CN101981450A

CN101981450A - 底物偶联珠的长期储存方法

Info

Publication number: CN101981450A
Application number: CN2009801107111A
Authority: CN
Inventors: T·亨茨勒; T·赫格特
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 2008-03-26
Filing date: 2009-03-13
Publication date: 2011-02-23
Also published as: JP2011515685A; US20110027126A1; EP2255192A1; WO2009118108A1

Abstract

本发明涉及底物偶联珠的长期储存方法，所述底物偶联珠为生物反应、优选酶促反应而制备。适用于这一方法的珠可以是无机或者有机的。优选地，这一方法使用聚苯乙烯珠。

Description

底物偶联珠的长期储存方法

发明背景

对于具有改善活性的新型药物的开发，重要的是寻找在诱发疾病中起作用的特异靶点。为了这一目标和设计新型治疗方法，创造了适合平行测试大量靶点的测试方法，例如在96孔板中进行。过去开发了不同的系统，现在仍在继续改善。非常精密的筛选系统，是基于小型特制聚合物珠的应用，所述聚合物珠在生物医学应用中，用于简化生物系统的分离，定位生物学相互作用和扩大信号。在这一领域中，研究者可以选择适合其特殊筛选问题的系统。

表1：珠的性质比较(Drug Discovery Today，卷5，增刊1，1 June2000，页38-41)

所有这些基于珠的技术的开发，是为了使基于光学性质的简单分离或灵敏检测更加便利。基于对已用两个变浓度荧光团进行内部染色的珠的流式细胞分析，

系统当前可以在单管或单孔中测定例如高达100种分析物(J.Zimmermann，Micro array technology advances fortherapeutic target discovery，Gen.Eng.News 19(1999)，p.1-34)。橙色相对于红色内部荧光团的比例可以区分微球体的分离群(separatesets)。如抗生蛋白链菌素(streptavidin)等表面蛋白质促进主要配体附着，而绿色荧光标记提供分析物的定量。因为平行鉴定大量靶分子的这一方法是非常精细的程序，大多数情况下在药物开发程序中选用这一分析方法。

特别地，主要使用

技术。它基于聚苯乙烯珠，所述聚苯乙烯珠如上所述(WO2006/044413 A2，US 7,141,431 B2，EP 1 208 382B1，WO 2007/103859 A2，WO 2006/044275 A2)用两种不同荧光染料进行彩色编码。所用的珠显示的平均粒径约等于6μm，特别是约5.6μm。

这些珠的编码，是通过将其加入含有荧光染料特殊混合物的溶剂来完成的。珠膨胀并通过扩散来吸收染料。在用于去除多余染料的几个清洗步骤后，溶剂被蒸发，并且内部带有编码荧光染料的珠收缩到它们最初的大小。

这些编码的珠可以在特殊的流式细胞仪中检测，用一个激光检测珠本身的荧光，用另一个激光检测偶联物质或大分子的荧光报告信号。

这表示，用635nm激光激发时，两种荧光分类染料在不同波长上(657nm和730nm)发射荧光。这些荧光染料不同浓度的组合最终成为100种不同的珠类型。第三种荧光染料用作报告分子。这样的报告染料例如藻红蛋白，是由第二个激光激发的(532nm)。报告荧光是珠表面上有阳性反应的指示。

这100种不同的珠的区域会带来100个平行实验的可能，所述实验可以用一个样品在一个孔中以多路形式实现。因此，这一系统能满足多种应用的需要，例如：蛋白质表达谱、焦点基因表达谱、自身免疫疾病、遗传病、分子传染病和HLA测试。珠可以便利地功能化。

