CN113406323A - 一种胶乳免疫比浊第二试剂、含其的组合及其制备方法 - Google Patents

一种胶乳免疫比浊第二试剂、含其的组合及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种胶乳免疫比浊第二试剂、含其的组合及其制备方法。所述胶乳免疫比浊第二试剂包含0.05～5％(w/v)胆碱类物质。本发明所提供的胶乳免疫比浊第二试剂具有优异的防沉降稳定性，常温下至少可放置18个月，且可以放置于任何环境下，并适用于大部分通过化学偶联方式获得的胶乳微球。

Description

一种胶乳免疫比浊第二试剂、含其的组合及其制备方法
技术领域
本申请属于医学检测技术领域，尤其涉及一种胶乳免疫比浊第二试剂、含其的组合及其制备方法。
背景技术
体外诊断领域中，胶乳免疫比浊法包括胶乳免疫比浊透射法和胶乳免疫比浊散射法，两种方法均是通过化学偶联或物理吸附的方式，将抗体标记在胶乳微球的表面，形成抗体-微球偶联物的胶乳试剂，即第二试剂。在第一试剂的缓冲液体系中，第二试剂中的抗体-微球偶联物与被测抗原发生反应，形成抗原-抗体-微球复合物，复合物导致试剂出现浊度，浊度的变化通过仪器信号值的变化来体现。通过使用已知浓度的标准品与浓度绘制标准曲线，测定未知浓度的样品获得信号值，在标准曲线上对应信号值获得被测样品的对应浓度。
对于含有胶乳微球和抗体的第二试剂而言，胶乳试剂是典型的热力学不稳定体系，试剂中的微粒表面积较大，因此其对应的表面能很大，为了降低高表面能，试剂中的微粒会通过聚集来减少表面能，随着时间的流逝，试剂中逐渐凝集的微粒最终出现沉降。
另一方面，胶乳免疫比浊试剂中的用来连接抗体的胶乳微球带有负电荷，抗体带正电荷，当过量的带正电荷的抗体加入后与带负电荷的胶乳微球连接，在微球表面既有化学连接的抗体，也有因为物理吸附的抗体，因此此时抗体-微球偶联物表面空间仍存在些许正电荷。由于抗体-微球偶联物本身的重力作用较大于微球间正电荷的排斥作用，因此随着时间的延长，试剂中的抗体-微球偶联物会慢慢沉降下来。
由于表面能和电荷等原因，大部分液体状态的胶乳免疫比浊试剂在室温或2-8℃条件下仍旧会出现凝集沉降的问题。当胶乳试剂出现凝集沉降的时候，会明显损害试剂的基本性能，比如试剂空白升高，试剂重复性降低、线性范围缩小等。
专利文献1(日本特开昭61-222531号公报)中记载了将未致敏胶乳冷冻干燥时添加的防冻剂，列举了分子量大的多糖类、PVP、Tween20等表面活性剂。根据这种手法能够实现胶乳试剂的稳定保存。但是，利用这种方法仅适用于冷冻干燥的试剂，冻干粉试剂对于用户而言，操作繁琐，方便性不好。
专利文献2(申请号为201480011899.5)中记载了通过使用三甲基甘氨酸可以解决经冷冻解冻后导致的胶乳颗粒的凝集沉降。但是该方法也仅适用于由于未致敏的胶乳免疫比浊试剂，且该试剂是由于温度变化而导致出现了凝集沉淀的现象。
因此提供一种适用度广且防沉降稳定性高的胶乳免疫比浊第二试剂是很有必要的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为克服现有技术中存在的缺乏适用度广且防沉降稳定性高的胶乳免疫比浊试剂的缺陷，提供一种一种胶乳免疫比浊第二试剂、含其的组合及其制备方法。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案之一为：一种胶乳免疫比浊第二试剂，其包含0.05～5％(w/v)胆碱类物质。
本发明中所述胆碱类物质为胆碱的2号碳上的氢键或羟基上的氢键被化学基团替代而获得的胆碱衍生物；优选包括磷酸胆碱、L-α-甘油磷酸胆碱、L-α-磷脂酰胆碱、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵、琥珀酰左旋肉碱锂盐、(S)-(-)-(3-氯-2-羟丙基)三甲基氯化铵、戊酰左旋肉碱、聚乙二醇-磷酸胆碱、聚磷酸胆碱乙二醇丙烯酸酯、biolipidure103、biolipidure203、biolipidure206、biolipidure405、biolipidure406和biolipidure1002中的一种或几种；更优选包括biolipidure103、biolipidure405、戊酰左旋肉碱、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵和琥珀酰左旋肉碱锂盐中的一种或几种。
本发明中所述胶乳免疫比浊第二试剂较佳地还包含连接抗体的胶乳微球，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。所述抗体优选包括血清淀粉样蛋白A抗体、尿转铁蛋白抗体、生长刺激因子表达蛋白2抗体、降钙素原抗体、肝素结合蛋白抗体、视黄醇结合蛋白抗体、C反应蛋白抗体、α1-微球蛋白抗体、β2-微球蛋白抗体、中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白抗体、胃蛋白酶原I抗体、胃蛋白酶原II抗体、载脂蛋白E抗体、涎液化糖链抗原抗体；更优选包括载脂蛋白E抗体、中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白抗体和尿转铁蛋白抗体。
