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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Zielstrukturen, insbesondere von bestimmten Nukleinsäuresequenzen und/oder bestimmten Peptiden oder Proteinen und/oder bestimmten Zellen oder Zelltypen, sowie Nanopartikel, die in diesem Verfahren einsetzbar sind, einen Kit zum Nachweis von Zielstrukturen sowie eine Verwendung dieses Kits zum Nachweis von Zielstrukturen.
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Stand der Technik
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Analysen von Nukleinsäuren und insbesondere der Nachweis bestimmter DNA-Sequenzen werden für eine Vielzahl von Zwecken durchgeführt. Hierbei spielen vor allem medizinisch-diagnostische Anwendungen eine große Rolle. Beispielsweise geben kleinste Mengen einer BCR-ABL1-Gentranslokation Auskunft über eine chronische myeloische Leukämie (CML) im Bereich der Minimal Residual Disease (minimale Resterkrankung). Mutationen im Chromosomensatz 21, 18 und 13 deuten auf Trisomien hin, die im Bereich einer pränatalen Diagnostik untersucht werden können. Kleinste Mengen einer bestimmten Virus-RNA, z. B. Ebolavirus, können frühzeitig Aufschluss über eine Infektion liefern. Ein Nachweis bestimmter Nukleinsäuresequenzen wird oftmals über eine enzymatische Amplifikationsreaktion (Polymerase Chain Reaction – PCR) durchgeführt, die aber nicht immer einen eindeutigen Nachweis ermöglicht. Zudem ist hierfür ein hoher apparativer, zeitlicher und personeller Aufwand erforderlich. Bei einem anderen Ansatz werden einzelne Moleküle mit gelabelten Hybridisierungssonden markiert. Als Markierung können beispielsweise Quantum-Dots (QDs) eingesetzt werden, die über eine fluorometrische Messung ausgewertet werden können. Aber auch diese Methode ist verhältnismäßig kostenintensiv und aufwändig und führt nicht immer zu befriedigenden Ergebnissen.
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Offenbarung der Erfindung
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Vorteile der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweis von Zielstrukturen, insbesondere von bestimmten Nukleinsäuresequenzen und/oder bestimmten Peptiden oder Proteinen und/oder bestimmten Zellen oder Zelltypen, bereit, das kostengünstig und einfach in der Durchführung ist und ohne großen apparativen Aufwand schnell durchgeführt werden kann. Es eignet sich daher für viele Anwendungen, beispielsweise in der medizinischen Diagnostik. Kernpunkt des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, dass Nanopartikel eingesetzt werden, die mit wenigstens einem immobilisierten spezifischen Fängermolekül, das mit der Zielstruktur wechselwirken kann, verwendet werden. Diese Nanopartikel werden mit den Zielstrukturen in einem Reaktionsansatz unter Bedingungen, die eine Bindung der Zielstrukturen an die Nanopartikel erlauben, in Kontakt gebracht (Konjugationsschritt). Anschließend wird der Reaktionsansatz unter Bedingungen, die eine Clusterbildung der Nanopartikel mit den daran gebundenen Zielstrukturen untereinander erlauben, inkubiert. Diese Clusterbildung basiert zumindest zum Teil auf unspezifischen intra- und/oder intermolekularen Wechselwirkungen. Die Zielstrukturen mit den damit gebundenen Nanopartikeln verknäulen sich gewissermaßen zu größeren Einheiten. Im folgenden Schritt werden diese gebildeten Cluster von den übrigen Nanopartikeln, die keine gebundenen Zielstrukturen aufweisen, abgetrennt, sodass die abgetrennten Cluster ausgewertet werden können. Diese Auswertung kann beispielsweise in besonders einfacher Weise optisch erfolgen, beispielsweise mikroskopisch oder mit optischen Sensoren. Die mikroskopische Auswertung kann beispielsweise mittels Hell- oder Dunkelfeldmikroskopie oder Fluoreszenzmikroskopie erfolgen, wobei unmittelbar die gebildeten Cluster sichtbar sind und Aufschluss über das Vorhandensein der Zielstrukturen in der Ausgangsprobe geben. Weiterhin ist beispielsweise auch eine spektrometrische Auswertung möglich.
