CN114891608A - 用于过滤有核细胞的过滤器和使用了其的过滤方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于过滤有核细胞的过滤器，其能够提高有核细胞的回收率。本发明的过滤器是用于过滤有核细胞的过滤器，其以金属和金属氧化物中的至少任一者作为主成分，并形成有多个贯通孔，上述多个贯通孔不包括正方形，上述贯通孔的内切椭圆的长径小于上述有核细胞的核的尺寸，上述贯通孔的内切椭圆是与划定上述贯通孔的开口的所有边相切的椭圆。

Description

用于过滤有核细胞的过滤器和使用了其的过滤方法
本申请是申请日为2018年4月19日、申请号为201810357055.6、发明名称为“用于过滤有核细胞的过滤器和使用了其的过滤方法”的申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及用于过滤有核细胞的过滤器和使用了其的过滤方法。
背景技术
专利文献1公开了使用细胞捕捉过滤材料从包含红细胞、有核细胞和血小板而成的液体中浓缩单核细胞和血小板的方法。专利文献1的细胞捕捉过滤材料捕捉有核细胞和血小板，并使红细胞之类的不需要的细胞通过。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2009-284860号公报
发明内容
发明要解决的问题
然而，专利文献1的细胞捕捉过滤材料在提高有核细胞的回收率方面尚有改善的余地。
本发明的目的在于，提供一种用于过滤有核细胞的过滤器和使用了其的过滤方法，所述过滤器能够提高有核细胞的回收率。
用于解决问题的方法
本发明的一个方式的过滤器是用于过滤有核细胞的过滤器，
其以金属和金属氧化物中的至少任一者作为主成分，
并形成有多个贯通孔(不包括正方形)，
上述贯通孔的内切椭圆的长径小于上述有核细胞的核的尺寸，上述贯通孔的内切椭圆是与划定上述贯通孔的开口的所有边相切的椭圆。
本发明的一个方式的过滤方法是过滤有核细胞的方法，其包括如下步骤：
准备过滤器的步骤，所述过滤器以金属和金属氧化物中的至少任一者作为主成分，并形成有多个贯通孔(不包括正方形)，上述贯通孔的内切椭圆的长径小于上述有核细胞的核的尺寸，上述贯通孔的内切椭圆是与划定上述贯通孔的开口的所有边相切的椭圆；
使包含上述有核细胞的液体通过上述过滤器的步骤。
发明的效果
根据本发明，可提供用于过滤有核细胞的过滤器和使用了其的过滤方法，所述过滤器能够提高有核细胞的回收率。
附图说明
图1是本发明的实施方式1的过滤器的结构示意图。
图2是本发明的实施方式1的过滤器的一部分的放大立体图。
图3是从厚度方向观察图2的过滤器的一部分时的示意图。
图4是本发明的实施方式1的过滤器设置有支承基材时的示意图。
图5是本发明的实施方式1的变形例的过滤器的示意图。
图6是本发明的实施方式1的其它变形例的过滤器的一部分的放大截面图。
图7是本发明的实施方式1的其它变形例的过滤器的一部分的放大截面图。
图8是本发明的实施方式1的其它变形例的过滤器的一部分的放大截面图。
具体实施方式
(实现本发明的经过)
专利文献1中，使用由无纺布构成的细胞捕捉过滤材料来捕捉有核细胞和血小板，并使红细胞之类的不需要的细胞通过，从而从血液中分离出单核细胞。然而，专利文献1的细胞捕捉过滤器的单核细胞回收率为74％左右，在提高捕捉对象细胞的回收率的方面尚有改善的余地。
本发明人等进行了深入研究，结果发现：通过使用以金属和金属氧化物中的至少任一者作为主成分的过滤器，并对包含有核细胞的液体进行过滤，能够提高作为捕捉对象的有核细胞的回收率，从而完成了本发明。
本发明的一个方式的过滤器是用于过滤有核细胞的过滤器，
其以金属和金属氧化物中的至少任一者作为主成分，
并形成有多个贯通孔(不包括正方形)，
上述贯通孔的内切椭圆的长径小于上述有核细胞的核的尺寸，上述贯通孔的内切椭圆是与划定上述贯通孔的开口的所有边相切的椭圆。
通过这样的构成，能够提高有核细胞的回收率。
上述过滤器中，上述贯通孔的形状可以为多边形。
通过这样的构成，能够提高有核细胞的回收率。
上述过滤器中，上述贯通孔的形状可以为长方形。
通过这样的构成，能够在缩短过滤时间的同时，提高有核细胞的回收率。
上述过滤器中，可以进一步具备：
具有上述多个贯通孔的过滤部，所述多个贯通孔贯通彼此相对的第一主面和第二主面；以及
以包围上述过滤部的外周的方式配置的框部，
在上述过滤部之内，远离上述框部的中央侧区域的上述过滤部的膜厚小于比上述中央侧区域更靠近上述框部的边缘侧区域的上述过滤部的膜厚。
通过这样的构成，能够在过滤部的第一主面和第二主面中的至少任一个表面的一部分形成凹面。利用形成有凹面的一侧来捕捉细胞这样的情况下，容易因流体的表面张力而在凹面形成流体积存，因此能够抑制所捕捉的细胞发生干燥。因而，能够提供被过滤部捕捉的细胞的处理性。
上述过滤器中，上述金属和上述金属氧化物中的至少任一者在磷酸缓冲生理盐水中的浸渍电位可以高于0.03V，所述浸渍电位以浸渍在饱和氯化钾溶液中的由氯化银形成的参比电极作为基准。
通过这样的构成，能够防止作为过滤器成分的金属或金属氧化物溶出至包含有核细胞的液体中。
上述过滤器中，上述金属和上述金属氧化物中的至少任一者可以含有选自金、银、铜、铂、镍、钯、它们的合金和它们的氧化物中的至少1种。
通过这样的构成，能够进一步提高有核细胞的回收率。
本发明的一个方式的过滤方法是过滤有核细胞的方法，其包括如下步骤：
