CN117554610A - 细胞辨识方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种结合荧光强度分析、荧光影像分析以及白光影像分析结果辨识目标细胞的细胞辨识方法。
Description
技术领域
本发明涉及细胞辨识方法，更具体而言，涉及能够以高正确辨识率辨识稀少细胞的辨识方法。
背景技术
一毫升血液样本中，细胞数小于1000颗的细胞可被归类为稀少细胞。诸如循环肿瘤细胞(CTCs)、胎儿有核红血球(FnRBCs)等稀少细胞可应用于医疗、检测分析等领域，诸如辅助癌症预后分析、产前检测或病毒感染检测分析等应用。
血液中稀少细胞的分选与辨识，临床上采用血液抹片的方式透过化学染色的方式在显微镜底下辨识是否存在目标细胞，然而由于根据这种方法分选与辨识目标细胞时，目标细胞相对于背景细胞(例如红血球或白血球)的数量比过低(大约1:107～109)，同时在使用特定抗体标定目标细胞以进行目标细胞的辨识时，目标细胞与抗体的结合率与准确率尚未满足临床鉴验的最低标准(99.5％)，因此需要建立更准确的辨识逻辑或分析方法。
发明内容
本发明提供一种细胞辨识方法，更具体而言，提供一种能够以高正确辨识率辨识稀少细胞的辨识方法。
本发明的一种细胞辨识方法，包括以下步骤。提供分析样品，分析样品含有目标细胞、非目标细胞与荧光标记物，荧光标记物包括用于标定细胞核的第一荧光标记物、用于标定目标细胞的第二荧光标记物以及用于标定目标细胞或非目标细胞的第三荧光标记物。分别以与第一荧光标记物对应的第一荧光波段、与第二荧光标记物对应的第二荧光波段及与第三荧光标记物对应的第三荧光波段对分析样品进行荧光扫描以取得分析样品在第一荧光波段、第二荧光波段及第三荧光波段下的第一荧光影像照片、第二荧光影像照片及第三荧光影像照片。量测第一荧光影像照片、第二荧光影像照片及第三荧光影像照片的荧光信号亮度，将荧光信号亮度落在默认范围中的荧光信号标定为有效荧光信号。
根据本发明实施例，将同时在第一荧光影像照片及第二荧光影像照片中具有有效荧光信号的细胞标定为第一初步目标细胞。当第三荧光标记物用于标定目标细胞时，从第一初步目标细胞之中挑选，挑出在第三荧光影像照片中具有有效荧光信号的细胞筛选标定为第二初步目标细胞。或者，当第三荧光标记物用于标定非目标细胞时，从第一初步目标细胞之中挑选，挑出在第三荧光影像照片中不具有效荧光信号的细胞筛选标定为第二初步目标细胞。以白光对分析样品进行白光扫描以取得分析样品的白光影像照片，从第二初步目标细胞之中挑选，挑出具有特定细胞表型与形状的细胞进一步筛选辨识为目标细胞。
在本发明的一实施例中，上述的目标细胞为循环肿瘤细胞，第一荧光标记物为Hoechst 33342，第二荧光标记物为带有荧光异硫氰酸盐(fluorescein isothiocyanate，FITC)的抗EpCAM抗体，且第三荧光标记物为带有藻红素(phycoerythrin，PE)的抗CD45抗体。
在本发明的一实施例中，上述的目标细胞为胎儿有核红血球，第一荧光标记物为4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)，第二荧光标记物为带有荧光异硫氰酸盐(FITC)的抗CD147抗体，且第三荧光标记物为带有藻红素(PE)的抗CD71抗体。
在本发明的一实施例中，上述的目标细胞为进行间质-上皮相互转换(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的细胞(又称简称EMT细胞)，第一荧光标记物为Hoechst 33342或DAPI，第二荧光标记物为带有FITC的抗EpCAM抗体，且第三荧光标记物为带有PE的抗波形蛋白(vimentin)抗体。
在本发明的一实施例中，上述的第一荧光标记物为Hoechst 33342，且第一荧光标记物的有效荧光信号的亮度范围为5-40。
在本发明的一实施例中，上述的第二荧光标记物为带有荧光异硫氰酸盐(fluorescein isothiocyanate，FITC)的抗EpCAM抗体，且第二荧光标记物的有效荧光信号的亮度范围为70-120。
