CN105002148A - 泽泻3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶抗体制备及检测方法 - Google Patents

泽泻3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶抗体制备及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种泽泻3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶，具有序列表SEQ？ID？No.2的氨基酸序列，或由具有序列表SEQ？ID？No.1的碱基序列的基因所编码。本发明还涉及了上述泽泻3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的原核表达、获得纯化蛋白的方法以及多克隆抗体的制备方法。本发明得到了泽泻3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶并且制备得到了该蛋白的多克隆抗体，以及该蛋白的ELISA？检测方法和Western？blot检测方法，为进一步开展AoHMGR功能分析奠定基础，并为原萜烷型三萜类化合物生物工程应用提供重要依据。

Description

泽泻3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶抗体制备及检测方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及泽泻原萜烷型三萜类化合物生物合成途径中关键酶基因3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶抗体的制备及检测方法。
背景技术
泽泻(Alismatis Rhizoma)为泽泻科植物东方泽泻的干燥块茎，具有利水、渗湿、泄热之功效，道地产区为福建。其主要药效成分为原萜烷型(Protostane)四环三萜类，该类成分具有明显的抗高血脂、降血压、抗HIV1等作用，尤其抗癌活性显著，预示着其广阔的应用开发前景，但其资源分布窄，含量低，仅存在泽泻属等少数植物类群中，不能满足利用需求，生物工程是提高药效成分产量的有效途径之一。
生物合成途径的研究对于改善药用植物的品质至关重要，其中关键酶基因的克隆、表达和调控是目前的研究热点。羟甲基戊二酰CoA还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase,HMGR)HMGR是MVA途径中的重要酶，催化3-羟基-3-甲基戊二酰CoA(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A，HMG-CoA)形成MVA，是MVA途径中的第1个限速酶，也是细胞质萜类代谢中的重要调控位点。近年来，对3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的研究倍受重视，迄今人们已对14个不同物种中的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶进行了研究。有关泽泻三萜类成分生物合成关键酶的研究还未见报道。
发明内容
本发明的第一目的是提供了一种泽泻3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶。
本发明的第二目的是提供上述泽泻3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶原核表达、获得纯化蛋白的方法。
本发明的第三目的是提供上述泽泻3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的多克隆抗体制备和检测方法。
本发明要解决的技术问题是在首次克隆了泽泻AoHMGR基因的全长cDNA，并使用NCBIBlast比对，氨基酸序列与三七(Panax notoginseng)，蓖麻(Ricinus communis)，人参(Panaxginseng)的同源性分别达到70％，69％，68％的基础上，提供一种泽泻原萜烷型三萜类化合物生物合成途径中关键酶基因3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶多克隆抗体制备及快速检测方法，以便用于快速合成和检测3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶抗体，为快速获得四环三萜类化合物提供基础。
本发明通过以下技术方案来实现：
一、一种泽泻3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶，具有序列表SEQ ID No.2的氨基酸序列，或由具有序列表SEQ ID No.1的碱基序列的基因所编码。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：运用同源克隆法和RACE技术克隆泽泻3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因的cDNA全长。
上述运用同源克隆法和RACE技术克隆泽泻3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因的cDNA全长，在前期获得AoHMGR基因保守区片段的基础下克隆AoHMGR全长。采用试剂盒法提取泽泻RNA，以Oligo dT18为引物进行反转录获得cDNA，进行AoHMGR基因保守区片段克隆，以及RACE和全长cDNA扩增。