准备过滤器的步骤，所述过滤器以金属和金属氧化物中的至少任一者作为主成分，并形成有多个贯通孔(不包括正方形)，上述贯通孔的内切椭圆的长径小于上述有核细胞的核的尺寸，上述贯通孔的内切椭圆是与划定上述贯通孔的开口的所有边相切的椭圆；
使包含上述有核细胞的液体通过上述过滤器的步骤。
通过这样的构成，能够提高有核细胞的回收率。
上述过滤方法中，上述贯通孔的形状可以为多边形。
通过这样的构成，能够提高有核细胞的回收率。
上述过滤方法中，上述贯通孔的形状可以为长方形。
通过这样的构成，能够在缩短过滤时间的同时，进一步提高有核细胞的回收率。
上述过滤方法中，上述过滤器可以具备：
具有上述多个贯通孔的过滤部，所述多个贯通孔贯通彼此相对的第一主面和第二主面；以及
以包围上述过滤部的外周的方式配置的框部，
在上述过滤部之内，远离上述框部的中央侧区域的上述过滤部的膜厚小于比上述中央侧区域更靠近上述框部的边缘侧区域的上述过滤部的膜厚。
通过这样的构成，能够利用在过滤部的第一主面和第二主面中的至少任一个表面的一部分上形成的凹面来捕捉细胞。由于容易因流体的表面张力而在凹面形成流体积存，因此能够抑制所捕捉的细胞发生干燥。因而，能够提高被过滤部捕捉的细胞的处理性。
上述过滤方法中，上述金属和上述金属氧化物中的至少任一者在磷酸缓冲生理盐水中的浸渍电位可以高于0.03V，所述浸渍电位以浸渍在饱和氯化钾溶液中的由氯化银形成的参比电极作为基准。
通过这样的构成，能够防止作为过滤器成分的金属或金属氧化物溶出至包含有核细胞的液体中。
上述过滤方法中，上述金属和上述金属氧化物中的至少任一者可以含有选自金、银、铜、铂、镍、钯、它们的合金和它们的氧化物中的至少1种。
通过这样的构成，能够进一步提高有核细胞的回收率。
上述过滤方法中，使包含上述有核细胞的液体通过上述过滤器的步骤可以包括将活细胞与死细胞分离的步骤。
通过这样的构成，能够将活细胞与死细胞分离。
本发明的一个方式的试剂盒是包含用于过滤有核细胞的过滤器且用于实施上述过滤方法的试剂盒，
上述过滤器以金属和金属氧化物中的至少任一者作为主成分，且形成有多个贯通孔(不包括正方形)，上述贯通孔的内切椭圆的长径小于上述有核细胞的核的尺寸，上述贯通孔的内切椭圆是与划定上述贯通孔的开口的所有边相切的椭圆。
通过这样的构成，能够提高有核细胞的回收率。
以下，针对本发明的实施方式1，一边参照附图一边说明。此外，在各图中为了便于说明而夸大示出各要素。
(实施方式1)
[过滤器的构成]
图1是本发明的实施方式1的过滤器10的结构示意图。图2是本发明的实施方式1中的过滤器10的一部分的放大立体图。图1和图2中的X、Y、Z方向分别表示过滤器10的纵向、横向、厚度方向。如图1所示那样，过滤器10具备过滤部11和设置在过滤部11外周的框部15。如图2所示那样，过滤器10具有彼此相对的第一主面PS1和第二主面PS2。过滤部11具备形成有多个贯通孔12的过滤器基体部14，所述多个贯通孔12贯通第一主面PS1和第二主面PS2。
过滤器10通过使包含有核细胞的液体(细胞悬浮液)穿过过滤部11来过滤有核细胞。
本说明书中，“有核细胞”是指核仁与细胞质被核膜隔开的细胞。
<材质>
形成过滤器10的基体部分的过滤器基体部14的构成材料以金属和/或金属氧化物作为主成分。过滤器基体部14可以为例如金、银、铜、铂、镍、钯、它们的合金和它们的氧化物。
过滤器10的最外表层可以由难以向细胞悬浮液中溶出的金属和/或金属氧化物构成。例如，过滤器10的最外表层被在磷酸缓冲生理盐水中的浸渍电位高于0.03V的金属覆盖时，能够抑制构成过滤器10的材料溶出至细胞悬浮液，所述浸渍电位以浸渍在饱和氯化钾溶液中的由氯化银形成的参比电极作为基准。由此能够降低对细胞造成的应力。或者，过滤器10的最外表层也可以由亲水性的材料构成。例如，对水系的细胞悬浮液进行处理时，能够缩短处理时间，因此能够降低对细胞造成的应力。
<外形>
过滤器10的外形是例如圆形、长方形或椭圆形。实施方式1中，过滤器10的外形为大致圆形。通过将过滤器10的外形制成大致圆形，能够使流体均匀地流过过滤器10的主面(例如过滤部11的第一主面PS1)。需要说明的是，本说明书中，“大致圆形”是指长径的长度相对于短径的长度之比为1.0以上且1.2以下。
<过滤部>
过滤部11是形成有多个贯通孔12的板状结构体。过滤部11的形状是例如圆形、长方形、椭圆形。实施方式1中，过滤部11的形状为大致圆形。通过将过滤部11的形状制成大致圆形，能够使流体均匀地流过过滤部11的第一主面PS1。
图3是从厚度方向(Z方向)观察过滤部11的一部分时的示意图。如图3所示那样，多个贯通孔12周期性地配置在过滤部11的第一主面PS1和第二主面PS2上。具体而言，多个贯通孔12在过滤部11中等间隔地设置成矩阵状。
实施方式1中，贯通孔12从过滤部11的第一主面PS1侧、即Z方向来看具有长方形的形状。如图3所示那样，贯通孔12的形状是X方向为长边d1、Y方向为短边d2的长方形。需要说明的是，贯通孔12从Z方向来看具有正方形以外的形状。贯通孔12从Z方向来看可以是例如菱形、多边形等形状。需要说明的是，多边形可以包含不包括正方形在内的正多边形。
实施方式1中，贯通孔12的长边d1例如形成为短边d2的1.2倍以上且1.8倍以下。
实施方式1中，向垂直于过滤部11的第一主面PS1的面投影而成的贯通孔12的形状(截面形状)为长方形。具体而言，贯通孔12的截面形状是过滤器10的半径方向的一边长度大于过滤器10的厚度方向的一边长度的长方形。需要说明的是，贯通孔12的截面形状不限定于长方形，可以为例如平行四边形或梯形等锥形，也可以为对称形状，还可以为不对称形状。