本发明中所述胶乳微球较佳地包括羧基微球，所述羧基微球粒径较佳地为50-450nm。
本发明所述的胶乳免疫比浊第二试剂，较佳地还包含pH为4-10的缓冲液，所述缓冲液优选N,N-二(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸盐缓冲液、N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液或N-(2-羟乙基)哌嚓-N/-(2-乙磺酸)缓冲液。
在本发明一较佳实施方案中，所述缓冲液为N,N-二(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸盐缓冲液，所述胶乳微球为羧基微球，所述抗体为载脂蛋白E抗体，所述胆碱类物质为biolipidure103；其中，所述biolipidure103的质量体积比优选0.5～2％，更优选1％；所述N,N-二(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸盐缓冲液浓度优选20～70mmol/L，更优选50mmol/L；pH优选7～8，更优选7.2；所述羧基微球粒径优选80-100nm。
在本发明一较佳实施方案中，所述缓冲液为N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液，所述抗体为中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白抗体，所述胶乳微球为羧基微球，所述胆碱类物质为戊酰左旋肉碱和甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵；其中，所述戊酰左旋肉碱的质量体积比优选0.05～1％，更优选0.75％；所述甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵的质量体积比优选0.1～1％，更优选0.6％；所述N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液的浓度优选50～80mmol/L，更优选70mmol/L，pH优选7～9，更优选8.5；所述羧基微球粒径优选180～250nm。
在本发明一较佳实施方案中，所述缓冲液为N-(2-羟乙基)哌嚓-N/-(2-乙磺酸)缓冲液，所述胶乳微球为羧基微球，所述抗体为尿转铁蛋白抗体，所述胆碱类物质为琥珀酰左旋肉碱锂盐和biolipidure405；其中，所述琥珀酰左旋肉碱锂盐的质量体积比优选0.7-2％，更优选1.5％；所述biolipidure405的质量体积比优选0.05-1％，更优选0.7％；所述N-(2-羟乙基)哌嚓-N/-(2-乙磺酸)缓冲液的浓度优选70～120mmol/L，更优选90mmol/L，pH优选7～8，更优选7.5；所述羧基微球粒径优选60～400nm。
本发明提供的技术方案之二为：一种组合，所述组合含有上述技术方案之一中所述的胶乳免疫比浊第二试剂。
本发明所述组合为例如溶液或试剂盒的形式。具体地：
当所述组合为溶液形式时，本发明旨在表明所述组合为一个溶液体系；所述组合中优选还包含第一试剂。
当所述组合为试剂盒形式时，所述试剂盒优选还含有独立地第一试剂；
本发明中所述第一试剂优选包含磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液或甘氨酸缓冲液。
在本发明一较佳实施方案中，所述缓冲液为N,N-二(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸盐缓冲液，所述胶乳微球为羧基微球，所述抗体为载脂蛋白E抗体，所述胆碱类物质为biolipidure103，所述第一试剂为磷酸盐缓冲液；其中，所述biolipidure103的质量体积比优选0.5～2％，更优选1％；所述N,N-二(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸盐缓冲液浓度优选20～70mmol/L，更优选50mmol/L；pH优选7～8，更优选7.2；所述羧基微球粒径优选80-100nm。
在本发明一较佳实施方案中，所述缓冲液为N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液，所述抗体为中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白抗体，所述胶乳微球为羧基微球，所述胆碱类物质为戊酰左旋肉碱和甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵，所述第一试剂为三羟甲基氨基甲烷缓冲液；其中，所述戊酰左旋肉碱的质量体积比优选0.05～1％，更优选0.75％；所述甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵的质量体积比优选0.1～1％，更优选0.6％；所述N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液的浓度优选50～80mmol/L，更优选70mmol/L，pH优选7～9，更优选8.5；所述羧基微球粒径优选180～250nm。
