JP4388779B2 - マラリア原虫の検出方法、検出装置、およびその試薬キット - Google Patents
マラリア原虫の検出方法、検出装置、およびその試薬キット Download PDFInfo
- Publication number
- JP4388779B2 JP4388779B2 JP2003331963A JP2003331963A JP4388779B2 JP 4388779 B2 JP4388779 B2 JP 4388779B2 JP 2003331963 A JP2003331963 A JP 2003331963A JP 2003331963 A JP2003331963 A JP 2003331963A JP 4388779 B2 JP4388779 B2 JP 4388779B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- malaria
- hemolytic agent
- alkyl group
- specimen
- surfactant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Description
しかし、この方法は、塗抹標本の作成、固定、染色など煩雑な工程を必要とし、それらの処理のために長時間を要する。また、マラリア原虫の検出、同定が目視によって行われるため、正確な検出、同定には観察者の熟練を要する。さらに、検査されるマラリア患者の検体には感染率の低いものも含まれるため、高感度検出を実現するためには多数の赤血球を長時間かけて観察する必要がある。このようなことから、測定結果はしばしば正確性を欠くとともに、検体の前処理と測定に長時間を要し、多数の検体を処理することは困難であった。
これらの欠点を解決する方法として、フローサイトメトリによるマラリア原虫の測定方法が開発されている。この方法は、マラリア原虫を核酸染色性色素で染色し、フローサイトメータで測定するものである。この方法では、ほとんどの場合、測定は自動化されており、顕微鏡検査に比較して誤差は極めて少ない。また、測定時間は数十秒〜数分と短時間であり、多数の検体を一度に処理するができ、迅速かつ簡便な測定法である(例えば、非特許文献1〜4参照)。
この欠点を解決するために、赤血球を、ホルムアルデヒド、エチレングリコールを含む溶血剤により溶血し、マラリア原虫を遊離した後に染色してフローサイトメータで測定する方法(例えば、非特許文献5参照)や赤血球のみを遠心分離で分離し、化学物質又は超音波で溶血した後、計数する方法がある(特許文献1参照)。
また、界面活性剤で赤血球を溶血させ、遊離したマラリア原虫に蛍光染色を混合し、蛍光染色されたマラリア原虫を含む血液試料をフローサイトメータで測定し、前方散乱光強度及び側方蛍光強度を得てスキャッタグラムを作成し、スキャッタグラム上で各種血球、デブリス(溶血した赤血球の残骸)及びマラリア原虫を弁別、検出する方法がある(非特許文献6及び特許文献2参照)。この方法によれば、培養マラリアを生活環の各ステージごとに、高感度に検出することができる。
本発明は、上記課題に鑑みなされたものであり、網状赤血球の影響を排除して、正確かつ高精度にマラリア原虫を検出することができるマラリア原虫の検出方法、検出装置、およびその試薬キットを提供することを目的とする。
前記溶血を、第1の界面活性剤を含む第1の溶血剤で検体を処理し、処理された検体を、第1の界面活性剤よりも溶血力の強い第2の界面活性剤を含む第2の溶血剤で処理することにより行うマラリア原虫の検出方法が提供される。
測定試料の蛍光情報を測定するフローサイトメータと、
前記蛍光情報に基づいてマラリア原虫を弁別する制御部と、
を備えるマラリア原虫の検出装置が提供される。
特に、試料に対して溶血剤を少なくとも2段階以上で添加することにより、赤血球や網状赤血球を十分に溶血させ、かつマラリア原虫には測定に影響するダメージを与えないよう処理することで、試料中のマラリア原虫を正確に測定することができる。
検体としては、マラリアに感染した赤血球を含むものであり、臨床分野で得られる血液試料(例えば、末梢血等)のほか、試験的に培養された培養液等であってもよい。なお、試料は、マラリア原虫に感染しているものであれば、その程度は特に限定されず、例えば、10%以上の感染率のもの、0.01%以下の感染率のものも含まれる。試料は抗凝固剤等により処理されたものでもよい。抗凝固剤としては、特に限定されないが、例えば、EDTA、ヘパリン、クエン酸又はクエン酸塩等を使用することができる。
溶血は、まず、検体を第1の界面活性剤を含有する第1の溶血剤で処理し、次いで、得られた検体を第2の界面活性剤を含有する第2の溶血剤で処理することにより行う。
具体的には、非イオン性、アニオン性及びカチオン性界面活性剤等が挙げられる。