实施方式1中，多个贯通孔12沿着从过滤部11的第一主面PS1侧(Z方向)来看与长方形的各边平行的2个排列方向、即图3中的X方向和Y方向以相等的间隔进行设置。像这样，通过以长方形格子排列来设置多个贯通孔12，能够提高开口率，能够降低流体通过过滤器10的通过阻力。通过这样的构成，能够缩短处理时间，降低对细胞造成的应力。此外，由于多个贯通孔12的排列对称性提高，因此容易观察过滤器。
需要说明的是，多个贯通孔12的排列不限定于长方形格子排列，可以为例如准周期排列或周期排列。作为周期排列的例子，只要是方形排列，则可以是2个排列方向的间隔不相等的长方形排列，也可以是三角形格子排列或正三角形格子排列等。需要说明的是，贯通孔12只要在过滤部11设置有多个即可，其排列没有限定。
需要说明的是，将划定贯通孔12的开口的各边加以连接的角部可以进行了倒圆角加工(日文原文：R加工)。即，贯通孔12的角部可以形成为圆形。通过这样的构成，就贯通孔12的角部而言，能够抑制细胞损伤，进一步确保细胞的活性。
贯通孔12的间隔根据要分离的细胞种类(尺寸、形态、性质、弹性)或量来适当设计。此处，贯通孔12的间隔是指：如图3所示那样，从过滤部11的第一主面PS1侧观察贯通孔12时，任意的贯通孔12的中心与相邻的贯通孔12的中心之间的距离b1和b2。具体而言，间隔b1是指贯通孔12的短边方向(X方向)的贯通孔12的中心与相邻的贯通孔12的中心之间的距离。间隔b2是指贯通孔12的长边方向(Y方向)的贯通孔12的中心与相邻的贯通孔12的中心之间的距离。需要说明的是，实施方式1中，任意的贯通孔12的中心是指长方形的贯通孔12的对角线的交点。
在周期排列的结构体的情况下，贯通孔12的间隔b1例如大于贯通孔12的长边d1的1倍且为10倍以下，优选为贯通孔12的长边d1的3倍以下。贯通孔12的间隔b2例如大于贯通孔12的短边d2的1倍且为10倍以下，优选为贯通孔12的短边d2的3倍以下。或者，过滤部11的开口率例如为10％以上，开口率优选为25％以上。通过这样的构成，能够降低流体通过过滤部11的通过阻力。因此，能够缩短处理时间，能够减低对细胞造成的应力。需要说明的是，开口率通过(贯通孔12所占的面积)/(假设没开通贯通孔12时的第一主面PS1的投影面积)来计算。
以贯通孔12的内切椭圆的长径小于有核细胞的核的尺寸的方式进行设计。本说明书中，“贯通孔12的内切椭圆”是具有长径和短径的椭圆，是指从过滤部11的第一主面PS1侧来看，在贯通孔12内画出的椭圆之中长径最大的椭圆。即，“贯通孔12的内切椭圆”是指：与构成贯通孔12的过滤器基体部14的内壁相切的椭圆之中长径最大的椭圆。换言之，“贯通孔12的内切椭圆”是指：从过滤部11的第一主面PS1侧来看，与划定贯通孔12的开口的所有边相切的椭圆。此外，“贯通孔12的内切椭圆”的长径与短径可以为不同的长度，也可以为相同的长度。本说明书中，“贯通孔12的内切椭圆”可以包含正圆。
此外，本说明书中，“有核细胞的核的尺寸”是指：将有核细胞配置在液体中并利用显微镜进行观察，在将有核细胞的核的外周的任意两点链接而成的线段之中，将最长的线段作为有核细胞的核的长度时，多个有核细胞的核的长度的平均值。
多个贯通孔12的尺寸设计成大致相同。相同形状的多个贯通孔12呈周期排列的构成时，多个贯通孔12的尺寸的标准偏差优选较小。
过滤部11从过滤部11的中心朝向外侧具有均匀的膜厚。换言之，沿着过滤部11的Z方向切断时，过滤部11具有平板状的截面形状。过滤部11的厚度优选大于划定贯通孔12的边之中的最短边(例如短边d2)的0.1倍且为100倍以下。过滤部11的厚度更优选大于贯通孔12的短边d2的0.5倍且为10倍以下。通过这样的构成，能够降低过滤器10对流体的阻力，能够缩短处理时间。其结果，能够降低对细胞造成的应力。
过滤部11的表面(第一主面PS1)的算术平均粗糙度优选小于有核细胞的核的尺寸。通过这样的构成，细胞对过滤部11的表面(第一主面PS1)的附着得以降低，能够提高细胞的回收率。需要说明的是，算术平均粗糙度的测定中，使用ULVAC，Inc.制造的触针式表面形状测定机DEKTAK150(注册商标)，将过滤部11的表面之中的5处测定值的平均值作为过滤部11的算术平均粗糙度。
过滤部11中，与包含有核细胞的液体接触的第一主面PS1可以平滑地形成。具体而言，过滤部11的第一主面PS1也可以由没有凹凸的均匀平面形成。换言之，过滤部11的第一主面PS1上的多个贯通孔12的开口可以形成在同一平面上。此外，过滤部11之中的未形成贯通孔12的部分、即过滤器基体部14相连而一体地形成。通过这样的构成，细胞对过滤部11的表面(第一主面PS1)的附着得以降低，能够容易地回收所捕捉的有核细胞。
对于过滤部11的贯通孔12而言，第一主面PS1侧的开口与第二主面PS2侧的开口借助连续的壁面而连通。具体而言，贯通孔12以第一主面PS1侧的开口能够投影至第二主面PS2侧的开口的方式进行设置。即，从第一主面PS1侧来观察过滤部11时，贯通孔12以第一主面PS1侧的开口与第二主面PS2侧的开口重合的方式进行设置。实施方式1中，贯通孔12以其内壁垂直于第一主面PS1和第二主面PS2的方式进行设置。
<框部>
框部15设置于过滤部11的外周，是与过滤部11相比平均单位面积的贯通孔12的数量少的部分。框部15的贯通孔12的数量为过滤部11的贯通孔12的数量的1％以下。框部15的厚度可以厚于过滤部11的厚度。通过这样的构成，能够提高过滤器10的机械强度。