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Zur Einstellung von Bedingungen, die eine Bindung der Zielstrukturen an die Nanopartikel bzw. eine Clusterbildung erlauben, können insbesondere die Puffer- und/oder Temperaturbedingungen entsprechend eingestellt werden, wobei für die Clusterbildung im Allgemeinen niedrigere Temperaturen als bei der Bindung der Zielstrukturen an die Nanopartikel geeignet sind. Im Fall von Nukleinsäuresequenzen als Zielstrukturen können als Bedingungen, die eine Bindung der Zielstrukturen an die Nanopartikel erlauben, beispielsweise an sich bekannte Hybridisierungsbedingungen mit entsprechendem Puffer und Temperatur (z.B. 5 × SSC, 0,1 % SDS und 50 % Formamid, Temperatur 42 °C) eingestellt werden. Als Bedingungen für die Clusterbildung in diesem Beispiel kann der gleiche Puffer und eine Absenkung der Temperatur auf beispielsweise 10–20 °C eingesetzt werden. Die konkrete Ausgestaltung dieser Bedingungen ist auf den jeweiligen Anwendungsfall abzustimmen.
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In besonders bevorzugter und einfacher Weise kann die Abtrennung der gebildeten Cluster durch einen Größenausschluss erfolgen, wobei hierfür eine Größenausschlussfiltration mit einem Filter, der eine Porengröße im Größenbereich der Nanopartikel aufweist, durchgeführt werden kann, beispielsweise als Mikrofiltration. Der Filter wird hierbei so gewählt, dass die gebildeten Cluster zurückgehalten werden und die Nanopartikel, die keine gebundenen Zielstrukturen aufweisen, den Filter passieren. Hierfür können im Prinzip handelsübliche Filter eingesetzt werden. Eine Größenausschlussabtrennung kann auch mit anderen Methoden durchgeführt werden, beispielsweise durch Größenausschlusschromatographie oder Ähnliches.
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Die Fängermoleküle sind so gewählt, dass sie spezifisch an die Zielstrukturen binden. Diese Bindung kann auf unterschiedlichen Prinzipien beruhen. Beispielsweise kann diese Wechselwirkung auf einer Hybridisierung beruhen, wobei in diesem Fall die Zielstrukturen Nukleinsäuresequenzen und die Fängermoleküle ebenfalls Nukleinsäuremoleküle sind. Die Bindung über die Hybridisierung beruht darauf, dass mehr oder weniger komplementäre DNA- oder RNA-Einzelstränge sich aneinander anlagern. Wenn als Fängermolekül ein Nukleinsäuremolekül eingesetzt wird, eignen sich hierfür insbesondere DNA- oder PNA-Moleküle aufgrund ihrer besonderen Stabilität im Vergleich mit RNA-Molekülen, die in der Handhabung im Allgemeinen schwieriger sind. Es kann sich aber beispielsweise auch um Protein-Protein- oder Peptid-Protein- oder Peptid-Peptid-Wechselwirkungen handeln, beispielsweise, wenn ein Peptid-Aptamer als Fängermolekül eingesetzt wird, das spezifische Wechselwirkungen mit der Zielstruktur, insbesondere einem Peptid oder Protein oder bestimmten Oberflächenproteinen von bestimmten Zellen oder Zelltypen, eingeht. Als Fängermolekül kann beispielsweise auch ein Nukleinsäure-Aptamer eingesetzt werden, das sich ebenfalls durch spezifische Wechselwirkungen mit bestimmten Zielstrukturen auszeichnet. Eine weitere Möglichkeit sind Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen, die für den erfindungsgemäßen Ansatz genutzt werden können.
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Bei den Fängermolekülen werden als Nukleinsäuremoleküle oder als Nukleinsäure-Aptamere vorzugsweise Sequenzen mit ca. 5 bis ca. 2000 Nukleotiden, insbesondere mit ca. 10 bis ca. 100 Nukleotiden eingesetzt, wobei die jeweilige Sequenz in Anpassung an die nachzuweisende Zielstruktur ausgewählt wird. Wenn für den erfindungsgemäßen Ansatz Antikörper als Fängermoleküle verwendet werden, kann beispielsweise für einen Nachweis von zirkulierenden Tumorzellen als Antikörper Anti-EpCAM-Antikörper eingesetzt werden. Für andere Anwendungen bzw. Nachweise eignen sich beispielsweise FcMBL-Antikörper, bei denen das Mannose-bindende Lektin (MBL) an eine Fc-Domäne eines Antikörpers gekoppelt ist. Prinzipiell ist durch Auswahl geeigneter Fängermoleküle das erfindungsgemäße Verfahren an eine sehr große Bandbreite von Zielstrukturen, die mit diesem Verfahren nachweisbar sind, anpassbar.