在本发明一较佳实施方案中，所述缓冲液为N-(2-羟乙基)哌嚓-N/-(2-乙磺酸)缓冲液，所述胶乳微球为羧基微球，所述抗体为尿转铁蛋白抗体，所述胆碱类物质为琥珀酰左旋肉碱锂盐和biolipidure405，所述第一试剂为甘氨酸缓冲液；其中，所述琥珀酰左旋肉碱锂盐的质量体积比优选0.7-2％，更优选1.5％；所述biolipidure405的质量体积比优选0.05-1％，更优选0.7％；所述N-(2-羟乙基)哌嚓-N/-(2-乙磺酸)缓冲液的浓度优选70～120mmol/L，更优选90mmol/L，pH优选7～8，更优选7.5；所述羧基微球粒径优选60～400nm。
本发明提供的技术方案之三为：一种制备胶乳免疫比浊试剂的第二试剂方法，其包含以下步骤：
将连接抗体的胶乳微球与胆碱类物质溶液混合，所述胆碱类物质在所述第二试剂中的浓度为0.05～5％(w/v)；
其中，
所述胆碱类物质较佳地为胆碱的氢键被化学基团替代而获得的胆碱衍生物；优选包括磷酸胆碱、L-α-甘油磷酸胆碱、L-α-磷脂酰胆碱、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵、琥珀酰左旋肉碱锂盐、(S)-(-)-(3-氯-2-羟丙基)三甲基氯化铵、戊酰左旋肉碱、聚乙二醇-磷酸胆碱、聚磷酸胆碱乙二醇丙烯酸酯、biolipidure103、biolipidure203、biolipidure206、biolipidure405、biolipidure406和biolipidure1002中的一种或几种；更优选包括biolipidure103、biolipidure405、戊酰左旋肉碱、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵和琥珀酰左旋肉碱锂盐中的一种或几种；
所述抗体较佳的为单克隆抗体或多克隆抗体；优选包括血清淀粉样蛋白A抗体、尿转铁蛋白抗体、生长刺激因子表达蛋白2抗体、降钙素原抗体、肝素结合蛋白抗体、视黄醇结合蛋白抗体、C反应蛋白抗体、α1-微球蛋白抗体、β2-微球蛋白抗体、中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白抗体、胃蛋白酶原I抗体、胃蛋白酶原II抗体、载脂蛋白E抗体、涎液化糖链抗原抗体；更优选包括载脂蛋白E抗体、中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白抗体或尿转铁蛋白抗体。
本发明中所述连接抗体的胶乳微球可以通过以下步骤制备：
a.将缓冲液1、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和所述胶乳微球混合，离心，
其中所述缓冲液1优选2-吗啉乙磺酸缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液或二(2-羟乙基)亚氨基Tris(羟甲基)甲烷缓冲液，
其中所述胶乳微球较佳地为羧基微球，所述羧基微球的粒径较佳地为50-450nm，所述混合较佳地为按体积比5：(0.01～0.03)：(0.01～0.04)：1混合；
b.向步骤a所得沉淀中加入缓冲液1进行重悬后加入所述抗体，离心。
其中所述缓冲液与抗体的体积比较佳地为5：(0.08～0.12)。
本发明中所述胆碱类物质的溶液可以通过以下步骤制备：
向缓冲液中加入所述胆碱类物质，所述缓冲液为N,N-二(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸盐缓冲液、N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液或N-(2-羟乙基)哌嚓-N/-(2-乙磺酸)缓冲液。
在本发明一实施方案中，所述缓冲液1为2-吗啉乙磺酸缓冲液，所述缓冲液为N,N-二(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸盐缓冲液，所述胶乳微球为羧基微球，所述抗体为载脂蛋白E抗体，所述胆碱类物质为biolipidure103；其中，所述biolipidure103的质量体积比优选0.5～2％，更优选1％；所述N,N-二(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸盐缓冲液浓度优选20～70mmol/L，更优选50mmol/L；pH优选7～8，更优选7.2；所述羧基微球粒径优选80-100nm。
