JP2006304774A - マラリア感染赤血球の検出方法並びにこれに使用する検出用試薬及び赤血球膜部分溶解試薬 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 本発明の赤血球膜部分溶解試薬は、赤血球の細胞膜に対して所定の溶解力を有する第一の界面活性剤と、該第一の界面活性剤よりも溶解力が弱い第二の界面活性剤とを含み、pH5〜7であり、浸透圧が200〜300mOsm/kg・H2Oであり、マラリア原虫を赤血球内部に保持した状態で蛍光色素が透過できるように、赤血球の細胞膜を部分的に溶解する。この検出試薬と全血検体を混合した試料をフローサイトメータに導入して得られた散乱光情報及び蛍光情報からマラリア感染赤血球を検出する。
【選択図】 図2
Description
K×(M×WBC)/(W×RBC)×100(式中、Kは補正定数である)
により算出する。
K×M/(RBC×V)×100(式中、Kは補正定数である)
により算出する。
前記感染率(%)を、
M/(G+M)×100
により算出する。
はじめに、本発明のマラリア感染赤血球の検出方法に好適に用いられる、本発明の赤血球膜部分溶解試薬について説明する。
従って、前記第一の界面活性剤及び前記第二の界面活性剤が長鎖アルキル基を有する四級アンモニウム塩の場合には、前記第二の界面活性剤の長鎖アルキル基の炭素数を、前記第一の界面活性剤の長鎖アルキル基の炭素数より少なくすることが好ましい。
本発明のマラリア感染赤血球検出用試薬は、上記本発明の赤血球膜部分溶解試薬とDNA選択的蛍光色素、好ましくはDNA選択的ビスベンズイミド系蛍光色素を含有する。
DNA選択的蛍光色素とは、RNAよりもDNAを強く染色する蛍光色素で、DNA選択的ビスベンズイミド系蛍光色素とは骨格がビスイミド系のものである。
本発明のマラリア原虫感染赤血球の検出方法は、RNAよりもDNAを強く染色するDNA選択的蛍光色素を含み且つマラリア原虫を内部に保持した状態で前記蛍光色素が透過できるように赤血球の細胞膜を部分的に溶解することができる試薬と、マラリアに感染した赤血球を含む試料とを混合して、測定試料を調製する工程;前記測定試料に光を照射して散乱光情報及び蛍光情報を取得する工程;並びに前記散乱光情報及び蛍光情報に基づいてマラリアに感染した赤血球を検出する工程を含む。
また、リングフォーム、トロポゾイド、シゾントとマラリア原虫が成育するに従って感染赤血球のサイズが大きくなるので、それぞれ異なった散乱光強度を示す。以上より、DNA量を反映する蛍光強度と、細胞サイズを反映する散乱光強度とに基づいてマラリア原虫感染赤血球をマラリア原虫の成育段階毎に分類することが可能である。
感染率は以下の方法A〜Cのいずれかにより求められる。
方法A:白血球濃度と赤血球濃度の比率を利用する方法
方法Aは、予め検体の赤血球濃度RBCと白血球濃度WBCを測定しておき、その比率を利用して、フローサイトメータで作成したスキャッタグラムに基づいて感染率を求める方法である。
一方、本発明によるゲートで各細胞領域を区切ったスキャッタグラム(図3)から、各細胞領域内のドットを計数して、白血球粒子数(W1ゲート内ドット数)W、マラリア感染赤血球数(M1ゲート領域内ドット数)Mを求める。
x = (W×RBC)/WBC (式1)
赤血球数xと上記で得られた感染赤血球数Mから、感染率Ratioを式2に基づいて算出する。式中、Kは、測定装置内部での損失等を考慮して決定される補正定数である。
Ratio= K×M/x×100 (式2)
式1及び式2から、あるいは直接、式3により感染率を求めることができる。
Ratio=K×(M×WBC)/(W×RBC)×100 (式3)
Mr=(R1+R2)/M×100
Mt:マラリア感染RBCに占めるトロポゾイトを含む赤血球の比率 (%)
Mt=T/M×100
Ms:マラリア感染RBCに占めるシゾントを含む赤血球の比率 (%)
Ms=S/M×100
さらに、リングフォーム(R1+R2)を含む赤血球(R1+R2)のうちのリングフォーム(マルチ)の割合Mrm(%)は、下記式4により算出できる。
Mrm=R2/(R1+R2)×100 (式4)
予め、検体の赤血球濃度RBCを測定し、測定試料の調製に使用する検体の容積から測定試料中に含まれる赤血球数を算出して、図3のスキャッタグラムから計数される感染赤血球数との割合を求める方法である。
Ratio=K×M/(RBC×V)×100 (式5)
測定試料中の赤血球数と感染赤血球数を計数し、それから感染率を算出する方法である。
Ratio=M/(G+M)×100 (式6)
本発明の検出方法で使用するフローサイトメータは、特に限定しないが、例えば特開2004−105027に開示されている装置、すなわち、測定試料を導入するためのフローセルと、フローセル内を流れる測定試料中の細胞に励起光を照射するための光源;励起光を照射された前記細胞より発せられる散乱光強度を検出するための第1の検出器;励起光を照射された前記細胞より発せられる蛍光光強度を検出するための第2の検出器;散乱光強度と蛍光強度を二軸とする散布図を作成し、前記散布図上でマラリア非感染赤血球領域及び感染赤血球領域を特定し、計数する解析部;を備えた装置を用いることができる。
図4において、励起光源(例えば青色レーザダイオード:波長405nm)21から出射されたビームは、コリメートレンズ22を介してシースフローセル23のオリフィス部を照射する。ノズル6から吐出されたオリフィス部を通過する血球から発せられる前方散乱光は集光レンズ24とピンホール板25を介して前方散乱光検出器(フォトダイオード)26に入射する。一方、オリフィス部を通過する血球から発せられる側方散乱光は、集光レンズ27とダイクロイックミラー28とフィルタ29とピンホール板30を介して側方蛍光検出器(フォトマルチプライアチューブ)31に入射する。また、オリフィス部を通過する血球から発せられる側方蛍光は、集光レンズ27とダイクロイックミラー28とフィルタ29とピンホール板30を介して側方蛍光検出器(フォトマルチプライアチューブ)31に入射する。前方散乱光検出器26から出力される前方散乱光信号と、側方散乱光検出器29から出力される側方散乱光信号と、側方蛍光検出器31から出力される側方蛍光信号とは、それぞれアンプ32,33,34により増幅され、解析部35に入力される。
尚、上記実施形態では、リングフォーム(シングル)の領域及びリングフォーム(マルチ)の領域を特定しているが、これらのうちの何れか一方の領域のみを特定してもよい。
1:界面活性剤濃度について
表1に示す組成を有する赤血球膜部分溶解試薬において、界面活性剤の濃度を表2に示すように変え、塩酸量によりいずれもpH6.1に調整した試薬No.1〜5を調製した。検体a(ヒト全血)、検体b(ヒト全血に培養マラリア原虫を添加)それぞれ20μlに、色素としてヘキスト34580(Invitrogen社:励起波長392nm、蛍光波長498nm)をエチレングリコールで溶解した色素液(0.5mg/ml)2μlと、前記試薬No.1〜5を1ml添加し、40℃、40秒間混合して、測定試料とした。この測定試料を、光源として青半導体レーザ(波長405nm)を用いたフローサイトメータにかけて測定した。
表1に示す組成を有する赤血球膜部分溶解試薬において、界面活性剤としてSTAC90ppm、LTAC900ppmを含み、さらに塩酸量を変えることにより、表3に示すように、pHを調節した試薬No.11〜13を調製した。検体a(ヒト全血)、検体b(ヒト全血に培養マラリア原虫を添加)それぞれ20μlに、上記1で用いた蛍光色素(ヘキスト34580)液2μlと、前記試薬No.11〜13を1ml添加し、40℃、40秒間混合して、測定試料とした。この測定試料を、光源として青半導体レーザを用いたフローサイトメータにかけて測定した。
浸透圧は、Advanced Instruments社のAdvanced 3D3 Osmometer(凝固点降下法)で測定した。
実施例1:
表1に示す組成において、界面活性剤としてSTAC90ppm及びLTAC900ppmを含有する赤血球膜部分溶解試薬(pH6.1、浸透圧256mOsm/kg・H2O)1mlと、上記で用いたヘキスト34580色素液2μlを混合して、検出用試薬を調製した。
表1に示す組成において、界面活性剤としてSTAC281ppm、LTAC924ppmを含有する赤血球膜部分溶解試薬(実施例2)、実施例2の試薬にさらにPOE(20)フィトステロールを500ppm含有させた赤血球膜部分溶解試薬(実施例3)、及び実施例2の試薬にさらにPOE(25)フィトスタノールを500ppm含有させた赤血球膜部分溶解試薬(実施例4)を調製した。実施例2〜4の赤血球膜部分溶解試薬のpHは6.1、浸透圧は257mOsm/kg・H2Oであった。これらの試薬のいずれか1mlと、上記で用いたヘキスト34580色素液2μlを混合して、検出用試薬を調製した。
次に、この測定試料を上記検出用試薬と混合した後、光源として青色半導体レーザを用いたフローサイトメータに導入し、横軸:蛍光強度、縦軸:散乱光強度とするスキャッタグラムを作成した。実施例2〜4の試薬を用いた際のスキャッタグラムを、それぞれ図19〜21に示す。そして、このスキャッタグラムに基づいて、上記の方法Aを使用して、マラリア粒子のカウント数およびマラリア感染率を求めた。なお、方法Aによる感染率の算出に用いられる補正定数Kは1である。これらの結果を表6に示す。また、同じ検体について塗抹標本を作製し、ギムザ染色を行ない、顕微鏡観察(目視)により算出した感染率の結果も、あわせて表6に示す。
以上より、顕微鏡観察を行なう技術者の技能によって、結果の再現性が悪い点や検出限界感度が異なるなどの問題を回避できる。また、技術者の主観に基づく判断を防止して、より客観的な検査結果を提供できる。実際の医療現場では、迅速な診断、さらには薬剤投与量、投与スパンなどの治療方法の選択決定に利用できる。
26 散乱光検出器
31 蛍光検出器
35 解析部
Claims (14)
- 試料中の赤血球の細胞膜を部分的に溶解するための試薬であって、
前記赤血球の細胞膜に対して所定の溶解力を有する第一の界面活性剤と、
該第一の界面活性剤よりも溶解力が弱い第二の界面活性剤とを含み、
pH5〜7であり、浸透圧が200〜300mOsm/kg・H2Oであり、
マラリア原虫を赤血球内部に保持した状態で蛍光色素が透過できるように、赤血球の細胞膜を部分的に溶解する赤血球膜部分溶解試薬。 - 前記第一の界面活性剤及び前記第二の界面活性剤が長鎖アルキル基を有する四級アンモニウム塩であり、
前記第二の界面活性剤の長鎖アルキル基の炭素数は、前記第一の界面活性剤の長鎖アルキル基の炭素数より少ない、請求項1に記載の赤血球膜部分溶解試薬。 - 前記第一の界面活性剤が、ステアリルトリメチルアンモニウムクロライドであり、
前記第二の界面活性剤が、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライドである請求項1又は2記載の赤血球膜部分溶解試薬。 - 実質的に赤血球の細胞膜を溶解しないノニオン界面活性剤をさらに含む請求項1〜3の何れかに記載の赤血球膜部分溶解試薬。
- 前記ノニオン界面活性剤は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル型界面活性剤、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル型界面活性剤、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル型界面活性剤、ポリオキシエチレンフィトステロール型界面活性剤、及びひまし油からなる群より選ばれる請求項4に記載の赤血球膜部分溶解試薬。
- 前記ノニオン界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタンモノイソステアリン酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸エステル、ポリオキシエチレン水素化ひまし油、ポリオキシエチレンフィトステロール、ポリオキシエチレンフィトスタノール、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレンデシルテトラデシルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレンセチルエーテル、およびポリオキシエチレンモノラウリン酸エステルからなる群より選択される少なくとも1つである、請求項4に記載の赤血球膜部分溶解試薬。
- マラリア原虫に感染した赤血球を検出するための試薬であって、
請求項1〜6の何れかに記載の赤血球膜部分溶解試薬と、RNAよりもDNAを強く染色するDNA選択的蛍光色素とを含むマラリア感染赤血球検出用試薬。 - 前記DNA選択的蛍光色素が、下式で示される蛍光色素である請求項7記載のマラリア感染赤血球検出用試薬。
- RNAよりもDNAを強く染色するDNA選択的蛍光色素を含み且つマラリア原虫を内部に保持した状態で前記蛍光色素が透過できるように赤血球の細胞膜を部分的に溶解することができる試薬と、マラリアに感染した赤血球を含む試料とを混合して、測定試料を調製する工程;
前記測定試料に光を照射して散乱光情報及び蛍光情報を取得する工程;及び
前記散乱光情報及び蛍光情報に基づいてマラリアに感染した赤血球を検出する工程;
を含むマラリア感染赤血球の検出方法。 - 前記取得工程において、前記測定試料をフローサイトメータのフローセルに導入し、前記フローセル内を流れる前記測定試料に前記蛍光色素の蛍光を励起する励起光を照射し、前記測定試料中の赤血球から散乱光情報及び蛍光情報を取得し、
前記検出工程において、前記散乱光情報及び前記蛍光情報に基づいて、マラリアに感染した赤血球が含まれるマラリア感染赤血球領域を特定する、
請求項9に記載の検出方法。 - 前記検出工程において、前記散乱光情報および前記蛍光情報を二軸とする散布図を作成し、前記散布図中に、マラリアに感染した赤血球が含まれるマラリア感染赤血球領域を設定し、前記マラリア感染赤血球領域内のマラリアに感染した赤血球を検出する、請求項10に記載の検出方法。
- 前記マラリア感染赤血球領域のうち、リングフォーム(シングル)を含む赤血球の領域及びリングフォーム(マルチ)を含む赤血球の領域を特定する工程をさらに含む請求項10又は11記載の検出方法。
- 前記マラリア感染赤血球領域に含まれる赤血球数(感染赤血球数M)を計数し、前記試料におけるマラリア感染赤血球の割合(感染率)を算出する、請求項11又は12に記載の方法。
- 前記試薬には、赤血球の細胞膜に対して所定の溶解力を有する第一の界面活性剤と、前記第一の界面活性剤よりも溶解力の弱い第二の界面活性剤とが含有されている請求項9〜13の何れかに記載の方法。
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