在本发明的一实施例中，上述的第三荧光标记物为带有藻红素(phycoerythrin，PE)的抗CD45抗体，且第三荧光标记物的有效荧光信号的亮度范围为3-45。
在本发明的一实施例中，以白光对所述分析样品进行白光扫描以取得所述分析样品的白光影像照片，从第二初步目标细胞中进一步辨识筛选，将具有特定细胞表型与形状的细胞辨识为所述目标细胞的方法步骤包括：根据所取得白光影像照片，计算所标定的第二初步目标细胞各细胞的周长与面积，来决定所标定的第二初步目标细胞各细胞的形状与尺寸是否合乎所述目标细胞的标准形状，以进一步判定辨识所标定的第二初步细胞是否为目标细胞。
在本发明的一实施例中，上述的目标细胞的标准形状包括圆形或偏心率小于0.8的微椭圆形。
在本发明的一实施例中，其中将具有特定细胞表型与形状的所述第二初步目标细胞辨识为目标细胞的步骤包括：将所取得白光影像照片与第二荧光影像照片交叉比对，确认所述白光影像照片中所标定的第二初步目标细胞的细胞轮廓与第二荧光影像照片中的有效荧光信号所定位的细胞轮廓相对位置误差是否小于或等于所述目标细胞的直径的特定比例。
在本发明的一实施例中，上述的特定比例为所述目标细胞的直径的5％。
附图说明
图1是根据本发明实施例的细胞辨识方法的主要流程示意图。
图2是根据本发明实施例的细胞辨识方法的细部流程示意图。
图3是根据本发明实施例的细胞辨识方法的细部流程示意图。
图4是根据本发明实施例的细胞辨识方法的细部流程示意图。
图5是根据本发明实施例的荧光影像照片。
图6是根据本发明实施例的细胞辨识方法的荧光影像分析的判读逻辑流程图。
图7是根据本发明实施例的不同荧光波段的荧光影像照片的特定位置的放大图。
图8是根据本发明实施例的不同荧光波段的荧光影像照片的特定位置的放大图。
图9是根据本发明实施例的白光影像照片。
具体实施方式
现将详细地参考本发明的示范性实施例，示范性实施例的实例说明于附图中。
图1是根据本发明实施例的细胞辨识方法的主要流程示意图。图2到图4是根据本发明实施例的细胞辨识方法的细部流程示意图。
参照图1，根据本发明实施例的细胞辨识方法主要包括三个主要流程S11、S13、S15。流程S11为对含有目标细胞、非目标细胞与荧光标记物的分析样品进行荧光强度分析，根据荧光的亮度范围确定是否为有效荧光。流程S13为根据有效荧光信号的重叠与否判读初步目标细胞的荧光影像分析。流程S15为根据初步目标细胞的白光影像照片评估初步目标细胞的细胞表型与形状的白光影像分析。
参照图2详细说明荧光强度分析的细部流程。首先，以不同的荧光激发波段对含有目标细胞、非目标细胞与荧光标记物的分析样品进行荧光扫描以取得所述荧光标记物的荧光影像照片(流程S111)。接着，量测荧光影像照片中的荧光信号的亮度，将荧光信号亮度落在默认范围中的荧光信号标定为有效荧光信号(流程S113)。各种不同荧光标记物的有效荧光信号的亮度范围是基于标准上皮癌细胞进行线性浓度曲线的校正所提供的线性亮度范围而得到的。
在本发明的实施例中，荧光标记物可包括与第一荧光波段对应的第一荧光标记物、与第二荧光波段对应的第二荧光标记物以及与第三荧光波段对应的第三荧光标记物；其中第一荧光标记物可用以标定细胞特定部件例如细胞核，第二荧光标记物可用以标定目标细胞，以及第三荧光标记物可用以标定目标细胞或者标定非目标细胞。
在本发明的一些实施例中，荧光标记物包括标定目标细胞的荧光标记物、标定细胞核的荧光标记物与标定非目标细胞的荧光标记物，以便进行筛选。
在本发明的一些实施例中，荧光标记物包括标定目标细胞的两种不同的荧光标记物与标定细胞核的荧光标记物，来进行筛选。
举例而言，第一荧光标记物可例如为结合至细胞核的4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)或蓝色荧光染剂Hoechst 33342而产生对应于第一波长波段的蓝色荧光。第二荧光标记物可因所携带的特定荧光物质例如荧光异硫氰酸盐(fluorescein isothiocyanate，FITC)而产生对应于第二波长波段的绿色荧光。第三荧光标记物可因所携带的特定荧光物质例如藻红素(phycoerythrin，PE)而产生对应于第三波长波段的橘黄色荧光。
