な配列は、前記ＲＮＡ産物とのハイブリダイズ形成に充分な長さを含む、請求項８５に記載のキット。
  88. さらに、前記ＲＮＡポリメラーゼによって生じたオーバーハングを除去する手段を備える、請求項５１に記載のキット。
  89. 機能を有するＲＮＡをスクリーニングするための方法であって、
    Ａ）対象ＲＮＡを提供する工程；
    Ｂ）Ｂ−１）該所望の配列を有する鋳型核酸にリンカー核酸を結合させてリンカー核酸結合鋳型核酸を生産するライゲーション工程；
    Ｂ−２）該リンカー核酸結合鋳型核酸に基づいて核酸増幅鋳型を生産する核酸増幅鋳型生産工程；
    Ｂ−３）該核酸増幅鋳型に対して核酸増幅反応を行って増幅産物を生産する増幅工程；
    Ｂ−４）該増幅産物をベクターに配置し、該ベクターで宿主を形質転換する工程；
    Ｂ−５）該宿主を増幅させる増幅された宿主からベクターを入手する工程；
    Ｂ−６）該ベクターを鋳型として用いてＲＮＡポリメラーゼを使用してＲＮＡ産物を生産するＲＮＡ増幅工程；および
    Ｂ−７）該ＲＮＡ産物から所望でないＲＮＡ配列を除去し、それにより成熟型ＲＮＡを生産する調整工程、
    を行って、対象ＲＮＡを増幅生産する工程、
    Ｃ）該対象ＲＮＡを試験細胞に感染させる工程；
    Ｄ）該試験細胞が所望の機能を発現した場合、該発現が見出される試験細胞に含まれる対象ＲＮＡに対応する宿主をさらに培養して増幅させる工程；
    Ｅ）必要に応じて、Ｂ−５〜Ｂ−７、ＣおよびＤを繰り返し、単一コロニーを探索する工程、
    Ｆ）該単一コロニーに含まれるＲＮＡの配列を決定する工程；
    ここで、該決定された配列と該機能と関連付けて、機能を有するRNAが同定される、方法。
  90. Ｇ）該ＲＮＡの発現パターン解析を行う工程、をさらに包含する、請求項８９に記載の方法。
  91. 請求項１〜４に記載のRNAまたは請求項５〜８８に記載の方法によって生産されたRNAの、該RNAの機能を利用する分析または診断のための使用。
  92. 所望の配列を含むＲＮＡから所望でないＲＮＡ配列を除去し、それにより成熟型ＲＮＡを生産する方法であって、
    ａ）所望の配列を含むＲＮＡ以外の配列に相補的な少なくとも１つのＤＮＡプライマーと該所望の配列を含むＲＮＡとをハイブリダイズさせる工程；および
    ｂ）ＤＮＡ−ＲＮＡの結合のみを認識して分解する工程、
    を包含する、方法。
  93. 前記ＤＮＡプライマーは、５’末端に少なくとも１つおよび３’末端に少なくとも１つ含む、請求項９２に記載の方法。
  94. 所望の配列を含むＲＮＡから所望でないＲＮＡ配列を除去し、それにより成熟型ＲＮＡを生産するためのキットであって、
    ａ）所望の配列を含むＲＮＡ以外の配列に相補的な少なくとも１つのＤＮＡプライマー；および
    ｂ）ＤＮＡ−ＲＮＡの結合のみを認識して分解する手段、
    を備える、キット。
  95. 前記ＤＮＡプライマーは、５’末端に少なくとも１つおよび３’末端に少なくとも１つ含む、請求項９４に記載のキット。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN114891782A (zh) * 2022-05-24 2022-08-12 四川农业大学 一种利用酚氯仿法纯化rna的方法

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