CN116008045A - 一种定量分析人全血中网织红细胞配的试剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种血细胞分析仪定量检测人全血中网织红细胞配套试剂盒，包括稀释液和荧光剂两个组分。稀释液包括有机醇1、表面活性剂、缓冲物质、阴离子化合物、抗凝剂和防腐剂，染色剂包括有机醇2和两种荧光染料。本发明中的稀释液，能够在不溶解细胞的情况下，使染色剂的荧光染料快速浸入到细胞内对RNA进行染色，避免白细胞和血小板的干扰，降低了检测误差；并且能够降低细胞膜的破坏程度，保持细胞相对完整性的同时增加细胞膜的通透性，进而增加染色剂的有效浸入，在血细胞分析仪上使网织红细胞、血小板和红细胞区域界限更加清晰，为快速准确检测人全血细胞奠定了基础。
Description
技术领域
本技术应用于血细胞分析领域，具体的，涉及网织红细胞检测试剂盒成分优化及其配制方法。
背景技术
网织红细胞(reticulocyte，Ret)是未完全成熟的红细胞，细胞内含有点粒状或丝网状RNA，网织红细胞是红细胞成熟过程中的一个重要阶段，网织红细胞的总数或百分比对贫血的临床诊断及疗效观察有着重要意义。
使用血细胞分析仪检测网织红细胞，主要原理是先使用稀释液将成熟红细胞、血小板和网织红细胞进行球形化处理，再结合染色液中染色成分将网织红细胞快速染色，并结合激光散射法及荧光染色的流式细胞技术对三种细胞进行检测，根据荧光强弱和细胞体积大小对它们进行区分，对其中的网织红细胞进行定量检测。
目前市场上检测网织红细胞使用的稀释液多由阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂、有机醇和防腐剂配制而成，由于阳离子表面活性剂的添加，容易造成细胞膜溶解，细胞破裂，导致网织红细胞的体积发生较大变化，增加了检测结果的误差。
市场上检测网织红细胞长久普遍使用的染液为煌焦油蓝，然而这种染液存在溶解度低，染料沉渣易附着于细胞表面，严重影响检测结果，造成网织红细胞假性偏高。
发明内容
本发明的目的是提供一种定量分析人全血中网织红细胞配套试剂，适用于血细胞分析仪使用阻抗法结合核酸荧光法定量检测网织红细胞，通过在稀释液中加入阴离子表面活性剂和阴离子化合物，并且严格规范了用量，在保证细胞膜完整、细胞不破裂的情况下，增加了细胞膜的通透性，使染色剂浸入细胞内的有效成分增加，能够快速浸入细胞内部并进行RNA染色，并提高了细胞的球形化比例。
为了实现上述发明目的，本发明的技术方案具体如下：
本发明第一方面公开了一种定量分析人全血中网织红细胞配套试剂，包括以下成分：
稀释液：包括有机醇1、表面活性剂、缓冲物质、阴离子化合物、抗凝剂和防腐剂。
染色剂：包括荧光染料1、荧光染料2和有机醇溶剂2。
其中，所述稀释液中含有的有机醇选自甲醇、乙醇中的一种或两种，浓度范围为每升稀释液中1～5g。
其中所述稀释液中含有的表面活性剂包括阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂，其中阴离子表面活性剂选自十二烷基苯磺酸钠、十二烷基硫酸钠或脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠中的一种或两种，浓度范围为每升稀释液中0.01～0.2g；非离子表面活性剂选自脂肪醇聚氧乙烯醚、聚氧乙烯烷基醇酰胺、月桂酰二乙醇胺中的一种或两种，浓度范围为每升稀释液中0.1～2.0g。
其中，所述稀释液中含有的缓冲溶液选自柠檬酸钠、磷酸二氢钠、三羟甲基氨基甲烷中的一种或两种，浓度范围为每升稀释液中0.5～5.0g。