在本发明一实施方案中，所述缓冲液1为3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液，所述缓冲液为N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液，所述抗体为中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白抗体，所述胶乳微球为羧基微球，所述胆碱类物质为戊酰左旋肉碱和甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵；其中，所述戊酰左旋肉碱的质量体积比优选0.05～1％，更优选0.75％；所述甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵的质量体积比优选0.1～1％，更优选0.6％；所述N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液的浓度优选50～80mmol/L，更优选70mmol/L，pH优选7～9，更优选8.5；所述羧基微球粒径优选180～250nm。
在本发明一实施方案中，所述缓冲液1为3-吗啉丙磺酸缓冲液和二(2-羟乙基)亚氨基Tris(羟甲基)甲烷缓冲液，所述缓冲液为N-(2-羟乙基)哌嚓-N/-(2-乙磺酸)缓冲液，所述胶乳微球为羧基微球，所述抗体为尿转铁蛋白抗体，所述胆碱类物质为琥珀酰左旋肉碱锂盐和biolipidure405；其中，所述琥珀酰左旋肉碱锂盐的质量体积比优选0.7-2％，更优选1.5％；所述biolipidure405的质量体积比优选0.05-1％，更优选0.7％；所述N-(2-羟乙基)哌嚓-N/-(2-乙磺酸)缓冲液的浓度优选70～120mmol/L，更优选90mmol/L，pH优选7～8，更优选7.5；所述羧基微球粒径优选60～400nm。
本发明中所提及的“质量体积比”或者“w/v”指的是特定种类的胆碱类物质的质量(g)与胶乳免疫比浊第二试剂的体积(ml)之间的比值。
本发明中缓冲液之后的数值(如缓冲液1中的“1”)没有实际意义，仅为区分相同术语。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明提供的胶乳免疫比浊第二试剂具有以下优点：在不影响免疫比浊试剂其他性能(如校准品线性、试剂空白和重复性)的情况下，第二试剂具有优异的防沉降稳定性，常温下至少可放置18个月；且可以放置于任何环境下，并适用于大部分通过化学偶联方式获得的胶乳微球。
附图说明
图1为载脂蛋白E(APOE)的实施例与对照组试剂在不同时间段的定标曲线数据图。
图2为中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)的实施例与对照组试剂在不同时间段的定标曲线数据图。
图3为尿转铁蛋白(uTRF)的实施例与对照组试剂在不同时间段的定标曲线数据图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下获得的其他实施例，都属于本发明保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1：一种制备检测载脂蛋白E(APOE)的试剂
检测试剂包括第一试剂和第二试剂。实施例组1与对照组1使用同一组第一试剂。
包括以下步骤：
(1)制备载脂蛋白E抗体-微球偶联物：用2-吗啉乙磺酸缓冲液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和80-100nm的羧基微球混合将羧基微球活化，体积比为5:0.01:0.02:1，室温混合30min后，离心去上清。在沉淀中加入2-吗啉乙磺酸缓冲液进行重悬，加入羊抗人载脂蛋白E多克隆抗体(商购，从菲鹏生物股份有限公司处采购)，缓冲液与抗体的体积比为5:0.1，室温混合2小时后，添加BSA进行封闭，封闭时间1小时，离心去上清，即获得载脂蛋白E抗体-微球偶联物。该步骤使用相同的工艺及原料，制备两组载脂蛋白E抗体-微球偶联物，一组用于实施例1组，一组用于对照组1。
(2)制备实施例1组的溶液：在20-70mmol/L pH为7-8的N,N-二(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸盐缓冲液中，添加0.5-2％的biolipidure103。具体地，N,N-二(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸缓冲液浓度为50mmol/L，pH为7.2，biolipidure103浓度为1％。
(3)制备对照组1的溶液：配制浓度为50mmol/L pH为7.2的N,N-二(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸盐缓冲液，不添加任何胆碱类物质。
(4)制备第二试剂：在步骤(1)制备的载脂蛋白E抗体-微球偶联物中，1组抗体-微球偶联物添加步骤(2)制备的实施例1组溶液并进行重悬，即得到载脂蛋白E胶乳试剂实施例1组的第二试剂。另1组抗体-微球偶联物中添加步骤(3)制备的对照组1溶液并重悬，即得到载脂蛋白E对照组1的第二试剂。
(5)制备检测载脂蛋白E(APOE)的第一试剂：配制浓度为100mmol/L pH为7.0的磷酸盐缓冲液。
实施例2：一种制备检测中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)的试剂
检测试剂包括第一试剂和第二试剂。实施例组2与对照组2使用同一组第一试剂。
包括以下步骤：
(1)制备中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白抗体-微球偶联物：用3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和180-250nm的羧基微球混合将羧基微球活化，体积比为5:0.03:0.01:1，室温混合30min后，离心去上清。在沉淀中加入3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液进行重悬，加入鼠抗人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白单克隆抗体(商购，从深圳雅为世纪科技有限公司处采购)，缓冲液与抗体的体积比为5:0.12，室温混合2小时后，添加BSA进行封闭，封闭时间1小时，离心去上清，即获得中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白抗体-微球偶联物。该步骤使用相同的工艺及原料，制备两组中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白抗体-微球偶联物，一组用于实施例2组，一组用于对照组2。
(2)制备实施例2组的溶液：在50-80mmol/L pH为7-9的N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液中，添加0.05-1％的戊酰左旋肉碱和0.1-1％甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵。具体地，N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液浓度为70mmol/L，pH为8.5，戊酰左旋肉碱浓度为0.75％，甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵浓度为0.6％。
(3)制备对照组2的溶液：配制浓度为70mmol/L pH为8.5的N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液，不添加任何胆碱类物质。
(4)制备第二试剂：在步骤(1)制备的中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白抗体-微球偶联物中，1组抗体-微球偶联物添加步骤(2)制备的实施例2组溶液并进行重悬，即得到中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白胶乳试剂实施例2组胶乳试剂。另1组抗体-微球偶联物中添加步骤(3)制备的对照组2溶液并重悬，即得到中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白对照组2。
(5)制备检测中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)的第一试剂：配制浓度为50mmol/L pH为8.0的三羟甲基氨基甲烷缓冲液。
实施例3：制备尿转铁蛋白(uTRF)的试剂
检测试剂包括第一试剂和第二试剂。实施例组3与对照组3使用同一组第一试剂。
包括以下步骤：
(1)制备尿转铁蛋白抗体-微球偶联物，该项目需要使用两种胶乳微球与两种抗体进行标记：
(1-1)用3-吗啉丙磺酸缓冲液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和60-90nm的羧基微球混合将羧基微球活化，体积比为5:0.02:0.04:1，室温混合30min后，离心去上清。在沉淀中加入3-吗啉丙磺酸缓冲液进行重悬，加入兔抗人尿转铁蛋白多克隆抗体(商购，从Dako公司处采购)，缓冲液与抗体的体积比为5:0.08，室温混合2小时后，添加BSA进行封闭，封闭时间1小时，离心去上清，即获得尿转铁蛋白抗体-小粒径微球偶联物。该步骤使用相同的工艺及原料，制备两组尿转铁蛋白抗体-小粒径微球偶联物，一组用于实施例3组，一组用于对照组3。
(1-2)用二(2-羟乙基)亚氨基Tris(羟甲基)甲烷缓冲液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和300-400nm的羧基微球混合将羧基微球活化，体积比为5:0.01:0.01:1，室温混合30min后，离心去上清。在沉淀中加入二(2-羟乙基)亚氨基Tris(羟甲基)甲烷缓冲液进行重悬，加入羊抗人尿转铁蛋白多克隆抗体(商购，从Dako公司处采购)，缓冲液与抗体的体积比为5:0.15，室温混合2小时后，添加BSA进行封闭，封闭时间1小时，离心去上清，即获得尿转铁蛋白抗体-大粒径偶联物。该步骤使用相同的工艺及原料，制备两组尿转铁蛋白抗体-大粒径微球偶联物，一组用于实施例3组，一组用于对照组3。