R1‐R2−(CH2CH2O)n‐H
(式中、R1は炭素数10〜22のアルキル、アルケニル、アルキニル基、R2は−O−、−(C6H4)−O−又は−COO−、nは8〜120の整数である)
で表されるポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤が好ましい。
炭素数10〜22のアルキル基としては、直鎖又は分岐のものが挙げられ、例えば、デシル、ラウリル、ミリスチル、パルミチル、ステアリル、イコシル等が挙げられる。炭素数10〜22のアルケニル基としては、上記アルキル基の任意の位置に1以上の二重結合を有するもの、炭素数10〜22のアルキニル基としては、上記アルキル基の任意の位置に1以上の三重結合を有するものが挙げられる。
非イオン性界面活性剤の濃度は、用いる界面活性剤の種類によって適宜調整することができる。過剰な界面活性剤の濃度はマラリア原虫にダメージを与え、原虫が発する散乱光及び/又は蛍光強度が減少し、溶解した赤血球のデブリスの影響を受けるため、好ましくない。例えば、ポリオキシエチレン(40)ノニルフェニルエーテルを用いた場合には、処理時の検体を含む全液量に対して、0.1〜20mg/L程度、ポリオキシエチレン(100)ノニルフェニルエーテルの場合には、0.1〜30mg/L程度が適当である。
アニオン性界面活性剤は、一般式
R1‐R2−(CH2CH2O)n‐X
(式中、R1、R2、nは上記定義と同じ、XはSO3Na、COONa、OSO3Na又はONaである)
で表されるポリオキシエチレン系アニオン界面活性剤が好ましい。
また、カチオン性界面活性剤は、一般式
で表されるカチオン性界面活性剤が好ましい。
カチオン性界面活性剤は、具体的には、オクチルトリメチルアンモニウムブロマイド(OTAB)、デシルトリメチルアンモニウムブロマイド(DTAB)、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド(LTAC)、ミリスチルトリメチルアンモニウムブロマイド(MTAB)、セチルピリジニウムクロライド(CPC)等が挙げられる。
第2の溶血剤での処理は、第1の溶血剤での処理で例示したのと同様の条件下で行うことが適当である。
他の波長の光源、例えば、赤色レーザなどを使用する場合には、それに合わせて使用可能な色素を適宜選択すればよい。その色素としては、一般式
エチジウム・アクリジン・ヘテロダイマー(Ethidium-acridine heterodimer)、 エチジウムジアジド(Ethidium diazide)、エチジウム・ホモダイマー1(Ethidium homodimer-1)、エチジウム・ホモダイマー2、エチジウムモノアジド(Ethidium monoazide)、ヘキシジウムアイオダイド(Hexidium iodide)、ヒドロキシスチルバミジン(Hydroxystilbamidine)、メタンスルホネート(methanesulfonate)、 LDS 751、オイルグリーンssDNA定量試薬(OilGreen ssDNA quantitation reagent)、 ピコグリーンdsDNA定量試薬(PicoGreen dsDNA quantitation reagent)、PO-PO-1、PO-PO-3、PO-PRO-1、PO-PRO-3、SYTO 11生細胞核酸染料(SYTO 11 live-cell nucleic acid stain)、SYTO 12生細胞核酸染料、SYTO 13生細胞核酸染料、SYTO 14生細胞核酸染料、SYTO 15生細胞核酸染料、SYTO 16生細胞核酸染料、SYTO 20生細胞核酸染料、SYTO 21生細胞核酸染料、SYTO 22生細胞核酸染料、SYTO 23生細胞核酸染料、SYTO 24生細胞核酸染料、SYTO 25生細胞核酸染料、SYTO 17赤色蛍光核酸染料、SYTOX緑色核酸染料、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TO-PRO-5、 TO-TO-1、TO-TO-3、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YO-YO-1、YO-YO-3等も使用できる。これらは、Molecular Probes, Inc.より入手できる。
本発明における試料、第1の溶血剤及び/又は第2の溶血剤は、pHを一定に保つための緩衝剤を含有してもよい。緩衝剤はpHを一定に保つことにより、安定したマラリア原虫の染色結果を得るために使用される。通常数mMから100mM程度の濃度で使用される。緩衝剤の種類は通常使用されるものであれば限定されるものではなく、染色するのに好適なpHに応じて、例えば、カルボン酸類、リン酸、トリシンなどのグッドの緩衝剤、タウリンなどが挙げられる。好適なpHは、使用する色素によって異なるが、3〜11程度、好ましくは4〜9程度である。
