JPH0815261A - 免疫測定用材料の製造方法 - Google Patents
免疫測定用材料の製造方法Info
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- JPH0815261A JPH0815261A JP14276094A JP14276094A JPH0815261A JP H0815261 A JPH0815261 A JP H0815261A JP 14276094 A JP14276094 A JP 14276094A JP 14276094 A JP14276094 A JP 14276094A JP H0815261 A JPH0815261 A JP H0815261A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 抗ＧＡＤ抗体に対するＧＡＤの抗原性を長期
間保持させる安定化法を提供する。 【構成】 グルタミン酸デカルボキシラーゼを固定化し
た担体をグルタミン酸デカルボキシラーゼ安定化剤溶液
の存在下で凍結乾燥することを特徴とする免疫測定用材
料の製造方法。
間保持させる安定化法を提供する。 【構成】 グルタミン酸デカルボキシラーゼを固定化し
た担体をグルタミン酸デカルボキシラーゼ安定化剤溶液
の存在下で凍結乾燥することを特徴とする免疫測定用材
料の製造方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は免疫測定用材料の製造方
法に関し、更に詳しくは、Ｉ型糖尿病の検査に有用な免
疫測定用担体に結合したグルタミン酸デカルボキシラー
ゼ（ＧＡＤ）の抗原性を長期間保持できる免疫測定用材
料の製造方法に関するものである。
法に関し、更に詳しくは、Ｉ型糖尿病の検査に有用な免
疫測定用担体に結合したグルタミン酸デカルボキシラー
ゼ（ＧＡＤ）の抗原性を長期間保持できる免疫測定用材
料の製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】Ｉ型糖尿病の原因は、膵臓β細胞が破壊
されインスリン産生が減少することによる。疾患発病の
機序は、膵臓β細胞に対する自己抗体が産生され、この
自己抗体が膵臓β細胞を破壊していると考えられてい
る。事実、患者中には膵臓細胞を認識する自己抗体が存
在する。1990年にS.Baekkeskovらは、Ｉ型糖尿病患者血
清中に存在する自己抗体の一つが、膵臓細胞に存在する
グルタミン酸デカルボキシラーゼ(ＧＡＤ：γ−glutami
c acid decarboxylase，分子量64ＫＤ、γ−アミノ酪酸
（ＧＡＢＡ）の生合成に関与しＧＡＢＡ合成酵素と呼ば
れる）を認識することを示し、このＧＡＤを指標にし
て、Ｉ型糖尿病の診断が可能であることを示した（Natu
re，Vol 347, p151〜156，1990）。
されインスリン産生が減少することによる。疾患発病の
機序は、膵臓β細胞に対する自己抗体が産生され、この
自己抗体が膵臓β細胞を破壊していると考えられてい
る。事実、患者中には膵臓細胞を認識する自己抗体が存
在する。1990年にS.Baekkeskovらは、Ｉ型糖尿病患者血
清中に存在する自己抗体の一つが、膵臓細胞に存在する
グルタミン酸デカルボキシラーゼ(ＧＡＤ：γ−glutami
c acid decarboxylase，分子量64ＫＤ、γ−アミノ酪酸
（ＧＡＢＡ）の生合成に関与しＧＡＢＡ合成酵素と呼ば
れる）を認識することを示し、このＧＡＤを指標にし
て、Ｉ型糖尿病の診断が可能であることを示した（Natu
re，Vol 347, p151〜156，1990）。
【０００３】前記S.Baekkeskovらが行った診断は、ラッ
トの膵臓細胞を35Ｓ−メチオニン存在下で培養後、ラベ
ル化64ＫＤ含有粗画分を調製し、この分画を患者血清と
接触させて免疫沈降反応を起こさせ、得られた沈殿物を
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけ、オートラジオグラフ
ィーで抗原抗体反応生成物の存在を確認するものであっ
た。その後、Merrillらは、125Ｉラベル化精製ＧＡＤを
用いた免疫沈降反応により、さらに簡便なＩ型糖尿病診
断方法を確立した（Diabetes, Vol 41，４月，1992）。