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In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind an den Nanopartikeln wenigstens zwei verschiedene Fängermoleküle immobilisiert. Hiermit können im Sinne eines Multiplexing in einem Reaktionsansatz gegebenenfalls verschiedene Zielstrukturen parallel getestet werden.
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In einer weiteren besonders bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens bzw. der Nanopartikel sind die Nanopartikel weiterhin mit reduzierenden Gruppen, insbesondere mit Aldehyd-Gruppen funktionalisiert. Hierbei wird der Reaktionsansatz mit Tollens-Reagenz oder einem anderen Reagenz, das für den Nachweis von reduzierenden Gruppen geeignet ist, versetzt. Das jeweilige Reagenz kann vor und/oder nach der Abtrennung der gebildeten Cluster zugegeben werden. Durch die Verwendung derartiger Reagenzien kann die Nachweisbarkeit der gebildeten Cluster vereinfacht werden. Beim Einsatz des Tollens-Reagenz wird das in diesem Reagenz vorhandene Silbernitrat zu elementarem Silber reduziert und scheidet sich lokal ab (Silberspielgelprobe). Durch das damit verbundene Aufwachsen einer Silberschicht auf den gebildeten Clustern können diese mechanisch stabilisiert werden und der Differenzdruck bei einer Filtration erhöht werden, wodurch das Risiko eines Auflösens des Clusters verringert wird. Dies kann sowohl die maximale Geschwindigkeit des Filtrationsschrittes (Zentrifugation) als auch die Ausbeute erhöhen. Wenn das Tollens-Reagenz beispielsweise nach der Filtration zugefügt wird, werden die abgetrennten Cluster beschichtet und vergrößert, wodurch beispielsweise eine optische Detektion der Cluster vereinfacht wird.
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Weiterhin kann für die Abtrennung der gebildeten Cluster ein Filter eingesetzt, der ebenfalls mit wenigstens einem spezifischen Fängermolekül, das mit der Zielstruktur wechselwirken kann, beschichtet ist, wobei die Fängermoleküle vorzugsweise im Wesentlichen ganzflächig auf dem Filter immobilisiert sind. In dieser Ausführungsform wird in einem ersten Reaktionsschritt die Probe mit den nachzuweisenden Zielstrukturen unter Bindungsbedingungen (Konjugationsschritt) mit dem beschichteten Filter in Kontakt gebracht. Hierbei binden die Zielstrukturen statistisch verteilt (Poisson-Verteilung) an die Fängermoleküle, wobei zweckmäßigerweise die absolute Anzahl der Fängermoleküle deutlich größer als die maximal zu erwartende absolute Anzahl der Zielstrukturen in der Probe ist. In einem zweiten Reaktionsschritt werden dann die Nanopartikel zugegeben, die sich spezifisch an die auf dem Filter gebundenen Zielstrukturen anlagern, wobei es hierbei zu der Clusterbildung kommt. In diesem Fall dienen die Zugabe und die Anbindung der Nanopartikel im Wesentlichen dem Sichtbarmachen der Zielsequenzen. Ungebundene oder überschüssige Nanopartikel werden vor der Detektion weggespült. Diese Variante hat den besonderen Vorteil, dass über ein Auszählen der auf dem Filter gebildeten Cluster die absolute Menge der Zielstrukturen gewissermaßen ausgezählt und damit quantitativ bestimmt werden kann.
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In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung dieses Aspektes des erfindungsgemäßen Verfahrens sind Teilbereiche des Filters mit jeweils unterschiedlichen spezifischen Fängermolekülen beschichtet. Diese Ausführungsform erlaubt die gleichzeitige Analyse verschiedener Zielstrukturen. Es können beispielsweise auf einem Filter in vier Quadranten jeweils unterschiedliche Fängermoleküle immobilisiert sein, um damit in der eben beschriebenen Weise vier verschiedene Zielstrukturen binden zu können. Die Probe mit den potentiell vorhandenen Zielstrukturen wird dann also zunächst mit dem Filter in Kontakt gebracht. Anschließend werden die Nanopartikel zugesetzt, um die an dem Filter angebundenen Zielstrukturen über eine entsprechende Clusterbildung in der oben beschriebenen Weise sichtbar zu machen. Bei dieser Variante ist es also möglich, unterschiedliche einzelne Zielstrukturen, beispielsweise unterschiedliche DNA-Zielsequenzen, quantitativ nachzuweisen.
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Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren handelt es sich um eine einfach zu realisierende Methode für die spezifische Detektion bestimmter Zielstrukturen. Es sind keine aufwendigen Apparate hierfür erforderlich, da das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere eine mechanische Abtrennung der gebildeten Cluster, beispielsweise durch eine laborübliche Mikrofiltration, vorsieht. Bei der Bindung der Zielstrukturen an die Nanopartikel über die spezifischen Fängermoleküle (Konjugationsschritt) ist die Bindung über die Auswahl des jeweiligen Fängermoleküls, beispielsweise eine bestimmte DNA-Sequenz, und über die Oberflächenbelegung bzw. die Immobilisierung von weiteren spezifischen Fängermolekülen auf dem Filter steuerbar. Die Größe der zu erwartenden Cluster ist über die Größe der Nanopartikel und die Art und Anzahl der Fängermoleküle einstellbar. Dadurch lassen sich beispielsweise Clustergrößen von etwa 200 nm oder größer erzielen. Dies erlaubt eine einfache optische Detektion mit einem normalen Lichtmikroskop oder beispielsweise einer CCD-Kamera mit geeigneter Optik. Durch diese geringen Anforderungen an eine Prozessiereinheit ist beispielsweise auch eine Realisierung in Form eines handgeführten Apparates möglich. Der erfindungsgemäße Ansatz erlaubt auch eine quantitative Auswertung in der beschriebenen Weise. Gegenüber herkömmlichen Nachweisverfahren wie beispielsweise einer quantitativen PCR hat das erfindungsgemäße Verfahren auch den Vorteil, dass für eine Quantifizierung von Zielstrukturen keine Referenzreaktionen durchgeführt werden müssen, was die Komplexität und den Platzbedarf einer entsprechenden Vorrichtung reduziert. Zusätzlich lassen sich über ein einfaches Multiplexing beispielsweise verschiedene Nukleinsäuresequenzen in einem Ansatz nachweisen, indem ein Filter eingesetzt wird, der mit verschiedenen Fängermolekülen beschichtet ist.
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Die Erfindung umfasst weiterhin Nanopartikel, die zum Nachweis von Zielstrukturen, insbesondere von bestimmten Nukleinsäuresequenzen und/oder bestimmten Peptiden oder Proteinen und/oder bestimmten Zellen oder Zelltypen, vorgesehen sind. An den Nanopartikeln ist jeweils wenigstens ein spezifisches Fängermolekül, das mit der Zielstruktur wechselwirken kann, immobilisiert. Das Fängermolekül kann insbesondere ein Nukleinsäure-Molekül, insbesondere ein DNA-Molekül oder ein PNA-Molekül, und/oder ein Aptamer und/oder ein Antikörper sein. Das Nukleinsäure-Molekül oder das Aptamer kann beispielsweise 5–2000 Nukleotide, insbesondere 10–100 Nukleotide, umfassen. Der Antikörper kann beispielsweise ein Anti-EpCAM-Antikörper oder ein mit FcMBL gekoppelter Antikörper sein. Vorzugsweise sind an den Nanopartikeln wenigstens zwei verschiedene Fängermoleküle immobilisiert. In einer bevorzugten Ausgestaltung der Nanopartikel sind wenigstens zwei unterschiedliche Nanopartikel mit jeweils verschiedenen immobilisierten spezifischen Fängermolekülen vorgesehen, die für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt werden können. Darüberhinaus können die Nanopartikel zusätzlich mit reduzierenden Gruppen, insbesondere mit Aldehyd-Gruppen, funktionalisiert sein. Bei der Durchführung des Nachweisverfahrens mit diesen Nanopartikeln kann der Reaktionsansatz mit einem Reagenz zum Nachweis der reduzierenden Gruppen, vorzugsweise mit Tollens-Reagenz, versetzt werden, wobei vorzugsweise das Reagenz vor und/oder nach der Abtrennung der gebildeten Cluster zugegeben wird. Bezüglich weiterer Merkmale dieser Nanopartikel und dem damit durchführbaren Verfahren zum Nachweis von Zielstrukturen wird auf die obige Beschreibung verwiesen.
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Weiterhin umfasst die Erfindung einen Kit zum Nachweis von bestimmten Zielstrukturen. Dieser Kit umfasst Nanopartikel gemäß der obigen Beschreibung und/oder einen Filter, der eine Porengröße im Größenbereich der Nanopartikel aufweist. Es ist beispielsweise möglich, dass das Kit nur die Nanopartikel und gegebenenfalls entsprechend geeignete Puffer und ähnliche Reagenzien umfasst und dass von dem Anwender ein handelsüblicher Filter eingesetzt wird, der eine entsprechende Porengröße aufweist. Insbesondere in den Fällen, in denen ein Filter mit immobilisierten Fängermolekülen, wie oben beschrieben, verwendet wird, enthält der Kit neben den Nanopartikeln vorzugsweise auch diesen speziellen Filter oder gegebenenfalls nur den speziellen Filter. Schließlich umfasst die Erfindung die Verwendung eines solchen Kits zum Nachweis von bestimmten Zielstrukturen. Je nach der nachzuweisenden Zielstruktur sind die Komponenten des Kits mit spezifischen Fängermolekülen ausgestattet. Weiterhin ist es auch möglich, dass der Kit nach Art eines Baukastens zusammengesetzt ist, der eine Immobilisierung der spezifischen Fängermolekülen, die gegebenenfalls in einer Auswahl im Kit vorhanden sind oder vom Anwender bereitgestellt werden, durch den Anwender erlaubt bzw. erfordert.
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Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen in Verbindung mit den Zeichnungen. Hierbei können die einzelnen Merkmale jeweils für sich oder in Kombination miteinander verwirklicht sein.
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In den Figuren zeigt
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1 schematische Darstellung eines Nanopartikels mit daran immobilisierten spezifischen Fängermolekülen;
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2A–C schematische Darstellung der Interaktion zwischen erfindungsgemäßen Nanopartikeln und verschiedenen Zielstrukturen;
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3 schematische Darstellung der Abtrennung der gebildeten Cluster gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren;
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4A–B schematische Darstellung von bevorzugten Ausführungsformen des Verfahrens (4A – Nanopartikel, die mit reduzierenden Gruppen funktionalisiert sind; 4B – Filter mit immobilisierten Fängermolekülen).
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Beschreibung von Ausführungsbeispielen
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1 zeigt in schematischer Weise den prinzipiellen Aufbau eines erfindungsgemäßen Nanopartikels 10, der eine Nanopartikelstruktur 11 umfasst, auf deren Oberfläche eine Mehrzahl von Fängermolekülen 12 immobilisiert ist. Bei den Fängermolekülen 12 kann es sich beispielsweise um bestimmte DNA-Moleküle handeln, die im Hinblick auf eine Wechselwirkung mit den nachzuweisenden Zielstrukturen ausgewählt sind. Andere Möglichkeiten für Fängermoleküle 12 sind Antikörper oder Aptamere. Die Herstellung der Nanopartikelstruktur 11 kann mit an sich bekannten Verfahren erfolgen, wie z. B. einer kontrollierten Polymerisation, Reduktion von Metallsalzen oder Seed-mediated Growths-Methoden. Neben sphärischen Formen sind beispielsweise auch stäbchenförmige Nanopartikel oder Anderes möglich. Die Nanopartikelstruktur 11 kann einen magnetischen Kern aufweisen, beispielsweise aus Fe3O4, und mit einer Goldhülle überzogen sein. In dieser Ausgestaltung hat der Nanopartikel 10 eine besonders gute Bioverträglichkeit und stellt darüber hinaus eine sehr geeignete Oberflächenschicht für die Anbindung von beispielsweise Thiol-modifizierten Nukleinsäuren oder Proteinmolekülen dar.