将过滤器10与装置连接并使用时，框部15也可以作为连接过滤器10和装置的连接部而发挥功能。此外，框部15也可以显示过滤器的信息(贯通孔12的尺寸等)。
框部15从过滤部11的第一主面PS1侧来看形成为环状。从第一主面PS1侧观察过滤器10，框部15的中心与过滤部11的中心保持一致。即，框部15与过滤器形成在同心圆上。
从处理容易度以及与系统接合的容易度的观点出发，过滤器10可以被固定于夹具并使用。夹具可以由例如能够进行伽马灭菌的材料构成。夹具例如可以由包含聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚氨酯、聚苯乙烯、硅橡胶、ABS树脂、聚酰胺、聚酰胺酰亚胺、聚砜、天然橡胶、胶乳、氨基甲酸酯橡胶、硅橡胶、乙烯-乙酸乙烯酯、聚酯类、环氧类、酚类、二氧化硅、氧化铝、金、铂、镍、不锈钢、钛等的材料形成。通过由这样的材料来构成夹具，能够降低对细胞造成的应力。
[过滤方法]
针对使用了过滤器10的过滤方法进行说明。
首先准备过滤器10。该工序中，准备根据有核细胞的核的尺寸而选择了贯通孔12的尺寸的过滤器10。具体而言，准备具有比成为过滤对象的有核细胞的核的尺寸小的贯通孔12的过滤器10。
例如，在准备过滤器10的工序中，通过使用测微计或血细胞计数器等来确认多个有核细胞的核的尺寸，也可以选择具有比有核细胞的核的尺寸小的贯通孔12的尺寸的过滤器10。或者，通过拍摄多个有核细胞的照片，并测定多个有核细胞的核的尺寸，也可以选择具有比有核细胞的核的尺寸小的贯通孔12的尺寸的过滤器10。需要说明的是，过滤器10的选择不限定于它们。
过滤器10被安装于装置。具体而言，通过夹持过滤器10的框部15而将过滤器10安装于装置。
接着，使细胞悬浮液通过过滤器10。本说明书中，“细胞悬浮液”是包含有核细胞的流体。在多数情况下，包含有核细胞的流体是液体。作为液体，为例如包含氨基酸、蛋白质、血清等的培养溶液、磷酸缓冲生理盐水或水。细胞悬浮液中，除了包含细胞和流体之外，也可以包含树脂制粒子等非生物来源物质、骨片或肉片等组织的一部分、死细胞等。
像这样，通过使包含有核细胞的液体通过过滤部11，从而从液体中分离出有核细胞。实施方式1中，以过滤部11的贯通孔12的内切椭圆的长径小于有核细胞的核的尺寸的方式进行设计。因此，有核细胞被捕捉到过滤部11的第一主面PS1上而不通过贯通孔12。
作为使细胞悬浮液通过过滤器10的方法，有例如下述方法：使细胞悬浮液从相对于过滤部11的第一主面PS1的大致铅直上方借助重力通过的方法。除此之外，有下述方法：使细胞悬浮液接触过滤部11的第一主面PS1，并且对细胞悬浮液施加压力而使其通过的方法(挤压)；或者使细胞悬浮液接触过滤部11的第一主面PS1，并从第二主面PS2抽吸而使细胞悬浮液通过的方法(抽吸)等。需要说明的是，在使包含有核细胞的液体通过过滤部11的工序中，优选尽可能不对细胞施加应力。例如，在施加压力的情况下，优选设为有核细胞不发生变形的程度的压力。更优选不施加压力而利用液体的自重使液体通过过滤部11。或者，优选通过提高过滤部11的开口率来缩短处理时间，减少应力作用于有核细胞的时间。
此外，可以使细胞悬浮液以在液体中浮游有有核细胞的状态通过过滤器10。浮游在液体中的有核细胞大致呈现球状，因此能够提高作为捕捉对象的有核细胞的回收率。即，能够提高想要捕捉的有核细胞的尺寸精度。
此外，通过使其多次通过过滤器10，能够提高作为捕捉对象的有核细胞的尺寸精度。
在使用了过滤器10的过滤方法中，例如可以使用过滤用容器来进行过滤。过滤用容器是例如外径为14mm、内径为6mm、高度为55mm的圆筒形容器，底部可以安装有过滤器10。需要说明的是，过滤容器不限定于此，可以使用各种形状和尺寸的容器。
[过滤器的制造方法]
针对过滤器10的代表性制造方法进行说明。过滤器10通过下述工序进行制造。
<供电膜的形成>
使用溅射装置，在硅基板的上表面形成Cu供电膜。该供电膜在形成后述过滤器10的过滤器基体部14时成为供电源。此时，出于确保硅基板与供电膜的接合性的目的而可以形成Ti等中间层。
形成Cu供电膜的条件如下所示。
溅射气体：氩气
溅射装置的真空度：5.0×10-4Pa
施加电力：DC500W
溅射时间：形成Cu膜时/27分钟
形成Ti膜时/3分5秒
<抗蚀图像的形成>
在形成于硅基板上表面的供电膜上形成抗蚀图像。
使用旋涂机等，在形成于硅基板上表面的供电膜上形成规定膜厚的抗蚀膜。接着，隔着形成有规定图案的光掩模对抗蚀剂进行曝光，并进行显影处理，从而形成抗蚀图像。
抗蚀膜的涂布条件如下所示。
抗蚀剂：酚醛清漆系树脂+有机溶剂
旋涂机的转速：1130rpm
抗蚀膜厚：2μm
利用旋涂机将上述抗蚀剂涂布在硅基板上表面后，在氮气气氛下以130℃使溶剂挥发后进行冷却，从而形成抗蚀膜。
照射0.25秒钟的包含波长365nm且能量密度为2500J/m2的光线，对抗蚀剂进行曝光。
使曝光部分接触碱性溶液来进行显影处理。
<过滤器基体部的形成>
在抗蚀图像的开口部形成过滤器基体部14。将预先形成的供电膜作为供电源，使用电镀法，形成包含镀镍膜的过滤器基体部14。
过滤器基体部14的形成条件如下所示。
前处理：通过在稀硫酸中浸渍60秒来活化供电膜的表面。
镀液：氨基磺酸镍镀液液温＝55℃pH＝4.0
镀敷速度：0.5μm/分钟
镀敷：一边摇动，一边进行电镀。
<抗蚀剂的溶解和剥离>
通过在丙酮溶液中对过滤器基体部14施加15分钟的超声波，从而使抗蚀膜溶解，并剥离抗蚀剂。
