CN113462532B - 细胞分离和富集一体化装置及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物样本处理领域,具体公开了一种细胞分离和富集一体化装置,包括:样本过滤杯;过滤杯密封盖板,盖设在进液口处,样本过滤嘴,与所述样本过滤杯可拆卸连接,所述样本过滤嘴的顶端与底端均开设有开口,且所述样本过滤嘴的顶端开口与所述出液口连通;微孔滤膜,位于所述出液口与所述样本过滤嘴的底端开口之间;过滤嘴密封器件,与所述样本过滤嘴的底端连接,用于封堵所述样本过滤嘴的底端开口。本发明的一体化装置集成有细胞俘获、释放和回收功能,能够一体化实现复杂液基样本中稀有细胞分离与富集,在保证细胞活性和保留生化异质性的同时,提高了稀有细胞悬液的回收纯度。
Description
技术领域
本发明涉及生物样本处理领域,具体公开了一种细胞分离和富集一体化装置及方法。
背景技术
血行转移是癌症最重要的转移途径。循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,CTC)作为血行转移的先驱,是指从原发肿瘤脱落进入人外周血循环系统的肿瘤细胞。近年来,CTC的研究逐渐成为一个热点,研究者围绕CTC开展了CTC分离、富集、检测及下游分析等一系列研究。
血液的组成成分复杂,每毫升血液中包含107个白细胞,1010个红细胞,而仅有1-10个CTC。因此,从大量背景细胞中高活性、高纯度、高效率分离并富集CTC是进行CTC检测和分析的基本前提。目前,稀有细胞的富集包括基于物理性质的分离和基于生物亲和性的分离。近年来,逐渐有研究者将两种性质的富集方法组合,改善稀有细胞的分离效果。但是目前基于物理和生物亲和性两种性质分离稀有细胞的装置集成度低,由于将两种分离原理相结合,存在液体多次转移的问题,易造成细胞丢失以及细胞活性降低,阻碍后续对CTC开展单细胞水平的下游分析和个性化精准治疗。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种细胞分离和富集一体化装置及方法,旨在解决上述至少一个技术问题。
为实现上述目的,本发明提出了一种细胞分离和富集一体化装置,包括:
样本过滤杯,所述样本过滤杯的顶端开设有进液口,所述样本过滤杯的底端开设有出液口;
过滤杯密封盖板,盖设在所述进液口处;
样本过滤嘴,与所述样本过滤杯可拆卸连接,所述样本过滤嘴的顶端与底端均开设有开口,且所述样本过滤嘴的顶端开口与所述出液口连通;
微孔滤膜,位于所述出液口与所述样本过滤嘴的底端开口之间;
过滤嘴密封器件,与所述样本过滤嘴的底端连接,用于封堵所述样本过滤嘴的底端开口。
另外,本发明提出了使用上述所述的一体化装置进行细胞分离和富集的方法,包括以下步骤:
将血样自进液口倒入所述样本过滤杯内;
采用过滤嘴密封器件封堵所述样本过滤嘴的底端开口,并向所述样本过滤杯添加释放缓冲液,将过滤杯密封盖板盖设在所述进液口处,并对整个装置进行旋转和振荡,使微孔滤膜上俘获的细胞释放至释放缓冲液中;
打开过滤杯密封盖板,并向样本过滤杯中添加免疫磁珠缓冲液,再盖上过滤杯密封盖板进行孵育,孵育过程中进行旋转、振荡;
将磁铁放置于磁铁放置槽,将一体化装置倒置并静置,直至免疫磁珠和白细胞的混合物被吸附至过滤杯密封盖板上;
更换一张相同孔径且未经修饰的微孔滤膜,再次翻转一体化装置,依次打开过滤嘴密封器件和过滤杯密封盖板,对含有稀有细胞的上清液进行二次过滤。另外,本发明的上述细胞分离和富集一体化装置还可以具有如下附加的技术特征。
根据本发明的一个实施例,所述过滤杯密封盖板与所述样本过滤杯螺接或卡接;还包括第一密封垫圈,所述样本过滤杯的顶端开设有用于放置所述第一密封垫圈的第一凹槽。
根据本发明的一个实施例,所述过滤杯密封盖板上开设有用于放置磁铁的磁铁放置槽。
根据本发明的一个实施例,所述样本过滤嘴的顶端与所述样本过滤杯的底端螺接或卡接。
根据本发明的一个实施例,所述过滤嘴密封器件呈空心柱状体,且所述过滤嘴密封器件的顶端具有开口,所述样本过滤嘴的底端自所述过滤嘴密封器件顶端的开口插入所述过滤嘴密封器件内,并与所述过滤嘴密封器件螺接。
根据本发明的一个实施例,还包括第二密封垫圈,所述过滤嘴密封器件的内底面开设有用于放置所述第二密封垫圈的第二凹槽。
根据本发明的一个实施例,所述过滤嘴密封器件呈板状,所述过滤嘴密封器件与所述样本过滤嘴的底端开口扣合。
根据本发明的一个实施例,所述微孔滤膜的孔径为6-12μm。
根据本发明的一个实施例,所述微孔滤膜的上表面形成有修饰层,所述修饰层的材质选自聚乙烯醇、海藻酸凝胶、明胶、胶原中的任一种。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
1、本发明的一体化装置集成有细胞俘获、释放和回收功能,能够一体化实现复杂液基样本中稀有细胞分离与富集,解决了将基于物理和基于生物亲和性两种性质分离方法结合提高回收效率的同时带来的液体多次转移导致的细胞丢失和失活问题,在保证细胞活性和保留生化异质性的同时,提高了稀有细胞悬液的回收纯度;
2、本发明的一体化装置体积较小、操作简单,无需外力驱动即可完成整套操作,可实现快速床旁便携检测,为临床应用提供了有效手段;
3、本发明的一体化装置为下游单细胞分析检测、精准治疗、药物筛选等应用提供有力工具。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为本发明一个实施例中高纯度稀有细胞分离和富集一体化装置的透视图;
图2为图1的爆炸图;
图3为图1的截面图;
图4为图1中样本过滤杯的立体图;
图5为图1中样本过滤嘴的立体图;
图6为本发明另一个实施例中高纯度稀有细胞分离和富集一体化装置的爆炸图;
图7为图6的截面图;
图8为第二张滤膜上稀有目标细胞的荧光照片。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例,参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
需要说明,本发明实施例中所有方向性指示(诸如上、下、左、右、前、后……)仅用于解释在某一特定姿态(如附图所示)下各部件之间的相对位置关系、运动情况等,如果该特定姿态发生改变时,则该方向性指示也相应地随之改变。
另外,在本发明中如涉及“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此,限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中,“多个”的含义是至少两个,例如两个,三个等,除非另有明确具体的限定。
在本发明中,除非另有明确的规定和限定,术语“连接”、“固定”等应做广义理解,例如,“固定”可以是固定连接,也可以是可拆卸连接,或成一体;可以是机械连接,也可以是电连接;可以是直接相连,也可以通过中间媒介间接相连,可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系,除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言,可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
另外,本发明各个实施例之间的技术方案可以相互结合,但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础,当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在,也不在本发明要求的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者,按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂以及其他仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
本发明的实施例提供了一种高纯度稀有细胞分离和富集一体化装置100,如图1-5所示,该高纯度稀有细胞分离和富集一体化装置100包括样本过滤杯10、过滤杯密封盖板11、样本过滤嘴12、微孔滤膜13以及过滤嘴密封器件14,其中,样本过滤杯10具有样本过滤腔,可用于存储待处理生物样本,样本过滤杯10的顶端开设有进液口,样本过滤杯10的底端开设有出液口,过滤杯密封盖板11盖设在进液口处,样本过滤嘴12与样本过滤杯10可拆卸连接,样本过滤嘴12的顶端与底端均开设有开口,样本过滤嘴12的顶端与样本过滤杯10的底端对接,且样本过滤嘴12的顶端开口与样本过滤杯10的出液口连通;微孔滤膜13位于样本过滤杯10出液口与样本过滤嘴12的底端开口之间,过滤嘴密封器件14与样本过滤嘴12的底端连接,用于封堵样本过滤嘴12的底端开口。
在本发明的一个实施例中,继续参照图2,过滤杯密封盖板11与样本过滤杯10螺接,具体地,样本过滤杯10的顶端具有环绕进液口的第一平台101,过滤杯密封盖板11的内侧与第一平台101外侧设置有配套螺纹,此外,该高纯度稀有细胞分离和富集一体化装置100还包括第一密封垫圈15,边沿101的顶面开设有用于放置第一密封垫圈15的第一凹槽,过滤杯密封盖板11与样本过滤杯10通过螺接和第一密封垫圈15实现密封连接。
进一步地,过滤杯密封盖板11上开设有用于放置磁铁16的磁铁放置槽110,磁铁16可以为圆形,用于吸附免疫磁珠。
在本发明的一个实施例中,继续参照图3,样本过滤嘴12的顶端与样本过滤杯10的底端螺接,具体地,样本过滤杯10的底端具有环绕出液口的第二平台102,样本过滤嘴12的顶端具有环绕样本过滤嘴12开口的第三平台120,第二平台102和第三平台120设置有配套通孔,通过固定螺母17和连接螺杆18实现样本过滤嘴12与样本过滤杯10的连接。
值得一提的是,在本发明的一个实施例中,继续参照图1-3,过滤嘴密封器件14呈空心柱状体,且过滤嘴密封器件14的顶端具有开口,样本过滤嘴12的底端自过滤嘴密封器件14顶端的开口插入过滤嘴密封器件14内,并与过滤嘴密封器件14螺接。具体地,样本过滤嘴12外侧与过滤嘴密封器件14内侧设置有配套螺纹,且过滤嘴密封器件14的内底面开设有用于放置第二密封垫圈19的第二凹槽,过滤嘴密封器件14与样本过滤嘴12通过螺纹和第二密封垫圈19实现密封连接。
在本发明的其他实施例中,如图6-7所示,过滤杯密封盖板11与样本过滤杯10还可以卡接固定,过滤嘴密封器件14呈板状,过滤嘴密封器件14与样本过滤嘴12的底端开口扣合,样本过滤嘴12的顶端与样本过滤杯10的底端通过卡扣20连接。
此外,在本实施例中,微孔滤膜13的孔径为6-12μm,微孔滤膜13的上表面形成表面修饰生物兼容性好且易于可控切换的材料,具体可以选自聚乙烯醇、海藻酸凝胶、明胶、胶原中的任一种。
该高纯度稀有细胞分离和富集一体化装置100可以使用生物兼容性好、超疏水的材料制备得到,包括但不限于聚四氟乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯等材料。
本实施例中的高纯度稀有细胞分离和富集一体化装置100应用于从复杂液基样本中提取稀有细胞,这里所提到的复杂液基样本可以为人或动物的血液、痰液、胸水、腹水、肺泡灌洗液、心包积液、脑脊液或尿液中的任意一种,稀有细胞可以包括:肿瘤细胞、上皮细胞、巨噬细胞、胞外囊泡、细菌、真菌或孕妇体内外周血胎儿有核红细胞中的任意一种。
下面结合具体实施例详细说明高纯度稀有细胞分离和富集一体化装置100在人外周血中稀有细胞分离与富集中的应用,具体包括以下步骤:
1、样本制备
1mL未稀释全血中定量加入A549细胞(数目为N0,Cell Tracker Green和Hoechst预染),得到模拟肿瘤血样。
2、基于微孔滤膜的初次细胞俘获
使用8μm孔径,4μm孔-孔间距的微孔滤膜(表明经聚乙烯醇修饰)过滤模拟肿瘤血样,由于A549和部分白细胞存在尺寸重叠,所以加入的A549和部分尺寸较大的白细胞同时被俘获到表面功能化修饰的微孔滤膜上。
3、释放微孔滤膜上俘获的细胞
采用滤嘴密封器件14封装样本过滤嘴12的底端开口,并从样本过滤杯10顶端的开设有进液口加5mL释放缓冲液(PBS溶液或细胞培养基),采用过滤杯密封盖板11密封样本过滤杯10的进液口,在释放过程中,保持旋转和振荡状态,释放时间可以为3min,使初次俘获的细胞从微孔滤膜13上充分释放至释放缓冲液中。
4、免疫磁珠孵育
打开过滤杯密封盖板11,并快速向样本过滤杯10中加1mL含有CD45免疫磁珠的磁珠缓冲液(不含Ca2+、Mg2+的PBS溶液,0.1%BSA,2mM EDTA,pH 7.4),对初次俘获得到的A549、尺寸较大的白细胞和CD45免疫磁珠混合悬液进行孵育;在孵育过程中,保持混匀(旋转震荡或者涡旋)状态,孵育时间可以为30min。
需要说明的是,在本实施步骤中,可根据实际情况(如,磁珠货源、磁珠规格等),确定投加CD45免疫磁珠的量。
5、免疫磁珠负选法提纯稀有细胞
将磁铁16放置于磁铁放置槽110,将整个一体化装置倒置并在室温静置,至免疫磁珠和白细胞的混合物被吸附至过滤杯密封盖板11,液体变澄清,细胞提纯时间可以为10min。
6、细胞二次过滤富集
在一体化装置倒置并不影响样本过滤杯10中磁珠缓冲液的情况下,打开一体化装置样本过滤杯10和样本过滤嘴12连接卡扣,取出第一张已经完成细胞释放的微孔滤膜13,并快速更换一张相同孔径且未经聚乙烯醇修饰的微孔滤膜13,用于富集提纯后的细胞。更换微孔滤膜13后,保持磁铁16置于磁铁放置槽110内不变,再次翻转一体化装置,依次打开装置过滤嘴密封器件14和过滤杯密封盖板11,对含有稀有细胞的磁珠缓冲液进行二次过滤,实现对稀有细胞的回收、富集,并使用封片剂将第二张微孔滤膜进行封片。
7、细胞鉴定和计数
如图8所示,镜下观察,计数第二张滤膜上A549(NA)和WBC(NW),计算A549回收效率及纯度,实验结果详见表1。
表1.模拟肿瘤血样分离A549实验结果
实验组 | N0 | NA | NW | 纯度 | 回收效率 |
1 | 4822 | 2715 | 646 | 80.8% | 56.3% |
2 | 4822 | 3099 | 799 | 79.5% | 64.3% |
3 | 7557 | 5509 | 1278 | 81.2% | 72.9% |
从表1中计算分析可以得出,本发明提出的分离富集分析方法实现了大体积液体样本中稀有目标细胞的高效(高回收效率、高纯度)分离。其中,平均纯度为80.48±0.87%,回收后的稀有目标细胞的回收率为57.83±10.62%。
其中,纯度=NA/(NW+NA);回收率=NA/N0。
以上对本公开的实施例进行了描述。但是,这些实施例仅仅是为了说明的目的,而并非为了限制本公开的范围。本公开的范围由所附权利要求及其等价物限定。不脱离本公开的范围,本领域技术人员可以做出多种替代和修改,这些替代和修改都应落在本公开的范围之内。
Claims (7)
1.一种采用一体化装置进行细胞分离和富集的方法,其特征在于,所述一体化装置包括:
样本过滤杯,所述样本过滤杯的顶端开设有进液口,所述样本过滤杯的底端开设有出液口;
过滤杯密封盖板,盖设在所述进液口处;所述过滤杯密封盖板与所述样本过滤杯螺接或卡接;还包括第一密封垫圈,所述样本过滤杯的顶端开设有用于放置所述第一密封垫圈的第一凹槽;
样本过滤嘴,与所述样本过滤杯可拆卸连接,所述样本过滤嘴的顶端与底端均开设有开口,且所述样本过滤嘴的顶端开口与所述出液口连通;
微孔滤膜,位于所述出液口与所述样本过滤嘴的底端开口之间;
过滤嘴密封器件,与所述样本过滤嘴的底端连接,用于封堵所述样本过滤嘴的底端开口;
所述过滤杯密封盖板上开设有用于放置磁铁的磁铁放置槽;
所述方法包括以下步骤:将血样自进液口倒入所述样本过滤杯内;
采用过滤嘴密封器件封堵所述样本过滤嘴的底端开口,并向所述样本过滤杯添加释放缓冲液,将过滤杯密封盖板盖设在所述进液口处,并对整个装置进行旋转和振荡,使微孔滤膜上俘获的细胞释放至释放缓冲液中;
打开过滤杯密封盖板,并向样本过滤杯中添加免疫磁珠缓冲液,再盖上过滤杯密封盖板进行孵育,孵育过程中进行旋转、振荡;
将磁铁放置于磁铁放置槽,将一体化装置倒置并静置,直至免疫磁珠和白细胞的混合物被吸附至过滤杯密封盖板上;
更换一张相同孔径且未经修饰的微孔滤膜,再次翻转一体化装置,依次打开过滤嘴密封器件和过滤杯密封盖板,对含有稀有细胞的上清液进行二次过滤。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述样本过滤嘴的顶端与所述样本过滤杯的底端螺接或卡接。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述过滤嘴密封器件呈空心柱状体,且所述过滤嘴密封器件的顶端具有开口,所述样本过滤嘴的底端自所述过滤嘴密封器件顶端的开口插入所述过滤嘴密封器件内,并与所述过滤嘴密封器件螺接。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,还包括第二密封垫圈,所述过滤嘴密封器件的内底面开设有用于放置所述第二密封垫圈的第二凹槽。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述过滤嘴密封器件呈板状,所述过滤嘴密封器件与所述样本过滤嘴的底端开口扣合。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法,其特征在于,所述微孔滤膜的孔径为6-12μm。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述微孔滤膜的上表面形成有修饰层,所述修饰层的材质选自聚乙烯醇、海藻酸凝胶、明胶、胶原中的任一种。
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