さらに、必要に応じて防腐剤を添加してもよい。防腐剤としては、例えば、2-ピリジルチオ-1-オキシドナトリウム、β−フェネチルアルコール等が挙げられる。
染色されたマラリア原虫は、光学的情報に基づいて弁別することができる。光学的情報を得るために、例えば、フローサイトメータを利用することができる。フローサイトメータは、公知のフローサイトメータが使用可能である。光源は使用する色素に応じて選択することができる。
フローサイトメータでの弁別は、まず、(1)測定用試料をフローサイトメータに導入し、(2)シースフロー中を流れる細胞に励起光を照射し、細胞が発する光強度を測定し、(3)光強度の差異を用いて、マラリア原虫と他の細胞成分を弁別する。
弁別は、例えば、散乱光強度と蛍光強度との差異を用いて行うことができる。具体的には、散乱光強度と蛍光強度とを用いて2次元分布図(スキャッタグラム)を作成し、スキャッタグラムにおいて、マラリア原虫を囲むようにゲーティング(領域設定)し、各ゲートの細胞数を計数することにより、弁別することができる。また、蛍光強度によりマラリア原虫と白血球とを弁別することができる。
反応チャンバ12には、第1溶血剤庫5から吸引吐出ポンプ9により所定量採取された第1の溶血剤がサンプリングバルブ2を経て血液試料とともにチューブを介して導入され、該チャンバ12中で血液試料と混合される。さらに、第2溶血剤庫6から吸引吐出ポンプ10により所定量採取された第2の溶血剤を該チャンバ12に導入して、第1の溶血剤で処理された血液試料と混合される。その後、染料庫7から吸引吐出ポンプ11により所定量採取された染色液を該チャンバ12に導入して、マラリア原虫等を染色する。
このようにして得られた試料を、陰圧ポンプ14などによりチューブを介して該チャンバ12からフローセル13に導入して、散乱光及び蛍光を測定する。測定後、前方散乱用検出器17および蛍光用検出器18で検出した散乱光および蛍光のデータを解析部19で解析し、マラリア原虫を弁別計数する。
以下に本発明のマラリア原虫の検出方法及びその試薬キットを具体的に説明する。
以下の組成のマラリア原虫測定用試薬を調製した。
ポリオキシエチレン(40)ノニルフェニルエーテル4mgを120mMリン酸緩衝液(pH9)500mLに混合して第1の溶血剤を調製した。第1の溶血剤の浸透圧は307mOsm/kgであった。
ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド500mgと、アクリジンオレンジ3mgとを、120mMリン酸緩衝液(pH9)500mLに混合して第2の溶血剤を調製した。第2の溶血剤の浸透圧は318mOsm/kgであった。
感染率(総赤血球数に対するマラリア原虫感染赤血球数の割合)0.2%の熱帯熱マラリア患者の末梢血2μLを、第1の溶血剤500μLと混合し、37℃で30秒間インキュベートした。次いで、得られた試料を、第2の溶血剤500μLと混合し、37℃で15秒間インキュベートして、マラリア原虫を染色した。
前方散乱光強度と側方蛍光強度とから得られたスキャッタグラムを図1に示す。図1中、A〜Cの長方形は、マラリア原虫(それぞれリングフォーム、トロポゾイト、シゾント)、Dは白血球の出現領域をゲーティングしたものである。また、破線楕円は網状赤血球の出現領域、実線円はデブリスの出現領域を示す。
図1によれば、網状赤血球の出現領域にプロットはなく、網状赤血球がほとんど出現していないことがわかる。
特開平11−75892号公報における実施例1に記載された方法と同様に、1種の界面活性剤での1回の処理により、実際のマラリア感染患者の血液の測定を行った。
具体的には、アクリジンオレンジ3mg、トリシン10mM、LTAC1000mg、リン酸二水素ナトリウム120mM、精製水1Lを水酸化ナトリウムでpH9に調整して、マラリア原虫測定用試薬を調製した。この試薬1mLと、後述の試料1μLとをインキュベートした。なお、試料としては、感染率0.9%の熱帯熱マラリア患者の末梢血を用いた。
このように、十分溶血されなかった網状赤血球がマラリア原虫の出現領域に重なって出現すると、本来マラリア患者のものではない検体と測定した場合でもマラリア原虫を検出したものと誤認する恐れがある。
その結果、界面活性剤の濃度を上げると網状赤血球の溶血は促進されるが、同時にマラリア原虫の溶解も進む。マラリア原虫の溶解によって、マラリア原虫からの散乱光強度及び蛍光強度が共に減少し、マラリア原虫がスキャッタグラム上で赤血球のデブリスと重なり、正確な測定ができなかった。
その結果、いずれの界面活性剤も、濃度が低い場合には、未溶血の網状赤血球がマラリア原虫の領域に重なって測定を妨害した。
濃度を上げていくにしたがって網状赤血球は溶解するが、原虫も溶解し始め、散乱光強度及び蛍光強度が共に減少し、赤血球のデブリスに重なるようになった。