其中，所述稀释液中含有的阴离子化合物选自水杨酸、硼酸中的一种或两种，浓度范围为每升稀释液中0.1～2.0g。
其中，所述稀释液中含有的抗凝剂选自EDTA-2Na、EDTA-2K中的一种，浓度范围为每升稀释液中0.05～0.5g。
其中，所述稀释液中含有的防腐剂选自叠氮化钠、苯甲酸及其盐和吡啶硫酮钠中的一种或两种，浓度范围为每升稀释液中0.1～0.5g。
其中，所述染色剂中含有的有机醇溶剂2选自乙二醇、丙三醇中的一种。
其中，所述染色剂中含有的荧光染料1为10-壬基溴代吖啶橙，浓度范围为每升染色剂中0.00001～0.0002g。
在上述技术方案中，所述染色剂中含有的荧光染料2为多甲川花菁染料，浓度范围为每升染色剂中0.0001～0.002g。
本发明第二方面公开了一种将上述检测试剂制备成检测人血网织红细胞的检测试剂盒的用途。
将上述第一方面公开的两种检测试剂分别进行过滤除菌，并且在无菌条件下分别盛放，使用时分别链接血细胞分析仪的网织红细胞稀释液和染色液接口，通过仪器对血液样本进行分析。
本发明第三方面，公开了一种利用上述第一方面公开的检测试剂或第二方面公开的检测试剂盒在人血网织红细胞检测中的用途。
使用含有抗凝剂的采血管抽取人血，混匀获得血细胞样本。
使用本发明公开的检测试剂由于含有阴离子表面活性剂和阴离子化合物，能够加快荧光染料渗入细胞的速率，具体提高多少速率；且显微镜下观察细胞，细胞形态维持度较好，达到多少比例，经过仪器检测，相较于其他的检测试剂，边界更清晰。
本发明和现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明提供的试剂盒，包括稀释液和染色剂两个组分，其中稀释液中含有阴离子表面活性剂、阴离子化合物等特有成分，能够在不溶解细胞的情况下，使染色剂的荧光染料快速浸入到细胞内对RNA进行染色，避免白细胞和血小板的干扰，降低了检测误差；并且能够降低细胞膜的破坏程度，保持细胞相对完整性的同时增加细胞膜的通透性，进而增加染色剂的有效浸入，在血细胞分析仪上使网织红细胞和血小板区域界限更加清晰。
附图说明
图1为血细胞分析仪使用实施例1试剂盒检测网织红细胞散点图。
图2为血细胞分析仪使用实施例2试剂盒检测网织红细胞散点图。
图3为血细胞分析仪使用市场在售试剂盒检测网织红细胞散点图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请所要求保护的技术方案。
实施例中使用的培养基中各个组分和细胞因子组分均为市售，可通过常规商业途径购买获得。
实施例1、网织红细胞检测试剂的配置1
检测试剂包括稀释液和染色剂，其中，每升稀释液中包括有机醇、表面活性剂、缓冲物质、阴离子化合物、抗凝剂和防腐剂。其中，有机醇为1～5g的甲醇，阴离子表面活性剂为0.01～0.2g的十二烷基苯磺酸钠，非离子表面活性剂为0.1～2.0g的脂肪醇聚氧乙烯醚，缓冲物质为0.5～5.0g的三羟甲基氨基甲烷，阴离子化合物为0.1～2.0g的水杨酸，抗凝剂为0.05～0.5g的EDTA-2Na，防腐剂为0.1～0.5g的吡啶硫酮钠，浓度范围为每升稀释液中，将上述试剂溶解后定容至1L，调节pH8.8-10.2范围内。每升染色剂中含有荧光染料为0.00001～0.0002g的10-壬基溴代吖啶橙、0.0001～0.002g的多甲川花菁染料和乙二醇溶剂。
通过对图1和图3对比可看出，使用本试剂盒对同一血液样品的网织红细胞进行检测，能够更好维持其细胞形态、保证细胞体积不被压缩，因而散点图位置更高，与血小板细胞边界更加清晰。
实施例2网织红细胞检测试剂的配置2
