CN113637639A - 一种血液循环肿瘤细胞的俘获方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的一种血液循环肿瘤细胞的俘获方法，包括以下步骤：s1:根据需要，用ACD抗凝管抽取外周血设定的量，上下颠倒混匀；再加入血小板抑制剂，低温4℃～8℃保存或者运输；s2:把血液从低温条件下取出，放在室温下即20℃～25℃平衡到设定时间，再加入EDTA混匀，室温平衡；s3:平衡后的血液开始进行血液过滤，进行肿瘤细胞的俘获。本发明的血液循环肿瘤细胞的俘获方法，方便含有稀少细胞如CTC的全血的保存、稳定和运输，与基于肿瘤细胞形态大小的CTC芯片分离技术相适配，提高CTC俘获的纯度和俘获率。

Description

一种血液循环肿瘤细胞的俘获方法
技术领域
本发明涉及全血的保存和稳定技术领域，具体涉及一种血液循环肿瘤细胞的俘获方法。
背景技术
CTC(CirculatingTumorCell)是指来源于肿瘤组织而在血液中循环的肿瘤细胞。CTC是化疗作用的靶点，也是肿瘤转移和复发的元凶。现研究证实肿瘤在原位癌的阶段就向患者的血中释放CTC，不过大都被机体的免疫系统所清除。直到肿瘤的大小达到一定的阶段时，患者的血中就可以检测出CTC，但此时影像学尚不能发现肿瘤。因此，对高危人群血中CTC的监测，有机会发现早期肿瘤。但此时，血中CTC的数目少，需要一种高灵敏度的检测装置。CTC的基因学检测可以实时提供患者包括基因突变在内的肿瘤负载信息，也可以用作FISH染色体重组检测，NGS基因测序，PCR基因表达水平检测和细胞培养等，为肿瘤患者的精准治疗提供解决方案。
CTC在血液中的含量非常的低，几乎每10亿个血细胞中含有一个肿瘤细胞。所以对它的俘获和富集完全由技术所决定的。
CTC的俘获和富集基于原理，共分为化学方法和物理方法。化学方法则基于CTC细胞表面的上皮细胞特定的标记物，利用对应的抗体和抗原特异性的反应来达到分离CTC的目的。代表的是
Figure BDA0003200001970000011
技术，该技术的缺点是CTC的检测数目少，灵敏度低。相对于化学方法的基于细胞形态大小的物理方法(ISET)技术，方法简便。但ISET技术取决于血液的质量和对血液的处理方法。即涉及到血液的保存、稳定和运输。保存的温度是主要的影响因素。对照研究使用spiked-in的肿瘤细胞已经证实抽血后5小时内CTC的损失＞60％,RNA显著性降解发生在2～4小时内。在12小时内，79％的细胞中发现RNA降解。虽然现代输血医学已经为血液储备制定了标准化的技术，但这些技术不足以将全血用于像血液循环肿瘤细胞等稀有细胞的应用。另外，血液的粘稠度也特别影响血细胞的过滤和CTC的俘获。血液粘度热大，CTC俘获的效率就热低。所以，降低血液的粘稠度通过影响血小板的聚集在全血的温定中发挥核心的作用。
当前世面上采用游离DNA保存技术，这类技术通过一些特别的试剂来保护血细胞。它主要是通过稳定血细胞来保存DNA的。但宣称能够在常温下保存血液/DNA 7天。这类保护剂对血液粘度－血小板的积聚功能没有影响，在基于ISET技术CTC俘获时会影响CTC俘获的纯度和俘获效率。
目前，CTC在肿瘤早筛和肿瘤的精准治疗方面的应用非常的广泛，各种技术层出不重，与之相关的血液保存技术也不断出现。现将相关的技术的缺点作出一些总结。
Figure BDA0003200001970000021
美国FDA唯一批准的CTC俘获平台，主要依靠固定剂稳定全血达96小时为多中心研究提供标本的储存和运输。然而，固定剂不仅损伤了细胞的活力，同时，固定剂通过化学交联、断裂和化学修饰作用降低了RNA的质量。
国内的游离DNA保护剂，这类保护剂对血液粘度－血小板的积聚功能没有影响。在基于ISET技术CTC俘获时会影响CTC俘获的纯度和俘获率。
国外的产品如美国Streck公司的Cell-Free DNA BCT，Janssen diagnostics LLC的CellSave Preservation Tubes，在国内，不但价格高；而且对血小板的积聚功能没有影响。
所以，应用这些技术保存的血液，均不能应用于CTC芯片技术对CTC的俘获和富集。