<支承基材的形成>
使用过滤器10进行过滤时，根据需要可以对过滤器10设置支承基材。
图4示出安装有支承基材13的过滤器10的大致结构。如图4所示那样，可以在过滤器10的第二主面PS2侧设置有支承基材13。支承基材13设置有正方形形状的多个开口部13a。支承基材13的厚度例如为14μm，开口部13a的一边、即横条的间隔A为260μm、横条的宽度B为14μm。
像这样，通过设置支承基材13，能够防止过滤器10在过滤中发生破损。支承基材通过下述工序来制作。
在形成有过滤器10的基体的硅基板的上表面再次涂布感光性抗蚀剂而形成抗蚀膜后，隔着光掩模对抗蚀剂进行曝光，并进行显影处理，从而形成抗蚀图像。此时，以抗蚀图像横跨多个过滤器10的基体的方式进行曝光、显影处理。需要说明的是，抗蚀图像横跨过滤器10的基体的部分在过滤器10完成后成为过滤器10的开口部。换言之，抗蚀图像所横跨的过滤器10的基体数根据过滤器10所要求的开口率来适当决定。
在抗蚀图像的开口部形成过滤器基体部14。将预先形成的供电膜作为供电源，使用电镀法，形成包含镀镍膜的支承基材。需要说明的是，支承基材的宽度根据过滤器10所要求的强度来适当决定。
通过在丙酮溶液中对支承基材施加15分钟的超声波而使抗蚀膜溶解，从而剥离抗蚀剂。
<供电膜的去除>
去除供电膜，并从硅基板分离过滤器基体部14和支承基材，从而完成用于过滤有核细胞的过滤器10。
供电膜的去除通过在60％的过氧化氢水溶液与乙酸与纯水以1∶1∶20的混合比制作而成的水溶液中在25℃的环境下浸渍48小时来进行。
[效果]
根据实施方式1所述的过滤器10，能够发挥出如下效果。
过滤器10以金属和金属氧化物中的至少任一者作为主成分。此外，过滤器10具备形成有多个贯通孔12的过滤部11。通过这样的构成，过滤部11的贯通孔12不易变形，能够捕捉作为捕捉对象的有核细胞，并提高有核细胞的回收率。
以贯通孔12的内切椭圆的长径小于有核细胞的核的尺寸的方式进行设计。通过这样的构成，能够进一步提高有核细胞的回收率。
贯通孔12的形状形成为长方形。通过这样的构成，与正方形形状的贯通孔相比能够减少过滤时间。若具体说明，则有核细胞的细胞质与核相比容易变形。在正方形形状的贯通孔的情况下，如果用过滤部来捕捉有核细胞，则细胞质发生变形，贯通孔有可能被变形的细胞质堵塞。另一方面，就长方形形状的贯通孔12而言，即使在捕捉有核细胞时细胞质发生变形而堵塞一部分贯通孔12，液体也可从贯通孔12的其它部分穿过。因此，长方形形状的贯通孔12与正方形形状的贯通孔相比容易使液体通过，能够减少过滤时间。
过滤部11的第一主面PS1平滑地形成。通过这样的构成，能够使被第一主面PS1捕捉的有核细胞轻易地从过滤部11分离，因而使回收变得简单。
关于有核细胞的核的形状，除了正圆之外，还存在椭圆形等各种形状。过滤器10中，贯通孔12的内切椭圆的长径形成得比有核细胞的核的尺寸小，且贯通孔12的内切椭圆是与划定贯通孔12的开口的所有边相切的椭圆。通过这样的构成，针对除了正圆形状的核之外各种形状的核也能够确实地捕捉，能够提高回收率。
此外，在使用了过滤器10的过滤方法中，通过使包含有核细胞的液体通过过滤器10，能够确实地捕捉作为捕捉对象的有核细胞，因此能够提高回收率。
有核细胞的核的尺寸因种类、培养条件、传代数等而发生变动。例如，即使是相同的细胞，其核的尺寸也会因培养温度、时间或环境等培养条件而异。因此，即使是相同的有核细胞，核的尺寸也多种多样，不关注核尺寸地准备过滤器10时，有核细胞有时会通过贯通孔12。在使用了过滤器10的过滤方法中，根据有核细胞的核的尺寸而选择贯通孔12的尺寸地准备过滤器10。即，在使用了过滤器10的过滤方法中，选择具有比作为过滤对象的有核细胞的核的尺寸小的贯通孔12的过滤器10，准备用于过滤的过滤器10。因此，在使用了过滤器10的过滤方法中，能够将有核细胞确实地捕捉至过滤器10上，能够提高回收率。
需要说明的是，实施方式1中，针对贯通孔12的尺寸大致相同的例子进行了说明，但不限定于此。例如，贯通孔12的尺寸可以彼此不同。此时，贯通孔12的最大尺寸设计得小于有核细胞的核的尺寸即可。
实施方式1中，过滤器10的制造方法针对包括形成衬底层基体部的工序的例子进行了说明，但不限定于此。例如，过滤器10的制造方法可以不包括形成衬底层基体部的工序。
实施方式1中，针对通过使包含有核细胞的液体通过过滤器10来过滤有核细胞的例子进行了说明，但不限定于此。例如，也可以使用过滤器10，从包含活细胞和死细胞的液体对活细胞与死细胞进行分离。
作为将活细胞与死细胞进行分离的方法，例如可以利用过滤器10将活细胞捕捉至过滤部11的第一主面PS1上，并使死细胞通过。此外，也可以利用过滤器10将死细胞捕捉至过滤部11的第一主面PS1上，并使活细胞通过。
实施方式1中，针对过滤器10和过滤方法进行了说明，但不限定于此。例如，也可以以包含用于过滤有核细胞的过滤器10且用于实施过滤方法的试剂盒的形式来使用。
实施方式1中，针对过滤部11具有均匀膜厚的例子进行了说明，但不限定于此。例如，过滤部11可以以中央侧的膜厚比边缘侧小的方式来形成，而不具有均匀的膜厚。
图5示出实施方式1的变形例的过滤器10A。如图5所示那样，在过滤器10A的过滤部11a之内，远离框部15的中央侧区域R11的膜厚T1形成得小于比中央侧区域R11更靠近框部15的边缘侧区域R13的膜厚T3。进而，就过滤器10A而言，在过滤部11a之内，将位于中央侧区域R11与边缘侧区域R13之间的中间区域R12的膜厚记作T2时，各个区域的膜厚满足T1＜T2＜T3的关系。即，在过滤器10的过滤部11a之内，以膜厚从过滤部11a的中心朝向放射方向(半径方向朝外)增加的方式设定膜厚。此外，膜厚可以连续增加或阶段性地增加。
此外，如图5所示那样，过滤器10A的第二主面PS2形成为平坦面，与第一主面PS1中的过滤部11a相当的面形成为边缘侧区域高于中央侧区域那样的凹面。过滤器10A的框部15形成为膜厚T0大致恒定的厚度，膜厚T0达到边缘侧区域R13的膜厚T3以上。
过滤器10A如下形成：例如直径为6mm(框部15的外形)、框部15的宽度尺寸为1mm、相邻的贯通孔12a的间隔为1μm以上且500μm以下。此外，过滤部11a如下形成：接近框部15的边缘侧区域R13的膜厚T3为1.1μm、中央侧区域R11的膜厚T1为0.8μm。
根据过滤器10A，就过滤部11a而言，第一主面PS1以中央侧区域R11的膜厚T1小于边缘侧区域R13的膜厚T3的方式形成为凹面。由此，利用形成有凹面的第一主面PS1来捕捉细胞那样的情况下，容易因流体的表面张力而在凹面形成流体积存。例如，通过对在培养液以积液的形式滞留于凹面的状态下捕捉的细胞进行处理，能够在抑制细胞干燥的同时进行分析等处理。因而，能够提高被过滤部11a捕捉的细胞的处理性。
此外，在过滤部11a之内，通过使过滤部11a的膜厚从中央侧区域R11朝向边缘侧区域R13连续增加或阶段性地增加，能够使过滤部11a形成平滑的凹面。由此，因表面张力的作用而能够容易地在凹面形成流体积存，能够进一步提高被过滤部11a捕捉的细胞的处理性。
此外，过滤部11a的第二主面PS2为平坦面，第一主面PS1制成了凹面。由此，例如在想要利用采用凹面而实现的流体积存的情况下，可以在作为凹面的第一主面PS1侧捕捉细胞。另一方面，在想要改善流体脱除而不形成流体积存的情况下，可以在作为平坦面的第二主面PS2侧捕捉细胞。通过这样地根据目的来区分使用第一主面PS1和第二主面PS2，能够提高细胞过滤器的处理性。
需要说明的是，在过滤器10A的说明中，将在过滤部11a之内以膜厚从中央侧区域R11朝向边缘侧区域R13连续增加或阶段性地增加的方式形成凹面的情况作为例子。然而，过滤器10A不仅仅限定于这样的情况。例如，可以是在过滤部11a之内包含一部分膜厚从中央侧区域R11朝向边缘侧区域R13增加的部位之类的情况。即使是那样的情况，只要是中央侧区域R11的平均膜厚小于边缘侧区域R13的平均膜厚，就能够发挥出过滤器10A的效果。
实施方式1中，针对贯通孔12的形状为长方形的例子进行了说明，但不限定于此。例如，贯通孔12的形状可以是不包括正方形在内的多边形。
图6示出具有形成为正六边形形状的贯通孔12b的过滤器10B的一部分的放大截面图。如图6所示那样，在过滤器10B的过滤部11b，形成为正六边形形状的多个贯通孔12b形成正三角形格子排列(蜂窝结构)。
图7示出具有形成为正八边形形状的贯通孔12c的过滤器10C的一部分的放大截面图。如图7所示那样，在过滤器10C的过滤部11c，形成为正八边形形状的多个贯通孔12c形成正方形格子。
如图6和图7所示那样，在正多边形形状的贯通孔12b、12c中，能够使划定贯通孔12b、12c的开口的相邻边与边之间的角度为钝角。即，贯通孔12a、12b的角部与正方形的贯通孔相比变缓。因此，贯通孔12b、12c与正方形的贯通孔相比存在不易损伤细胞的优点。此外，正多边形形状的贯通孔12b、12c与正方形形状的贯通孔相比容易加工，因此能够提高加工精度。即，正多边形形状的贯通孔12b、12c与正方形形状的贯通孔相比能够减小变异系数。
需要说明的是，贯通孔12可以形成为除了正六边形和正八边形之外的正多边形状。
此外，贯通孔12的形状可以是包含长度不同的边的多边形。
图8示出具有形成为多边形状的贯通孔12d的过滤器10D的一部分的放大截面图。如图8所示那样，在过滤器10D中，贯通孔12d形成为沿着Y方向延伸的横向的六边形形状。具体而言，贯通孔12d形成为划定开口的平行的两边沿着Y方向延伸的横向的六边形形状。
通过这样的构成，过滤器10D可以发挥出与正多边形形状的贯通孔12b、12c相同的效果，并且发挥出与长方形形状的贯通孔12相同的效果。
需要说明的是，就过滤器10D而言，不限定于六边形形状的贯通孔12d，也可以是八边形等多边形形状的贯通孔。此外，过滤器10D的贯通孔12d的延伸方向没有限定。例如，贯通孔12d可以形成为沿着X方向延伸的纵向的多边形形状。
实施例
使用实施例1-5和比较例1-3来进行实施方式1所述的过滤器10的性能评价。
(1)关于实施例1-5和比较例1-3的过滤器
按照表1所示的规格来制作实施例1-5和比较例1-3的过滤器。
[表1]
Figure BDA0003659494000000201
需要说明的是，在表1的排列间隔中，长边相当于图3中的符号b1的长度，短边相当于图3中的b2的长度。
实施例1-5和比较例1-3的过滤器为圆形，外形的直径为7.8mm、过滤部11的直径为6mm、框部的厚度为2μm。材质为镍(Ni)。
实施例1和2使用了具有长方形形状的贯通孔12的过滤器10。实施例3使用了具有正六边形形状的贯通孔12b的过滤器10B。实施例4使用了具有正八边形形状的贯通孔12c的过滤器10C。实施例5使用了具有长方形形状的贯通孔12a的过滤器10A。此外，实施例5中，远离框部15的中央侧区域的过滤部11a的膜厚小于比中央侧区域更靠近框部15的边缘侧区域的过滤部11a的膜厚。