本实施例提供的网织红细胞试剂盒中，每升稀释液中包括有机醇、表面活性剂、缓冲物质、阴离子化合物、抗凝剂和防腐剂。其中，有机醇为1～5g的乙醇，阴离子表面活性剂为0.01～0.2g的脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠，非离子表面活性剂为0.1～2.0g的聚氧乙烯烷基醇酰胺醚，缓冲物质为0.5～5.0g的柠檬酸钠，阴离子化合物为0.1～2.0g的水杨酸，抗凝剂为0.05～0.5g的EDTA-2K，防腐剂为0.1～0.5g的苯甲酸钠，浓度范围为每升稀释液中，将上述试剂溶解后定容至1L，调节pH9.2-9.8范围内。每升染色剂中含有荧光染料为0.00001～0.0002g的10-壬基溴代吖啶橙、0.0001～0.002g的多甲川花菁染料和丙三醇溶剂。
通过对图2和图3对比可看出，使用本试剂盒对同一血液样品的网织红细胞进行检测，染色效果和染色率更高，明显提高了网织红细胞检测结果的准确性。
Claims (10)
1.一种定量分析人全血中网织红细胞配套试剂盒，其特征在于，包括以下成分：
稀释液：有机醇1、表面活性剂、缓冲物质、阴离子化合物、抗凝剂和防腐剂。
染色剂：荧光染料1、荧光染料2和有机醇溶剂2。
2.根据权利要求1所述的一种定量分析人全血中网织红细胞配套试剂盒，其特征在于，所述稀释液中含有的有机醇1选自甲醇、乙醇中的一种或两种，浓度范围为每升稀释液中1～5g。
3.根据前述任一权利要求所述的试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂包括阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂，其中阴离子表面活性剂选自十二烷基苯磺酸钠、十二烷基硫酸钠或脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠中的一种或两种，浓度范围为每升稀释液中0.01～0.2g；非离子表面活性剂选自脂肪醇聚氧乙烯醚、聚氧乙烯烷基醇酰胺、月桂酰二乙醇胺中的一种或两种，浓度范围为每升稀释液中0.1～2.0g。
4.根据前述任一权利要求所述的试剂盒，其特征在于，所述缓冲溶液选自柠檬酸钠、磷酸二氢钠、三羟甲基氨基甲烷中的一种或两种，浓度范围为每升稀释液中0.5～5.0g，pH值范围8～9。
5.根据前述任一权利要求所述的一种定量分析人全血中网织红细胞配套试剂盒，其特征在于，所述阴离子化合物选自水杨酸、硼酸中的一种或两种，浓度范围为每升稀释液中0.1～2.0g。
6.根据前述任一权利要求所述的试剂盒，其特征在于，所述抗凝剂选自EDTA-2Na、EDTA-2K中的一种，浓度范围为每升稀释液中0.05～0.5g。
7.根据前述任一权利要求所述的试剂盒，其特征在于，所述防腐剂选自叠氮化钠、苯甲酸及其盐和吡啶硫酮钠中的一种或两种，浓度范围为每升稀释液中0.1～0.5g。
8.根据前述任一权利要求所述的试剂盒，其特征在于，所述染色剂中含有的有机醇溶剂2选自乙二醇、丙三醇中的一种。
9.根据前述任一权利要求所述的试剂盒，其特征在于，所述染色剂中含有的荧光染料1为10-壬基溴代吖啶橙，浓度范围为每升染色剂中0.00001～0.0002g，和/或，所述荧光染料2为多甲川花菁染料，浓度范围为每升染色剂中0.0001～0.002g。
10.一种利用前述任一权利要求所述试剂盒检测在人血细胞组分的方法，其特征在于，将获得的人血细胞使用前述任一权利要求所述的试剂盒稀释和染色。
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