これらの方法は、それ以前の測定方法、例えば、ＩＣＡ
(Islet Cell Antibodies）法、ＩＣＳＡ(Islet Cell Su
rface Antibodies)法、ＩＡＡ（InsulinAutoantibodie
s)法、または、糖付加試験などと比較し、Ｉ型糖尿病診
断の判定精度を向上させたと同時に、発症の予測を可能
にした点でも優れている。
トの膵臓細胞を35Ｓ−メチオニン存在下で培養後、ラベ
ル化64ＫＤ含有粗画分を調製し、この分画を患者血清と
接触させて免疫沈降反応を起こさせ、得られた沈殿物を
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけ、オートラジオグラフ
ィーで抗原抗体反応生成物の存在を確認するものであっ
た。その後、Merrillらは、125Ｉラベル化精製ＧＡＤを
用いた免疫沈降反応により、さらに簡便なＩ型糖尿病診
断方法を確立した（Diabetes, Vol 41，４月，1992）。
これらの方法は、それ以前の測定方法、例えば、ＩＣＡ
(Islet Cell Antibodies）法、ＩＣＳＡ(Islet Cell Su
rface Antibodies)法、ＩＡＡ（InsulinAutoantibodie
s)法、または、糖付加試験などと比較し、Ｉ型糖尿病診
断の判定精度を向上させたと同時に、発症の予測を可能
にした点でも優れている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】前述した如く、ＧＡＤ
を指標にしたより正確なＩ型糖尿病診断法の開発が進行
しつつあるが、その多くは、分離精製ＧＡＤを放射性ヨ
ードでラベルし、免疫沈降法により測定しようとする試
みである。一般的見解として、ＲＩＡ法は、より高感度
の測定を可能にするが、放射性ヨードのもつ短半減期性
により、測定時の減衰補正および有効測定期間などいろ
いろな煩雑さと制約を加える。この本質的欠点は、下記
に示す診断上の問題点を提起する。
を指標にしたより正確なＩ型糖尿病診断法の開発が進行
しつつあるが、その多くは、分離精製ＧＡＤを放射性ヨ
ードでラベルし、免疫沈降法により測定しようとする試
みである。一般的見解として、ＲＩＡ法は、より高感度
の測定を可能にするが、放射性ヨードのもつ短半減期性
により、測定時の減衰補正および有効測定期間などいろ
いろな煩雑さと制約を加える。この本質的欠点は、下記
に示す診断上の問題点を提起する。
【０００５】ａ）あるＩ型糖尿病患者の抗ＧＡＤ抗体産
生を長期間測定し、その経時的変化を測定する場合、測
定時の放射性ヨードの減衰補正、または、測定キット間
の補正が必要である。 ｂ）複数のＩ型糖尿病患者の抗ＧＡＤ抗体を、複数の人
間が複数の施設で、測定する場合、測定日および測定時
間が一定せず、各患者間の相対比較が困難となる。
生を長期間測定し、その経時的変化を測定する場合、測
定時の放射性ヨードの減衰補正、または、測定キット間
の補正が必要である。 ｂ）複数のＩ型糖尿病患者の抗ＧＡＤ抗体を、複数の人
間が複数の施設で、測定する場合、測定日および測定時
間が一定せず、各患者間の相対比較が困難となる。
【０００６】以上の理由から、放射能の減衰に付随する
有効測定期間を考慮する必要のない測定方法、つまり、
長期間、再現性ある測定結果の得られる非放射性測定法
（例：Enzyme immuno assay法(ＥＩＡ法））の確立が望
まれる。しかしながら、ＧＡＤの抗ＧＡＤ抗体に対する
抗原性を長期間保持させる方法がなく、検討課題であっ
た。
有効測定期間を考慮する必要のない測定方法、つまり、
長期間、再現性ある測定結果の得られる非放射性測定法
（例：Enzyme immuno assay法(ＥＩＡ法））の確立が望
まれる。しかしながら、ＧＡＤの抗ＧＡＤ抗体に対する
抗原性を長期間保持させる方法がなく、検討課題であっ
た。
【０００７】従って、本発明の目的は、抗ＧＡＤ抗体に
対するＧＡＤの抗原性を長期間保持させる安定化法を提
供することにあり、これにより長期間安定で再現性ある
Ｉ型糖尿病検査用免疫測定法の提供を可能にすることに
ある。
対するＧＡＤの抗原性を長期間保持させる安定化法を提
供することにあり、これにより長期間安定で再現性ある
Ｉ型糖尿病検査用免疫測定法の提供を可能にすることに