比较例1使用了具有长方形形状的贯通孔12的过滤器10。比较例2使用了具有正六边形形状的贯通孔12b的过滤器10B。比较例3使用了具有正八边形形状的贯通孔12c的过滤器10C。
将这些实施例1-5和比较例1-3的过滤器分别设置于过滤装置，并对细胞悬浮液进行过滤，从而进行性能评价。需要说明的是，作为前处理，将各个过滤器在乙醇溶液中浸渍1分钟，其后，在纯水中浸渍1分钟，从而提高了亲水性。
(2)关于细胞悬浮液
使用100mm平皿，用包含10vol％的胎牛血清和1vol％的青霉素-链霉素的RPMI1620培养基(含有L-谷氨酰胺)，对作为白血病细胞株的浮游细胞HL-60进行5天的培养。
通过移液操作将一部分培养液从100mm平皿转移至15mL的离心分离管中。接着，对装有培养液的离心分离管以1000rpm的转速进行3分钟的离心分离后，去除上清。接着，添加磷酸缓冲生理盐水来生成细胞悬浮液。需要说明的是，调整磷酸缓冲生理盐水的添加量，使得细胞悬浮液的细胞浓度达到105个/mL。
将30μL的细胞悬浮液与15μL的荧光试剂DAPI在微型管中混合而对细胞进行染色，将染色的细胞悬浮液(细胞染色液)在遮光条件下以37℃培养20分钟。其后，在载玻片上滴加细胞染色液10μL，重叠盖玻片，使用波长为345nm的激发光源，通过以455nm为中心的带通滤波器，利用荧光显微镜进行荧光观察。测定显色为蓝紫色的核的尺寸，结果HL-60的核的尺寸为3.66μm。需要说明的是，HL-60的核的尺寸是通过测定100个HL-60的核的尺寸而算出的平均值。
对于100mm平皿中的一部分培养液，通过移液操作使细胞分散后，使用微型移液管取出10μL，利用细胞计数器(Thermo Fisher公司制，自动细胞计数器、Countess(注册商标)II FL)测定细胞浓度、存活率、细胞尺寸的平均值。其结果，细胞浓度为5×105个/mL、有活性的细胞(HL-60)的尺寸的平均值为13.4μm、存活率为90％。具体而言，将细胞悬浮液与0.4％的锥虫蓝(Trypan blue)溶液以1∶1的体积比例进行混合而将细胞膜染色为蓝色，将细胞悬浮液与锥虫蓝溶液的混合液10μL滴加至细胞计数载玻片(Thermo Fisher公司制，Countess(注册商标)Cell Counting Chamber Slide)，观察细胞的形态。在细胞计数中，通过以染色的细胞膜作为标记物来进行图像分析，从而分别求出细胞的个数(浓度)、细胞尺寸的平均值、存活率。
对100mm平皿中的培养液以任意的比率进一步混合RPMI1620培养基，从而制作如下的HL-60细胞悬浮液。
有活性的细胞(HL-60)的浓度…3.06×105个/mL
液量…1mL
需要说明的是，针对在室温下的洁净台内放置4小时的100mm平皿中的培养液，利用上述方法测定细胞的存活率，结果存活率降低至81％。这意味着因将细胞在室温下长期放置而导致活性降低。
(3)关于过滤方法
就安装于过滤装置的实施例1-5和比较例1-3的过滤器而言，通过利用移液管在过滤部11的第一主面PS1上滴加细胞悬浮液，并从第二主面PS2侧抽吸细胞悬浮液，从而进行细胞悬浮液的过滤。作为操作条件，以0.5kPa的压力进行抽吸。通过目视来确认穿过过滤器的液体(通过液)达到约0.8ml后，停止抽吸。评价通过测定自抽吸开始起至抽吸停止为止的时间(过滤时间)、通过液的液量、通过液中包含的细胞数来进行。
(4)关于评价结果
表2示出评价结果。
[表2]
Figure BDA0003659494000000231
实施例1-5中，细胞(HL-60)的回收率为100％。与此相对，比较例1-3中，细胞的回收率分别为29.3％、35.7％、40.9％。
如表1所示那样，比较例1-3中，贯通孔12的内切椭圆的长径分别为9.0μm、6.6μm、6.5μm，大于细胞(HL-60)的核的尺寸3.66μm。因此，可以认为细胞通过了贯通孔12。
另一方面，实施例1-5中，贯通孔12的内切椭圆的长径为3.0μm以上且3.5μm以下，小于细胞的核的尺寸。因此，可以认为实施例1-5中能够确实地捕捉细胞。
需要说明的是，本说明书中，“回收率”是指投入的有活性的细胞数相对于过滤器的第一主面PS1上捕捉的细胞的比例，用(投入的有活性的细胞数-通过液中包含的活性细胞数)/(投入的有活性的细胞数)来计算。
需要说明的是，通过液中包含的活性细胞数如下计测：通过移液操作而使通过液中的细胞分散后，使用微型移液管采取10个10μL通过液的检体，利用细胞计数器(ThermoFisher公司制，自动细胞计数器、Countess(注册商标)II FL)来计测上述检体中的细胞数。
像这样，通过将贯通孔12的内切椭圆的长径设计得小于细胞核的尺寸，能够提高回收率。作为其理由，在于包围细胞核的细胞质容易变形、细胞核不易变形这一点。
如比较例1-3那样，在贯通孔12的内切椭圆的长径大于细胞核的尺寸的情况下，即使贯通孔12的内切椭圆的长径小于细胞整体的尺寸，有时也会因细胞质发生变形而导致细胞通过过滤器10。
另一方面，如实施例1-5那样，在将贯通孔12的内切椭圆的长径设计得小于细胞核的情况下，由于细胞核与细胞质相比不易变形，因此，与比较例1-3相比容易将细胞捕捉在过滤器10上。
此外，过滤器10为金属制这一点也有助于提高细胞的回收率。通过使用由金属形成的过滤器10，过滤器10的贯通孔12自身的变形量与薄膜等树脂性的过滤器相比变少。因此，过滤器10更容易捕捉细胞。
