CN1306212A

CN1306212A - 检测脱氧核糖核蛋白抗体的免疫乳胶试剂及其制备与应用

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Publication number: CN1306212A
Application number: CN 01109087
Authority: CN
Inventors: 崔京涛; 王慧珍; 李永哲
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-02-28
Filing date: 2001-02-28
Publication date: 2001-08-01
Anticipated expiration: 2021-02-28
Also published as: CN1120368C

Abstract

本发明公开了一种用于系统性红斑狼疮(SLE)诊断的一种新方法,利用脱氧核糖核蛋白(DNP)抗原,致敏聚苯乙烯乳胶制备成抗DNP抗体乳胶凝集试剂,用该试剂可以检测LE细胞形成过程中的重要因素LE因子(DNP抗体),该DNP乳胶凝集试验敏感性、特异性高于传统的LE细胞检查法。

Description

检测脱氧核糖核蛋白抗体的免疫乳胶试剂及其制备与应用

本发明涉及免疫诊断领域，涉及红斑狼疮的诊断，具体地说涉及利用脱氧核糖核蛋白(DNP)抗原，致敏聚苯乙烯乳胶制备的抗DNP抗体乳胶凝集试剂，还涉及该乳胶试剂在临床诊断系统性红斑狼疮中的应用。

1948年美国学者Hargraves等首先在SLE患者的骨髓和胸水中发现LE细胞现象。LE细胞形成原理在于LE因子(即IgG类的抗脱氧核糖核蛋白抗体)在补体辅助下与中性粒细胞核内的DNA组蛋白复合物(DNP)起作用，使核发生肿胀、变碱，中性粒细胞分裂溶解，形成均匀游离体(均匀体)。均匀体再被中性粒细胞吞噬，并将细胞核推向一边，形成典型的LE细胞现象。LE细胞发现奠定了SLE的自身免疫的基础。LE细胞除在50-60％的SLE出现外，也可在其他结缔组织病(CTD)，如干燥综合征(SS)、混合性结缔组织病(MCTD)等病中出现，但阳性率很低。虽然LE细胞的特异性和敏感性不如十年后发现(Frion等，1957年)并发展起来的间接免疫荧光技术(IFA)测定抗核抗体(ANA)试验，加之传统的LE细胞检查法操作繁杂，但国内外SLE诊断标准中一直将LE细胞阳性做为SLE诊断的实验室指标之一。同其他实验室指标如ANA、抗ds-DNA抗体、抗Sm抗体、狼疮带试验(LBT)并用，可大大提高诊断SLE的特异性。因此，LE细胞检查对SLE诊断仍有重要意义。为提高LE细胞检查敏感性、特异性，我们用简单、快速的抗DNP抗体乳胶凝集试验替代了延用至今近40年的传统LE细胞检查法。

本发明的目的在于提供了一种用于DNP抗体检测的免疫乳胶试剂。

本发明的又一目的是应用前面所述的免疫乳胶试剂临床诊断系统性红斑狼疮疾病。

本发明是按照如下所述实现的：

一、DNP乳胶的制备

1、DNP抗原提取：

新鲜小牛胸腺(去脂肪和结缔组织)，剪碎加入0.14M氯化钠，匀浆慢速3次，每次30秒，8层纱布过滤，高速离心，3000转，1小时，弃上清，沉淀加1M氯化钠，匀浆全速3次，每次30秒，高速离心，3000转，1小时，弃沉淀，加蒸馏水于上清液中(蒸馏水∶上清液=6∶1)，4℃下过夜，高速离心，3000转，1小时，沉淀加入1M氯化钠溶解。

2、DNP抗原鉴定：

DNP抗原提取后，必须通过以下6种试验：

A．DNP含量测定：取DNP抗原3ml用分光度计测其蛋白含量，在其260nm、280nm处分别测OD值后，用公式280nmOD×1.45-260nmOD×0.74即可计算DNP含量。

B．DNA酶和RNA酶消化试验：DNP乳胶100μl加入DNA酶(RNA酶)100μl，置室温30分钟后离心1500rpm 5分钟，弃上清，加PB缓冲液100μl后用DNP抗体阳性病人血清做琼脂扩散。

C．组蛋白测定试验：以2.5mg/ml组蛋白抗原200μl包被聚苯乙烯微孔板，置4℃20小时后。弃去抗原包被液，加入明胶液以阻断未被抗原包被的部分，次日加入DNP抗原200μl置室温2小时，经PBS-吐温和PBS缓冲液洗涤后，加入最适工作浓度HRP标记的羊抗人IgG200μl，置室温2小时后，分别以PBS-吐温和PBS溶液冲洗各3次，加入底物液200μl，置室温2小时后，以410nm测定各孔的吸光度(A)。