ある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記目的を
達成するべく種々検討の結果、グルタミン酸デカルボキ
シラーゼを固定化した担体をグルタミン酸デカルボキシ
ラーゼ安定化剤溶液の存在下で凍結乾燥することにより
ＧＡＤの抗原性を長期間安定保持させることができるこ
とを見出し、この知見に基づいて本発明を完成するに到
った。
達成するべく種々検討の結果、グルタミン酸デカルボキ
シラーゼを固定化した担体をグルタミン酸デカルボキシ
ラーゼ安定化剤溶液の存在下で凍結乾燥することにより
ＧＡＤの抗原性を長期間安定保持させることができるこ
とを見出し、この知見に基づいて本発明を完成するに到
った。
【０００９】本発明で使用されるＧＡＤは、ヒトの血液
中に存在する膵臓細胞由来のＧＡＤの抗体と抗原抗体反
応するものであればよく、哺乳動物由来のＧＡＤを広く
用いることができる。このＧＡＤは例えば脳または膵臓
から公知の方法で分離精製したものでよく、遺伝子工学
の手法を用いて人為的に合成されたものであってもよ
い。
中に存在する膵臓細胞由来のＧＡＤの抗体と抗原抗体反
応するものであればよく、哺乳動物由来のＧＡＤを広く
用いることができる。このＧＡＤは例えば脳または膵臓
から公知の方法で分離精製したものでよく、遺伝子工学
の手法を用いて人為的に合成されたものであってもよ
い。
【００１０】担体はＧＡＤを固定化する表面を提供でき
るものであればよく、公知の免疫測定法用の担体を広く
利用できる。例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ポ
リビニルクロライド、フェノール樹脂ガラス、セルロー
ス、等の酵素免疫測定法で使用される担体、ポリスチレ
ンラテックス、ポリプロピレンラテックス、ポリビニル
クロライドラテックス、フェノール樹脂ラテックス、ガ
ラスラテックス、等の粒子凝集反応で使用される担体な
どを挙げることができる。
るものであればよく、公知の免疫測定法用の担体を広く
利用できる。例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ポ
リビニルクロライド、フェノール樹脂ガラス、セルロー
ス、等の酵素免疫測定法で使用される担体、ポリスチレ
ンラテックス、ポリプロピレンラテックス、ポリビニル
クロライドラテックス、フェノール樹脂ラテックス、ガ
ラスラテックス、等の粒子凝集反応で使用される担体な
どを挙げることができる。
【００１１】ＧＡＤを担体に固定化する方法も酵素免疫
測定法や粒子凝集反応で用いられている方法を広く利用
することができる。例えば、抗原の吸着力を利用して固
相に固定化する方法（物理的吸着法）、アミノ基やカル
ボキシル基等を導入された担体にグルタールアンデヒド
等の架橋剤や水溶性カルボジイミド等の活性化剤を用い
て固定化する共有結合法（化学結合法）、ＨＥＭＡ、Ｈ
ＰＭＡ等のモノマーとγ線を用いた重合吸着法（包括
法）、等がある。
測定法や粒子凝集反応で用いられている方法を広く利用
することができる。例えば、抗原の吸着力を利用して固
相に固定化する方法（物理的吸着法）、アミノ基やカル
ボキシル基等を導入された担体にグルタールアンデヒド
等の架橋剤や水溶性カルボジイミド等の活性化剤を用い
て固定化する共有結合法（化学結合法）、ＨＥＭＡ、Ｈ
ＰＭＡ等のモノマーとγ線を用いた重合吸着法（包括
法）、等がある。
【００１２】ＧＡＤを固定化した担体はアルブミン、ポ
リビニルピロリドン、ゼラチン、スキムミルク、ウシ血
清、トリ血清あるいは市販のブロッキング剤（ブロック
エース：大日本製薬）等でブロッキング処理を行なうこ
とが好ましい。アルブミンには牛血清アルブミン等を使
用できる。
リビニルピロリドン、ゼラチン、スキムミルク、ウシ血
清、トリ血清あるいは市販のブロッキング剤（ブロック
エース：大日本製薬）等でブロッキング処理を行なうこ
とが好ましい。アルブミンには牛血清アルブミン等を使
用できる。
【００１３】グルタミン酸デカルボキシラーゼ安定化剤
にはソルビトール、デキストロース（グルコース）、フ
コース、マンニトール、ダルシトール、アラビノース、
キシロース、ヘプトース、マンノース、フルクトース、
ガラクトース、等の単糖類、トレハロース、ラクトー
ス、マルトース、サッカロース、アガロビオース、イソ