功能化可通过由核苷酸或氨基酸组成的生物分子进行。特别地，珠可以通过蛋白、肽类或环肽类来进行功能化。

在优选的实施方案中描述的珠与抗体或其他连接体(binder)相结合，所述连接体例如支架蛋白，如anticalins、ancyrin重复蛋白(ancyrinrepeat protein)，半胱氨酸-结蛋白(cystein-knot protein)，纳米抗体(nanobody)等等。在另一个优选的实施方案中，珠用例如磷酸酶、激酶、脂肪酶等酶来进行功能化。但它们也可以用核苷酸序列来进行功能化。这些核苷酸序列可作为引物、DNA或RNA片段、如适体等连接分子或更大的DNA或RNA结构存在。通过例如抗体或其他结构进行的所述珠的功能化，可通过NHS-化学作用或标签的共价偶联来完成，所述标签被相应的亲和配体捕捉，例如His-标签-Ni²⁺-NTA、GST-标签-谷胱甘肽，S-标签-S蛋白。

功能化的珠可应用于分析测定反应的生物学反应中。对于这些应用，重要的是反应物的活性可靠并保持恒定。

如上所述，

技术的典型应用是三明治免疫测定，该测定中捕捉抗体偶联到珠上。分析物从例如细胞裂解液等蛋白质混合物中进行捕捉，并且可以通过藻红蛋白标记的检测抗体来进行检测。使用该技术的结果是在一个孔中可平行进行几个常规ELISA。

可进行相似的实验来检测蛋白质-蛋白质相互作用、DNA-蛋白质相互作用或测量酶促反应。这些测定在制药研究和开发项目、学术界和生物技术公司中受到特别关注。例如，在WO 2007/009613A1中公开了利用这一技术的测量酪氨酸激酶磷酸化的方法。

在真核细胞的大多数细胞信号通路中，蛋白激酶是关键的调节子。已经开发了许多蛋白激酶抑制剂，来研究信号通路中激酶的特定作用，或用作可能的治疗药物(Cohen，P.Nat.Rev.Drug discov.(2000)，1，309-315)。由酪氨酸激酶诱导的磷酸化似乎在细胞周期和胞内途径中扮演核心角色，在药物靶向中针对酪氨酸激酶看来很有希望。已经开发了靶向酪氨酸激酶的一些方法。对癌症治疗，可能的策略是使用酪氨酸激酶结构域抑制剂、酪氨酸激酶受体阻断剂(例如单克隆抗体)、配体调节剂(例如单克隆抗体)，RNA干涉和反义技术、基因治疗策略、受体酪氨酸激酶抑制剂或下游信号传导通路抑制剂。受体酪氨酸激酶是多结构域蛋白。近年的药物设计中催化域(Mg-ATP复合物结合部位)已成为最有希望的靶点。化合物库的随机筛选对催化域的小分子化学抑制剂进行初步鉴定。

组合化学、电子克隆(in-silico cloning)、基于结构的药物设计和计算化学当前已经成为先导化合物鉴定和这些抑制剂的优化当中必不可少的工具。

由于蛋白激酶超家族很大(超过500个成员)，且事实上大多数激酶抑制剂与高度保守的ATP-结合袋相结合，存在问题的是激酶抑制剂有时抑制超过一个靶点(Davies，S.P.，Reddy，H.，Caivano，M & Cohen，P.Biochem.J.(2000)351，95-105)。

由于活细胞中的活跃激酶存在巨大差异，必须进行大量的测试。因此，已经为筛选抑制剂开发了高度灵敏、精确且可靠的高通量测定方法。

在荧光染料标记珠的情况下，酶反应所需底物可以同样偶联到珠表面上，并加入ATP和相应的酶(例如激酶)。在磷酸化的情况下，可以通过藻红蛋白标记的磷酸特异抗体来检测反应。由于每种情况下都必须筛选许多不同的靶分子，制备的珠必须以恒定活性进行长时间储存。这是个问题，因为偶联到珠表面的底物贮存期限有限。所述酶反应所需底物通常基于蛋白质，该蛋白质必须低温储存(＜-20℃)。尽管在约4℃储存，这些底物还是在数日后降解并失活。特别是酶活性丧失。另外，供应商建议不要在水凝固点以下的温度储存偶联了底物的物质。为通常使用的