まず、顕微鏡検査により感染率を確認した多数のマラリア感染検体を、本発明の実施例1の方法(以下、「B法」と呼ぶ)にて測定し、感染率と、リングフォーム領域に出現したプロット数との相関図を作成した。その図を図3に示す。
図3の相関図の回帰直線から、感染率が0.1%の場合に対応するプロット数として113を得た。
次に、マラリアに感染していないことが顕微鏡検査により確認された患者の検体を、特開平11−75892号の実施例1に記載された方法(以下、「A法」と呼ぶ)及びB法でそれぞれ測定し、スキャッタグラムのリングフォーム領域におけるプロット数を比較した。
つまり感染率0.1%を検出感度とした場合、A法では、本来はマラリアに感染していない137検体のうち、52.5%の検体に対しては、マラリア感染検体であると誤認する恐れがあることになる。一方、B法では、マラリア感染検体であると誤認する恐れが生じた検体の割合は4.1%となり、測定精度が大幅に改善されていることがわかる。
A法とB法それぞれで、感染率の異なる複数のマラリア患者の検体を測定し、各方法の測定感度を求めた。ここでマラリア原虫の検出の可否は以下のように判断した。
・検出の可否の判断方法:
検体を測定して作成したスキャッタグラム上では、マラリア原虫は所定の領域内に集団となりまとまって出現する。上記実施例1の方法でマラリア感染患者の末梢血検体を測定し、スキャッタグラムを作成した。そのスキャッタグラムを図4に示す。
蛍光強度をパラメータとしたヒストグラムを作成すると、マラリア原虫の出現領域に対応する蛍光強度の範囲(座標の65から210)には、マラリア原虫の集団が現れて山状を呈する。
スキャッタグラム中のリングフォームの集団に対応して、ヒストグラム中にも集団が出現していることがわかる。
検討を重ねた結果、ヒストグラム中に現れるマラリア原虫の集団は、ピーク高さの二分の一におけるこの集団の幅(以下、「半値幅」と呼ぶ)が30〜80の範囲内となることが見出された。
(1)半値幅が30〜80の範囲内の長さである、
(2)高さが全体頻度の0.4%を超える高さである、
という両条件を満たす集団の存在がマラリア原虫の検出領域(蛍光強度に関しては座標の65から210)中で確認された場合には、網状赤血球の影響がなく、マラリアの検出が可能であるとした。逆に、マラリア患者の検体を測定して上記の両条件を満たす集団を確認できない場合には、マラリアの検出が不可であると判断した。
A法
全検体で測定可能な感染率:0.5%以上
全検体で測定不可の感染率:0.1%未満
(感染率0.1%以上0.5%未満の検体では、約38%の検体で測定可能であった。)
B法
全検体で測定可能な感染率:0.1%以上
全検体で測定不可の感染率:0.05%未満
(感染率0.05%以上0.1%未満の検体では約45%の検体で測定可能であった。)
このように、B法では、A法と比べてより低い感染率の患者の検体でもマラリアの検出が可能であった。
2 サンプリングバルブ
3 試料吸引ピペット
4 試験管
5 第1溶血剤庫
6 第2溶血剤庫
7 染料庫
12 反応チャンバ
13 フローセル
14 陰圧ポンプ
17 前方散乱用検出器
18 蛍光用検出器
19 解析部
Claims (6)
- 検体中の赤血球を溶血してマラリア原虫を遊離させ、遊離したマラリア原虫を蛍光色素で染色して測定用試料を調製し、該測定用試料から光学的情報を検出し、得られた光学的情報に基づいてマラリア原虫を弁別するマラリア原虫の検出方法であって、
前記溶血を、処理時の検体を含む全液量に対して濃度が0.1〜20mg/Lとなる量のポリオキシエチレン(40)ノニルフェニルエーテルを含む第1の溶血剤で検体を処理し、
処理された検体を、処理時の検体を含む全液量に対して濃度が300〜10000mg/Lとなる量のラウリルトリメチルアンモニウムクロライドを含む第2の溶血剤で処理することにより行うことを特徴とするマラリア原虫の検出方法。 - 処理時の検体を含む全液量に対して濃度が0.1〜20mg/Lとなる量のポリオキシエチレン(40)ノニルフェニルエーテルを含有する第1の溶血剤と、処理時の検体を含む全液量に対して濃度が300〜10000mg/Lとなる量のラウリルトリメチルアンモニウムクロライドを含有する第2の溶血剤と、蛍光色素とからなることを特徴とするマラリア原虫検出用の試薬キット。
- 蛍光色素が前記第1の溶血剤又は第2の溶血剤のいずれか又は双方に含有されるか、あるいは蛍光色素が前記第1の溶血剤及び第2の溶血剤と別個にパッケージされてなることを特徴とする請求項2に記載の試薬キット。
- 蛍光色素が、核酸を染色する蛍光色素である請求項2又は3に記載の試薬キット。
- 蛍光色素が、以下の群:
アクリジリンオレンジ、チアゾールオレンジ、エチジウムブロマイド、プロピジウムアイオダイド、オーラミンO、ヘキスト33258、ヘキスト33342、ローダミン123、DiOC1(3)の中から選択される請求項2又は3に記載の試薬キット。 - 第1の溶血剤および第2の溶血剤の浸透圧が、150〜600mOsm/kgである請求項2又は3に記載の試薬キット。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2003331963A JP4388779B2 (ja) | 2002-10-04 | 2003-09-24 | マラリア原虫の検出方法、検出装置、およびその試薬キット |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2002292612 | 2002-10-04 | ||
JP2003331963A JP4388779B2 (ja) | 2002-10-04 | 2003-09-24 | マラリア原虫の検出方法、検出装置、およびその試薬キット |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2004141150A JP2004141150A (ja) | 2004-05-20 |
JP2004141150A5 JP2004141150A5 (ja) | 2006-11-09 |
JP4388779B2 true JP4388779B2 (ja) | 2009-12-24 |
Family
ID=32473449
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2003331963A Expired - Fee Related JP4388779B2 (ja) | 2002-10-04 | 2003-09-24 | マラリア原虫の検出方法、検出装置、およびその試薬キット |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP4388779B2 (ja) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7625712B2 (en) * | 2004-05-21 | 2009-12-01 | Beckman Coulter, Inc. | Method for a fully automated monoclonal antibody-based extended differential |
JP4969115B2 (ja) * | 2005-03-29 | 2012-07-04 | シスメックス株式会社 | マラリア感染赤血球の検出方法並びにこれに使用する検出用試薬及び赤血球膜部分溶解試薬 |
JP4884049B2 (ja) * | 2005-03-30 | 2012-02-22 | シスメックス株式会社 | 巨核球の計数方法及び装置 |
US20080020023A1 (en) * | 2006-07-20 | 2008-01-24 | Shiping Wang | Nonaqueous coating composition for elastomeric articles and articles containing the same |
EP2889620B1 (en) * | 2008-05-09 | 2017-10-11 | Sysmex Corporation | Blood analyzer, blood analysis method, hemolytic agent and staining agent |
CN105572389A (zh) * | 2011-06-17 | 2016-05-11 | 协和梅迪克斯株式会社 | 糖化血红蛋白的测定方法、测定试剂和测定试剂盒 |
JP6208473B2 (ja) | 2012-06-20 | 2017-10-04 | アークレイ株式会社 | 血液成分を含む試料の処理方法 |
JP6635720B2 (ja) | 2015-08-31 | 2020-01-29 | シスメックス株式会社 | 血液分析装置及び血液分析方法 |
CN107655865B (zh) | 2016-07-25 | 2021-10-19 | 希森美康株式会社 | 血液分析装置及血液分析方法 |
JP7425597B2 (ja) * | 2019-12-25 | 2024-01-31 | シスメックス株式会社 | 血液分析方法 |
-
2003
- 2003-09-24 JP JP2003331963A patent/JP4388779B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2004141150A (ja) | 2004-05-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US8367358B2 (en) | Reagent, kit and method for differentiating and counting leukocytes | |
US7354775B2 (en) | Reagent for partially lysing a cell membrane of a red blood cell, a reagent for detecting malaria infected red blood cells, and a sample analyzing method for detecting malaria infected red blood cells | |
US7236236B2 (en) | Methods for detecting malaria parasites and reagent kits therefor | |
US20200326332A1 (en) | Method for classifying/counting leukocytes, reagent kit for classifying leukocytes, and reagent for classifying leukocytes | |
US6100038A (en) | Method for the enumeration of micronucleated erythrocyte populations with a single laser flow cytometer | |
US9797824B2 (en) | Method for hematology analysis | |
JP4388779B2 (ja) | マラリア原虫の検出方法、検出装置、およびその試薬キット | |
JP2003532790A (ja) | 未成熟赤血球細胞における核酸の検出用色素及び方法 | |
JPH11508353A (ja) | 網状赤血球を迅速に分析するための組成物及び方法 | |
JP4969115B2 (ja) | マラリア感染赤血球の検出方法並びにこれに使用する検出用試薬及び赤血球膜部分溶解試薬 | |
JP4794334B2 (ja) | 尿試料分析用試薬及び尿試料の分析方法 | |
JP4063363B2 (ja) | マラリア原虫の検出方法 | |
US8597952B2 (en) | Reagent, reagent kit and analyzing method | |
KR101993965B1 (ko) | 소변 시료 분석 방법, 소변 시료 분석용 시약 및 소변 시료 분석용 시약 키트 | |
CN106062557B (zh) | 尿样品分析方法及尿样品分析用试剂盒 | |
JP2001242168A (ja) | 精子計数方法及び試薬 | |
EP3112862B1 (en) | Method for urine sample analysis, use of a reagent for urine sample analysis, and use of a reagent kit for urine sample analysis | |
EP1710579B1 (en) | Method and apparatus for counting megakaryocytes | |
JP4794414B2 (ja) | 血小板測定用試薬、血小板測定用試薬キット並びに血小板測定方法 | |
CN116008045A (zh) | 一种定量分析人全血中网织红细胞配的试剂及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060922 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060922 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090630 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090817 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20090908 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20091005 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121009 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121009 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20151009 Year of fee payment: 6 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |