CN111929439B - 一种快速诊断蜜蜂丝状病毒试纸及其应用 - Google Patents
一种快速诊断蜜蜂丝状病毒试纸及其应用 Download PDFInfo
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- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
-
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Abstract
本发明提供了一种蜜蜂丝状病毒抗体胶体金快速检测试剂条，包括支撑层，以及在所述支撑层上依次设置的加样垫、金标抗体释放垫、检测层和吸收层，所述金标抗体释放垫包埋有胶体金标记的抗蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白的鼠源多克隆抗体；所述检测层上设置有检测带和质控带，所述检测带固定有抗蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白的兔源多克隆抗体，所述质控带固定有蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白抗原。本发明的试纸条特异性强，极大的降低了出现假阳性的概率，保证了试纸条特异性和灵敏度；安全性高，避免检测过程中复杂的病毒处理操作；操作简便快捷，本发明不需要专业的技术人员进行操作和专业仪器的辅助检测，检测结果直观易判定并且检测时间只需20min极为迅速。
Description
技术领域
本发明属于兽医生物技术领域，涉及胶体金以及金标抗体复合物，尤其涉及蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白抗体的检测试纸条，同时还涉及该试纸条的制备方法以及应用。
背景技术
蜜蜂丝状病毒（Apismellifera filamentous virus，AmFV），最初被误认为是蜜蜂立克次氏体病，随着后来进一步的研究发现它是一个大的囊膜双链DNA (dsDNA)病毒。其丝状核蛋白折叠成三个重叠的“8”环状，形成一个450 nm×170 nm的病毒粒子。由于蜜蜂丝状病毒（AmFV）具有基因组大、隐性感染、流行广泛等特点，近年来逐渐受到各国科学家的关注。但该病毒的研究进展缓慢，2015年才完成第一株（瑞士株）基因组的测序工作。病毒蛋白主要包括核衣壳蛋白和囊膜蛋白。
AmFV感染的一个主要诊断特征是，严重感染的成年蜜蜂的血淋巴由于细胞降解和大量病毒粒子的存在而变成奶白色。AmFV已在美国、英国、瑞士、法国、墨西哥、叙利亚、非洲、中国等地区的意大利蜜蜂及中国地区的中华蜜蜂中被报道，并都具有较高的流行率。另有报道称蜜蜂丝状病毒在中国意大利蜜蜂的流行率（90%）明显高于在中华蜜蜂中的流行率（52%）。分子诊断表明，AmFV病毒在蜜蜂蜂群中是广泛存在的，既可以通过食物交换进行水平传播，又可以通过蜂王到子代工蜂的垂直传播。目前，对于AmFV的检测主要是通过对蜜蜂血淋巴样品的电子显微镜检查和聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR）。这些方法存在一些较难克服的缺点，例如：PCR法需要若干个试剂、且需要特殊的仪器，检测步骤较为繁琐，检测所需的时间较长，而显微镜检测过程中还需其它设备与仪器，并且对于在实地情况下的蜂农来说，对技术要求也是一个重要的难题，整体所需的花费也较高。因此迫切需要建立一种省时省力又可以迅速普及的检测方法。因此，开发建立一种可以对蜜蜂丝状病毒抗体检测快速有效的方法是十分必要的。目前没有任何关于蜜蜂丝状病毒的抗体检测法，而免疫胶体金技术是20 世纪80 年代继荧光标记、放射性同位素标记和酶标记三大标记技术后发展起来的固相标记免疫测定技术，目前已广泛应用于临床诊断, 尤其是在医学、兽医学临床检验中已广泛应用，具有费用低、灵敏度高、检测速度快、使用便捷和易于普及等特点。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种蜜蜂丝状病毒（AmFV）抗体胶体金快速检测试纸条。
本发明提供的检测纸条，其包括支撑层，以及在所述支撑层上依次设置的加样垫、金标抗体释放垫、检测层和吸收层，所述金标抗体释放垫包埋有胶体金标记的抗蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白的鼠源多克隆抗体；所述检测层上设置有检测带和质控带，所述检测带固定有抗蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白的兔源多克隆抗体，所述质控带固定有蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白。所述蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白序列如序列表中序列2所示。
所述蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白是将序列表中序列1所示的核苷酸片段插入到表达载体中表达后纯化得到所述蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白白；所述表达载体优选为PET-28a载体。
其中，所述的支撑层优选为聚乙烯纤维板，更优选为聚氯乙烯板（Polyvinylchlorid PVC 板），其中，所述的加样垫优选为中速定性滤纸。
其中，所述的金标抗体释放垫优选为玻璃纤维素膜，更优选为Rapid27（美国Whatman）的玻璃纤维素膜。
其中，所述的检测层优选为硝酸纤维素膜，更优选为FF85 系列（美国Whatman）的硝酸纤维素膜。
其中，所述的吸收层优选为玻璃纤维，更优选为玻璃纤维CF4（美国Whatman）。
本发明还提供一种制备所述检测试纸条的方法，其包括如下步骤：
1）在检测层的不同位置上分别固定抗蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白PIF2的兔源多克隆抗体以及蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白，形成检测带和质控带；
2）制备金标抗体释放垫；
3）组装支撑层、加样垫、金标抗体释放垫、检测层和吸收层。
其中，制备金标抗体释放垫包括如下步骤：以1:100~3000的标记比例将待标记的抗蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白PIF2的鼠源多克隆抗体加入到pH7.0~10.0 胶体金溶液中，按1:10~500 的比例用含0.1~5%BSA 的0.001~0.1mol/L 磷酸盐缓冲液（PB）稀释胶体金标记的抗蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白的鼠源多克隆抗体，将稀释后的胶体金标记的抗蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白的鼠源多克隆抗体液按60μL/cm2的速度喷于玻璃纤维素膜中，4℃低温真空干燥。
其中，将包被浓度为0.1~1mg/mL，优选为0.2~0.8mg/mL，更优选为0.5mg/mL 的抗蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白的兔源多克隆抗体按1μL/cm 的速度喷于检测层上作为检测带，将包被浓度为0.1~5mg/mL，优选为0.5~2mg/mL，更优选为1mg/mL 的蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白按1μL/cm 的速度喷于检测带下方的检测层上作为质控带，37℃下干燥30min，从而制备检测层。
与传统的PCR等方法相比，本方明的试纸条具有明显的优越性：特异性强，使用原核表达病毒囊膜蛋白，极大的降低了出现假阳性的概率，保证了试纸条特异性和灵敏度；安全性高，避免检测过程中病毒的操作；操作简便快捷，本发明不需要专业的技术人员进行操作和专业仪器的辅助检测，检测结果直观易判定并且检测时间只需10min 极为迅速。
附图说明
图1为蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白抗体胶体金快速检测试纸条的结构示意图。其中，1为加样垫，2为胶体金标记的金标抗原释放垫，3为质控带，抗原层，4为吸收层，5为检测带，多抗层，6为支撑层。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
实施例1、蜜蜂蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白抗体胶体金快速检测试纸条的制备
如图1所示，本发明的蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白抗体胶体金快速检测试纸条，包括支撑层6，以及在所述支撑层上依次设置的加样垫1、金标抗原释放垫2、检测层和吸收层4；
其中，所述金标抗体释放垫包埋有胶体金标记的抗蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白的鼠源多克隆抗体；所述检测层上设置有检测带5和质控带3，所述检测带固定有抗蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白的兔源多克隆抗体，所述质控带固定有蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白。
蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白抗体胶体金快速检测试纸条按照下述方法制备：
一、蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白的表达与纯化
所述蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白按照下述方法获得：根据蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白PIF2的核苷酸序列为基础，采用Primer 5.0软件设计了扩增引物，其上下游引物分别为：F： 5’GCGGATCCGGGTTCTCGCGCGACATGTACTCG'，R：5’CCCAAGCTTCGCGACAGGCGAGAACACGCCGACCTTCTG3'，其扩增产物大小为1008 bp。然后根据已检测的蜜蜂丝状病毒阳性样品，采用RNA提取试剂盒Trizol提取总RNA，按反转录试剂盒步骤，采用M-MLV 反转录酶合成cDNA。为了得到1008bp大小的产物，将适量的GoTaq反应液，1uM的上、下游，1uL的cDNA，及无核酸酶的蒸馏水使其达到总体积为20uL。其PCR条件为，在 95°C 孵育预变性1 min, 其相应的循环参数为94 °C下变性30 s, 55 °C下退火30 s， 72 °C下延伸1 min，33个循环; 随后在72 °C 下终延伸10 min, 于4°C下冷却。紧接着将PCR产物在1%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，证实与目标大小一致。用DNA凝胶回收与纯化试剂盒对目的片段进行回收纯化。其主要步骤如下：用洁净的刀片切取含有目的基因片段的琼脂糖凝胶放入到1.5mL的离心管中，加入3倍体积的胶块融化液，使胶块完全融化。将融化的溶液移至吸附柱上，在12000转下离心2分钟，弃滤液重复上述步骤。最后用洗脱缓冲液将目标DNA洗脱，并收集于管中，-20°C保存。
产物的连接、转化与质粒鉴定。按照PET-28a载体试剂盒说明书操作，将蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白PIF2基因与载体连接，16°C连接16小时，构建重组蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白PIF2质粒。将10uL连接产物加入感受态细胞管中，冰浴30分钟，42°C水浴热激90秒后，立即冰浴10分钟。将其加入到LB培养基中，于37°C、170转摇床下，摇1个小时，将其涂于平板中过夜。挑取单菌落后，采用PCR进行鉴定质粒。将接种的菌液加入1M IPTG于18°C下过夜诱导，取菌液沉淀并加入裂解缓冲液，经离心、搅拌、过滤洗脱等，采用GE镍柱纯化系统按相应参数进行纯化，进而得到纯化的囊膜蛋白PIF2。
二、蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白PIF2抗体制备
1、抗蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白PIF2的兔源多克隆抗体制备
动物免疫：采用新西兰大白兔作为免疫动物，免疫浓度为1mg·ml－1蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白PIF2。将新西兰兔子饲养数周后接种免疫，首次免疫用1ml完全弗氏佐剂乳化，加强免疫用1ml不完全弗氏佐剂乳化。每次免疫间隔3-4周，一共免疫5次，最后一次不加佐剂直接肌肉注射，最后一次免疫7-10d 后采血检测，测定血清效价后，颈动脉放血，收集血清。
采用饱和硫酸胺盐法 (SAS) 和DEME纤维素离子交换层析法纯化抗血清，得到纯化的蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白PIF2兔源多克隆抗体。
2、蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白PIF2的鼠源多克隆抗体制备
动物免疫：采用小鼠作为免疫动物，免疫浓度为1mg·ml－1蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白PIF2。将小鼠饲养数周后接种免疫，首次免疫用1ml完全弗氏佐剂乳化，加强免疫用1ml不完全弗氏佐剂乳化。以纯化获得的蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白PIF2与佐剂等体积混合，冰浴超声乳化后，皮下多点注射4-6周龄的Balb/C小鼠4只，每只小鼠50微克抗原蛋白。每次免疫间隔3-4周，一共免疫5次，最后一次不加佐剂直接肌肉注射，最后一次免疫7-10d 后采血检测，测定血清效价后，颈动脉放血，收集血清。
采用饱和硫酸胺盐法 (SAS) 和DEME纤维素离子交换层析法纯化抗血清，得到纯化的蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白PIF2兔多克隆抗体。
三、蜜蜂丝状病毒胶体金快速检测试纸条的制备
1、胶体金标记的抗蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白的鼠源多克隆抗体的制备
以柠檬酸钠还原法制备金溶液：在50ml 沸腾的0.04% 氯金酸水溶液中加入2ml的1.5% 柠檬酸三钠溶液，继续搅拌加热直至溶液呈稳定而透亮的红色。在透射电镜下观察胶体金溶液，发现胶体金颗粒其大小均一，无椭圆形或者其他不规则形状，说明已获得了稳定胶体金。
以0.1mol/L 的K2CO3调节胶体金pH 值在7~10 之间，以1:1000~2000 的标记比例将待标记的抗蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白的鼠源多克隆抗体加入到调节好pH 值的胶体金溶液中，静置10min 后，加入20% 聚乙二醇（PEG）10000 至最终浓度为0.05%，4℃下2000r/min离心20min，除去未结合的胶体金颗粒，4℃下15000r/min 离心40min 后弃去上清获得胶体金标记好的鼠源多克隆抗体，用丙烯葡聚糖S-400 层析柱分离纯化后4℃下短期保存。