(2)制备实施例3组的溶液：在70-120mmol/L pH为7-8的N-(2-羟乙基)哌嚓-N/-(2-乙磺酸)缓冲液中，添加0.7-2％的琥珀酰左旋肉碱锂盐和0.05-1％biolipidure405。具体地，N-(2-羟乙基)哌嚓-N/-(2-乙磺酸)缓冲液浓度为90mmol/L，pH为7.5，琥珀酰左旋肉碱锂盐浓度为1.5％，biolipidure405浓度为0.7％。
(3)制备对照组2的溶液：配制浓度为70mmol/L pH为7.5的N-(2-羟乙基)哌嚓-N/-(2-乙磺酸)缓冲液，不添加任何胆碱类物质。
(4)制备第二试剂：在步骤(1)制备的尿转铁蛋白抗体-微球偶联物中，1组抗体-小粒径微球偶联物和抗体-大粒径微球偶联物添加步骤(2)制备的实施例3组溶液并进行重悬，即得到尿转铁蛋白胶乳试剂实施例3组胶乳试剂，大小粒径偶联物与溶液体积比为2.5:1:50。另1组抗体-小粒径微球偶联物和抗体-大粒径微球偶联物中添加步骤(3)制备的对照组3溶液并重悬，即得到尿转铁蛋白对照组3，大小粒径偶联物与溶液体积比为2.5:1:50。
(5)制备尿转铁蛋白(uTRF)的第一试剂：配制浓度为80mmol/L pH为8.3的甘氨酸缓冲液。
效果实施例
将各项实施例的胶乳试剂，分别在配制完成的两天后、15天后、1个月后、2个月后、4个月后、6个月、12个月后进行下列性能测试：
1、外观检查：在光线充足的条件下，目视检查，胶乳试剂是否出现凝集沉降的现象。
2、校准曲线图：使用小牛血清稀释不同抗体对应的抗原至少5个浓度，要求抗原最高浓度为接近对应产品的线性区间上限的浓度。
3、试剂空白吸光度：用纯化水作为样品重复测定2次，记录试剂空白吸光度.
4、重复性：对两个抗原浓度的样品(APOE抗原浓度分别为40mg/L和100mg/L，NGAL抗原浓度分别为45μg/L和300μg/L，uTRF抗原浓度分别为2mg/L和7mg/L)，分别重复测试10次，计算10次测定结果的平均值
Figure BDA0003122378080000091
和标准差(SD)，计算变异系数CV：
Figure BDA0003122378080000092
若试剂出现凝集沉降的现象，可重新进行重悬后再进行校准、试剂空白吸光度及重复性的测试。
表1为实施例与对照组在不同时间段的外观检查结果。根据表1可知，添加了胆碱类的实施例的第二试剂在12个月的时间内，均未出现凝集沉降的现象。而未添加胆碱类的对照组的第二试剂在一个月或两个月之后，均出现了凝集沉降的现象。即使在发现沉淀后重新进行了重悬，但是在后面的观察时间中仍发现了凝集沉降现象。
表1
Figure BDA0003122378080000101
表2为实施例与对照组在不同时间段的定标曲线数据。根据表2数据可知，实施例在12个月的时间内，定标曲线数据未发生明显变化，而对照组在制备完成的1个月或2个月后，开始出现高浓度的抗原对应的吸光度在持续的下降，且随着时间的延长。即说明凝集沉降的胶乳试剂，即使重新重悬之后，仍然有部分抗体-微球偶联物无法与抗原结合，从而导致试剂的线性范围缩小。
表2
Figure BDA0003122378080000102
Figure BDA0003122378080000111
表3为实施例与对照组在不同时间段的试剂空白数据。根据表3的数据可知，在12个月的时间内，实施例的试剂空白吸光度均无明显变化，但对照组在1个月或2个月后的试剂空白开始出现持续上升的情况。数据见图1～3。
表3
Figure BDA0003122378080000121
表4为实施例与对照组在不同时间段的重复性数据。
表4
Figure BDA0003122378080000122
根据表4的数据可知，在12个月的时间内，实施例的CV无明显变化，均未超过10％。但对照组在1个月或2个月后的CV出现持续升高的趋势，即随着时间的延长，随着对照组的凝集沉降现象越来越严重时，对照组试剂的重复性在持续变差。

Claims (10)

1.一种胶乳免疫比浊第二试剂，其特征在于，其包含0.05～5％(w/v)胆碱类物质。
2.如权利要求1所述的胶乳免疫比浊第二试剂，其特征在于，
所述胆碱类物质为胆碱的2号碳上的氢键或羟基上的氢键被化学基团替代而获得的胆碱衍生物，优选包括磷酸胆碱、L-α-甘油磷酸胆碱、L-α-磷脂酰胆碱、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵、琥珀酰左旋肉碱锂盐、(S)-(-)-(3-氯-2-羟丙基)三甲基氯化铵、戊酰左旋肉碱、聚乙二醇-磷酸胆碱、聚磷酸胆碱乙二醇丙烯酸酯、biolipidure103、biolipidure203、biolipidure206、biolipidure405、biolipidure406和biolipidure1002中的一种或几种；
和/或，所述胶乳免疫比浊第二试剂还包含连接抗体的胶乳微球，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，优选包括血清淀粉样蛋白A抗体、尿转铁蛋白抗体、生长刺激因子表达蛋白2抗体、降钙素原抗体、肝素结合蛋白抗体、视黄醇结合蛋白抗体、C反应蛋白抗体、α1-微球蛋白抗体、β2-微球蛋白抗体、中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白抗体、胃蛋白酶原I抗体、胃蛋白酶原II抗体、载脂蛋白E抗体和涎液化糖链抗原抗体中的一种或多种。