D．对流电泳试验：在对流免疫电泳琼脂板上靠近负极的孔中加入DNP抗原，正极端孔中加入DNP抗体阳性血清，以注满小孔为度，按琼脂板长度电压4-6v/cm，电泳45-60分钟，后观察结果，在黑色背景上方，可见两孔间形成抗原-抗体复合物的乳白色沉淀线。

E．对照试验：用DNP乳胶20μl分别入DNP抗体阳性血清和阴性血清，混匀后，阳性血清出现颗粒凝集，阴性则无凝集。

F．致敏试验：参见DNP乳胶致敏方法。

3、DNP乳胶致敏方法：

A．物理方法

蒸馏水10倍稀释物理乳胶，加0.2M PH5.7PB，搅拌下加DNP抗原，放37℃水浴30分钟，离心3000转，5分钟，去上清，加0.01M PH5.7PB至原体积，DNP阳性血清测试。

B．化学方法

蒸馏水10倍稀释化学乳胶，加0.2M PH 5.7PB，加环氧氯丙烷，搅拌5分钟，加PEG搅拌5分钟，加入DNP抗原，搅拌30分钟，离心3000转，5分钟，去上清，加0.01M PH 5.7PB至原体积，DNP阳性血清测试。

二、应用DNP乳胶试剂检测红斑狼疮

1、操作步骤

(1)自4℃冰箱中取出DNP乳胶试剂，将乳胶充分摇匀，并置室温中平衡温度后待用。

(2)将被检血清20ul和DNP乳胶试剂20ul滴加于洁净玻璃片上，用竹签或塑料棒混匀涂成2cm直径的圆斑。

(3)缓缓旋转摇动玻璃板1分钟后，在黑色背景下肉眼观察是否有凝集反应。

(4)被检阳性血清若需做半定量测定，可将血清做倍比稀释，重复上法测定，以出现凝集的血清最高稀释度为抗DNP抗体滴度。

2、结果判断

阳性时乳胶出现明显的凝集颗粒；阴性时乳胶呈均匀悬液状态。

(-)乳胶均匀，无肉眼可见的凝集颗粒(有时可以出现极细均匀的颗粒)。

(+)肉眼可见较细的凝集颗粒，背景混浊。

(++)肉眼可见大而清晰的凝集颗粒，背景稍混。

(+++)肉眼可见大而清晰的凝集颗粒，背景澄清。

(++++)肉眼可见大而清晰的凝集块，背景澄清。

阳性结果报告方式可按凝集反应强弱报告(-)-(++++)；或按半定量反应结果报告抗DNP抗体滴度。

3、临床意义

(1)正常人无此抗体，阳性时主要见于系统性红斑狼疮，尤其活动期SLE，阳性率可达88.8％。其它结缔组织病等有时可见阳性，阳性率低，且部分病人合并SLE症状。某些结缔组织病(如肝炎)等偶见阳性。

(2)抗DNP抗体乳胶凝集试验为SLE的十分重要的过筛试验。阳性结果，特别是(++)以上时要高度考虑SLE的诊断；阴性结果时，SLE的诊断要慎重。

4、注意事项

(1)每次实验必须设阳性和阴性对照，一切实验用品(玻璃板、搅拌棒等)应洁净、干燥。

(2)DNP乳胶试剂应置4℃保存，严禁冻结(乳胶试剂冻结→融化，可使致敏乳胶的DNP抗原脱落，而致乳胶试剂失效)。

(3)DNP乳胶试剂有效期6个月。若阳性对照血清或生理盐水对照出现明显凝集现象则表示该试剂有质量问题，不能再使用。

与现有技术相比，应用本发明的DNP乳胶试剂替代传统的狼疮细胞检测方法，由于DNP乳胶凝集试验操作简易、使用方便，不需任何特殊设备，为红斑狼疮诊断、治疗提供了一种快速敏感的实验室指标。该产品质量稳定、特异性强、效果良好。

实施例

DNP乳胶试剂用于检测红斑狼疮

按照“发明技术方案”所述的检测方法以及LE细胞检查法进行比较检测，共检测了71例SLE患者，其比较结果见表1和表2

表1 71例SLE患者两种方法检测阳性率比较

抗dsDNA抗体(结合率％)	例数	LE细胞阳性率	抗DNP抗体阳性率
抗dsDNA抗体(结合率％)	例数	LE细胞阳性率	抗DNP抗体阳性率	＞40％20-40％＜20％	181835	83％33％11.4％	94.4％66％40％

表2 468份血清两方法检测阳性率比较

n=468	DNP乳胶试验
	DNP乳胶试验				-	+	++	+++
	LEC(-)LEC(+)	2675	3324	4967	-	+	++	+++	718

完全符合374份，占80％；DNP乳胶试验阳性，LE细胞阴性89份；占19％；LE细胞阳性，DNP试验阴性5份，占1％。

由以上两表可见，DNP乳胶凝集实验敏感性、特异性均高于LE细胞检测法，假阴性率仅为1％，可完全替代LE细胞检查法。

抗DNP抗体临床意义

正常人无此抗体，阳性时主要见于SLE，尤其活动期SLE阳性率可达88.8％。解放军205医院应用本发明制备的DNP乳胶试剂，观察抗DNP抗体在活动期SLE阳性率为92.8％(见《中华医学会第四次全国风湿病学术会议论文汇编》P140页)。抗DNP抗体在其它CTD(如SS、MCTD等)有时可见阳性，但阳性率低；在某些非CTD(如肝炎、白血病等)偶见阳性。

抗DNP抗体与抗核抗体(ANA)滴度无关，ANA阴性，低滴度也可阳性；与ANA染色模型(均质型)、抗ds-DNA抗体阳性(结合率)30％、LE细胞试验结果阳性有密切关系。

LE细胞在病情重(活动期)，又未用过激素治疗的SLE患者血中容易找到，其阳性率可达50％-70％；在病情缓解或服用激素治疗患者血中则不易找到。在一些其它CTD(如肝炎、结核、肾炎、白血病等)中都可以有LE细胞阳性发现。因此，很多病人甚至医生把找到LE细胞看成是诊断SLE的唯一标准或未查到LE细胞就不是SLE，这显然是不合适的。同样，抗DNP抗体亦是如此。阳性结果。特别是(++)以上时要高度考虑SLE诊断，并进一步检查诊断SLE的其它实验室指标(如ANA、抗ds-DNA抗体、抗Sm抗体及狼疮带试验等)；阴性时，SLE的诊断应慎重。

表3 778份血清抗DNP抗体乳胶凝集实验检测结果

检测对象	例数	阳性数	阳性率
检测对象	例数	阳性数	阳性率	系统性红斑狼疮(SLE)活动期系统性红斑狼疮(SLE)非活动期干燥综合症(SS)混合性结缔组织病(MCTD)类风湿关节炎(RA)硬皮病(PSS)皮肌炎/多发性肌炎(PM/DM)肝炎其它风湿性疾病献血员	17025068305234212530100	1515182211111	88.8％20.4％12.1％6.7％3.8％2.9％4.7％4.0％3.3％1.0％

(DNP乳胶凝集试验敏感、特异、简便、快速，是一个十分有用的筛选试验，可用于最基层的医疗单位，替代传统的LE细胞检查法，对SLE诊断和鉴别诊断有重要帮助。)

附图说明：

图1是乳胶凝集试验检测抗DNP抗体试剂及实验材料；

图2是乳胶凝集试验检测抗DNP抗体：阳性(左)、阴性(右)。

Claims

1、用于DNP抗体检测的免疫乳胶试剂的制备方法，其特征在于由下列步骤制备的：

A．DNP抗原的提取；B．DNP乳胶致敏。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于其中A步骤包括将新鲜小牛胸腺剪碎，加入氯化钠，慢速匀浆3次，过滤，高速离心，弃上清，沉淀加氯化钠匀浆，高速离心，弃沉淀，加蒸馏水于上清液中，4℃过夜，高速离心，沉淀加入氯化钠溶解。

3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于B步骤包括物理方法或化学方法。

4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于物理方法是用蒸馏水稀释物理乳胶，加入磷酸缓冲液(PB)，边搅拌边加入DNP抗原，放37C水浴30分钟，离心3000转，5分钟，去上清，加入PB至原体积，用于DNP阳性血清测试。

5、根据权利要求3所述的方法，其特征在于化学方法是用蒸馏水稀释化学乳胶，加入PB，加环氧氯丙烷，搅拌5分钟，加聚乙二醇(PEG)，搅拌5分钟，加入DNP抗原，搅拌30分钟，离心3000转，5分钟，去上清，加入PB至原体积，用于DNP阳性血清测试。

6、根据权利要求1所述方法获得的免疫乳胶试剂。