2、抗蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白的鼠源多克隆抗体胶体金快速检测试纸条的制备
如图1所示，发明设计的试纸条基本结构为支撑层6、加样垫1、检测层与吸收层4。将各层按以下顺序粘贴：将检测层粘贴在支撑层上；将加样垫1粘在金标抗体释放垫2上组成加样层，由胶体金标记的鼠源多克隆抗体释放垫连接在靠近检测层的检测带5一端，边缘附在检测层上，定义为始端；把吸收层粘贴在检测层上靠近质控带3的一侧，定义为末端。
1）将GF/C 滤纸、中速定性滤纸和GF-9 型滤纸三种滤纸折叠成漏斗状置于10mL小烧杯中，把离心后的空白蜜蜂血淋巴1mL滴入滤纸中央，通过比较其各自的过滤速度及过滤后血淋巴的澄清度后发现，中速定性滤纸的过滤速度最快，且澄清度与其余两支相近。选择中速定性滤纸作为加样层的加样垫材料。
2）NC 膜的三种备选材料为FF85（美国Whatman）、AE100( 美国Whatman) 和Vivid170( 美国PALL)。经不断摸索后发现，FF85 系列的流速适中满足本发明需求而被选用选定囊膜蛋白三个包被浓度为0.5、1和2 mg/mL，选定抗囊膜蛋白的兔源多克隆抗体的三个包被浓度为0.2、0.5和1 mg/mL。用喷膜机按1μL/cm 的速度将两种蛋白喷于硝酸纤维素膜上，通过交叉试验，结果显示：囊膜蛋白的包被浓度为0.5mg/ml、其多克隆抗体的包被浓度为1mg/ml 时，在FF85 上红色印记最明显。
3）将0.01mol/L PB（含1%BSA）稀释1:200 倍的胶体金标记的鼠源多克隆抗体分别滴加在Glass24（美国Whatman）、Glass33（美国Whatman)、Rapid27（美国Whatman）和Ahlstrom8964（芬兰Ahlstrom）四种释放垫备选材料上，37℃下烘干1h 后，粘贴在标记好检测带和质控带的NC 膜上，滴加100μL生理盐水在释放垫上比较其金标抗体的释放速度，结果发现使用Rapid27 质控带在7min35sed 时显色，其它的显色时间均大于8min，因此优选Rapid27 作为释放垫的材料。
用0.01mol/L PB（含1%BSA）稀释1:100、1:200、1:300 和1:400 倍的胶体金标记的鼠源多克隆抗体滴加在Rapid27，按60μL/cm2的体积均匀喷于金标垫上，37℃下烘干1h 后，粘贴在标记好检测线和质控线的NC 膜上，滴加100μL 生理盐水在释放垫上比较其质控线的显色深浅。结果如下表1：
表1
| 浓度 | 1:250 | 1:1000 | 1:4000 | 1:16000 |
| 显色 | + | ++ | +++ | ++ |
注：+的多少表示颜色的深浅程度。
上述最优条件制备得到蜜蜂丝状病毒抗体胶体金快速检测试纸条。
实施例2、蜜蜂丝状病毒抗体胶体金快速检测试纸条的使用方法和效果实验
一、蜜蜂丝状病毒抗体胶体金快速检测试纸条的使用方法
活蜂抓住，一只手捏住蜂体的两侧腹，另一只手用毛细血管插入蜂体腹部的第三至第四节，收集蜜蜂血淋巴约20 ul，将其滴到检测试剂条上。加样垫1即吸取液体向上端移动，流经金标抗体释放垫2时使胶体金标记的鼠源多克隆抗体探针复溶，并带动其向检测层渗移。若标本中有待测病毒囊膜蛋白抗原，其可与胶体金标记的鼠源多克隆抗体探针结合，此复合物流至检测带5即被固相抗病毒囊膜蛋白的兔源多克隆抗体所获，在膜上显出红色反应线条。过剩胶体金标记单克隆抗体探针继续前行，至质控带3与病毒囊膜蛋白结合，而显出红色质控线条。反之，阴性标本则无反应线条，而仅显示质控线条。
二、蜜蜂丝状病毒抗体胶体金快速检测试纸条的效果实验
1、敏感性测试
用实例1最优条件制备的蜜蜂丝状病毒抗体胶体金快速检测试纸条检测100只感染蜜蜂丝状病毒的蜜蜂，100只健康蜜蜂，活蜂抓住，一只手捏住蜂体的两侧腹，另一只手用毛细血管插入蜂体腹部的第三至第四节，收集蜜蜂血淋巴约20 ul，将其滴到检测试剂条上。
同时，按照实施例1中蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白基因的扩增方法检测样品中是否含有AmFV。
结果本发明的试纸条检测与PCR检测结果一致。说明本发明的试纸的敏感性达到100%。
2、检测限测试
将蜜蜂丝状病毒扩繁，提取血淋巴，然后按10，20，30，40，50，60，70，80，90和100倍稀释，用本发明的试纸测试，结果表明能检测到病毒的最多稀释倍数为30。
3、特异性试验
通常情况下，蜜蜂丝状病毒与蜜蜂立克次氏体病在感染症状上比较相似，不容易区分。
使用实施例1制备的试剂盒，检测100只健康蜜蜂、100只感染丝状病毒的蜜蜂、100只患立克次氏体病的蜜蜂。
特异性检测结果如显示，对100份健康蜜蜂和100只患立克次氏体病的蜜蜂的检测结果均显示为阴性，而对100只感染丝状病毒的蜜蜂的检测结果显示特异性为100%。
序列表
<110> 一种快速诊断蜜蜂丝状病毒试纸及其应用
<120> 中国农业科学院蜜蜂研究所
<130> WHOI201063
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1007
<212> DNA
<213> 蜜蜂丝状病毒(Apismellifera filamentous virus)
<400> 1
gggttctcgc gcgacatgta ctcgcgatcc gaggacttga gcagtgcgtt cgttcagccc 60