マルトース、メリビオース、ルチノース、キシロビオー
ス、セロビオース、マンノビオース、等の二糖類等があ
る。
にはソルビトール、デキストロース（グルコース）、フ
コース、マンニトール、ダルシトール、アラビノース、
キシロース、ヘプトース、マンノース、フルクトース、
ガラクトース、等の単糖類、トレハロース、ラクトー
ス、マルトース、サッカロース、アガロビオース、イソ
マルトース、メリビオース、ルチノース、キシロビオー
ス、セロビオース、マンノビオース、等の二糖類等があ
る。
【００１４】これらの安定化剤は水溶液の状態でＧＡＤ
固定化担体に添加する。水溶液における濃度は問わない
が、単糖類の場合には0.5〜10重量％程度、好ましくは
８〜10重量％程度が適当である。二糖類の場合は0.5〜1
0重量％程度、好ましくは２〜８重量％程度が適当であ
る。水溶液はＧＡＤを単に水に溶かしたものでもよい
が、ＧＡＤを失活させない緩衝液、例えばｐＨ７〜８程
度の緩衝液であれば良く、好ましくは、リン酸緩衝液、
トリス緩衝液あるいは、それらに0.15Ｍ程度の塩化ナト
リウムを加えたもので溶解して形成することが好まし
い。
固定化担体に添加する。水溶液における濃度は問わない
が、単糖類の場合には0.5〜10重量％程度、好ましくは
８〜10重量％程度が適当である。二糖類の場合は0.5〜1
0重量％程度、好ましくは２〜８重量％程度が適当であ
る。水溶液はＧＡＤを単に水に溶かしたものでもよい
が、ＧＡＤを失活させない緩衝液、例えばｐＨ７〜８程
度の緩衝液であれば良く、好ましくは、リン酸緩衝液、
トリス緩衝液あるいは、それらに0.15Ｍ程度の塩化ナト
リウムを加えたもので溶解して形成することが好まし
い。
【００１５】安定化剤の添加量は担体表面に対し単糖類
の場合は５〜100mg／cm2程度、好ましくは６〜50mg／cm
2程度、二糖類の場合は３〜50mg／cm2程度、好ましくは
４〜30mg／cm2程度が適当である。
の場合は５〜100mg／cm2程度、好ましくは６〜50mg／cm
2程度、二糖類の場合は３〜50mg／cm2程度、好ましくは
４〜30mg／cm2程度が適当である。
【００１６】凍結乾燥は公知の凍結乾燥機を用いて行な
えばよく、例えば0.01〜0.2torrの減圧下−50〜−80℃
で乾燥すればよい。
えばよく、例えば0.01〜0.2torrの減圧下−50〜−80℃
で乾燥すればよい。
【００１７】本発明の免疫測定用材料は酵素を固定化し
た担体を用いて抗原抗体反応を利用して分析を行なう方
法に広く適用できる。このような方法として例えば酵素
免疫測定法と粒子凝集反応法がある。担体の形状は測定
法の種類等に応じて反応容器、ウエル等の内壁面、ビー
ズ、微粒子等種々の形状をとりうる。
た担体を用いて抗原抗体反応を利用して分析を行なう方
法に広く適用できる。このような方法として例えば酵素
免疫測定法と粒子凝集反応法がある。担体の形状は測定
法の種類等に応じて反応容器、ウエル等の内壁面、ビー
ズ、微粒子等種々の形状をとりうる。
【００１８】本発明の免疫測定用材料を用いた測定法は
酵素免疫測定法または粒子凝集反応法等の公知の方法に
準拠して行なうことができる。
酵素免疫測定法または粒子凝集反応法等の公知の方法に
準拠して行なうことができる。
【００１９】
【作用】本発明の方法はＧＡＤ担体を安定化剤溶液とと
もに乾燥するところに特徴があり、例えば、特開平２−
161357号公報に開示されているように、担体を一旦安定
化剤溶液で洗浄後、洗浄液を廃棄して凍結乾燥したので
はＧＡＤの安定化効果は得られなかった。
もに乾燥するところに特徴があり、例えば、特開平２−
161357号公報に開示されているように、担体を一旦安定
化剤溶液で洗浄後、洗浄液を廃棄して凍結乾燥したので
はＧＡＤの安定化効果は得られなかった。
【００２０】
精製ＧＡＤの調製 本実施例で用いたＧＡＤは、J.M.Blindermannらの方法
（Eur.J.Biochem.,Vol86, 143〜152，1978）に準拠し、
ラット脳よりＧＡＤ精製して得た。その概略を下記に示
す。
（Eur.J.Biochem.,Vol86, 143〜152，1978）に準拠し、
ラット脳よりＧＡＤ精製して得た。その概略を下記に示
す。
【００２１】ラット脳を５倍量のＰＢＳ緩衝液中でホモ