举例来说，当目标细胞为循环肿瘤细胞(CTCs)时，第一荧光标记物可例如为结合至细胞核的蓝色荧光染剂Hoechst 33342或DAPI，第二荧光标记物可例如为标定循环肿瘤细胞的带有特定荧光物质FITC的抗EpCAM抗体，而第三荧光标记物可例如为结合至白血球或红血球等非目标细胞的带有特定荧光物质PE的抗CD45抗体。
举例来说，当目标细胞为胎儿有核红血球(FnRBCs)时，可使用两种不同的标识目标细胞的荧光标记物。第一荧光标记物可例如为结合至细胞核的蓝色荧光染剂Hoechst33342或DAPI，第二荧光标记物可例如为标定目标细胞的带有特定荧光物质FITC的抗CD147抗体，而第三荧光标记物可例如为标定目标细胞的带有荧光物质PE的抗CD71抗体。
举例来说，当目标细胞为循环肿瘤细胞簇(CTM)时，第一荧光标记物可例如为结合至细胞核的蓝色荧光染剂Hoechst 33342，第二荧光标记物可例如为标定循环肿瘤细胞的带有特定荧光物质FITC的抗EpCAM抗体，而第三荧光标记物可例如为标定胞毒性T细胞的带有特定荧光物质PE的抗CD8抗体。
举例来说，当目标细胞为进行间质-上皮相互转换(Epithelial-MesenchymalTransition，EMT)的细胞(又称简称EMT细胞)时，第一荧光标记物可例如为结合至细胞核的蓝色荧光染剂Hoechst 33342或DAPI，第二荧光标记物可例如为标定EMT细胞的带有特定荧光物质FITC的抗EpCAM抗体，而第三荧光标记物可例如为标定EMT细胞的带有特定荧光物质PE的抗波形蛋白(vimentin)抗体。在本发明的一些实施例中，荧光扫描(流程S111)包括以第一荧光波段、第二荧光波段及第三荧光波段对分析样品进行荧光扫描以取得分析样品在第一荧光波段、第二荧光波段及第三荧光波段的第一荧光影像照片、第二荧光影像照片及第三荧光影像照片。标定有效荧光信号(流程S113)包括量测第一荧光影像照片、第二荧光影像照片及第三荧光影像照片中的荧光信号亮度，将荧光信号亮度落在默认范围中的荧光信号标定为有效荧光信号。
参照图3详细说明荧光影像分析的细部流程。首先，将第一荧光影像照片、第二荧光影像照片及第三荧光影像照片重叠，以筛选出在第一荧光影像照片与第二荧光影像照片中皆具有有效荧光信号的第一初步目标细胞(流程S131)。接着，判定第三荧光标记物是用于标定目标细胞或非目标细胞(流程S133)。当第三荧光标记物是用于标定目标细胞时，将在第三荧光影像照片中具有有效荧光信号的第一初步目标细胞标定为第二初步目标细胞(流程S135A)，或者，当第三荧光标记物是用于标定非目标细胞时，将在第三荧光影像照片中不具有效荧光信号的第一初步目标细胞标定为第二初步目标细胞(流程S135B)。最后，确定第二初步目标细胞的相对位置(又即定位)(流程S137)。虽然图3中显示先根据显示标定细胞核的有效荧光信号的第一荧光影像照片与显示标定目标细胞的有效荧光信号的第二荧光影像照片筛选出第一初步细胞，再根据显示标定目标细胞或非目标细胞的有效荧光信号的第三荧光影像照片筛选出第二初步细胞，但本发明并不限于此。
根据本发明的实施例，可先根据显示标定目标细胞的有效荧光信号的第二荧光影像照片与没有显示标定非目标细胞的有效荧光信号的第三荧光影像照片筛选出第一初步细胞，再根据显示标定细胞核的有效荧光信号的第一荧光影像照片筛选出第二初步细胞。
根据本发明的实施例，可先根据显示标定目标细胞的有效荧光信号的第二荧光影像照片与显示标定目标细胞的有效荧光信号的第三荧光影像照片筛选出第一初步细胞，再根据显示标定细胞核的有效荧光信号的第一荧光影像照片筛选出第二初步细胞。