gggctcaaca tcgacaactt gccggcggtc aagatcgatt acggcgcgta caagccgtcc 120
gaaaatacgg gcgatgagga ggagacgggc ggcaacgatc ccgaagagag catcgccgag 180
cgacgtatcc gttgtcttac gcgtggcgtc taccttggtg agcagaacca gtacgtcaac 240
tgtgtcgact attgtcgcat cagctccgag gaagaggtgc gctacgtgta tctgtcgtcc 300
acgcaacaag tcattgcagg ccgcacgcct ctgtcacccg gcgcgtggtg tttgcccacg 360
gcggcagctt cgtgcaacct caactcggct ttggtcgtgt actcgctgaa cggatggctc 420
tgtataccca agacggacgc gctggtcggt gagggcggga acaaaatcgc ggtgtgcgac 480
ggttcgctct gggacaacgc gctgcaaacc cgctatgacg gcttcattcc cgcgaacctc 540
tactttaacg atttttacga ggacaaactg agcgacgggc gctaccggtt ccaatgtctg 600
cccaacttga aggacgacat caaaaacaag tacttgttct cgccgttcaa tcggttccac 660
ttgttacaga actggtgcgt gcagaacatt ccgtttgcca aggagactag cgtacccgat 720
ttcaagacgg gcaagtgcac gtgcgacccg ccgtacggca gctggataac acacaatgca 780
ccgcgtgtcg cgtgggtttc gacgagcaga cgttcacgtt caacctgcgc gtccagccgt 840
gcttcagcgt ccgcgattac atctcgtttc tgactcgatt acgcaaccag atgtggcccg 900
acgagatcct gcgaccttgc ggtctcgacg agaacgagtc gaccaccgag gaggtgactc 960
gtccgcgctg cgtcgtccag aaggtcggcg tgttctcgcc tgtcgcg 1007
<210> 2
<211> 290
<212> PRT
<213> 蜜蜂丝状病毒(Apismellifera filamentous virus)
<400> 2
Gly Phe Ser Arg Asp Met Tyr Ser Arg Ser Glu Asp Leu Ser Ser Ala
1 5 10 15
Phe Val Gln Pro Gly Leu Asn Ile Asp Asn Leu Pro Ala Val Lys Ile
20 25 30
Asp Tyr Gly Ala Tyr Lys Pro Ser Glu Asn Thr Gly Asp Glu Glu Glu
35 40 45
Thr Gly Gly Asn Asp Pro Glu Glu Ser Ile Ala Glu Arg Arg Ile Arg
50 55 60
Cys Leu Thr Arg Gly Val Tyr Leu Gly Glu Gln Asn Gln Tyr Val Asn
65 70 75 80
Cys Val Asp Tyr Cys Arg Ile Ser Ser Glu Glu Glu Val Arg Tyr Val
85 90 95
Tyr Leu Ser Ser Thr Gln Gln Val Ile Ala Gly Arg Thr Pro Leu Ser
100 105 110
Pro Gly Ala Trp Cys Leu Pro Thr Ala Ala Ala Ser Cys Asn Leu Asn
115 120 125
Ser Ala Leu Val Val Tyr Ser Leu Asn Gly Trp Leu Cys Ile Pro Lys
130 135 140
Thr Asp Ala Leu Val Gly Glu Gly Gly Asn Lys Ile Ala Val Cys Asp
145 150 155 160
Gly Ser Leu Trp Asp Asn Ala Leu Gln Thr Arg Tyr Asp Gly Phe Ile
165 170 175
Pro Ala Asn Leu Tyr Phe Asn Asp Phe Tyr Glu Asp Lys Leu Ser Asp
180 185 190
Gly Arg Tyr Arg Phe Gln Cys Leu Pro Asn Leu Lys Asp Asp Ile Lys
195 200 205
Asn Lys Tyr Leu Phe Ser Pro Phe Asn Arg Phe His Leu Leu Gln Asn
210 215 220
Trp Cys Val Gln Asn Ile Pro Phe Ala Lys Glu Thr Ser Val Pro Asp
225 230 235 240
Phe Lys Thr Gly Lys Cys Thr Cys Asp Pro Pro Tyr Gly Ser Trp Ile