上述AoHMGR基因保守区片段克隆以及RACE和全长cDNA扩增方法如下，根椐GenBank提供的HMGR同源基因序列，用引物设计软件Primer 5.0设计简并引物HF1和HR2(见表1)。以反转录后的cDNA为模板进行保守区片段的PCR扩增，25μL反应体系：10×PCR缓冲液2.5μL，25mmol/L MgCl21μL，25mmol/L dNTP 1μL，10nmol/L引物各1μL，cDNA模板1μL，5U rTaq酶0.5μL，ddH2O 17μL。反应条件为：94℃预变性5min；94℃30s，58℃30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。将以上获得的PCR扩增产物经1.0％琼脂糖电泳后，割胶，纯化回收，克隆测序，测序由上海生工生物工程有限公司完成。
根据AoHMGR基因保守区片段的测序结果，在其序列内部设计5'RACE和3'RACE特异引物HF2和HR2(见表1)，利用Clontech公司SMARTer TMRACE cDNA AmplificationKit试剂盒扩增该基因的cDNA5'端和3'端。根据5'RACE和3'RACE测序结果拼接得到的全长cDNA设计引物HF3和HR 3(见表1)，进行全长cDNA扩增。RACE和全长cDNA引物由南京金思特公司合成。在50μL反应体系中加入cDNA模板2μL，上下游引物各10nmol·L-1，10×PCR缓冲液5.0μL，2.5mmol·L-1dNTP 1.6μL，25mmol·L-1MgCl21.2μL，2U rTaqDNA聚合酶(TaKaRa公司)进行RT-PCR扩增。95℃，3min；95℃，30s，56℃，60s，72℃，120s，循环30次，再72℃延伸5min。PCR产物克隆及测序等过程同上。
表1实验中引物序列表
将5'RACE和3'RACE扩增片段测序结果与已有保守区片段拼接得到全长cDNA。为了验证全长结果，根据拼接得到的全长序列设计引物,以cDNA为模板,扩增泽泻AoHMGR全长序列并测序，测序结果与拼接结果一致，泽泻AoHMGR基因保守区片段(a)，3’RACE(b)，5’RACE(c)和基因全长(d)扩增结果见图1。
3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶蛋白具有序列表SEQ ID No.1的氨基酸序列，或由具有序列表SEQ ID No.2的碱基序列的基因所编码。
二、一种上述泽泻3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶原核表达、获得纯化蛋白的方法，根据前期获得的AoHMGR基因序列结果，在获得克隆载体pGHn-HMGR的基础上，重新设计引物HF4，HR4(见表1)。50μl反应体系含：10×PCR缓冲液5.0μl，25mmol/L MgCl24.0μl，10mmol/L dNTP 4.0μl，10nmol/L引物各1.0μl，cDNA模板5.0μl，5U rTaq酶0.5μl，ddH2O28.5μl。反应条件为：94℃预变性5min；94℃30s，54℃30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸7min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，纯化回收，克隆测序。将AoHMGR克隆进pCzn1表达载体的KpnI和EcoRI之间，目标基因融合了6X his标签蛋白，获得pCzn1-AoHMGR质粒。结果见图2，3。
进一步的，重组质粒pCzn1-AoHMGR的诱导表达，具体的为将经测序无突变的重组质粒pCzn1-AoHMGR转化大肠杆菌BL21(Roseta)受体菌，筛选阳性重组克隆，置于含有50μg/mLAmp的3ml LB培养基中，37℃振摇过夜，次日稀释100倍，继续培养至OD600nm为0.6-0.8时，取出1mL留作诱导前的对照，向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.2mM，11℃220rpm培养12h，诱导表达，离心，收集菌体沉淀。分别取诱导前菌液，诱导后菌液，诱导后菌液的上清及沉淀作为样品，进行10％SDS-PAGE电泳分析。结果见图4。
进一步的，目的蛋白的纯化方法具体为将诱导表达的培养菌液低温离心10min，菌体沉淀重悬，与20mL细菌裂解缓冲液(20mM Tris-HCl，含1mM苯甲基磺酰氟PMSF，pH 8.0)超声破碎20min，4℃离心20min，收集沉淀，使用包涵体洗涤液(20mM Tris，1mM EDTA，2M尿素，1M NaCl，1％Triton X-100，pH8.0)洗涤包涵体3次，然后用溶解缓冲液(20mM Tris，5mM DTT，8M尿素pH8.0)溶解包涵体，4℃放置过夜后，室温离心15min，将包涵体溶解液滴加到20mM Tris，pH8.0缓冲液逐步成倍梯度稀释，缓慢搅拌，至尿素浓度达到0.5M时，将蛋白溶液装入透析袋，于4℃在20mM PBS，pH7.4中透析过夜。目的蛋白进行10％SDS-PAGE分析。结果见图5。
三、一种上述的泽泻3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的多克隆抗体制备和检测方法，原核表达纯化3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶蛋白并于用免疫家兔制备多克隆抗体。通过ELISA检测纯化抗体的效价，蛋白免疫印迹Western Blot检测纯化抗体的纯度观察。
进一步的，具体的为取纯化后的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶蛋白，采用皮下注射法免疫2-2.5Kg的新西兰白兔，400μg/次，2-3周免疫一次，共免疫4次；采血检测，通过间接ELISA方法确定抗血清针对蛋白的效价，待效价大于1:50,000进行最终采血制备抗血清，纯化得多克隆抗体，并进行Western blot检测。
进一步的，所述的纯化是将蛋白与琼脂糖介质偶联制备成抗原亲和纯化层析柱，将所得抗血清与PBS等量混合后缓慢上样，待抗原抗体结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，即得到所需纯化抗体，立即在PBS中进行4℃透析过夜，隔日进行纯度，浓度和效价测定。
上述纯化抗体浓度测定方法，包括以下步骤：