3.如权利要求2所述的胶乳免疫比浊第二试剂，其特征在于，所述胶乳微球包括羧基微球，所述羧基微球粒径为50-450nm；和/或，
所述胆碱类物质包括biolipidure103、biolipidure405、戊酰左旋肉碱、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵和琥珀酰左旋肉碱锂盐中的一种或几种；和/或，
所述抗体包括载脂蛋白E抗体、中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白抗体和尿转铁蛋白抗体。
4.如权利要求3所述的胶乳免疫比浊第二试剂，其特征在于，所述第二试剂还包含pH为4-10的缓冲液，所述缓冲液优选N,N-二(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸盐缓冲液、N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液或N-(2-羟乙基)哌嚓-N/-(2-乙磺酸)缓冲液。
5.如权利要求4所述的胶乳免疫比浊第二试剂，其特征在于，所述缓冲液为N,N-二(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸盐缓冲液，所述胶乳微球为羧基微球，所述抗体为载脂蛋白E抗体，所述胆碱类物质为biolipidure103；其中，所述biolipidure103的质量体积比优选0.5～2％，更优选1％；所述N,N-二(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸盐缓冲液浓度优选20～70mmol/L，更优选50mmol/L；pH优选7～8，更优选7.2；所述羧基微球粒径优选80-100nm，或，
所述缓冲液为N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液，所述抗体为中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白抗体，所述胶乳微球为羧基微球，所述胆碱类物质为戊酰左旋肉碱和甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵；其中，所述戊酰左旋肉碱的质量体积比优选0.05～1％，更优选0.75％；所述甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵的质量体积比优选0.1～1％，更优选0.6％；所述N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液的浓度优选50～80mmol/L，更优选70mmol/L，pH优选7～9，更优选8.5；所述羧基微球粒径优选180～250nm，或，
所述缓冲液为N-(2-羟乙基)哌嚓-N/-(2-乙磺酸)缓冲液，所述胶乳微球为羧基微球，所述抗体为尿转铁蛋白抗体，所述胆碱类物质为琥珀酰左旋肉碱锂盐和biolipidure405；其中，所述琥珀酰左旋肉碱锂盐的质量体积比选0.7-2％，更优选1.5％；所述biolipidure405的质量体积比优选0.05-1％，更优选0.7％；所述N-(2-羟乙基)哌嚓-N/-(2-乙磺酸)缓冲液的浓度优选70～120mmol/L，更优选90mmol/L，pH优选7～8，更优选7.5；所述羧基微球粒径优选60～400nm。
6.一种组合，其特征在于，其含有如权利要求1～5任一项所述的胶乳免疫比浊第二试剂。
7.如权利要求6所述的组合，其特征在于，所述组合为溶液形式，所述组合优选还包含第一试剂；或，
所述组合为试剂盒形式，所述组合优选还含有独立地第一试剂；
所述第一试剂优选包含磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液或甘氨酸缓冲液。
8.一种制备胶乳免疫比浊试剂的第二试剂的方法，其特征在于，包含以下步骤：
将连接抗体的胶乳微球与胆碱类物质的溶液混合，所述胆碱类物质在所述第二试剂中的浓度为0.05～5％(w/v)；其中，
较佳地，所述胆碱类物质为胆碱的2号碳上的氢键或羟基上的氢键被化学基团替代而获得的胆碱衍生物；优选包括磷酸胆碱、L-α-甘油磷酸胆碱、L-α-磷脂酰胆碱、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵、琥珀酰左旋肉碱锂盐、(S)-(-)-(3-氯-2-羟丙基)三甲基氯化铵、戊酰左旋肉碱、聚乙二醇-磷酸胆碱、聚磷酸胆碱乙二醇丙烯酸酯、biolipidure103、biolipidure203、biolipidure206、biolipidure405、biolipidure406和biolipidure1002中的一种或几种；更优选包括biolipidure103、biolipidure405、戊酰左旋肉碱、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵和琥珀酰左旋肉碱锂盐中的一种或几种；