技术提供珠的供应商，建议将这些珠在4℃下储存，不进行冷冻。但如果必须进行大量实验和测试，并且在长时间段中需要可重复的结果，在库存中储存底物偶联珠就是个问题。

因此，存在对底物偶联珠存货长期储存方法的需要，所述存货为生物反应，例如酶反应而制备。另一方面，提供在储存中保持偶联生物分子、片段或结构的活性(特别是偶联酶和所制备底物偶联珠存货的活性)的方法。特别地，这一方法必须以简单方式在合理条件下进行。

发明简述

本发明的内容涉及底物偶联珠长期储存的方法，其中在偶联反应后，珠以悬浮液形式冷却到低温，特别是冷却到至少约4℃的温度，并在冷却后储存直至使用。

本发明的内容也涉及底物偶联珠长期储存的方法，其包含向底物偶联珠悬浮液加入至少一种多羟基醇或糖，并储存悬浮液的步骤。

在一个优选的实施方案中，本发明的方法包含步骤：

a)向底物偶联珠悬浮液加入至少一种多羟基醇或糖，和

b)速冻(shock freeze)所得组合物。

速冻以后的长期储存(步骤c)在低温中进行，特别是在底物偶联珠悬浮液冷却到的温度下进行。通常在约4℃进行储存，但在本发明最优选的实施方案中，步骤c)至少在4℃进行储存，优选更低的温度。

在本发明更优选的实施方案中，冷冻悬浮液在4到-196℃范围内的温度下进行储存，最优选在-60到-100℃范围内的温度下进行储存。

在优选的实施方案中，步骤a)所得的组合物，在步骤b)中在液氮里进行速冻。

这一方法的步骤a)中，向底物偶联珠悬浮液加入至少一种多羟基醇或糖，所述多羟基醇或糖选自下组：甘油、山梨醇、甘露醇、异麦芽酮糖醇(isomalt)、乳糖醇、木糖醇、threit(苏糖醇)、赤藓糖醇、蔗糖、果糖、海藻糖、棉子糖和葡萄糖，随后在步骤b)中进行冷冻。优选在步骤a)中加入甘油和/或蔗糖。在本发明更优选的实施方案中，步骤a)中加入甘油和/或海藻糖，或者甘油和/或果糖，或者甘油和/或甘露醇。

在本发明最优选的实施方案中，本发明的方法涉及底物偶联聚苯乙烯珠的长期储存方法。如果需要，这一改善的储存方法可在一定程度上进行调整，并且步骤a)中，不仅可以加入至少一种多元醇或多羟基糖，也可以加入具有缓冲和稳定性质的其他添加剂。

在此之外，本发明的内容涉及在此公开的方法，其中珠偶联到化学个体(例如小分子或由核苷酸或氨基酸组成的分子)，或者蛋白质、肽类或环肽类，或者例如磷酸酶、激酶、脂肪酶或其他的酶。本发明内容也包括，珠偶联到抗体或其他连接体、例如anticalins、ancyrin重复蛋白，半胱氨酸-结蛋白，纳米抗体以及其他支架蛋白。珠也可以偶联到核苷酸序列，例如引物、DNA或RNA片段、如适体等连接分子以及更大的DNA或RNA结构。

在本发明优选的实施方案中，珠偶联到如磷酸酶、激酶、脂肪酶或其他的酶。最优选珠偶联到激酶。

发明详述

当前，与期望相反，已发现上述问题可通过冷冻底物偶联珠存货来解决，所述底物偶联珠存货为如酶反应等生物反应或筛选反应而制备。例如所制备的聚苯乙烯珠用特殊方法冷冻，可在解冻后用于测试，活性得到保持。实验显示，冷冻步骤必须进行得非常快。温度越快下降，冷冻对偶联生物片段、基团、分子或例如酶等结构的活性方面的保护就越多。特别地，速冻步骤可带来具有保持了活性的储存稳定的物质。速冻可以在约-20到-196℃范围内的温度下进行，最优选在约196℃温度下的液氮中进行。速冻后冷冻的底物偶联珠在约-20到-196℃范围内的温度下储存，优选在约-40到-140℃范围内的温度下储存，特别在-60到-100℃范围内储存，并且最优选在约-70到-90℃范围内的温度下储存。

但另外发现，如果冷冻前例如为酶反应制备的底物偶联珠存货悬浮在合适的包含一些防腐添加剂的混合液中，生物活性，特别是酶活性可以保持得更加稳定。通过多种实验可以显示，如果速冻在存在不同添加剂(所述添加剂可加入含有底物偶联珠的储存缓冲溶液中)的情况下进行，这些底物偶联珠的性质保持几乎不变。本发明的方法中也可应用合适的稳定添加剂，例如含有两个或更多羟基的多羟基醇(多元醇)，例如乙二醇、甘油、丙二醇，或者如蔗糖、果糖、核糖、葡萄糖、海藻糖、棉子糖等糖，或者如甘露醇、山梨醇、异麦芽酮糖醇、乳糖醇、木糖醇、苏糖醇、赤藓糖醇、果糖或葡萄糖、海藻糖、棉子糖、木糖醇等多羟基醇，或者其他类似物。但最合适的稳定多元醇是甘油，及选自蔗糖、果糖和核糖的糖。最优选的添加剂是甘油和蔗糖。像已提及的那样，多元醇或糖可以这样加入。优选甘油和/或蔗糖这样应用，或组合用作稳定添加剂。

如果在冷冻前向底物偶联珠悬浮液加入选自这些组之一的至少一种化合物，会发现活性得到改善。这些多元醇也可以这样添加，或者两种或多种多元醇或糖组合添加。特别地，如果加入适量甘油或蔗糖，活性可长时间保持。

通常，如果需要与其他缓冲添加剂组合，糖醇应用于包含底物偶联

珠的悬浮液中。

为了制备储存稳定的底物偶联珠，珠从反应溶液的分离例如WO2007/009613 A1中所述，WO 2007/009613 A1的公开内容以此引入作为参考。优选底物偶联珠重悬于含有如NaCl、KCl或类似的盐的水溶液，并含有在pH范围6到8之间，特别在pH7.0到7.4之间有效的缓冲系统。例如

珠可用作底物偶联珠制备的合适基础。但是，其他来源的珠也可以用于这一申请，其条件是反应所需底物可以在珠的表面上偶联，并且在反应后，这些珠可以用测试的分子来正确鉴定。本领域技术人员会知晓不同的颗粒聚合物，所述颗粒聚合物可如表1中所见，用于这一申请。但最优选的是

珠用于本申请，因为这些珠已经良好表征，且经过校准。它们可与流式细胞仪一起使用，所述流式细胞仪是小型分析系统的部分，该分析系统鉴定各微球颗粒和试验中捕捉的任意报告染料。每个珠组合可得到多个读数，进一步确认结果。

像已提及的那样，使用缓冲液系统来制备珠悬浮液是有优势的。合适的缓冲液基于Tris，或用磷酸盐进行缓冲。对酶反应，优选的系统是基于Tris或基于MOPS的缓冲液系统。酶反应中调节的pH取决于所用的酶。有时，如果悬浮液除水以外还包含至少一种溶剂，对反应是有利的。不证自明的是，所加溶剂必须从以下溶剂中选择，所述溶剂中编码珠的荧光染料不溶，这样染料才不会被洗去。

通常，制备的底物偶联珠悬浮液可含有包括水的溶剂，所述溶剂的量以重量计在10到90％的范围内。如果这些悬浮液含有水以外的溶剂，所述溶剂的量可优选以重量计在相对于溶剂总量约30-60％的范围内，特别优选以重量计约40-50％的范围内。但特别优选悬浮液只包含水作溶剂，并且其中水的量相对于整个悬浮液，以重量计少于50％而多于10％。

这种新储存方法的有利步骤可通过操作实例来显示，特别是通过在10-50％甘油或10-40％蔗糖中对珠进行速冻，特别是在范围在30-50％的甘油或10-20％的蔗糖中进行速冻，最优选在30％甘油或10％蔗糖中进行速冻。

可如下述生产底物偶联珠：

底物可通过典型的NHS-酯偶联法，共价偶联到在表面带有羧基的聚苯乙烯珠上。备选方法是将带有His-标签的重组蛋白底物偶联到具有Ni-NTA表面的聚苯乙烯珠上。另一种选择会是将特异抗体或标签特异的抗体共价偶联到聚苯乙烯珠上。用这一特异抗体，蛋白底物可以间接方式偶联到聚苯乙烯珠上(标签特异的抗体例如：抗His-标签抗体、抗谷胱甘肽转移酶抗体、抗麦芽糖结合蛋白抗体，以及其他)。

如上所述，功能化可通过由核苷酸或氨基酸组成的生物分子来进行。特别地，珠可以通过蛋白质、肽类或环肽类来进行功能化。在此之外，珠可以连接到如小分子等化学个体，所述化学个体具有作为药物在筛选实验中有作用的潜在活性。在优选的实施方案中，所述的珠与抗体或其他连接体相结合，所述连接体例如支架蛋白，如anticalins、ancyrin重复蛋白，半胱氨酸-结蛋白和纳米抗体等等。在另一个优选的实施方案中，珠用例如磷酸酶、激酶、脂肪酶等酶来进行功能化。但它们也可以用核苷酸序列来进行功能化。这些核苷酸序列可作为引物、DNA或RNA片段、如适体等连接分子或更大的DNA或RNA结构存在。通过例如抗体或其他结构进行的所述珠的功能化，可通过NHS-化学作用或标签的共价偶联来完成，所述标签被相应的亲和配体捕捉，例如His-标签-Ni²⁺-NTA、GST-标签-谷胱甘肽，S-标签-S蛋白。

像上面提及的那样，功能化的珠可应用于分析测定反应的生物学反应中。

实验已经显示，所有这些功能化的珠可以如上所述在冷冻法中进行处理，并长时间储存在含有所述多元醇的悬浮液中，保持其活性近似恒定。

本说明书令本领域技术人员能够综合应用本发明。任何缺乏明确性的情况下，不需说明的是，应当采用引述的出版物和专利文献。相应地，认为这些文件是本说明书公开内容的一部分。

为了更好地理解和说明本发明，下面给出了在本申请保护范围以内的实施例。

这些实施例也用于说明可能的变化。然而，由于所述发明原理的广泛有效性，实施例不适宜用于将本申请的保护范围减少到只有这些变化。

对本领域技术人员不需说明的是，在给出的实施例和本发明书的其他部分，基于作为整体的组合物，即使从指示的百分比范围可能得到更高的值，组合物中存在的组分的量相加，总是只能得到按重量计的100％，不会超过这个值。

实施例、说明书和权利要求书给出的温度总是以℃表示。

底物偶联珠的生产的实例：

根据制造商说明，标签特异的抗体，例如抗His标签抗体，以50μg/ml的浓度共价偶联到羧化聚苯乙烯珠的表面上。将重组his-标记的激酶加入抗-his聚苯乙烯珠中(约2000珠加入20ng激酶)。温育约一小时后多余的激酶可洗去，并且底物偶联珠可重悬于各自的冷冻缓冲液中。

1.甘油作为添加剂的未冷冻和冷冻/解冻珠的REM图。这些图片显示，珠的形状不受冷冻/解冻过程的影响，并且

2.以甘油或蔗糖作为添加剂，使用未冷冻底物偶联珠和冷冻/解冻底物偶联珠的激酶反应

数据。使用冷冻和不冷冻底物偶联珠的反应结果比较显示，可检测的激酶活性信号不存在显著性差异。

3.ErbB4激酶反应的

数据，所述ErbB4激酶在-80℃或4℃下储存特定时间段后偶联到珠上，或是立即偶联到珠上，随后在-80℃或4℃下储存特定时间段。ErbB4激酶单独储存或偶联到珠上储存的反应结果比较显示，偶联到珠上令酶稳定，并且即使珠-激酶复合物在4℃下储存，也可以长时间得到总体较高的激酶活性。

实施例

I.运用REM的珠的形状控制

珠在含有按重量计30％甘油的缓冲溶液中进行稀释。已稀释的珠用液氮速冻。冷冻的

珠在37℃下快速解冻，涡旋混合，超声处理30秒，并用REM(Raster electron microscopy，光栅电镜)观察。

与未处理的

珠相比，冷冻/解冻程序后珠的可视形状不存在明显变化(见图1)。

图1：用REM图(A)观察未处理的

珠。珠在含有30％甘油的缓冲溶液中稀释，并用液氮速冻，解冻，并用REM图(B)观察。冷冻过程没有引起可视改变。

II.冷冻的激酶偶联

珠，激酶的活性测量

珠偶联到重组蛋白(如制造商所述)，并重悬于冷冻缓冲液(1％BSA，PBS中0.03％Brij35，30％-50％甘油)。

激酶偶联

珠在液氮中速冻，并且在37℃下迅速解冻。用测试缓冲液(20mM MOPS，25mM B-甘油磷酸盐，5mM EGTA，1mM DTT，1mM正钒酸钠，pH2，补充0.1％BSA和0.03％Brij35)中的250μM ATP和40mM MgCl₂来开始激酶反应，在37℃下伴随搅拌进行30分钟。随后用150mM EDTA终止激酶反应。用检测缓冲液(1％BSA，PBS中0.03％Brij35)清洗三步后，用生物素化的抗-磷酸酪氨酸抗体(室温下搅拌1h)和藻红蛋白缀合的抗生蛋白链菌素(室温下搅拌45min)来检测磷酸化的酪氨酸残基。如制造商所述，在Luminex¹⁰⁰机器中分析微球。

图2：显示了使用不同浓度甘油(20％，30％，50％)(A)或蔗糖(10％，20％，30％)(B)的缓冲溶液时，在液氮中速冻后的FGFR1-激酶偶联

珠的活性。

对偶联到

珠上的冷冻激酶和偶联到珠上的冷冻/解冻激酶，可以得到可比较的激酶活性信号。对于冷冻缓冲液，甘油和蔗糖两者都是合适的添加剂(图2)。

III.激酶偶联到珠时，增加的激酶稳定性

a)激酶在-80℃下储存

重组ErbB4激酶在液氮中速冻，并且在-80℃下储存超过500天。在37℃下解冻样品后，激酶偶联到S-标签抗体偶联的

珠。平行地，来自同一制备过程的等量ErbB4激酶在偶联到S-标签抗体偶联的

珠后，在液氮中速冻。等份部分在-80℃下储存超过500天，并在37℃下分别解冻。用测试缓冲液(20mM MOPS，25mM β-甘油磷酸盐，5mM EGTA，1mM DTT，1mM正钒酸钠，pH2，补充0.1％BSA和0.03％Brij35)中的5μM ATP和40mMMgCl₂来开始激酶反应，在37℃下伴随搅拌进行30分钟。随后用150mM EDTA终止反应。用检测缓冲液(1％BSA，PBS中0.03％Brij35)清洗三步后，用生物素化的抗-磷酸酪氨酸抗体(室温下搅拌1h)和藻红蛋白缀合的抗生蛋白链菌素(室温下搅拌45min)来检测磷酸化的酪氨酸残基。如制造商所述，在Luminex200机器中分析微球。

这些存储实验的结果在图3中给出。

图3：ErbB4激酶在-80℃下单独储存指定时间，随后偶联到珠上(浅蓝)，或者立即偶联到

珠上，随后储存指定时间(深蓝)。评估ErbB4激酶在1到517天的储存期后的活性，以荧光强度中值显示。

与在-80℃下储存的未偶联激酶相比，已经偶联到xMAP珠的ErbB4激酶在储存时，激酶活性显著改善(图3)。因此，珠-激酶复合物稳定了目标蛋白，因而在长时间后可得到总体较高的激酶活性——如在实施例中所示，激酶活性改善大约2-3倍，珠偶联的激酶在至少517天的时间段中保持稳定。

b)激酶在4℃下储存

用ErbB4激酶进行等价实验，所述ErbB4激酶事先偶联到珠上，并在4℃的储存温度下温育长达517天。

这些实验的结果显示于图4。

图4：rbB4激酶在偶联前于4℃下单独储存(浅蓝)，或者在4℃下保存前直接偶联到

珠上(深蓝)。ErbB4激酶在1到517天的储存期后的活性，以荧光强度中值显示。

ErbB4激酶在珠-激酶复合物中储存时，4℃下的激酶活性也改善了(图4)。在偶联前于4℃单独储存的激酶，在8天后已显示出活性下降。然而，偶联到珠上的激酶在105天后才开始显示活性下降。

Claims

1.底物偶联珠长期储存的方法，其包括步骤a)向底物偶联珠悬液加入至少一种多羟基醇或糖，b)在低温下储存。

2.根据权利要求1的方法，其包括步骤a)向底物偶联珠悬液加入至少一种多羟基醇或糖，b)速冻所得的组合物，和c)在低温下储存。

3.根据权利要求1或2的方法，用于长期储存底物偶联聚苯乙烯珠。

4.根据前述权利要求1-3中一项或多项的方法，其中在步骤b)里所得组合物在液氮中速冻。

5.根据前述权利要求1-4中一项或多项的方法，其中储存在约4℃的温度下进行，优选在更低的温度下进行。

6.根据前述权利要求1-5中一项或多项的方法，其中储存在-20到-196℃的温度范围内进行，优选在-60到-100℃的温度范围内进行。

7.根据前述权利要求1-6中一项或多项的方法，其中步骤a)里加入了至少一种多羟基醇或糖，其选自：甘油、山梨醇、甘露醇、异麦芽酮糖醇、乳糖醇、木糖醇、苏糖醇、赤藓糖醇、蔗糖、果糖、海藻糖、棉子糖和葡萄糖。

8.根据前述权利要求1-6中一项或多项的方法，其中步骤a)里加入了甘油和/或蔗糖。

9.根据前述权利要求1-6中一项或多项的方法，其中步骤a)里加入了甘油和/或海藻糖。

10.根据前述权利要求1-6中一项或多项的方法，其中步骤a)里加入了甘油和/或果糖。

11.根据前述权利要求1-6中一项或多项的方法，其中步骤a)里加入了甘油和/或甘露醇。

12.根据前述权利要求1-6中一项或多项的方法，其中步骤a)里与其他具有缓冲和稳定性质的添加剂组合，向悬液加入了至少一种多元醇或多羟基糖。

13.根据前述权利要求1-12中一项或多项的方法，用于底物偶联珠的长期储存，其中珠偶联到化学个体，例如小分子或由核苷酸或氨基酸组成的分子，或者偶联到蛋白质、肽类或环肽类，或者偶联到例如磷酸酶、激酶、脂肪酶或其他的酶。

14.根据前述权利要求1-12中一项或多项的方法，用于底物偶联珠的长期储存，其中珠偶联到抗体或其他连接体，例如anticalin、ancyrin重复蛋白，半胱氨酸结蛋白，纳米抗体以及其他的支架蛋白。

15.根据前述权利要求1-12中一项或多项的方法，用于底物偶联珠的长期储存，其中珠偶联到核苷酸序列，例如引物、DNA或RNA片段、如适体等连接分子，及更大的DNA或RNA结构。

16.根据前述权利要求1-12中一项或多项的方法，用于底物偶联珠的长期储存，其中珠偶联到例如磷酸酶、激酶、脂肪酶或其他的酶。

17.根据前述权利要求1-12中一项或多项的方法，用于底物偶联珠的长期储存，其中珠偶联到激酶。