245 250 255
Thr His Asn Ala Pro Arg Val Ala Trp Val Ser Thr Ser Arg Arg Ser
260 265 270
Arg Ser Thr Cys Ala Ser Ser Arg Ala Ser Ala Ser Ala Ile Thr Ser
275 280 285
Arg Phe
290
Claims (10)
1.一种蜜蜂丝状病毒抗体胶体金快速检测试纸条，包括支撑层，以及在所述支撑层上依次设置的加样垫、金标抗体释放垫、检测层和吸收层，其特征在于，所述金标抗体释放垫包埋有胶体金标记的抗蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白的鼠源多克隆抗体；所述检测层上设置有检测带和质控带，所述检测带固定有抗蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白的兔源多克隆抗体，所述质控带固定有蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白；其中，蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白的序列如序列表中序列2所示。
2.如权利要求1 所述的检测试纸条，其特征在于，所述蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白是将序列表中序列1所示的核苷酸片段插入到表达载体中表达后纯化得到所述蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白；所述表达载体为PET-28a载体。
3.如权利要求1 所述的检测试纸条，其特征在于，所述的支撑层为聚氯乙烯板；所述的加样垫为中速定性滤纸；所述的金标抗体释放垫为玻璃纤维素膜。
4.如权利要求1 所述的检测试纸条，其特征在于，所述的检测层为硝酸纤维素膜。
5.如权利要求1 所述的检测试纸条，其特征在于，所述的吸收层为玻璃纤维。
6.一种制备权利要求l-5 任一项所述检测试纸条的方法，其包括如下步骤：
1）在检测层的不同位置上分别固定抗蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白的兔源多克隆抗体以及蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白，形成检测带和质控带；
2）制备金标抗体释放垫；
3）组装支撑层、加样垫、金标抗体释放垫、检测层和吸收层。
7.如权利要求6 所述的方法，其特征在于，制备金标鼠源多克隆抗体释放垫包括如下步骤：以1:1000-3000的标记比例将待标记的抗蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白的鼠源多克隆抗体加入到pH7.0~10.0 胶体金溶液中，按1:10~500 的比例用含0.1~5%BSA 的0.001~0.1mol/L磷酸盐缓冲液稀释胶体金标记的抗蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白的鼠源多克隆抗体，将稀释后的胶体金标记的抗蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白的鼠源多克隆抗体液按100μL/cm2的速度喷于玻璃纤维素膜中，4℃低温真空干燥。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，将包被浓度为0.1~1mg/mL 的抗蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白的兔源多克隆抗体按2μL/cm 的速度喷于检测层上作为检测带，将包被浓度为0.1~5mg/mL的蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白按1μL/cm 的速度喷于检测带下方的检测层上作为质控带，37℃下干燥30min，从而制备检测层。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白的包被浓度为0.5~2mg/mL，抗蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白的兔源多克隆抗体的包被浓度为0.2~0.8 mg/mL，抗蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白的鼠源多克隆抗体的包被浓度为0.2~0.8 mg/mL。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白的包被浓度为1 mg/mL，抗蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白的兔源多克隆抗体的包被浓度为0.5 mg/mL，抗蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白的鼠源多克隆抗体的包被浓度为0.5 mg/mL。
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