和/或，较佳地，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体；优选包括血清淀粉样蛋白A抗体、尿转铁蛋白抗体、生长刺激因子表达蛋白2抗体、降钙素原抗体、肝素结合蛋白抗体、视黄醇结合蛋白抗体、C反应蛋白抗体、α1-微球蛋白抗体、β2-微球蛋白抗体、中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白抗体、胃蛋白酶原I抗体、胃蛋白酶原II抗体、载脂蛋白E抗体和涎液化糖链抗原抗体；更优选包括载脂蛋白E抗体、中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白抗体和尿转铁蛋白抗体。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述连接抗体的胶乳微球通过以下步骤制备：
a.将缓冲液1、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和所述胶乳微球混合，离心；
所述缓冲液1较佳地为2-吗啉乙磺酸缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液或二(2-羟乙基)亚氨基Tris(羟甲基)甲烷缓冲液；
所述胶乳微球较佳地为羧基微球，所述羧基微球的粒径较佳地为50-450nm，所述混合较佳地为按体积比5：(0.01～0.03)：(0.01～0.04)：1混合，
b.向步骤a所得沉淀中加入缓冲液1进行重悬后加入所述抗体，离心；
所述缓冲液与抗体的体积比较佳地为5：(0.08～0.12)，
和/或，
所述胆碱类物质的溶液通过以下步骤制备：
向缓冲液中加入所述胆碱类物质，所述缓冲液为N,N-二(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸盐缓冲液、N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液或N-(2-羟乙基)哌嚓-N/-(2-乙磺酸)缓冲液。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述缓冲液1为2-吗啉乙磺酸缓冲液，所述缓冲液为N,N-二(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸盐缓冲液，所述胶乳微球为羧基微球，所述抗体为载脂蛋白E抗体，所述胆碱类物质为biolipidure103；其中，所述biolipidure103的质量体积比优选0.5～2％，更优选1％；所述N,N-二(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸盐缓冲液浓度优选20～70mmol/L，更优选50mmol/L；pH优选7～8，更优选7.2；所述羧基微球粒径优选80-100nm，或，
所述缓冲液1为3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液，所述缓冲液为N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液，所述抗体为中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白抗体，所述胶乳微球为羧基微球，所述胆碱类物质为戊酰左旋肉碱和甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵；其中，所述戊酰左旋肉碱的质量体积比优选0.05～1％，更优选0.75％；所述甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵的质量体积比优选0.1～1％，更优选0.6％；所述N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液的浓度优选50～80mmol/L，更优选70mmol/L，pH优选7～9，更优选8.5；所述羧基微球粒径优选180～250nm，或，
所述缓冲液1为3-吗啉丙磺酸缓冲液和二(2-羟乙基)亚氨基Tris(羟甲基)甲烷缓冲液，所述缓冲液为N-(2-羟乙基)哌嚓-N/-(2-乙磺酸)缓冲液，所述胶乳微球为羧基微球，所述抗体为尿转铁蛋白抗体，所述胆碱类物质为琥珀酰左旋肉碱锂盐和biolipidure405；其中，所述琥珀酰左旋肉碱锂盐的质量体积比优选0.7-2％，更优选1.5％；所述biolipidure405的质量体积比优选0.05-1％，更优选0.7％；所述N-(2-羟乙基)哌嚓-N/-(2-乙磺酸)缓冲液的浓度优选70～120mmol/L，更优选90mmol/L，pH优选7～8，更优选7.5；所述羧基微球粒径优选60～400nm。
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