需要说明的是，对有核细胞进行过滤时，优选抑制杂质混入至细胞悬浮液中、即抑制构成过滤器10的金属溶出至细胞悬浮液是不言而喻的。
实施例5中，在过滤后观察在过滤部11a的第一主面PS1上捕捉到的细胞。其结果可知：与过滤前的细胞同样地，细胞的形态为圆形，活性得以保持。这是因为：在过滤部11a的中央侧区域R11产生积液，细胞以浸渍在积液中的状态被捕捉到过滤部11a的第一主面PS1上。
针对镍，实施了作为金属离子化倾向的指标的浸渍电位的测定。针对在磷酸缓冲生理盐水中的浸渍电位测定3分钟，结果镍的浸渍电位在高于0.03V的范围进行推移，所述浸渍电位以浸渍在饱和氯化钾溶液中的由氯化银形成的参比电极作为基准。换言之可以说：在相同条件下进行测定时，只要是显示出至少高于0.03V的浸渍电位的金属和/或金属氧化物，就能够无损细胞活性地进行过滤。
此外，实施例1、2和5与实施例3和4相比过滤时间短。这是因为：通过将贯通孔12形成为长方形形状，能够抑制由细胞的细胞质变形而导致的堵塞。具体而言，贯通孔12的形状为长方形的情况下，即使贯通孔12的一部分因细胞质的变形而被堵塞，液体也容易从贯通孔12的其它部分穿过。因此可以认为：实施例1、2和5与实施例3和4相比过滤时间变短。
需要说明的是，实施例中，针对将细胞悬浮液中存在105个/mL以上的有核细胞的浓度较高的细胞悬浮液进行过滤来捕捉有核细胞的例子进行了说明，但过滤器10即使在对细胞悬浮液中的有核细胞为数个/mL左右的浓度极低的细胞悬浮液进行过滤的情况下，也能够捕捉作为回收对象的有核细胞。
本发明参照附图对优选的实施方式进行了充分记载，但对于本技术的熟练人群而言各种变形、修改是不言而喻的。应该理解为这种变形、修改只要不偏离附带的权利要求书所述的本发明范围则均包括在本发明中。
产业上的可利用性
本发明的过滤器能够提高有核细胞的回收率，因此，对于从细胞悬浮液中分离有核细胞的用途是有用的。
附图说明
10、10A、10B、10C、10D 过滤器
11、11a、11b、11c、11d 过滤部
12、12a、12b、12c、12d 贯通孔
13 支承基材
13a 开口部
14 过滤器基体部
15 框部
PS1 第一主面
PS2 第二主面
R11 中央侧区域
R12 中间区域
R13 边缘侧区域
T0、T1、T2、T3 膜厚

Claims (14)

1.一种过滤器，其是用于过滤有核细胞的过滤器，
其以金属和金属氧化物中的至少任一者作为主成分，
并形成有多个贯通孔，所述贯通孔不包括正方形，
所述过滤器的表面的算术平均粗糙度小于有核细胞的核的尺寸。
2.根据权利要求1所述的过滤器，其中，所述贯通孔的形状为多边形。
3.根据权利要求2所述的过滤器，其中，所述贯通孔的形状为长方形。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的过滤器，其具备：
具有所述多个贯通孔的过滤部，所述多个贯通孔贯通彼此相对的第一主面和第二主面；以及
以包围所述过滤部的外周的方式配置的框部，
在所述过滤部之内，远离所述框部的中央侧区域的所述过滤部的膜厚小于比所述中央侧区域更靠近所述框部的边缘侧区域的所述过滤部的膜厚。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的过滤器，其中，所述金属和所述金属氧化物中的至少任一者在磷酸缓冲生理盐水中的浸渍电位高于0.03V，所述浸渍电位以浸渍在饱和氯化钾溶液中的由氯化银形成的参比电极作为基准。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的过滤器，其中，所述金属和所述金属氧化物中的至少任一者含有选自金、银、铜、铂、镍、钯、它们的合金和它们的氧化物中的至少1种。
7.一种过滤方法，其是过滤有核细胞的方法，其包括如下步骤：
准备过滤器的步骤，所述过滤器以金属和金属氧化物中的至少任一者作为主成分，并形成有多个贯通孔，所述贯通孔不包括正方形，所述过滤器的表面的算术平均粗糙度小于有核细胞的核的尺寸；
使包含所述有核细胞的液体通过所述过滤器的步骤。
8.根据权利要求7所述的过滤方法，其中，所述贯通孔的形状为多边形。
9.根据权利要求8所述的过滤方法，其中，所述贯通孔的形状为长方形。
10.根据权利要求7～9中任一项所述的过滤方法，其中，所述过滤器具备：
具有所述多个贯通孔的过滤部，所述多个贯通孔贯通彼此相对的第一主面和第二主面；以及
以包围所述过滤部的外周的方式配置的框部，
在所述过滤部之内，远离所述框部的中央侧区域的所述过滤部的膜厚小于比所述中央侧区域更靠近所述框部的边缘侧区域的所述过滤部的膜厚。
11.根据权利要求7～10中任一项所述的过滤方法，其中，所述金属和所述金属氧化物中的至少任一者在磷酸缓冲生理盐水中的浸渍电位高于0.03V，所述浸渍电位以浸渍在饱和氯化钾溶液中的由氯化银形成的参比电极作为基准。
12.根据权利要求7～11中任一项所述的过滤方法，其中，所述金属和所述金属氧化物中的至少任一者含有选自金、银、铜、铂、镍、钯、它们的合金和它们的氧化物中的至少1种。
13.根据权利要求7～12中任一项所述的过滤方法，其中，使包含所述有核细胞的液体通过所述过滤器的步骤包括将活细胞与死细胞分离的步骤。
14.一种试剂盒，其是包含用于过滤有核细胞的过滤器且用于实施权利要求7～13中任一项所述的方法的试剂盒，
所述过滤器的表面的算术平均粗糙度小于有核细胞的核的尺寸。
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