参照图4详细说明白光影像分析的细部流程。首先，以白光光源(亮场)对分析样品进行白光扫描以取得分析样品的白光影像照片(流程S151)。接着，根据分析样品的白光影像照片，计算所标定的第二初步目标细胞的周长与面积，来决定所标定的第二初步目标细胞的形状与尺寸是否合乎所述目标细胞的标准形状(例如为圆形或椭圆形)(流程S153)。接着，将所取得白光影像照片与具有标定目标细胞的有效荧光信号的第二荧光影像照片交叉比对，确认所述白光影像照片中所标定的第二初步目标细胞的细胞轮廓与所述第二荧光影像照片中根据标定目标细胞的有效荧光信号所定位的细胞轮廓相对位置误差是否小于或等于所述目标细胞的直径的特定比例(流程S155)。举例来说，当判读细胞的形状为与目标细胞的标准形状相符的圆形及微椭圆形，且白光影像与荧光影像的细胞轮廓的相对位置误差小于或等于目标细胞的直径尺寸的5％时，则将该细胞辨识为目标细胞。虽然图4中显示先执行流程S153再执行流程S155，但本发明并不限于此。根据本发明的实施例，可先比对白光影像与荧光影像的细胞轮廓的相对位置后，再判读所标定的初步目标细胞的形状与尺寸是否合乎所述目标细胞的标准形状。
下文提供具体实施例详细描述根据本发明实施例的细胞辨识方法。
首先，制备分析样品。
举例来说，自检测对象取得生理样品(例如唾液、分泌物、血液样品等)来提供作为检验样品。检测对象类如为人类或哺乳类，血液样品例如是全血，但并不以此为限。
接着，对所提供的血液样品进行离心，以获取细胞混合物，所分离得到的细胞混合物含有本案实施例所预定辨识的目标细胞与非目标细胞。细胞混合物中的细胞主要例如为非贴附型细胞(即悬浮细胞)，且例如是包括单核淋巴细胞、循环肿瘤细胞(CTCs)、胎儿有核红血球(FnRBCs)、进行间质-上皮相互转换(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)的细胞或其组合。其中，依照某些实施例，目标细胞可包括例如循环肿瘤细胞，非目标细胞可包括例如白血球计数细胞(WBC)，红细胞(RBC)及/或血小板等，但不以此为限。
具体来说，例如可利用Ficoll-PaqueTM细胞/单核球分离液(以聚蔗糖(Ficoll))及酰胺碘苯甲酸钠(sodium diatrizoate)依比例配制成密度为1.077g/ml的溶液)将血液中的组分依据密度梯度进行分层，操作步骤大致如下：先将LymphoprepTM滴入Leucosep离心管过滤膜下方。接着，将血液样品缓慢地沿离心管壁倒入，并以800×g(RCF，相对离心力)离心15分钟。
接着，抽取分离出细胞混合物至微量离心管，并加入荧光标记物至细胞混合物中，以使荧光标记物与细胞混合物中的目标细胞结合。也就是将目标细胞进行荧光染色而得到分析样品。具体来说，将离心管中过滤膜上方的液体(包括细胞混合物与血浆)转移至另一全新的离心管，并以300×g离心10分钟，使细胞混合物中的细胞沉积至离心管底部。接着，移除上清液，并加入1毫升(ml)的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)使细胞混合物中的细胞重新悬浮(resuspend)后，取出的部分悬浮液(约5微升(μl))进行细胞计数，且将剩余的悬浮液以400×g离心6分钟，以使细胞混合物中的细胞沉积至离心管底部。接着，进行两阶段的荧光染色，第一阶段的荧光染色例如是对细胞的表面抗原进行染色，而第二阶段的荧光染色例如是对细胞的细胞核进行染色，且例示步骤大致如下：首先，移除上清液，加入100μl的PBS使细胞混合物中的细胞重新悬浮后，加入第一阶段的荧光标记物并避光30分钟，以使第一阶段的荧光标记物与细胞混合物中的特定细胞结合。接着，加入1ml的PBS，以400×g离心6分钟后移除上清液，以移除未与细胞表面抗原结合的第一阶段的荧光标记物。而后，加入100μl的PBS使细胞混合物中的细胞重新悬浮后，加入第二阶段的荧光标记物并避光10分钟，以使第二阶段的荧光标记物与细胞混合物中的所有细胞的细胞核结合。接着，加入1ml的PBS，以400×g离心6分钟并移除上清液，以移除未与细胞结合的第二阶段的荧光标记物。