ジナイズし、15,000xg超遠心後、上清を得た。その上清
を順次イオン交換カラム(ＤＥＡＥ−トヨパール650、ト
ーソー社製）、フェニルセプァロースカラム（ファルマ
シア）、分子ふるいカラム（3000ＳＷ，トーソー社製）
にかけ、ＧＡＤを分離精製した。
ジナイズし、15,000xg超遠心後、上清を得た。その上清
を順次イオン交換カラム(ＤＥＡＥ−トヨパール650、ト
ーソー社製）、フェニルセプァロースカラム（ファルマ
シア）、分子ふるいカラム（3000ＳＷ，トーソー社製）
にかけ、ＧＡＤを分離精製した。
【００２２】このようにして得られたＧＡＤの純度は、
スラブ電気泳動法により50％以上であった。その泳動ゲ
ルの銀染色後の結果を図１に示す。
スラブ電気泳動法により50％以上であった。その泳動ゲ
ルの銀染色後の結果を図１に示す。
【００２３】ＧＡＤの酵素活性は下記の如く測定した。
まず、ＧＡＤを含む試料25μlに、20ｍＭＬ−グルタメ
ート、0.1μＣi放射性グルタミン酸(１−14Ｃ）、50mM
燐酸カリウム、0.2mMピリドキサール・リン酸を含む溶
液（ｐＨ6.8）10μｌを加え、反応を開始した。生じた
放射性ＣＯ2を1Ｍのハイアミン・ハイドロオキサイドに
浸したろ紙に吸着させ、その放射活性をβ−カウンター
（ベックマン社製，ＬＳ−5000ＴＤＬＥＤ）で測定し
た。
まず、ＧＡＤを含む試料25μlに、20ｍＭＬ−グルタメ
ート、0.1μＣi放射性グルタミン酸(１−14Ｃ）、50mM
燐酸カリウム、0.2mMピリドキサール・リン酸を含む溶
液（ｐＨ6.8）10μｌを加え、反応を開始した。生じた
放射性ＣＯ2を1Ｍのハイアミン・ハイドロオキサイドに
浸したろ紙に吸着させ、その放射活性をβ−カウンター
（ベックマン社製，ＬＳ−5000ＴＤＬＥＤ）で測定し
た。
【００２４】抗ＧＡＤ抗体含有試料 臨床所見（血糖値、多尿、口渇等）によって糖尿病と判
断され、しかも、それらの血清がＩＣＡ(Islet Cell An
tibodies)陽性と判断された患者３名(Ａ〜Ｃ）から試験
用血清を採取し、これを抗ＧＡＤ抗体含有試料として実
施例および比較例に使用した。
断され、しかも、それらの血清がＩＣＡ(Islet Cell An
tibodies)陽性と判断された患者３名(Ａ〜Ｃ）から試験
用血清を採取し、これを抗ＧＡＤ抗体含有試料として実
施例および比較例に使用した。
【００２５】患者血清中の抗ＧＡＤ抗体の存在確認 (1) 精製ＧＡＤ50μgを25mM燐酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ
7.5）50μlに溶解し、更に250mM燐酸ナトリウム緩衝液
(ｐＨ7.5）10μlを添加した。この蛋白質溶液に放射性
ヨウ化ナトリウム（Ｎａ 125Ｉ）2.5μl（アマーシャム
社：ＰＭＳ30）およびクロラミンＴ溶液(0.5mg／ml：25
mM燐酸ナトリウム含有、ｐＨ7.5)を加え、10分間反応さ
せた。Ｎａ2Ｓ2Ｏ5溶液（0.5mg／ml，25mM燐酸ナトリウ
ム含有、ｐＨ7.5）25μlで反応を停止した後、25mM燐酸
ナトリウム緩衝液(ｐＨ7.5）150μlおよびウシ血清アル
ブミン溶液(10mg／ml，25mM燐酸ナトリウム含有、ｐＨ
7.5）12μlを加えた。この混合液をセファデックスＧ−
25カラム（５mlベッドボリーム）にかけ、未反応125Ｉ
から分離した放射化ＧＡＤを実験に使用した。
7.5）50μlに溶解し、更に250mM燐酸ナトリウム緩衝液
(ｐＨ7.5）10μlを添加した。この蛋白質溶液に放射性
ヨウ化ナトリウム（Ｎａ 125Ｉ）2.5μl（アマーシャム
社：ＰＭＳ30）およびクロラミンＴ溶液(0.5mg／ml：25
mM燐酸ナトリウム含有、ｐＨ7.5)を加え、10分間反応さ
せた。Ｎａ2Ｓ2Ｏ5溶液（0.5mg／ml，25mM燐酸ナトリウ
ム含有、ｐＨ7.5）25μlで反応を停止した後、25mM燐酸
ナトリウム緩衝液(ｐＨ7.5）150μlおよびウシ血清アル
ブミン溶液(10mg／ml，25mM燐酸ナトリウム含有、ｐＨ
7.5）12μlを加えた。この混合液をセファデックスＧ−
25カラム（５mlベッドボリーム）にかけ、未反応125Ｉ
から分離した放射化ＧＡＤを実験に使用した。
【００２６】(2) ゲル状プロテインＧビーズ(ファルマ
シア社製）20μlに、抗ＧＡＤ抗体含有試料(患者血清
Ａ，Ｂ，Ｃ）５μl、および前記(1)で調製した125Ｉ標
識ＧＡＤ0.625μgを含むＰＢＳ緩衝液（ｐＨ7.1）20μl
を加え、25℃にて１時間時々攪拌しながらインキュベー
ションした。１時間後に遠心処理(10,000rpm、２分間）
して沈殿を分離した。
シア社製）20μlに、抗ＧＡＤ抗体含有試料(患者血清
Ａ，Ｂ，Ｃ）５μl、および前記(1)で調製した125Ｉ標
識ＧＡＤ0.625μgを含むＰＢＳ緩衝液（ｐＨ7.1）20μl
を加え、25℃にて１時間時々攪拌しながらインキュベー
ションした。１時間後に遠心処理(10,000rpm、２分間）
して沈殿を分離した。
【００２７】(3) 上記(2)で得られた沈殿物を10μlの電
気泳動用サンプルバッファーに溶解し、スラブゲルにプ
ロット後、電気泳動を行った。泳動終了後、ろ紙上でゲ
ルを乾燥し、Ｘ線フィルムに感光させてオートラジオグ
ラフィーを行った。
気泳動用サンプルバッファーに溶解し、スラブゲルにプ
ロット後、電気泳動を行った。泳動終了後、ろ紙上でゲ
ルを乾燥し、Ｘ線フィルムに感光させてオートラジオグ
ラフィーを行った。
【００２８】得られた結果を図２に示す。なお、図２に
おいて、レーンＡ，Ｂ，Ｃは、それぞれ糖尿病患者Ａ，
Ｂ，Ｃからの各血清試料から得られた結果を示す。図か
ら明らかなように、ＧＡＤの分子量と相応する64ＫＤ付
近に明瞭なバンドが観察され、患者血清中（Ａ，Ｂ，
Ｃ）に抗ＧＡＤ抗体が存在している。
おいて、レーンＡ，Ｂ，Ｃは、それぞれ糖尿病患者Ａ，
Ｂ，Ｃからの各血清試料から得られた結果を示す。図か
ら明らかなように、ＧＡＤの分子量と相応する64ＫＤ付
近に明瞭なバンドが観察され、患者血清中（Ａ，Ｂ，
Ｃ）に抗ＧＡＤ抗体が存在している。
【００２９】実施例１〜６：ＧＡＤの酵素免疫測定用材
料の安定化 精製ＧＡＤ（図１）を、20mMリン酸緩衝液、ｐＨ7.2
（ＰＢＳ）で５μg／mlに希釈した。その50μlを96穴タ
イター・プレート(コーニング、イムノモジュール）の
各ウエルに分注後、４℃で一晩放置し吸着させた。それ
に2.67％ＢＳＡを含むＰＢＳを各ウエル150μl添加し、
２時間放置しブロッキング処理を行った後、該液を除去
した。その後、各ウェルに下記に示した糖を含む緩衝液
（安定化剤）50μlを添加し、凍結乾燥処理を行った。
これらをプラスチック製バッグに密封し、４℃、22℃、
及び37℃で保存した。
料の安定化 精製ＧＡＤ（図１）を、20mMリン酸緩衝液、ｐＨ7.2
（ＰＢＳ）で５μg／mlに希釈した。その50μlを96穴タ
イター・プレート(コーニング、イムノモジュール）の
各ウエルに分注後、４℃で一晩放置し吸着させた。それ
に2.67％ＢＳＡを含むＰＢＳを各ウエル150μl添加し、
２時間放置しブロッキング処理を行った後、該液を除去
した。その後、各ウェルに下記に示した糖を含む緩衝液
（安定化剤）50μlを添加し、凍結乾燥処理を行った。
これらをプラスチック製バッグに密封し、４℃、22℃、
及び37℃で保存した。
【００３０】安定化剤： 実施例１：ＰＢＳ＋５％ Treharose（Ｔｒｅ） 実施例２：ＰＢＳ＋５％ Lactose（Ｌａｃ） 実施例３：ＰＢＳ＋５％ Maltose（Ｍａｌ） 実施例４：ＰＢＳ＋５％ Saccharose（Ｓａｃ） 実施例５：ＰＢＳ＋10％ Sorbitol（Ｓｏｌ） 実施例６：ＰＢＳ＋10％ Dextrose（Ｄｅｘ）
【００３１】２ヵ月後、各ウエルのＧＡＤ抗原性の残存
率を次のように調べた。まず、各ウエルにＰＢＳ200μl
を加え、室温で1時間放置した。次いで、0.05％ Tween
20含有ＰＢＳ溶液で洗浄した後、500倍希釈抗ＧＡＤ抗
体（血清Ａ）50μlを各ウエルに加え、２時間放置し
た。その後、0.05％ Tween 20含有ＰＢＳ溶液で洗浄
し、ペルオキシダーゼ標識抗ヒト抗体（フナコシ薬品）
約0.1μg／mlを含有するＰＢＳ50μlを加え、１時間放
置した。これを0.05％ Tween 20含有ＰＢＳ溶液で洗浄
し、オルトフェニレンジアミン0.25mg／mlとＨ2Ｏ2 0.0
15％とを含む基質液100μlを各ウエルに加え、室温に30
分放置した。１ＮＨ2ＳＯ4を50μｌ加え反応を停止させ
た後、反応液の吸光度を492nmにて分光光度計（タイテ
ック、マルチスキャン−340）で測定した。
率を次のように調べた。まず、各ウエルにＰＢＳ200μl
を加え、室温で1時間放置した。次いで、0.05％ Tween
20含有ＰＢＳ溶液で洗浄した後、500倍希釈抗ＧＡＤ抗
体（血清Ａ）50μlを各ウエルに加え、２時間放置し
た。その後、0.05％ Tween 20含有ＰＢＳ溶液で洗浄
し、ペルオキシダーゼ標識抗ヒト抗体（フナコシ薬品）
約0.1μg／mlを含有するＰＢＳ50μlを加え、１時間放
置した。これを0.05％ Tween 20含有ＰＢＳ溶液で洗浄
し、オルトフェニレンジアミン0.25mg／mlとＨ2Ｏ2 0.0
15％とを含む基質液100μlを各ウエルに加え、室温に30
分放置した。１ＮＨ2ＳＯ4を50μｌ加え反応を停止させ
た後、反応液の吸光度を492nmにて分光光度計（タイテ
ック、マルチスキャン−340）で測定した。
【００３２】表１に本発明の方法で作製された免疫測定
用プレートの２ヵ月保存後のＧＡＤの抗原性を示す。凍
結乾燥直後のＧＡＤの抗原性を100％とし、2ヵ月後のそ
れを％で示した。ちなみに、凍結乾燥による抗原性の低
下は見られなかった。
用プレートの２ヵ月保存後のＧＡＤの抗原性を示す。凍
結乾燥直後のＧＡＤの抗原性を100％とし、2ヵ月後のそ
れを％で示した。ちなみに、凍結乾燥による抗原性の低
下は見られなかった。
【００３３】
【表１】
【００３４】比較例１〜６：実施例１と同様にＧＡＤの
吸着およびブロッキング処理を行ったプレートを、実施
例１に示した各種安定化剤で洗浄した後、洗浄液を廃棄
し、凍結乾燥した。その後、４℃、22℃、及び37℃保存
し、２ヵ月後にＧＡＤの抗原性を検討した（表２）。抗
原性測定は、実施例１と同様に行った。
吸着およびブロッキング処理を行ったプレートを、実施
例１に示した各種安定化剤で洗浄した後、洗浄液を廃棄
し、凍結乾燥した。その後、４℃、22℃、及び37℃保存
し、２ヵ月後にＧＡＤの抗原性を検討した（表２）。抗
原性測定は、実施例１と同様に行った。
【００３５】
【表２】
【００３６】実施例７：凍結乾燥時の至適安定化剤の液
量 実施例１と同様に、プレートを作製したが、安定化剤の
液量を10〜200μlとした。37℃で２ヵ月間保存後のＧＡ
Ｄ抗原性を表３に示す。
量 実施例１と同様に、プレートを作製したが、安定化剤の
液量を10〜200μlとした。37℃で２ヵ月間保存後のＧＡ
Ｄ抗原性を表３に示す。
【００３７】
【表３】
【００３８】実施例８：至適糖濃度 実施例1と同様に、プレートを作製したが、安定化剤中
の糖濃度を0.5〜８％とした。37℃で２ヵ月間保存後の
ＧＡＤ抗原性を表４に示す。
の糖濃度を0.5〜８％とした。37℃で２ヵ月間保存後の
ＧＡＤ抗原性を表４に示す。
【００３９】
【表４】
【００４０】
【発明の効果】本発明の方法により、免疫測定用担体に
結合したＧＡＤの抗原性を長期間保持することができ
る。それによって、Ｉ型糖尿病患者特異的に出現する抗
ＧＡＤ抗体を酵素免疫法で測定するキット作製が可能と
なった。
結合したＧＡＤの抗原性を長期間保持することができ
る。それによって、Ｉ型糖尿病患者特異的に出現する抗
ＧＡＤ抗体を酵素免疫法で測定するキット作製が可能と
なった。
【図１】 ＧＡＤのスラブゲル電気泳動パターンを示す
図である。
図である。
【図２】 糖尿病患者血清に125Ｉ標識ＧＡＤを加えて
得られた沈殿物をスラブゲル電気泳動して得られたパタ
ーンを示す図である。
得られた沈殿物をスラブゲル電気泳動して得られたパタ
ーンを示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 秋葉 久弥 東京都千代田区丸の内一丁目１番２号 日 本鋼管株式会社内 (72)発明者 鈴木 隆 東京都千代田区丸の内一丁目１番２号 日 本鋼管株式会社内 (72)発明者 丹羽 正弘 埼玉県鶴ヶ島市大字五味ヶ谷80−１ 鶴ヶ 島ハイツＢ−301 (72)発明者 伊藤 真由美 埼玉県川越市寿町１丁目2339番地６
Claims (1)
- 【請求項１】 グルタミン酸デカルボキシラーゼを固定
化した担体をグルタミン酸デカルボキシラーゼ安定化剤
溶液の存在下で凍結乾燥することを特徴とする免疫測定
用材料の製造方法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14276094A JPH0815261A (ja) | 1994-06-24 | 1994-06-24 | 免疫測定用材料の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14276094A JPH0815261A (ja) | 1994-06-24 | 1994-06-24 | 免疫測定用材料の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0815261A true JPH0815261A (ja) | 1996-01-19 |
Family
ID=15322946
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14276094A Pending JPH0815261A (ja) | 1994-06-24 | 1994-06-24 | 免疫測定用材料の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0815261A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004035084A3 (en) * | 2002-10-02 | 2004-12-02 | Diamyd Medical Ab | Formulation of glutarmic acid decarboxylase (gad65) and serum albumin |
| WO2005062050A1 (en) * | 2003-12-23 | 2005-07-07 | Maharashtra Hybrid Seeds Company Limited | A method for the preparation of ready-to-use solid support for rapid enzyme-linked immunosorbent assay (elisa) |
| WO2008075072A2 (en) * | 2006-12-21 | 2008-06-26 | Oxford Biosensors Limited | Formulation |
| JP2011515685A (ja) * | 2008-03-26 | 2011-05-19 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 基質結合ビーズを長期間保存する方法 |
-
1994
- 1994-06-24 JP JP14276094A patent/JPH0815261A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004035084A3 (en) * | 2002-10-02 | 2004-12-02 | Diamyd Medical Ab | Formulation of glutarmic acid decarboxylase (gad65) and serum albumin |
| WO2005062050A1 (en) * | 2003-12-23 | 2005-07-07 | Maharashtra Hybrid Seeds Company Limited | A method for the preparation of ready-to-use solid support for rapid enzyme-linked immunosorbent assay (elisa) |
| WO2008075072A2 (en) * | 2006-12-21 | 2008-06-26 | Oxford Biosensors Limited | Formulation |
| WO2008075072A3 (en) * | 2006-12-21 | 2008-08-07 | Oxford Biosensors Ltd | Formulation |
| JP2011515685A (ja) * | 2008-03-26 | 2011-05-19 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 基質結合ビーズを長期間保存する方法 |
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