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2A–C zeigt das Prinzip der Clusterbildung aus den erfindungsgemäßen Nanopartikeln mit daran gebundenen Zielstrukturen in einer wässrigen Phase gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren. Hierbei sind in der 2A bestimmte Zellen oder Zelltypen 210, beispielsweise Bakterien, Pilze oder humane Zellen, beispielsweise Krebszellen, dargestellt. Als hierfür geeignete Fängermoleküle an den erfindungsgemäßen Nanopartikeln 10 können beispielsweise Aptamere oder Antikörper eingesetzt werden, beispielsweise Anti-EpCAM (geeignet für bestimmte Krebszellen) oder FcMBL (universeller Binder, der insbesondere Pilze, Toxine und Bakterien bindet). Wenn die in der zu untersuchenden Probe nachzuweisenden Zielstrukturen vorhanden sind, kommt es zu einer Wechselwirkung mit den Nanopartikeln in einem ersten Konjugationsschritt und nachfolgend zu einer Quervernetzung der Zellen (Clusterbildung) über die daran gebundenen Nanopartikel 10 (2A – rechts). Diese gebildeten Cluster 20 können anschließend beispielsweise über eine Mikrofiltration von den überschüssigen bzw. nicht in Wechselwirkung getretenen Nanopartikeln 10 abgetrennt und nachgewiesen werden. 2B illustriert das erfindungsgemäße Verfahren in Hinblick auf Nukleinsäuren 220, insbesondere DNA oder RNA, als Zielstrukturen. Durch spezifische Fängermoleküle auf den Nanopartikeln 10, die beispielsweise auf der Basis einer Hybridisierung mit den Nukleinsäuren 220 wechselwirken (komplementäre Fängersequenzen) kommt es zu einer Bindung der Nanopartikel 10 an die Nukleinsäuren 220. Dabei können die Nanopartikel 10 gegebenenfalls mit verschiedenen Fängersequenzen funktionalisiert sein. Sofern die Zielstrukturen 220 in der Probe vorhanden sind, kommt es zunächst zu einer Wechselwirkung und einer Anbindung der Nanopartikel 10 an die Nukleinsäuren 220 (2B – links). Dabei ist es besonders vorteilhaft, während des Konjugationsschrittes, bei dem die Nanopartikel 10 und die Nukleinsäuren 220 in Wechselwirkung treten, Bedingungen zu schaffen, unter welchen die Nukleinsäuren 220 optimal für die DNA-Fängermoleküle zugänglich sind (unverknäult), beispielsweise durch eine Erhöhung der Temperatur auf beispielsweise zwischen 40 bis 70 °C. Hierfür können an sich bekannte Hybridisierungsbedingungen eingestellt werden, z.B. 5 × SSC, 0,1 % SDS, 50 % Formamid, 42 °C. Im folgenden Schritt kommt es unter entsprechenden Inkubationsbedingungen (z. B. Erniedrigung der Temperatur auf 10–20 °C, gleiche Pufferbedingungen) zu einer Quervernetzung und Clusterbildung 20 bzw. zu einem Verknäulen (2B – rechts). Beispielsweise mittels einer anschließenden Mikrofiltration können die Cluster 20 von den ungebundenen Nanopartikeln 10 abgetrennt und nachgewiesen werden. 2C illustriert das erfindungsgemäße Verfahren für den Nachweis von Peptiden oder Proteinen 230 als Zielstrukturen. Geeignete Fängermoleküle hierfür können beispielsweise Antikörper oder Aptamere sein. Sofern die gesuchten Peptide oder Proteine 230 in Probe vorhanden sind, kommt es zu einer Wechselwirkung mit den spezifischen Nanopartikeln 10 und zu einer intramolekularen Einlagerung der Nanopartikel 10 innerhalb der Peptid- oder Proteinstrukturen 230 in Form von größeren Einheiten 20 (2C – rechts). Eine intermolekulare Bindung und damit eine verstärkte Querverbindung oder Clusterbildung 20 ist ebenso möglich. Durch eine anschließende Mikrofiltration können die gebildeten Cluster von ungebundenen Nanopartikeln 10 abgetrennt und nachgewiesen werden.
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3 illustriert den Schritt einer Filtration zur Abtrennung der gebildeten Cluster 20. Nach der Konjugationsreaktion, bei der die Nanopartikel 10 an die Zielstrukturen 210, 220 oder 230 binden, werden Inkubationsbedingungen für die Bildung von Clustern 20 eingestellt. Diese Suspension wird durch einen geeigneten Filter 30 geführt (3 – links). Der Filter 30 kann aus unterschiedlichen Materialien, wie beispielsweise Polymeren, Metallen oder Halbleitermaterialien gefertigt sein. Wichtig ist, dass der Filter 30 eine den Zielstrukturen bzw. den Clustern 20 angepasste Porengröße aufweist, sodass der Filter die Cluster 20 zurückhält (3 – rechts) und die ungebundenen Nanopartikel 10 ungehindert passieren lässt. Auf dem Filter können dann die zurückgehaltenen Cluster 20 beispielsweise mit einem geeigneten optischen System, beispielsweise einem Mikroskop, erfasst und ausgewertet werden.
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Wenn ausschließlich auf den Nanopartikeln Fängermoleküle immobilisiert sind, also keine Fängermoleküle auf einer Filteroberfläche, findet die Bindungsreaktion (Konjugationsschritt) zwischen den Nanopartikeln und den Zielstrukturen ausschließlich in der Lösung statt. Anschließend werden Nanopartikel mit daran gebundenen Zielstrukturen von Nanopartikeln ohne gebundene Zielstrukturen separiert, beispielsweise mittels einer Filtration. Für diese Durchführung des Verfahrens können die Nanopartikel beispielsweise eine Spezies eines Fängermoleküls tragen. Es kann jedoch besonders vorteilhaft sein, wenn beispielsweise im Fall von bestimmten DNA-Sequenzen als Zielstrukturen zwei oder mehr spezifische Fängermoleküle an den Nanopartikeln immobilisiert sind, die an verschiedenen Stellen der DNA-Zielsequenz eine Bindung der Nanopartikel bewirken, wodurch ein Verknäulen und damit eine Clusterbildung unterstützt wird. Diese Clusterbildung kann durch eine erhöhte Anzahl von verschiedenen Fängermolekülen und über die Anzahl dieser jeweiligen Sequenzen auf den Nanopartikeln weiter verstärkt und gesteuert werden. Diese verschiedenen Fängermoleküle können jeweils auf einem Nanopartikel bzw. einer Spezies von Nanopartikeln immobilisiert sein. Es ist auch möglich, verschiedene Spezies von Nanopartikeln einzusetzen, die jeweils unterschiedliche Fängermoleküle tragen und die dann in einem Ansatz miteinander kombiniert werden können. Mit diesen Ansätzen kann die Bindung bzw. die Konjugation mit den Zielstrukturen verstärkt werden, indem verschiedene Unterstrukturen der jeweiligen Zielstrukturen adressiert werden.
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4A illustriert die Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei dem die Nanopartikel 10 zusätzlich mit reduzierenden Gruppen, beispielsweise Aldehyd-Gruppen, funktionalisiert sind. Durch Behandlung mit einem Nachweisreagenz für reduzierende Gruppen (z.B. Tollens-Reagenz) wird die Detektierbarkeit und Auswertung des erfindungsgemäßen Verfahrens weiter verbessert. Wenn die gebildeten Cluster 20 mit dem Reagenz versetzt werden, kommt es zu einer Abscheidung einer Silberschicht 40 auf und innerhalb der Cluster 20. Dies stabilisiert die gebildeten Cluster 20 und erhöht die Ausbeute und die Geschwindigkeit bei dem Filtrationsschritt über den Filter 30 und verbessert die Nachweisbarkeit. 4B illustriert eine weitere Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei dem zusätzliche Fängermoleküle 402 auf dem Filter 30 immobilisiert sind. Der Filter 30 ist also gewissermaßen mit den Fängermolekülen 402 zusätzlich beschichtet. In einem ersten Reaktionsschritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird hierbei die Probe oder die Lösung mit den nachzuweisenden Zielstrukturen 420, beispielsweise bestimmten DNA-Sequenzen, unter entsprechenden Reaktionsbedingungen (Hybridisierungsbedingungen) mit dem beschichteten Filter 30 in Kontakt gebracht, sodass die Zielstrukturen 420 spezifisch an den Filter binden (4B – links). Durch Zugabe der Nanopartikel 20, die ebenfalls an die bereits am Filter 30 angebundenen Zielstrukturen 420 binden, kommt es zur Clusterbildung 20 auf dem Filter 30 (4B – rechts). Diese Ausgestaltung des Verfahrens kann mit besonderem Vorteil für eine Quantifizierung der Zielstrukturen genutzt werden. Diese Ausführungsform des Verfahrens kann dahingehend erweitert werden, dass verschiedene Fängermoleküle auf den Nanopartikeln 10 und auf Teilbereichen des Filters 30 immobilisiert werden, sodass unterschiedliche bestimmte Zielstrukturen, beispielsweise verschiedene DNA-Zielsequenzen, parallel quantitativ analysiert werden können.