举例来说，当目标细胞为循环肿瘤细胞时，第一阶段的荧光标记物可包括带有特定荧光物质的抗EpCAM抗体，其中特定荧光物质例如是荧光异硫氰酸盐(fluoresceinisothiocyanate，FITC)，具有激发波长Ex:482±25nm/发射波长Em:531±40nm的荧光波段，其被激发后发出绿色荧光。第二阶段的荧光标记物可包括染剂Hoechst 33342。Hoechst33342具有激发波长Ex:357±44nm/发射波长Em:475±28nm的荧光波段，其被激发后发出蓝色荧光。抗EpCAM抗体结合至循环肿瘤细胞的表面抗原皮细胞黏附分子(epithelial celladhesion molecule，EpCAM)，而Hoechst 33342则结合至细胞核。此处，各荧光标记物分别具有不同的荧光发光波长范围。
特别说明的是，在一些实施例中，第一阶段的荧光染色可更包括使用标记非目标细胞的荧光标记物来对非目标细胞的表面抗原进行荧光染色。举例来说，当目标细胞为循环肿瘤细胞时，第一阶段的荧光标记物可更包括带有特定荧光物质的抗CD45抗体，其中特定荧光物质例如是藻红素(phycoerythrin，PE)，具有激发波长Ex:554±23nm/发射波长Em:624±40nm的荧光波段，其被激发后发出橘黄色荧光。抗CD45抗体可结合至白血球(此实施例中白血球为非目标细胞)的表面抗原CD71，可用来标记出非目标细胞(例如白血球)的位置。因此，在后续的荧光影像分析定位出目标细胞所在的位置的步骤时，发出橘黄色荧光的区域可视为应被排除的区域，借此设计，可更精准定位出目标细胞所在的位置。
接着，将分析样品以定量添加填入到数组芯片的细胞井中，使分析样品中的目标细胞与非目标细胞以大致单层的方式平铺于所述细胞井的底部，也就是说，目标细胞与非目标细胞在细胞井的法线方向上不会重叠。数组芯片可例如是细胞自组装数组芯片(Self-assembly cells array，SACA)。细胞自组装数组芯片具有多组孔槽，各孔槽槽底为具有亲水性且抗细胞沾黏涂层的平面，每个孔槽包括细胞井与多个蒸散槽，将细胞混合溶液加入细胞井中，此时液体会从间隙流到蒸散槽，透过结构驱动的流场及重力场，使细胞向下及向左右两侧沉降、排列。由于间隙小于细胞尺寸，因此细胞不会流出细胞井。只要每个细胞井内的细胞不超出极限值(端视细胞井体积来决定)，可促使细胞铺平成单一致密层，有效提升后续细胞的影像辨识率、降低误判机率、进而提升分选时的纯度。
接着，利用根据本发明实施例的细胞辨识系统来辨识以及定位前述数组芯片细胞井中的分析样品所包含的目标细胞。根据本发明实施例所提供的细胞辨识系统同时具有荧光影像分析系统与白光影像分析系统，可对数组芯片中的分析样品以自动化的影像分析方式，判定辨识目标细胞。本发明实施例的细胞辨识系统乃是可以同时实现自动细胞影像定位追踪与结合荧光与白光细胞表型辨识判断的细胞辨识系统。本发明实施例的细胞辨识系统判读逻辑程序可利用影像辨视所显示目标细胞的多重物理生理特征(包括：细胞与不同荧光标记物作用所产生的影像荧光强度，细胞外型分类，抗体荧光作用于细胞上的位置)用以判读，并可搭配人工智能影像判读逻辑进行细胞/血球细胞识别与深度学习。
本发明实施例所提供的细胞辨识系统至少包括装设于外壳之内的内置计算机(PC)和固态硬盘(SSD)，用以操作系统计算机包含的影像辨识软件。本发明实施例所提供的细胞辨识系统至少包括配置外加LED光源的高倍放大显微镜、XYZ样本移动平台、专用相机、内置电机系统和LED光源控制器以及外部电源。本发明实施例所提供的细胞辨识系统至少包括能够处理一次八种或更多种类的样本检体并摄相拍照，每张照片可由例如16张个别区域小图拼接而成。
首先，以荧光影像分析系统针对前述数组芯片细胞井中的分析样品进行荧光影像拍摄，定位出发出荧光的目标细胞的位置，并根据荧光的亮度尺寸，判读是否为有效荧光信号；根据有效荧光信号的种类的重叠程度，判读是否为初步目标细胞。后续，以白光影像分析系统针对前述数组芯片细胞井中的分析样品进行白光影像拍摄，根据白光影像的照片，进一步判读初步目标细胞的细胞表型与形状，以更精准地判别辨识出目标细胞。由于根据本揭露实施例的细胞辨识系统同时结合荧光信号分析与白光细胞表型辨识，而能够在即使是在辨识血液中的稀少细胞时，也能具有高准确率。