发明内容
本发明提出的一种血液循环肿瘤细胞的俘获方法，可解决上述技术问题。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种血液循环肿瘤细胞的俘获方法，包括以下步骤：
s1:根据需要，用ACD抗凝管抽取外周血设定的量，上下颠倒混匀；再加入血小板抑制剂，低温4℃～8℃保存或者运输；
s2:把血液从低温条件下取出，放在室温下即20℃～25℃平衡到设定时间，再加入EDTA混匀，室温平衡；
s3:平衡后的血液开始进行血液过滤，进行肿瘤细胞的俘获。
由上述技术方案可知，本发明的血液循环肿瘤细胞的俘获方法，方便含有稀少细胞如CTC的全血的保存、稳定和运输，与基于肿瘤细胞形态大小的CTC芯片分离技术相适配，提高CTC俘获的纯度和俘获率。
总的来说，本发明采用CTC芯片技术-
Figure BDA0003200001970000031
FR1检测系统的全血保存、稳定和运输技术。主要体现三个方面：①低温储存条件保存所有血细胞的形态和细胞表面表位的完整性。②为了对抗冷却诱导的血小板活化，使用糖蛋白IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)抑制剂比如替罗非班或依替巴肽处理血液，防止血小板的聚集和凝血的出现；③应用短暂的钙离子交换治疗来逆转非特异性血小板与白细胞的粘连。这种方法既可以有效地从血液中分离出稀有的CTC，在保持细胞活力的同时，又保存了完整的高质量的RNA用于后续的基因分析。
与现有的技术相比，本发明所能解决的技术问题以及具有的优点如下：
①市场上有各种的血液保存技术，但都不是专门针对于基于肿瘤细胞形态大小的CTC的俘获技术的。所以，这些技术有内在的缺陷，不能很好的解决现有CTC俘获技术中的难题。
②ACD低温用在血液的保存方面应用广泛，对细胞形态和细胞表面的表位完整性都具有很好的保护作用。但低温本身带来的血小板聚集的不良反应能够通过本发明技术中的GPIIb/IIIa抑制剂的加入而被消除。
③本发明技术所应用的材料包括GPIIb/IIIa抑制剂已经被批准用于临床使用，方便且成本低廉。
④本发明的技术方案执行起来非常的方便简单，不需要对CTC的俘获技术本身作出任何的修改。
⑤最后，与常温环境储存相比，低温易于管理，显著降低细菌污染的风险。
附图说明
图1是本发明的方法流程图；
图2是低温导致血小板对CTC俘获芯片微孔的堵塞示意图；
图3是血小板抑制剂替罗非班和依替巴肽防止低温诱导的血小板数目的下降示意图；
图4是血小板抑制剂替罗非班阻止低温条件下血小板对CTC俘获芯片微孔的堵塞示意图；
图5是总RNA的电泳图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
如图1所示，本实施例所述的血液循环肿瘤细胞的俘获方法，包括：
包括以下步骤：
s1:根据需要，用ACD抗凝管抽取外周血设定的量，上下颠倒混匀；再加入血小板抑制剂，低温4℃～8℃保存或者运输；
s2:把血液从低温条件下取出，放在室温下即20℃～25℃平衡5分总，再加入EDTA混匀，室温平衡10分钟；
s3:平衡后的血液开始进行血液过滤，进行肿瘤细胞的俘获。
其中，所述血小板抑制剂采用使用糖蛋白IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)抑制剂，替罗非班或依替巴肽。血小板抑制剂有很多不同种类，GIIb/IIIa类抑制剂效果最好，而这类中，又以这两个比较常见。
其中，相关解释如下：
ACD本身是抗凝剂，防止血液凝集的；它的主要成分有葡萄糖，来营养血细胞的。一般在4度下，把血液抽入含有ACD的管子内，在低温下，转移，细胞是活的，不会死亡。
但是对与本发明来说，低温可以导致血液中的大量的血小板聚集，会堵住下一步的血液过滤时的膜上的孔径，影响血液过滤以及肿瘤细胞俘获。所以，为了抑制血小板聚集，本发明要加入血小板的抑制剂。抑制剂是放入ACD抗凝管内。一般步骤是：先把血液抽好，混容好，再加入血小板的抑制剂。
然后，血液在低温下开始转移到本发明公司的实验室或者第三方的实验室。
到达实验室以后，要把血液拿出来，放在实验室的温度下。由于血小板容易和白细胞粘到一起，所以需要加入EDTA到血液管子中，与血液混容。EDTA能够可逆性把血小板和白细胞分开。放入EDTA的血液，在室温下，放置15分钟，再进行肿瘤细胞的俘获。
这样三个步骤保证：
1.包括肿瘤细胞在内的血液所有的细胞是活的；
2.防止了血小板之间的聚集；
3.防止了血小板和白细胞粘到一起。
总的作用：使血液血细胞，包括肿瘤细胞，血小板，白细胞三者不要相互作用，各自独立。这样，血液过滤时，不会堵塞膜孔。以利于肿瘤细胞的俘获。
以下具体说明：
1、ACD(酸性柠檬酸葡萄糖溶液)抗凝管的血液保存；值得说明的是，ACD抗凝管对全血的保存是早已存在的事实，临床上已经有大量的应用。但ACD低温条件下对血小板的影响，以及与CTC膜芯片俘获技术的结合，本发明实例还是首次公开；
1)、ACD的抗凝成分:柠檬酸、柠檬酸三钠和葡萄糖组成。
2)、ACD的全血保护作用：ACD常温条件下72小时可导致30％的血细胞死亡。所以，ACD保存血液时必须是低温如4℃条件下保存数天。ACD抗凝管在冷藏的条件下能够充分维持血细胞形态和细胞上表位的完整。但低温条件下，血小板自发激活。它不仅引起血小板的聚集，而且还增加血小板与白细胞的粘连。这些聚集和粘连会堵塞CTC膜芯片上的微孔，影响CTC的俘获和富集。显微镜下膜孔及周围均可见由血小板和完整细胞组成的堆积聚集体(见图2)。
图2是一定量的A549肺癌上皮细胞截留(Spiked in)在健康人的外周血中，4℃保存72小时，再通过
Figure BDA0003200001970000061
FR1检测系统进行CTC的俘获和富集。
2、血小板膜受体GPIIb/IIIa(GPIIb/IIIa)的抑制剂；
1)在心血管医学中，血小板膜特异性GPIIb/IIIa受体抑制剂可预防缺血性事件中的凝血。本发明测试了两种抑制剂替罗非班(0.4微克/毫升)和依替巴肽(40微克/毫升)，并发现两者均能完全抑制全血冷藏72小时后血小板计数的下降(见图3)。数据显示它们完全抑制了新鲜和冷藏血液中凝血酶诱导的血小板聚集，凝血酶是最重要的途径催化纤维蛋白聚合的关键丝氨酸蛋白酶最终共同路径。替罗非班处理后的血液再与EDTA后储存(2～3mM，15分钟)抑制血小板与白细胞的黏附，从而释放这些血小板；
2)截留(Spiked in)肺癌上皮细胞A549:ACD抗凝管的血液加入替罗非班(0.4微克/毫升)4℃避光冷藏72小时后，室温下平衡，加入2mM的EDTA室温下放置15分钟。经过
Figure BDA0003200001970000071
FR1检测系统，进行过滤。膜孔非常的干净，几乎没有白细胞和血小板的污染，见图4。
3)CTC的俘获率检测：4℃冷储存用替罗非班-EDTA处理，CTC的回收率为89.8％±8.4％(n＝7)，明显高于ACD冷藏72小时，无替罗非班－EDTA处理的血液70.2％±7.5％(n＝7)和新鲜血液没什么区别90.6％±6.5％。
4)在实验中，本发明发现血液中有截留的肿瘤细胞低温保存72小时后仍高度的存活(＞90％)。
5)本发明使用
Figure BDA0003200001970000072
FR1检测系统，研究替罗非班联合EDTA稳定血小板的低温保存血液技术，结果已经确认GPIIb/IIIa抑制是必要和充分的，以防止血液冷藏所致的血小板聚集导致膜芯片孔的堵塞；与EDTA共同作用，高效的俘获血中的CTC。
3、接下来本发明评估了是否从保存的血液中分离出CTCs包含与肿瘤分子图谱相容的完整RNA。本发明将A549肺癌上皮细胞掺入健康献血者，应用血小板稳定治疗，用
Figure BDA0003200001970000073
FR1检测系统处理新鲜或储存的血液。本发明然后从
Figure BDA0003200001970000074
FR1检测系统中回收CTC并评估RNA质量(RNA完整性数，RIN)。
结果：4℃冷藏保存72小时的血液中分离出的肿瘤细胞平均RIN值为7.9±1.5(n＝10)，与从新鲜血液中分离出来的没有区别(8.2±0.9，n＝11；p＞0.1)；相反，血液常温储存72小时的肿瘤细胞的RNA(RIN＝4.2±1.3，n＝8；p＜0.0001)，提示RNA明显的降解，见图5。
以下是本发明的具体实验过程：
实验一：肿瘤细胞的截留率(spiked-in)检测
1.取2.4x106/ml肺癌上皮细胞A549 200ul，加入2mMCalcein-AM 100ul,室温下染色15分钟。离心200g 5分钟，倒掉上清液，用PBS冲洗细胞两次，以去除多余的染料。然后，将细胞重新悬浮在含有2mM EDTA和0.5％BSA的PBS中。
2.通过连续稀释的统计取样，将细胞稀释至10～100个细胞/50μL的理想浓度。随后，使用微量移液管将50μL稀释细胞悬浮液转移至96孔微量滴定板中，在显微镜下计数移植悬浮液中的细胞数。重复计数三次，以确定悬浮液中细胞的实际数量。重复这些操作后，调整用于加入3ml全血(各种存储条件下)中细胞悬浮的体积，以制备肿瘤细胞加标样本。
3.一定量的肿瘤细胞加入到3ml健康人的全血中，混溶。血液上机检测；本实验中的膜孔的大小为6x40uM,膜孔的总面积为6x6mm，真空泵的压力为2.0±0.1Kpa，流速为500uL/min。
4.膜上活的肿瘤细胞的计数。由于Calcein-AM只与活细胞的细胞核结合，在荧光显微镜蓝光的激发下发出绿光，而被观察和计数。
实验二、RNA完整性评价
具体RNA完整性评价使用标准方案和Qiagen RNeasy Plus微量试剂盒从CTC膜芯片上提取总RNA。使用NanoDrop UV-VIS仪器测定RNA浓度，并使用260/280nm处的吸光度比作为RNA纯度的指标(A260/280比～2)。使用安捷伦技术公司Agilent 2100生物分析仪测定RNA质量和RIN值。
综上所述，本发明具体以下特点：
1)ACD抗凝管低温冷藏全血：在保护血细胞的同时会引起血小板的积聚，导致膜芯片上膜孔的污染和堵塞，从而影响CTC的俘获；
2)血小板稳定剂包括两个方面：GPIIb/IIIa抑制剂和EDTA的联合应用；
3)关键技术的保护范围：仅限定在CTC细胞俘获和富集这一领域。
需要说明的是，GPIIb/IIIa抑制剂替罗非班和依替巴肽均为一高效可逆性非肽类血小板表面糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂。纤维蛋白原和血小板GPⅡb/Ⅲa受体结合是血小板聚集的最终共同通路，血小板活化可诱导GPⅡb/Ⅲa受体发生构象变化，导致受体与纤维蛋白原的亲和力明显增加，结合的纤维蛋白原可使血小板发生交联，引起血小板聚集。因此，不论血栓形成的原因如何，血小板的活化、黏附和聚集是动脉血栓形成过程中的关键步骤，其中GPⅡb/Ⅲa受体在血小板聚集和血栓形成过程中起着重要作用。替罗非班竞争性抑制纤维蛋白原和血小板GPⅡb/Ⅲa受体的结合，抑制血小板聚集、延长出血时间、抑制血栓形成。
如上面所阐述的在血小板聚集和血栓形成过程中通过不同的作用机制影响血中血小板聚集功能的药物或者因素均可能也会影响ACD冷藏状态下血小板的聚集而影响通过CTC芯片系统的CTC的俘获和富集。这些不同作用机制的药物也应该在本发明的保护范围之内。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (4)

1.一种血液循环肿瘤细胞的俘获方法，其特征在于：
包括以下步骤：
s1:根据需要，用ACD抗凝管抽取外周血设定的量，上下颠倒混匀；再加入血小板抑制剂，低温4℃～8℃保存或者运输；
s2:把血液从低温条件下取出，放在室温下即20℃～25℃平衡到设定时间，再加入EDTA混匀，室温平衡；
s3:平衡后的血液开始进行血液过滤，进行肿瘤细胞的俘获。
2.根据权利要求1所述的血液循环肿瘤细胞的俘获方法，其特征在于：所述血小板抑制剂采用替罗非班或依替巴肽。
3.根据权利要求1所述的血液循环肿瘤细胞的俘获方法，其特征在于：所述步骤s2中平衡时间为5分钟。
4.根据权利要求3所述的血液循环肿瘤细胞的俘获方法，其特征在于：所述步骤s2中加入EDTA混匀后室温平衡10分钟。
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