(1)BCA工作液配制：根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。
(2)根据需要取适量BSA蛋白标准，加入去离子水稀释成1mg/mL(原液5mg/mL)，并混匀。
注意：原则上蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用去离子水、0.9％NaCl或PBS稀释标准品。稀释后的蛋白标准品也可以-20℃长期保存。以下步骤中均默认采用去离子水，可以根据条件选择使用稀释液。
(3)标准曲线绘制：取一块酶标板，按以下表格数据加入试剂：
(此方案工作线性范围为50-1000μg/mL。)
(4)振荡混匀后，37℃放置30min。
(5)用酶标仪测定562nm处的吸光值，以不含BSA的光吸收值为空白对照。
(6)以蛋白含量(μg)为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线。
(7)样品测定：将待测蛋白样品用去离子水稀释至适当浓度，取20μL样品，加入200μL BCA工作液，混匀后37℃放置30min，然后以A号孔为对照，测定样品吸收值A562。
注意：因为BCA法测定时颜色会随着时间的延长不断加深，并且显色反应的速度和温度有关，请注意保持定时和定温，以确保精确定量。
(8)根据测得的吸收值，在标准曲线上即可查得样品的蛋白含量。
(9)计算蛋白浓度：以查得的蛋白含量除以样品体积20μL，再乘以相应的稀释倍数即可得到待测样品的实际浓度。
进一步的，所述的ELISA方法包括以下步骤：
(1)用pH 9.6,0.05mol/L的碳酸盐缓冲液将纯化的抗体稀释为20μg/mL，包被酶标板，每孔100μL，4℃包被过夜；
(2)次日每孔加入100μL 5％的脱脂奶粉，37℃封闭1h后，用pH 7.4的PBST洗涤3次；
(3)然后每孔加入500～51,200倍稀释的兔抗血清100μL，阴性对照为1:50倍稀释的免疫前血清，空白对照为兔抗血清稀释液(PBS)，每份样品均做1平行，37℃孵育1h后，同上洗涤3次；
(4)再次每孔加入100μL HRP标记的羊抗兔IgG，37℃孵育1h后，同上洗涤3次；
(5)每孔加入100μL TMB显色液，37℃避光反应20min后，每孔再加入50μL 2mol/L硫酸终止液；
(6)在酶标仪上测450nm下的OD值；
(7)通过SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色观察纯化抗体的纯度。
进一步的，所述的Western blot检测方法包括以下步骤：
(1)分别取200mg泽泻植物组织样品，剪碎加入适量裂解液(使用前加PMSF)，匀浆器匀浆，充分裂解。取上清10μL加入等体积2X样品缓冲液，每个泳道上样20μL；
(2)上样完毕后，聚丙烯酰胺凝胶先90V跑完积层胶，再将电压升至200V直到电泳结束；
(3)电泳结束后，取下凝胶进行转膜，恒压100V转膜，约为1.5h；
(4)电转结束后，取下膜后先用PBS洗涤4次，每次5min。然后置于5％(m/V)脱脂奶粉封闭液中封闭37℃，1h；
(5)用封闭液稀释一抗，膜在一抗稀释液中37℃反应1h；
(6)洗膜4次，每次5min；用含5％牛奶的封闭液稀释二抗(羊抗兔-HRP)。膜在二抗中37℃反应1h；
(7)洗膜ECL显影。结果见图7。
采用上述技术方案的积极效果：本发明得到了泽泻3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶并且制备得到了该蛋白的多克隆抗体，以及该蛋白的ELISA检测方法和Western blot检测方法，为进一步开展HMGR功能分析奠定基础，并为原萜烷型三萜类化合物生物工程应用提供重要依据。
附图说明
图1是泽泻AoHMGR基因保守区片段，3’RACE(a)，5’RACE(b)和基因全长(c)凝胶电泳图；
图2是泽泻AoHMGR大肠杆菌表达载体示意图；
图3是重组质粒pCzn1-AoHMGR酶切鉴定结果；
图4是泽泻AoHMGR蛋白分析图；
图5是泽泻AoHMGR蛋白纯化分析图；
图6是纯化抗体SDS-PAGE电泳图；
图7是泽泻AoHMGR多克隆抗体的Western blotting鉴定示意图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制：
实施例1
运用同源克隆法和RACE技术克隆泽泻3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因的cDNA全长，多克隆抗体制备方法，原核表达纯化3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶蛋白并于用免疫家兔制备多克隆抗体。
上述运用同源克隆法和RACE技术克隆泽泻3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因的cDNA全长，在前期获得AoHMGR基因保守区片段的基础下克隆AoHMGR全长。采用试剂盒法提取泽泻RNA，以Oligo dT18为引物进行反转录获得cDNA，进行AoHMGR基因保守区片段克隆，以及RACE和全长cDNA扩增。
上述AoHMGR基因保守区片段克隆以及RACE和全长cDNA扩增方法如下，根椐GenBank提供的AoHMGR同源基因序列，用引物设计软件Primer 5.0设计简并引物HF1和HR2(见表1)。以反转录后的cDNA为模板进行保守区片段的PCR扩增，25μL反应体系：10×PCR缓冲液2.5μL，25mmol/L MgCl21μL，25mmol/L dNTP 1μL，10nmol/L引物各1μL，cDNA模板1μL，5U rTaq酶0.5μL，ddH2O 17μL。反应条件为：94℃预变性5min；94℃30s，58℃30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。将以上获得的PCR扩增产物经1.0％琼脂糖电泳后，割胶，纯化回收，克隆测序，测序由上海生工生物工程有限公司完成。
根据AoHMGR基因保守区片段的测序结果，在其序列内部设计5'RACE和3'RACE特异引物HF2和HR2(见表1)，利用Clontech公司SMARTer TMRACE cDNA AmplificationKit试剂盒扩增该基因的cDNA5'端和3'端。根据5'RACE和3'RACE测序结果拼接得到的全长cDNA设计引物HF3和HR 3(见表1)，进行全长cDNA扩增。RACE和全长cDNA引物由南京金思特公司合成。在50μL反应体系中加入cDNA模板2μL，上下游引物各10nmol·L-1，10×PCR缓冲液5.0μL，2.5mmol·L-1dNTP 1.6μL，25mmol·L-1MgCl21.2μL，2U rTaqDNA聚合酶(TaKaRa公司)进行RT-PCR扩增。95℃，3min；95℃，30s，56℃，60s，72℃，120s，循环30次，再72℃延伸5min。PCR产物克隆及测序等过程同上。
表1实验中引物序列表
将5'RACE和3'RACE扩增片段测序结果与已有保守区片段拼接得到全长cDNA。为了验证全长结果，根据拼接得到的全长序列设计引物,以cDNA为模板,扩增泽泻AoHMGR全长序列并测序，测序结果与拼接结果一致，泽泻AoHMGR基因保守区片段(a)，3’RACE(b)，5’RACE(c)和基因全长(d)扩增结果见图1。
3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶蛋白具有序列表SEQ ID No.1的氨基酸序列，或由具有序列表SEQ ID No.2的碱基序列的基因所编码。
实施例2
纯化是将蛋白与琼脂糖介质偶联制备成抗原亲和纯化层析柱，将所得抗血清与PBS等量混合后缓慢上样，待抗原抗体结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，即得到所需纯化抗体，立即在PBS中进行4℃透析过夜，隔日进行纯度，浓度和效价测定。
上述纯化抗体浓度测定方法，包括以下步骤：
(1)BCA工作液配制：根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。
(2)根据需要取适量BSA蛋白标准，加入去离子水稀释成1mg/mL(原液5mg/mL)，并混匀。
注意：原则上蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用去离子水、0.9％NaCl或PBS稀释标准品。稀释后的蛋白标准品也可以-20℃长期保存。以下步骤中均默认采用去离子水，可以根据条件选择使用稀释液。
(3)标准曲线绘制：取一块酶标板，按以下表格数据加入试剂：
(此方案工作线性范围为50-1000μg/mL。)
(4)振荡混匀后，37℃放置30min。
(5)用酶标仪测定562nm处的吸光值，以不含BSA的光吸收值为空白对照。
(6)以蛋白含量(μg)为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线。
(7)样品测定：将待测蛋白样品用去离子水稀释至适当浓度，取20μL样品，加入200μL BCA工作液，混匀后37℃放置30min，然后以A号孔为对照，测定样品吸收值A562。
注意：因为BCA法测定时颜色会随着时间的延长不断加深，并且显色反应的速度和温度有关，请注意保持定时和定温，以确保精确定量。
(8)根据测得的吸收值，在标准曲线上即可查得样品的蛋白含量。
(9)计算蛋白浓度：以查得的蛋白含量除以样品体积20μL，再乘以相应的稀释倍数即可得到待测样品的实际浓度。
实施例3
取纯化后的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶蛋白，采用皮下注射法免疫2-2.5Kg的新西兰白兔，400μg/次，2-3周免疫一次，共免疫4次；采血检测，通过间接ELISA方法确定抗血清针对蛋白的效价，待效价大于1:50,000进行最终采血制备抗血清，纯化得多克隆抗体。
实施例4
ELISA方法包括以下步骤：
(1)用pH 9.6,0.05mol/L的碳酸盐缓冲液将纯化的抗体稀释为20μg/mL，包被酶标板，每孔100μL，4℃包被过夜；
(2)次日每孔加入100μL 5％的脱脂奶粉，37℃封闭1h后，用pH 7.4的PBST洗涤3次；
(3)然后每孔加入500～51,200倍稀释的兔抗血清100μL，阴性对照为1:50倍稀释的免疫前血清，空白对照为兔抗血清稀释液(PBS)，每份样品均做1平行，37℃孵育1h后，同上洗涤3次；
(4)再次每孔加入100μL HRP标记的羊抗兔IgG，37℃孵育1h后，同上洗涤3次；
(5)每孔加入100μL TMB显色液，37℃避光反应20min后，每孔再加入50μL 2mol/L硫酸终止液；
(6)在酶标仪上测450nm下的OD值；
(7)通过SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色观察纯化抗体的纯度。
实施例5
Western blot检测方法包括以下步骤：
(1)分别取200mg泽泻植物组织样品，剪碎加入适量裂解液(使用前加PMSF)，匀浆器匀浆，充分裂解。取上清10μL加入等体积2X样品缓冲液，每个泳道上样20μL；
(2)上样完毕后，聚丙烯酰胺凝胶先90V跑完积层胶，再将电压升至200V直到电泳结束；
(3)电泳结束后，取下凝胶进行转膜，恒压100V转膜，约为1.5h；
(4)电转结束后，取下膜后先用PBS洗涤4次，每次5min。然后置于5％(m/V)脱脂奶粉封闭液中封闭37℃，1h；
(5)用封闭液稀释一抗，膜在一抗稀释液中37℃反应1h；
(6)洗膜4次，每次5min；用含5％牛奶的封闭液稀释二抗(羊抗兔-HRP)。膜在二抗中37℃反应1h；
(7)洗膜ECL显影。
本发明得到了泽泻3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶并且制备得到了该蛋白的多克隆抗体，以及该蛋白的ELISA检测方法和Western blot检测方法，为进一步开展AoHMGR功能分析奠定基础，并为原萜烷型三萜类化合物生物工程应用提供重要依据。
                         序列表
 
<110>  南京中医药大学
 
<120>  泽泻3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶抗体制备及检测方法
 
<130>  xb15080601
 
<160>  31   
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  2252
<212>  DNA
<213>  Artificial
 
<220>
<223>  泽泻3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因
 
 
<220>
<221>  CDS
<222>  (89)..(1897)
 
<400>  1
ctgcgcgggt gccgtcaccc ttcgccatcc ctctgctgca ctcgagacgg ttcctagcct     60
 
cctttccggc gcgtctctgg ggcggcca tgg acg tcc gtc gtc ggc ccg tga       112
                               Trp Thr Ser Val Val Gly Pro             
                               1               5                       
 
atc tcc ttc ctg cag atg aca ccg cca agc ccg aga aga agc tgc ctg      160
Ile Ser Phe Leu Gln Met Thr Pro Pro Ser Pro Arg Arg Ser Cys Leu         
        10                  15                  20                     
 
ccg cct cgc ggc cgg tgc agg cgt cag acg cgc ttc ctc tgc caa tca      208
Pro Pro Arg Gly Arg Cys Arg Arg Gln Thr Arg Phe Leu Cys Gln Ser        
    25                  30                  35                         
 
gat aca cca att ggt tct tct cgt tag tct tct tcg tgg cgt gct act      256
Asp Thr Pro Ile Gly Ser Ser Arg     Ser Ser Ser Trp Arg Ala Thr        
40                  45                      50                         
 
ttt tga tgg tgc ggt ggc ggg aga agg ttc gat ctt cct cgc cgc tgc      304
Phe     Trp Cys Gly Gly Gly Arg Arg Phe Asp Leu Pro Arg Arg Cys        
55                      60                  65                         
 
acc tcc tgt cct tct ctg aga tct tgg gag tgg ttg ccc ttg tcg cct      352
Thr Ser Cys Pro Ser Leu Arg Ser Trp Glu Trp Leu Pro Leu Ser Pro        
70                  75                  80                  85         
 
cgt tca cgt acc tcc tca att tct tcg gaa tcg gca tca tac agt cat      400
Arg Ser Arg Thr Ser Ser Ile Ser Ser Glu Ser Ala Ser Tyr Ser His        
                90                  95                  100            
 
tcc tcc cgc gtg gcg cgg acg acg act tca ttt ccg ggg aag atg tcg      448
Ser Ser Arg Val Ala Arg Thr Thr Thr Ser Phe Pro Gly Lys Met Ser        
            105                 110                 115                
 
gca atg acg ttg gaa cta tga atc aca aac cgc gaa tcc atc ctc gtc      496
Ala Met Thr Leu Glu Leu     Ile Thr Asn Arg Glu Ser Ile Leu Val        
        120                     125                 130                
 
ccg tct ctg att ctc tcc tcc cac cgg tgt cca agg cgg ctg ccg ccg      544
Pro Ser Leu Ile Leu Ser Ser His Arg Cys Pro Arg Arg Leu Pro Pro        
        135                 140                 145                    
 
acg atc tgc cgc ctt tgt gcc ctc cat tta tgc cca atg cta tcg ccc      592
Thr Ile Cys Arg Leu Cys Ala Leu His Leu Cys Pro Met Leu Ser Pro         
    150                 155                 160                        
 
ctc gcc cgc ctt tgc ccc cgg tca agt cgg tcg atc cca tca tcc tct      640
Leu Ala Arg Leu Cys Pro Arg Ser Ser Arg Ser Ile Pro Ser Ser Ser        
165                 170                 175                 180        
 
cat ctg acg acg agg aaa tcg tca gat ctg tcg ttg atg gga ccg tgc      688
His Leu Thr Thr Arg Lys Ser Ser Asp Leu Ser Leu Met Gly Pro Cys        
                185                 190                 195            
 
cat cgt att ccc ttg agt cca agc tcg ggg att gcc ggc ggg cgg ctg      736
His Arg Ile Pro Leu Ser Pro Ser Ser Gly Ile Ala Gly Gly Arg Leu        
            200                 205                 210                
 
cag ttc ggc gag agg cgc tga gaa gga tga ctg gga ggt cac tgg acg      784
Gln Phe Gly Glu Arg Arg     Glu Gly     Leu Gly Gly His Trp Thr        
        215                     220                     225            
 
ggc tgc cgc tgg aag ggt tcg act acg act cta tcc tgg gcc aat gct      832
Gly Cys Arg Trp Lys Gly Ser Thr Thr Thr Leu Ser Trp Ala Asn Ala        
            230                 235                 240                
 
gcg aga tgc cta tcg ggt atg tga ctc tgc ccg ttg gga ttg ccg gcc      880
Ala Arg Cys Leu Ser Gly Met     Leu Cys Pro Leu Gly Leu Pro Ala        
        245                     250                 255                
 
cac tgc tgc tag acg gaa aat gct act atg tgc cca tgg caa cta cgg      928
His Cys Cys     Thr Glu Asn Ala Thr Met Cys Pro Trp Gln Leu Arg        
        260                     265                 270                
 
agg ggt gcc ttg ttg cca gca cta ata ggg gtt gca aag cca tta ggg      976
Arg Gly Ala Leu Leu Pro Ala Leu Ile Gly Val Ala Lys Pro Leu Gly        
        275                 280                 285                    
 
att ctg gcg gtg cag aga gcg tca tat tcc ggg acg gaa tga cca ggg     1024
Ile Leu Ala Val Gln Arg Ala Ser Tyr Ser Gly Thr Glu     Pro Gly        
    290                 295                 300                        
 
cac cgg ctg tta ggt ttg att cag cca aga ggg ctg cgc aac tga agt     1072
His Arg Leu Leu Gly Leu Ile Gln Pro Arg Gly Leu Arg Asn     Ser        
    305                 310                 315                        
 
tct ttc tcg agg atc cat ctc att ttg agg agc ttg ccc tag tat tca     1120
Ser Phe Ser Arg Ile His Leu Ile Leu Arg Ser Leu Pro     Tyr Ser        
    320                 325                 330                        
 
acc gat cca gta ggt ttg cta ggc tgc aaa gta tcc agt gtg cca ttg     1168
Thr Asp Pro Val Gly Leu Leu Gly Cys Lys Val Ser Ser Val Pro Leu        
    335                 340                 345                         
 
ctg gga aaa act tgt aca tca ggt ttt gct gca aac ctg gag atg caa     1216
Leu Gly Lys Thr Cys Thr Ser Gly Phe Ala Ala Asn Leu Glu Met Gln        
350                 355                 360                 365        
 
tgg gga tga aca tgg tat cta agg gag tcc aaa atg ttt tgc agt tct     1264
Trp Gly     Thr Trp Tyr Leu Arg Glu Ser Lys Met Phe Cys Ser Ser        
                    370                 375                 380        
 
tgc agt ctg att tcc ccg aca tgg aag ttg ttg gta tct ctg gca att     1312
Cys Ser Leu Ile Ser Pro Thr Trp Lys Leu Leu Val Ser Leu Ala Ile        
                385                 390                 395            
 
tct gtt cgg aca aga aac ctg ctg cgg tga att gga ttg aag gca ggg     1360
Ser Val Arg Thr Arg Asn Leu Leu Arg     Ile Gly Leu Lys Ala Gly        
            400                 405                     410            
 
gga aat ctg tag tct gtg agg ctg tca tca cgg aag aaa tag tca aga     1408
Gly Asn Leu     Ser Val Arg Leu Ser Ser Arg Lys Lys     Ser Arg        
                415                 420                     425        
 
agg ttc tta aga cca ccg tgc cag cct tgg tgg aac tta aca agc taa     1456
Arg Phe Leu Arg Pro Pro Cys Gln Pro Trp Trp Asn Leu Thr Ser            
                430                 435                 440            
 
aaa acc ttg ttg gct ctg ccc tag ctg gag ccc tag gtg ggt tca atg     1504
Lys Thr Leu Leu Ala Leu Pro     Leu Glu Pro     Val Gly Ser Met        
                445                     450                            
 
ctc atg cca gca aca ttg tga ctg cag tct tca ttg cta ctg gcc aag     1552
Leu Met Pro Ala Thr Leu     Leu Gln Ser Ser Leu Leu Leu Ala Lys        
455                 460                     465                         
 
acc ctg cac aga atg ttg aga gct ccc att gcc tga cta tgc tag aac     1600
Thr Leu His Arg Met Leu Arg Ala Pro Ile Ala     Leu Cys     Asn        
470                 475                 480                            
 
cta taa atg atg gga ggg atc tgc ata tat ctg tta cta tgc ctg caa     1648
Leu     Met Met Gly Gly Ile Cys Ile Tyr Leu Leu Leu Cys Leu Gln        
        485                 490                 495                    
 
ttg agg tcg gta cag ttg gtg ggg gcg ctc aac tgg cat ctc aat cag     1696
Leu Arg Ser Val Gln Leu Val Gly Ala Leu Asn Trp His Leu Asn Gln        
    500                 505                 510                        
 
cac ttc tgg atc tac ttg gcg tga aag gtg caa acg ttg aga gcc ctg     1744
His Phe Trp Ile Tyr Leu Ala     Lys Val Gln Thr Leu Arg Ala Leu        
515                 520                     525                        
 
gtg caa atg cca ggc tac tgt cca cca tag tgg ctg gat ctg ttc tcg     1792
Val Gln Met Pro Gly Tyr Cys Pro Pro     Trp Leu Asp Leu Phe Ser        
530                 535                     540                        
 
cag ggg agc tgt ctc tca tgt cag cca ttg cag ctg ggc aac tag tta     1840
Gln Gly Ser Cys Leu Ser Cys Gln Pro Leu Gln Leu Gly Asn     Leu        
545                 550                 555                            
 
aga gcc aca tga aat aca acc gat cca gca ggg aca tgt cga aag tat     1888
Arg Ala Thr     Asn Thr Thr Asp Pro Ala Gly Thr Cys Arg Lys Tyr         
560                     565                 570                        
 
cct cat gag aaaagaaatc gcatttgtag attcgtatga gctcgcataa             1937
Pro His Glu                                                            
575                                                                     
 
tcagataaga gcgaggaggg aggagactga accatgattt gtcgactgca ttgtccgatg   1997
 
ctggaagggt cccagtttcc ttcctattca ctgaattatc aacatcaata tctcatgcct   2057
 
tcgcctctca ggctttttct tttttttgtt gtacttcgtt aatcggctct taacctttgt   2117
 
tctgtgttct ttgacttgtg tgctctgcgc ctacagttgg atttctctct cagagccatt   2177
 
tccttttggc ttttaagtat gttctctccg taaatgacca tggcaaaaaa aaaaaaaaaa   2237
 
aaaaaaaaaa aaaaa                                                    2252
 
 
<210>  2
<211>  602
<212>  PRT
<213>  Artificial
 
<220>
<223>  泽泻3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的氨基酸序列
 
<400>  2
 
Met Asp Val Arg Arg Arg Pro Val Asn Leu Leu Pro Ala Asp Asp Thr
1               5                   10                  15     
 
 
Ala Lys Pro Glu Lys Lys Leu Pro Ala Ala Ser Arg Pro Val Gln Ala
            20                  25                  30         
 
 
Ser Asp Ala Leu Pro Leu Pro Ile Arg Tyr Thr Asn Trp Phe Phe Ser
        35                  40                  45             
 
 
Leu Val Phe Phe Val Ala Cys Tyr Phe Leu Met Val Arg Trp Arg Glu
    50                  55                  60                 
 
 
Lys Val Arg Ser Ser Ser Pro Leu His Leu Leu Ser Phe Ser Glu Ile
65                  70                  75                  80 
 
 
Leu Gly Val Val Ala Leu Val Ala Ser Phe Thr Tyr Leu Leu Asn Phe
                85                  90                  95     
 
 
Phe Gly Ile Gly Ile Ile Gln Ser Phe Leu Pro Arg Gly Ala Asp Asp
            100                 105                 110        
 
 
Asp Phe Ile Ser Gly Glu Asp Val Gly Asn Asp Val Gly Thr Met Asn
        115                 120                 125            
 
 
His Lys Pro Arg Ile His Pro Arg Pro Val Ser Asp Ser Leu Leu Pro
    130                 135                 140                
 
 
Pro Val Ser Lys Ala Ala Ala Ala Asp Asp Leu Pro Pro Leu Cys Pro
145                 150                 155                 160
 
 
Pro Phe Met Pro Asn Ala Ile Ala Pro Arg Pro Pro Leu Pro Pro Val
                165                 170                 175    
 
 
Lys Ser Val Asp Pro Ile Ile Leu Ser Ser Asp Asp Glu Glu Ile Val
            180                 185                 190         
 
 
Arg Ser Val Val Asp Gly Thr Val Pro Ser Tyr Ser Leu Glu Ser Lys
        195                 200                 205            
 
 
Leu Gly Asp Cys Arg Arg Ala Ala Ala Val Arg Arg Glu Ala Leu Arg
    210                 215                 220                 
 
 
Arg Met Thr Gly Arg Ser Leu Asp Gly Leu Pro Leu Glu Gly Phe Asp
225                 230                 235                 240
 
 
Tyr Asp Ser Ile Leu Gly Gln Cys Cys Glu Met Pro Ile Gly Tyr Val
                245                 250                 255    
 
 
Thr Leu Pro Val Gly Ile Ala Gly Pro Leu Leu Leu Asp Gly Lys Cys
            260                 265                 270        
 
 
Tyr Tyr Val Pro Met Ala Thr Thr Glu Gly Cys Leu Val Ala Ser Thr
        275                 280                 285            
 
 
Asn Arg Gly Cys Lys Ala Ile Arg Asp Ser Gly Gly Ala Glu Ser Val
    290                 295                 300                
 
 
Ile Phe Arg Asp Gly Met Thr Arg Ala Pro Ala Val Arg Phe Asp Ser
305                 310                 315                 320
 
 
Ala Lys Arg Ala Ala Gln Leu Lys Phe Phe Leu Glu Asp Pro Ser His
                325                 330                 335    
 
 
Phe Glu Glu Leu Ala Leu Val Phe Asn Arg Ser Ser Arg Phe Ala Arg
            340                 345                 350        
 
 
Leu Gln Ser Ile Gln Cys Ala Ile Ala Gly Lys Asn Leu Tyr Ile Arg
        355                 360                 365            
 
 
Phe Cys Cys Lys Pro Gly Asp Ala Met Gly Met Asn Met Val Ser Lys
    370                 375                 380                
 
 
Gly Val Gln Asn Val Leu Gln Phe Leu Gln Ser Asp Phe Pro Asp Met
385                 390                 395                 400
 
 
Glu Val Val Gly Ile Ser Gly Asn Phe Cys Ser Asp Lys Lys Pro Ala
                405                 410                 415    
 
 
Ala Val Asn Trp Ile Glu Gly Arg Gly Lys Ser Val Val Cys Glu Ala
            420                 425                 430         
 
 
Val Ile Thr Glu Glu Ile Val Lys Lys Val Leu Lys Thr Thr Val Pro
        435                 440                 445            
 
 
Ala Leu Val Glu Leu Asn Lys Leu Lys Asn Leu Val Gly Ser Ala Leu
    450                 455                 460                 
 
 
Ala Gly Ala Leu Gly Gly Phe Asn Ala His Ala Ser Asn Ile Val Thr
465                 470                 475                 480
 
 
Ala Val Phe Ile Ala Thr Gly Gln Asp Pro Ala Gln Asn Val Glu Ser
                485                 490                 495    
 
 
Ser His Cys Leu Thr Met Leu Glu Pro Ile Asn Asp Gly Arg Asp Leu
            500                 505                 510        
 
 
His Ile Ser Val Thr Met Pro Ala Ile Glu Val Gly Thr Val Gly Gly
        515                 520                 525            
 
 
Gly Ala Gln Leu Ala Ser Gln Ser Ala Leu Leu Asp Leu Leu Gly Val
    530                 535                 540                
 
 
Lys Gly Ala Asn Val Glu Ser Pro Gly Ala Asn Ala Arg Leu Leu Ser
545                 550                 555                 560
 
 
Thr Ile Val Ala Gly Ser Val Leu Ala Gly Glu Leu Ser Leu Met Ser
                565                 570                 575    
 
 
Ala Ile Ala Ala Gly Gln Leu Val Lys Ser His Met Lys Tyr Asn Arg
            580                 585                 590        
 
 
Ser Ser Arg Asp Met Ser Lys Val Ser Ser
        595                 600        
 
 
<210>  3
<211>  24
<212>  DNA
<213>  Artificial
 
<220>
<223>  HF1
 
<400>  3
ggbgatgcha tgggratgaa yatg                                            24
 
 
<210>  4
<211>  26
<212>  DNA
<213>  Artificial
 
<220>
<223>  HR1
 
 
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (6)..(6)
<223>  n is a, c, g, or t
 
<400>  4
tcctgnactt graartadrt wcccat                                          26
 
 
<210>  5
<211>  37
<212>  DNA
<213>  Artificial
 
<220>
<223>  HF2
 
<400>  5
gatggatcct cgagaaagaa cttcagttgc gcagccc                              37
 
 
<210>  6
<211>  30
<212>  DNA
<213>  Artificial
 
<220>
<223>  HR2
 
<400>  6
gtcgaaccct tccagcggca gcccgtccag                                      30
 
 
<210>  7
<211>  23
<212>  DNA
<213>  Artificial
 
<220>
<223>  HF3
 
<400>  7
ctgcgcgggt gccgtcaccc ttc                                             23
 
 
<210>  8
<211>  30
<212>  DNA
<213>  Artificial
 
<220>
<223>  HR3
 
<400>  8
tgccatggtc atttacggag agaacatact                                      30
 
<210>  9
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Claims (7)

1.一种泽泻3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶，其特征在于：具有序列表SEQ ID No.2的氨基酸序列，或由具有序列表SEQ ID No.1的碱基序列的基因所编码。
2.根据权利要求1所述的泽泻3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶，是由泽泻3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶原核表达获得的纯化蛋白。
3.一种根据权利要求1所述的泽泻3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的多克隆抗体制备方法，其特征在于：原核表达纯化3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶蛋白并于用免疫家兔制备多克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：取纯化后的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶蛋白，采用皮下注射法免疫2-2.5 Kg的新西兰白兔，400 μg/次，2-3 周免疫一次，共免疫4次；采血检测，通过间接 ELISA 方法确定抗血清针对蛋白的效价，待效价大于 1:50, 000 进行最终采血制备抗血清，纯化得多克隆抗体，并进行Western blot检测。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的纯化是将蛋白与琼脂糖介质偶联制备成抗原亲和纯化层析柱，将所得抗血清与 PBS 等量混合后缓慢上样，待抗原抗体结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，即得到所需纯化抗体，立即在PBS 中进行 4 ℃透析过夜，隔日进行纯度，浓度和效价测定。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的ELISA 方法包括以下步骤：
（1）用pH 9.6, 0.05 mol/L的碳酸盐缓冲液将纯化的抗体稀释为20 μg/mL，包被酶标板，每孔100 μL，4 ℃包被过夜；
（2）次日每孔加入100 μL 5%的脱脂奶粉，37 ℃封闭1 h后，用pH 7.4 的PBST洗涤3次；
（3）然后每孔加入500～51, 200倍稀释的兔抗血清100 μL，阴性对照为1:50倍稀释的免疫前血清，空白对照为兔抗血清稀释液(PBS)，每份样品均做1平行，37 ℃孵育1 h后，同上洗涤3次；
（4）再次每孔加入100 μL HRP标记的羊抗兔IgG，37 ℃孵育1 h后，同上洗涤3次；
（5）每孔加入100 μL TMB显色液，37 ℃避光反应20 min后，每孔再加入50 μL 2 mol/L硫酸终止液；
（6）在酶标仪上测450 nm下的OD值；
（7）通过 SDS-PAGE 电泳，考马斯亮蓝染色观察纯化抗体的纯度。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的Western blot检测方法包括以下步骤：
（1）分别取 200 mg 泽泻植物组织样品，剪碎加入适量裂解液（使用前加 PMSF），匀浆器匀浆，充分裂解；
取上清 10 μL加入等体积 2X 样品缓冲液，每个泳道上样 20 μL；
（2）上样完毕后，聚丙烯酰胺凝胶先 90V 跑完积层胶，再将电压升至 200V 直到电泳结束；
（3）电泳结束后，取下凝胶进行转膜，恒压 100V 转膜，约为 1.5 h；
（4）电转结束后，取下膜后先用 PBS 洗涤 4 次，每次 5 min；
然后置于 5%（m/V）脱脂奶粉封闭液中封闭 37 ℃，1 h；
（5）用封闭液稀释一抗，膜在一抗稀释液中 37 ℃反应 1 h；
（6）洗膜4次，每次5 min；用含 5%牛奶的封闭液稀释二抗（羊抗兔-HRP）；
膜在二抗中 37 ℃反应1 h；
（7）洗膜 ECL 显影。
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