举例来说，将装有分析样品的数组芯片放上具有根据本发明实施例的细胞辨识系统的影像分析机台执行荧光影像分析与白光影像分析。荧光影像分析可例如是透过荧光影像分析系统，针对机台上含有混合溶液的数组芯片，进行x-y-z轴的校准，确认整个数组芯片位置正确，且得以精准定位细胞与数组芯片的细胞井相对位置。白光影像分析类似于荧光影像分析，但改以白光作为光源。在本文中，白光是色温在约3500-10000K范围内的光。
根据本发明实施例的细胞辨识系统首先执行荧光影像分析。针对实施例中所使用的各种不同荧光标记物，以各种不同的特定的荧光激发波段(所谓特定的荧光激发波段乃是指针对特定的荧光标记物会使用与其相对应的荧光激发波段)进行荧光扫描并拍摄照片，所拍摄的照片如图5所示。举例来说，可使用365nm(相对应的荧光能量为6.5mW)、488nm(相对应的荧光能量为13.5mW)、520nm(相对应的荧光能量为15mW)、630nm(相对应的荧光能量为17.2mW)的荧光激发波段。
接着针对在不同荧光激发波段下扫瞄并拍摄的荧光影像照片进行荧光强度分析。荧光强度分析步骤是根据荧光扫描的拍摄照片判读出现荧光信号的位置的荧光信号亮度。当荧光信号亮度落在默认范围中时，根据本发明的细胞辨识系统则标定该荧光信号为有效荧光信号。
第一阶段可先判读用以标记目标细胞的有效荧光信号。举例来说，当目标细胞为循环肿瘤细胞时，第一阶段可判读带有荧光异硫氰酸盐(FITC)的抗EpCAM抗体的荧光信号亮度以标定EpCAM信号。具体而言，使用与荧光异硫氰酸盐(FITC)相对应的荧光激发波段(例如488nm，相对应的荧光能量为13.5mW)进行荧光扫描并拍摄照片，当照片中的荧光信号亮度落在70-120的范围时，则标定此荧光信号为EpCAM有效信号(图6中会以EpCAM信号(+)来代指)。根据实施例，可在此一阶段自动标定或手动圈选有效荧光信号面积范围，来绘示出细胞轮廓。
第二阶段可判读用以标记非目标细胞的有效荧光信号。举例而言，第二阶段可判读对非循环肿瘤细胞(非目标细胞)进行荧光染色的带有藻红素(phycoerythrin，PE)的抗CD45抗体的荧光信号，以排除非循环肿瘤细胞。抗CD45抗体为结合至白血球(即非目标细胞)的表面抗原CD71，可用来标记出白血球的位置。具体而言，使用与藻红素(phycoerythrin，PE)相对应的荧光激发波段(例如520nm，相对应的荧光能量为15mW)进行荧光扫描并拍摄照片，当照片中的荧光信号亮度落在3-35的范围时，则标定此荧光信号为CD45有效信号(图6中会以CD45信号(+)来代指)。
第三阶段可判读用以标记细胞的特定部件的荧光物质(例如对细胞核进行染色的荧光物质的有效荧光信号以确认是带有细胞核的目标细胞。举例而言，第三阶段可判读对细胞核进行荧光染色的Hoechst 33342的荧光信号亮度以标定出现细胞核信号的位置。具体而言，使用与Hoechst 33342相对应的荧光激发波段(例如365nm，相对应的荧光能量为6.5mW)进行荧光扫描并拍摄照片，当照片中的荧光信号亮度落在5-40的范围时，则标定此荧光信号为Hoechst 33342有效信号(图6中会以Hoechest信号(+)来代指)。
标定出如图5的数字所指示的各种荧光信号后，可再根据图6的判读逻辑流程进行荧光影像分析辨识循环肿瘤细胞。可将不同荧光波段拍摄的影像进行迭图，以方便进行比对。参照图6，如果在标定EpCAM有效信号的位置处，也标定了CD45有效信号，由于CD45有效信号通常指示白血球而非循环肿瘤细胞，因此需进一步比对EpCAM有效信号与CD45有效信号是否完全重叠，如果不完全重叠，且此位置又有Hoechst 33342有效信号时，则初步判定此位置出现的细胞为循环肿瘤细胞，如果完全重叠，且此位置又有Hoechst 33342有效信号时，则须进一步比对CD45的荧光亮度与EpCAM的荧光亮度，如果CD45的荧光亮度大于EpCAM的荧光亮度，则判定此位置出现的细胞为白血球，反之则为循环肿瘤细胞或循环肿瘤细胞簇。或者，如果在出现CD45有效信号的位置没有观察到EpCAM有效信号，且此位置又有Hoechst 33342有效信号时，则初步判定此位置出现的细胞为白血球细胞。
图7是根据本发明实施例的不同荧光波段的荧光影像照片的特定位置的放大图。参见图7，图7的(a)为使用与Hoechst 33342相对应的荧光激发波段进行荧光扫描并拍摄的照片，照片中Hoechst 33342的荧光亮度为0、图7的(b)为使用与带有FITC的抗EpCAM抗体相对应的荧光激发波段进行荧光扫描并拍摄的照片，照片中的荧光亮度为220、图7的(c)为使用与带有PE的抗CD45抗体相对应的荧光激发波段进行荧光扫描并拍摄的照片，照片中的荧光亮度为26、图7的(d)为(a)-(c)的迭图。如图7所示，此位置出现EpCAM有效信号与CD45有效信号，但没有Hoechst 33342有效信号，因此，此位置应该为杂质。
图8是根据本发明实施例的不同荧光波段的荧光影像照片的特定位置的放大图。参见图8，图8的(a)为使用与Hoechst 33342相对应的荧光激发波段进行荧光扫描并拍摄的照片，照片中的荧光亮度为22、图8的(b)为使用与带有FITC的抗EpCAM抗体相对应的荧光激发波段进行荧光扫描并拍摄的照片，照片中的荧光亮度为237、图8的(c)为使用与带有PE的抗CD45抗体相对应的荧光激发波段进行荧光扫描并拍摄的照片，照片中的荧光亮度为26、图8的(d)为(a)-(c)的迭图。如图8所示，此位置同时出现EpCAM有效信号、CD45有效信号与Hoechst 33342有效信号，但EpCAM信号不与CD45信号完全重叠，因此，此位置出现的细胞可初步判定为目标细胞。
在完成荧光影像分析后，接着利用白光影像分析系统，针对机台上含有分析样品的数组芯片，进行x-y-z轴的校准，确认整个数组芯片位置正确，且得以精准定位细胞与数组芯片的细胞井相对位置，以白光扫描分析样品并拍摄照片，白光影像照片如图9所示。详细来说，根据白光影像照片，判断前述所筛选的初步目标细胞的细胞表型与形状。具体而言为利用周长与面积的计算方式判读初步目标细胞的面积尺寸与细胞是否呈现为圆形与/或微椭圆形。根据白光影像照片，可计算所选定初步目标细胞的面积尺寸以及圆周，并将白光影像照片与前述流程中具有EpCAM荧光信号的荧光影像照片交叉比对，确认白光影像照片所显示细胞轮廓与荧光影像照片中根据荧光信号所圈选定位的细胞轮廓相对位置误差是否小于或等于目标细胞的直径的特定比例(例如小于或等于目标细胞平均直径的5％)。并可搭配根据荧光信号所圈选的细胞轮廓来计算偏心率，举例来说偏心率范围大约为0～0.8。据此，挑选出初步目标细胞的形状为圆形及微椭圆形的细胞，当形状呈现椭圆(可计算偏心率eccentricity，例如偏心率>0.8则太过椭圆)或是非圆形时则定义此为杂质。并将白光影像照片与具有EpCAM荧光信号的荧光影像照片交叉比对，确认白光影像照片与荧光影像照片的定位的相对位置误差是否小于或等于目标细胞的直径(例如，循环肿瘤细胞的平均直径约为20μm)尺寸的5％。举例来说，当白光影像照片上的初步目标细胞具有圆形及微椭圆形(可计算偏心率，例如偏心率大于0但小于0.8视为微椭圆形)的形状，且其位置与EpCAM有效荧光信号的位置的误差小于或等于循环肿瘤细胞的直径(例如，循环肿瘤细胞的平均直径约为20μm)的5％时，则将其辨识为目标细胞。
在辨识出目标细胞后，可例如利用计算机可程序化的电动单细胞撷取注液系统的自动化吸取器，通过固定流率(例如是20微升/分钟(μl/min))的定量吸液来获取目标细胞，借此可实现单细胞撷取的功能，同时具有降低分选容液连带的背景噪声与污染的效果。撷取的目标细胞后续可再进行细胞培养、细胞生化检测、基因工程等等程序，而进一步应用于不同细胞学领域。
透过结合荧光强度分析、荧光影像分析与白光影像分析的结果进行细胞辨识，可进一步提高细胞辨识的精准度，因此可以高准确率辨识出目标细胞。借此，可使本实施例的细胞辨识方法具备细胞培养、分离领域等应用价值，如：单细胞基因组学和蛋白质组学、细胞异质性等。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (11)
1.一种细胞辨识方法，包括：
提供分析样品，所述分析样品含有目标细胞、非目标细胞与荧光标记物，所述荧光标记物包括用于标定细胞核的第一荧光标记物、用于标定所述目标细胞的第二荧光标记物以及用于标定所述目标细胞或所述非目标细胞的第三荧光标记物；
分别以与所述第一荧光标记物对应的第一荧光波段、与所述第二荧光标记物对应的第二荧光波段及与所述第三荧光标记物对应的第三荧光波段对所述分析样品进行荧光扫描以取得所述分析样品在所述第一荧光波段、所述第二荧光波段及所述第三荧光波段下的第一荧光影像照片、第二荧光影像照片及第三荧光影像照片；
量测所述第一荧光影像照片、所述第二荧光影像照片及所述第三荧光影像照片的荧光信号亮度，将荧光信号亮度落在默认范围中的荧光信号标定为有效荧光信号；
将同时在所述第一荧光影像照片及所述第二荧光影像照片中具有有效荧光信号的细胞标定为第一初步目标细胞；
当所述第三荧光标记物用于标定所述目标细胞时，将在第三荧光影像照片中具有所述有效荧光信号的所述第一初步目标细胞标定为第二初步目标细胞，或者当所述第三荧光标记物用于标定所述非目标细胞时，将在第三荧光影像照片中不具所述有效荧光信号的所述第一初步目标细胞标定为第二初步目标细胞；以及
以白光对所述分析样品进行白光扫描以取得所述分析样品的白光影像照片，将具有特定细胞表型与形状的所述第二初步目标细胞辨识筛选为所述目标细胞。
2.根据权利要求1所述的细胞辨识方法，其中所述目标细胞为循环肿瘤细胞，所述第一荧光标记物为Hoechst 33342，所述第二荧光标记物为带有荧光异硫氰酸盐(fluoresceinisothiocyanate，FITC)的抗EpCAM抗体，且所述第三荧光标记物为带有藻红素(phycoerythrin，PE)的抗CD45抗体。
3.根据权利要求1所述的细胞辨识方法，其中所述目标细胞为胎儿有核红血球，所述第一荧光标记物为4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)，所述第二荧光标记物为带有荧光异硫氰酸盐的抗CD147抗体，且所述第三荧光标记物为带有藻红素的抗CD71抗体。
4.根据权利要求1所述的细胞辨识方法，其中所述目标细胞为进行间质-上皮相互转换的细胞，所述第一荧光标记物为Hoechst 33342或4',6-二脒基-2-苯基吲哚，所述第二荧光标记物为带有荧光异硫氰酸盐的抗EpCAM抗体，且所述第三荧光标记物为带有藻红素的抗波形蛋白(vimentin)抗体。
5.根据权利要求1所述的细胞辨识方法，其中所述第一荧光标记物为Hoechst 33342，且所述第一荧光标记物的所述有效荧光信号的亮度范围为5-40。
6.根据权利要求1所述的细胞辨识方法，其中所述第二荧光标记物为带有荧光异硫氰酸盐的抗EpCAM抗体，且所述第二荧光标记物的所述有效荧光信号的亮度范围为70-120。
7.根据权利要求1所述的细胞辨识方法，其中所述第三荧光标记物为带有藻红素的抗CD45抗体，且所述第三荧光标记物的所述有效荧光信号的亮度范围为3-45。
8.根据权利要求1所述的细胞辨识方法，其中以白光对所述分析样品进行白光扫描以取得所述分析样品的白光影像照片，将具有特定细胞表型与形状的所述第二初步目标细胞辨识为所述目标细胞的步骤包括：根据所述分析样品的所述白光影像照片，计算所标定的第二初步目标细胞的周长与面积，来决定所标定的第二初步目标细胞的形状与尺寸，所述形状与尺寸符合所述目标细胞的标准形状，判定辨识为所述目标细胞。
9.根据权利要求8所述的细胞辨识方法，其中所述目标细胞的所述标准形状包括圆形或偏心率小于0.8的微椭圆形。
10.根据权利要求8所述的细胞辨识方法，其中将具有特定细胞表型与形状的所述第二初步目标细胞辨识为目标细胞的步骤更包括：将所取得白光影像照片与所述第二荧光影像照片交叉比对，比较所述白光影像照片中所标定的第二初步目标细胞的细胞轮廓以及所述第二荧光影像照片中的有效荧光信号所定位的细胞轮廓，两者轮廓相对位置误差小于或等于所述目标细胞的直径的特定比例，判定辨识为所述目标细胞。
11.根据权利要求10所述的细胞辨识方法，其中所述特定比例为所述目标细胞的直径的5％。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication |