JP2019141063A - 発現配列 - Google Patents
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Abstract
【課題】ピキア・パストリス(Pichia pastoris、P.pastoris)発現系の調節エレメント、及び目的のタンパク質(POI)を産生する方法の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列を有するリーダーペプチド、又は1若しくは2の点変異を有するその機能的バリアント、及びPOIをコードする核酸配列を含む発現カセットを導入した組換え酵母宿主細胞においてPOIを産生する方法、及び宿主細胞からのPOIの分泌を増大するための特定の核酸の使用。【選択図】なし
Description
本発明は、ピキア・パストリス(Pichia pastoris、P.pastoris)発現系の調節エレメント及び目的のタンパク質(POI)を産生する方法におけるその使用に関する。
タンパク質の首尾よい分泌は、原核生物及び真核生物宿主の両方によって達成されている。最も目立った例は、細菌、例えば大腸菌(Escherichia coli)、酵母菌、例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ピキア・パストリス若しくはハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、糸状菌、例えばアスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)若しくはトリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)、又は、哺乳動物細胞、例えばCHO細胞である。いくつかのタンパク質の分泌は、高い割合で容易に達成されるが、多くの他のタンパク質は、比較的低レベルでしか分泌されない。
宿主生物における遺伝子の異種発現は、その宿主細胞の安定的な形質転換を可能にするベクターを必要とする。このベクター又は発現カセットは、コード配列の5’末端に隣接する機能的プロモーターと共に遺伝子を提供しなければならない。従って、転写は、このプロモーター配列によって調節され、そして開始される。
分泌経路は、典型的には、膜貫通ポリペプチド及び分泌を目的とするポリペプチドの小胞体(ER)の腔内への移行によって開始する。この目的のために、これらのタンパク質は、アミノ末端前駆配列を有する。この配列は、「リーダー」とも呼ばれ、シグナルペプチド及び任意の分泌リーダープロペプチドを含むか、又はこれらからなる。シグナルペプチドは、典型的には、13〜36の比較的疎水性のアミノ酸からなる。シグナルペプチドは、短い、陽に帯電したアミノ末端領域(n領域);中央の疎水性領域(h領域);及びシグナルペプチダーゼによって切断される部位を含むより極性のカルボキシ末端領域(c領域)、という共通構造を有する。小体の管腔側において、シグナルペプチドが、シグナルペプチダーゼによって切断される。ERに常在するシャペロン及びフォールダーゼによる初期のポリペプチドの連続的な折り畳みの後、このタンパク質は、さらに、ERから出るように仕向けられる。このプロセスは、例えば、S.セレビシエ接合因子アルファ(MFα)の前駆体に存在する、N末端プロ配列の存在によって支えられていてもよい。次いで、タンパク質は、ゴルジネットワークに、そして最後に、上清への分泌のために、細胞膜に輸送される。リーダープロペプチドは、(恐らく)ゴルジ常在プロテアーゼ、例えばS.セレビシエのKex2プロテアーゼによってタンパク質から切断される。
酵母の殆どは大量の内在性タンパク質を分泌せず、その細胞外プロテオームは、これまで広範囲に性質決定されていなかったので、酵母における使用のために利用可能な分泌配列の数は、限られている。従って、S.セレビシエ由来の接合因子アルファリーダーペプチド(MFα)に対する標的タンパク質の融合が、多くの酵母の種(ピキア属、クリベロミセス属、ザイゴサッカロミセス属を含む)において分泌発現を駆動するために使用された。残念なことに、Kex2プロテアーゼによるMFαのタンパク質分解プロセシングは、多くの場合、産物における異種N末端アミノ酸残基を生じる。
EP324274B1は、切断型S.セレビシエアルファ因子リーダー配列を用いた酵母における異種タンパク質の改善された発現及び分泌を記載し、EP301669B1は、異種タンパク質の分泌のためのクリベロミセス属アルファ因子リーダー配列を記載する。
或いは、S.セレビシエホスファターゼ(PHO5、DK3614)、S.セレビシエスクロースインベルターゼ(SUC、WO84/01153)及び酵母アスパラギン酸プロテアーゼ3(YAP3、EP792367B1)のシグナルペプチドは、酵母における分泌発現のために使用された。EP0438200(A1)は、P.パストリスにおける発現のためのS.セレビシエSUC2のシグナルペプチド配列を記載する。
US5268273は、多くの場合MFαよりも弱い、P.パストリス酸ホスファターゼ(PHO1)シグナル配列を記載する。
US7741075は、組換えタンパク質発現のためのP.パストリスPIR1分泌シグナルペプチド、並びに組換え体表面呈示のためのピキア・パストリスPIR1及びPIR2アンカードメインペプチドを記載する。
Khasaら、2011(Yeast.28(3):213〜26)は、ピキア・パストリスPIR遺伝子の単離、並びに細胞表面呈示及び組換えタンパク質分泌、特にP.パストリスにおける、PpPir1pタンパク質のプレ−プロシグナルを利用した組換えタンパク質分泌のためのその利用を、MFαと比較することなく、記載する。
WO2011073367A1及びKottmeierら、2011(Applied
Microbiology and Biotechnology.91:1,133〜141)は、ピキア・パストリスにおいて組換えタンパク質の効率的な分泌を媒介するヒドロホビンシグナル配列、特に、P.パストリスにおけるeGFPの分泌のためのトリコデルマ・リーゼイヒドロホビンのプレ−配列又はプロ−配列の使用を、記載する。
Microbiology and Biotechnology.91:1,133〜141)は、ピキア・パストリスにおいて組換えタンパク質の効率的な分泌を媒介するヒドロホビンシグナル配列、特に、P.パストリスにおけるeGFPの分泌のためのトリコデルマ・リーゼイヒドロホビンのプレ−配列又はプロ−配列の使用を、記載する。
P.パストリスゲノム配列決定の過程において、54の異なる配列が、予測シグナルペプチドとして挙げられ、これは、タンパク質の分泌を提供するための切断部位を含む(De Schutterら、Nature Biotechnology doi:10.1038/nbt.1544 2009)。
US2011/0021378A1は、シグナル配列を含むことが同定されている54のP.パストリス遺伝子のセットを記載する。この中で、US2011/0021378A1において挙げられた配列番号8の残基1〜21は、やはり、タンパク質の分泌を提供するための切断部位を含む。
EP2258855A1は、P.パストリス由来の発現系の調節配列を記載する。ここで、P.パストリスEpx1タンパク質のシグナル及びリーダー配列は、57のアミノ酸前駆配列として使用され、目的のタンパク質POIの発現及び分泌を促進する。シグナルペプチダーゼについての切断部位は、シグナル配列に続くこと、すなわち、20位と21位との間であることが予測され、切断部位の配列におけるハイフンとして表される:VSA−AP(配列番号6)。
組換え真核生物宿主細胞においてPOIを発現するために好適な代替の調節エレメント、並びに、真核生物細胞において分泌タンパク質を産生するための、単純且つ効率的な、そして好ましくは均一なN末端のPOIをもたらす方法を提供することが望ましい。
この目的は、特許請求される主題によって解決される。
本発明は、
a)配列番号10のアミノ酸配列を有するリーダーペプチド、又は1若しくは2の点変異を有するその機能的バリアント、
b)配列番号11、12、13及び14からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するリーダーペプチド、
c)配列番号1のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド、又は1若しくは2の点変異を有するその機能的バリアントであって、好ましくは配列番号2以外であるもの、並びにd)配列番号2、3、4及び5からなる群から選択される、好ましくは配列番号2以外のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド
からなる群から選択されるリーダーをコードする、単離された核酸を提供する。
a)配列番号10のアミノ酸配列を有するリーダーペプチド、又は1若しくは2の点変異を有するその機能的バリアント、
b)配列番号11、12、13及び14からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するリーダーペプチド、
c)配列番号1のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド、又は1若しくは2の点変異を有するその機能的バリアントであって、好ましくは配列番号2以外であるもの、並びにd)配列番号2、3、4及び5からなる群から選択される、好ましくは配列番号2以外のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド
からなる群から選択されるリーダーをコードする、単離された核酸を提供する。
本発明は、さらに、
a)配列番号10のアミノ酸配列を有するリーダーペプチド、又は1若しくは2の点変異を有するその機能的バリアント、
b)配列番号11、12、13及び14からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するリーダーペプチド、
c)配列番号1のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド、又は1若しくは2の点変異を有するその機能的バリアントであって、好ましくは配列番号2以外であるもの、並びにd)配列番号2、3、4及び5からなる群から選択される好ましくは配列番号2以外のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド
からなる群から選択されるリーダーを提供する。
a)配列番号10のアミノ酸配列を有するリーダーペプチド、又は1若しくは2の点変異を有するその機能的バリアント、
b)配列番号11、12、13及び14からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するリーダーペプチド、
c)配列番号1のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド、又は1若しくは2の点変異を有するその機能的バリアントであって、好ましくは配列番号2以外であるもの、並びにd)配列番号2、3、4及び5からなる群から選択される好ましくは配列番号2以外のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド
からなる群から選択されるリーダーを提供する。
従って、この特定のリーダーペプチドは、36のアミノ酸(aa)のリーダー配列によって特徴付けられ、ここで、N末端の20のaa配列は、特定のシグナルペプチドである。
従って、この特定のシグナルペプチドは、20のaaシグナル配列、具体的には、C末端が伸長された配列、例えば付加されたアミノ酸、例えばアラニンによるC末端伸長を含む21のaa配列を除く、20のaaシグナル配列によって特徴付けられる。
配列番号1:MKXSTNLILAIAAASXVVSA、ここで、
3位のXは、F又はLのどちらかであり、
16位のXは、A又はTのどちらかである。
3位のXは、F又はLのどちらかであり、
16位のXは、A又はTのどちらかである。
例えば、20アミノ酸(aa)のシグナルペプチドであるEpxL−Aは、配列番号1のアミノ酸配列を有し、ここで、3位のXは、Lであり、そして16位のXは、Aである(配列番号2)。
特定の例に従って、20アミノ酸(aa)シグナルペプチドであるEpxL−Aは、配列番号1のアミノ酸配列を有し、ここで、3位のXは、Fであり、そして16位のXは、Aである(配列番号3)。
具体的には、本発明は、配列番号2、3、4及び5からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するシグナルペプチドをコードする、シグナルペプチド又は核酸を提供する。
配列番号2:MKLSTNLILAIAAASAVVSA
配列番号3:MKFSTNLILAIAAASAVVSA
配列番号4:MKFSTNLILAIAAASTVVSA
配列番号5:MKLSTNLILAIAAASTVVSA
3位及び16位におけるアミノ酸置換は、太字及び下線によって表される。
配列番号3:MKFSTNLILAIAAASAVVSA
配列番号4:MKFSTNLILAIAAASTVVSA
配列番号5:MKLSTNLILAIAAASTVVSA
3位及び16位におけるアミノ酸置換は、太字及び下線によって表される。
本発明に従うシグナルペプチドをコードする核酸分子は、ここでは、「シグナル配列」とも呼ばれる。
本発明に従う、上で具体的に規定されたリーダーは、配列番号10のアミノ酸配列を有する。
配列番号10:
MKXSTNLILAIAAASXVVSAAPVAPAEEAANHLHKR、ここで、
3位のXは、F又はLのどちらかであり、
16位のXは、A又はTのどちらかである。
MKXSTNLILAIAAASXVVSAAPVAPAEEAANHLHKR、ここで、
3位のXは、F又はLのどちらかであり、
16位のXは、A又はTのどちらかである。
具体的には、本発明は、リーダー、又は配列番号11、12、13及び14からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するリーダーをコードする核酸を提供する。
配列番号11:MKLSTNLILAIAAASAVVSAAPVAPAEEAANHLHKR
配列番号12:MKFSTNLILAIAAASAVVSAAPVAPAEEAANHLHKR
配列番号13:MKFSTNLILAIAAASTVVSAAPVAPAEEAANHLHKR
配列番号14:MKLSTNLILAIAAASTVVSAAPVAPAEEAANHLHKR
3位及び16位におけるアミノ酸置換は、太字及び下線によって表される。
配列番号12:MKFSTNLILAIAAASAVVSAAPVAPAEEAANHLHKR
配列番号13:MKFSTNLILAIAAASTVVSAAPVAPAEEAANHLHKR
配列番号14:MKLSTNLILAIAAASTVVSAAPVAPAEEAANHLHKR
3位及び16位におけるアミノ酸置換は、太字及び下線によって表される。
例えば、36アミノ酸(aa)切断型リーダーであるEpxL−KRは、配列番号10のアミノ酸配列を有し、ここで、3位のXはLであり、そして16位のXは、Aである。
特定の例に従い、36アミノ酸(aa)リーダーペプチドであるEpxL−KRは、配列番号10のアミノ酸配列を有し、ここで、3位のXは、Fであり、そして16位のXは、Aである(配列番号12)。
配列番号10、11、12、13若しくは14のアミノ酸配列を有する本発明のリーダー、又は1若しくは2の点変異を有するその機能的バリアントは、ここでは「切断型リーダー」と呼ばれる。
具体的には、切断型リーダーをコードする核酸は、配列番号2、3、4及び5からなる群から選択される、好ましくは配列番号2を除くシグナルペプチドをコードする核酸を含むか、又はこれらからなる。具体的には、切断型リーダーをコードする核酸は、配列番号11、12、13、及び14からなる群から選択されるリーダーペプチドをコードする核酸を含むか、又はこれらからなる。
具体的には、切断型リーダーは、配列番号2、3、4及び5からなる群から選択される、好ましくは配列番号2を除くシグナルペプチドを含むか、若しくはこれらからなるか、又は、配列番号11、12、13、及び14からなる群から選択されるリーダーペプチドからなる。
具体的に好ましい核酸は、配列番号3のアミノ酸配列のシグナルペプチド又は配列番号12のリーダーペプチドをコードする;好ましくは、シグナルペプチド又はリーダーペプチドをコードする核酸配列は、それぞれ、配列番号16又は配列番号19である。具体的に好ましいリーダーは、配列番号3のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド、又は配列番号12のアミノ酸配列を有するリーダーペプチドである。
従って、本発明の特定の態様は、リーダー又はこのようなリーダーをコードする核酸を指し、これは、
a)配列番号3のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド、好ましくは、ここで、コード核酸は、配列番号16のヌクレオチド配列、又は配列番号16のコドン最適化バリアントからなる;又は
b)配列番号12のアミノ酸配列を有するか、含むか、又はこれからなるリーダーペプチド、好ましくはここで、コード核酸は、配列番号19のヌクレオチド配列、又は配列番号19のコドン最適化バリアントからなる、
である。
a)配列番号3のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド、好ましくは、ここで、コード核酸は、配列番号16のヌクレオチド配列、又は配列番号16のコドン最適化バリアントからなる;又は
b)配列番号12のアミノ酸配列を有するか、含むか、又はこれからなるリーダーペプチド、好ましくはここで、コード核酸は、配列番号19のヌクレオチド配列、又は配列番号19のコドン最適化バリアントからなる、
である。
具体的には、本発明に従う核酸は、
a)シグナルペプチドをコードする、配列番号15、16及び17からなる群から選択される、好ましくは、配列番号15以外であるヌクレオチド配列、又は
b)リーダーペプチドをコードする、配列番号18、19及び20からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は
c)配列番号15、16、17、18、19若しくは20のコドン最適化バリアントであるヌクレオチド配列
を有する。
a)シグナルペプチドをコードする、配列番号15、16及び17からなる群から選択される、好ましくは、配列番号15以外であるヌクレオチド配列、又は
b)リーダーペプチドをコードする、配列番号18、19及び20からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は
c)配列番号15、16、17、18、19若しくは20のコドン最適化バリアントであるヌクレオチド配列
を有する。
本発明の特定の核酸は、配列番号3のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドである、リーダーをコードする。好ましくは、ここで、この核酸は、配列番号16のヌクレオチド配列、又は配列番号16のコドン最適化バリアントからなる。
本発明の特定の核酸は、リーダーペプチド又は配列番号12のアミノ酸配列を有する切断型リーダーであるリーダーをコードする。ここで、好ましくは、この核酸は、配列番号19のヌクレオチド配列、又は配列番号19のコドン最適化バリアントからなる。
配列番号15:P.パストリス、CBS7435株(CBS−KNAW Fungal
Biodiversity Centre、Centraalbureau voor
Schimmelcultures、ユトレヒト、オランダ)から得られたヌクレオチド配列:
ATGAAGCTCTCCACCAATTTGATTCTAGCTATTGCAGCAGCTTCCGCCGTTGTCTCAGCT
配列番号16:P.パストリスCBS7435株から実施例9に記載されるプライマーを用いたPCR増幅によって得られる、実施例9において使用されるヌクレオチド配列。
Biodiversity Centre、Centraalbureau voor
Schimmelcultures、ユトレヒト、オランダ)から得られたヌクレオチド配列:
ATGAAGCTCTCCACCAATTTGATTCTAGCTATTGCAGCAGCTTCCGCCGTTGTCTCAGCT
配列番号16:P.パストリスCBS7435株から実施例9に記載されるプライマーを用いたPCR増幅によって得られる、実施例9において使用されるヌクレオチド配列。
ATGAAGTTCTCTACCAATTTGATTCTAGCTATTGCAGCAGCTTCCGCCGTTGTCTCAGCT
配列番号17:P.パストリス、DSMZ70382株(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)から得られたヌクレオチド配列
ATGAAGTTCTCTACCAATTTGATCTTAGCTATTGCAGCAGCATCCACTGTTGTCTCAGCT
上の配列において変わっているヌクレオチドは、下線で示されている。
配列番号17:P.パストリス、DSMZ70382株(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)から得られたヌクレオチド配列
ATGAAGTTCTCTACCAATTTGATCTTAGCTATTGCAGCAGCATCCACTGTTGTCTCAGCT
上の配列において変わっているヌクレオチドは、下線で示されている。
配列番号18:P.パストリス、CBS7435株(CBS−KNAW Fungal
Biodiversity Centre、Centraalbureau voor
Schimmelcultures、ユトレヒト、オランダ)から得られるヌクレオチド配列
ATGAAGCTCTCCACCAATTTGATTCTAGCTATTGCAGCAGCTTCCGCCGTTGTCTCAGCTGCTCCAGTTGCTCCAGCCGAAGAGGCAGCAAACCACTTGCACAAGCGT
配列番号19:P.パストリスCBS7435株から実施例1及び5に記載されるプライマーを用いたPCR増幅によって得られる、実施例5において使用されるヌクレオチド配列
ATGAAGTTCTCTACCAATTTGATTCTAGCTATTGCAGCAGCTTCCGCCGTTGTCTCAGCTGCTCCAGTTGCTCCAGCCGAAGAGGCAGCAAACCACTTGCACAAGCGT
配列番号20:P.パストリス、DSMZ70382株(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)から得られるヌクレオチド配列
ATGAAGTTCTCTACCAATTTGATCTTAGCTATTGCAGCAGCATCCACTGTTGTCTCAGCTGCTCCAGTTGCTCCAGCCGAAGAGGCAGCAAACCACTTGCACAAGCGT
具体的には、本発明に従う核酸は、DNAである。
Biodiversity Centre、Centraalbureau voor
Schimmelcultures、ユトレヒト、オランダ)から得られるヌクレオチド配列
ATGAAGCTCTCCACCAATTTGATTCTAGCTATTGCAGCAGCTTCCGCCGTTGTCTCAGCTGCTCCAGTTGCTCCAGCCGAAGAGGCAGCAAACCACTTGCACAAGCGT
配列番号19:P.パストリスCBS7435株から実施例1及び5に記載されるプライマーを用いたPCR増幅によって得られる、実施例5において使用されるヌクレオチド配列
ATGAAGTTCTCTACCAATTTGATTCTAGCTATTGCAGCAGCTTCCGCCGTTGTCTCAGCTGCTCCAGTTGCTCCAGCCGAAGAGGCAGCAAACCACTTGCACAAGCGT
配列番号20:P.パストリス、DSMZ70382株(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)から得られるヌクレオチド配列
ATGAAGTTCTCTACCAATTTGATCTTAGCTATTGCAGCAGCATCCACTGTTGTCTCAGCTGCTCCAGTTGCTCCAGCCGAAGAGGCAGCAAACCACTTGCACAAGCGT
具体的には、本発明に従う核酸は、DNAである。
具体的には、本発明に従うリーダーは、ポリペプチドである。
特定の側面に従い、本発明は、単離されたリーダー、切断型リーダー、シグナルペプチド又はリーダーペプチドを提供し、好ましくは、このリーダーは、配列番号1、2、3、4、5、10、11、12、13及び14からなる群から選択される、好ましくは配列番号2を除くアミノ酸配列を有する。
具体的に好ましいリーダーは、配列番号3又は配列番号12のアミノ酸配列からなるペプチドである。
別の側面に従い、本発明は、POIをコードする核酸配列に作動可能に連結したリーダーをコードする核酸を含む発現カセットをさらに提供し、このリーダーは、
a)配列番号10のアミノ酸配列を有するリーダーペプチド、又は1若しくは2の点変異を有するその機能的バリアント、
b)配列番号11、12、13及び14からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するリーダーペプチド、
c)配列番号1のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド、又は1若しくは2の点変異を有するその機能的バリアント、並びに
d)配列番号2、3、4及び5からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するシグナルペプチド
からなる群から選択されることを特徴とし、好ましくは、ここで、配列番号2のアミノ酸配列からなるシグナルペプチドの、1以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又はこれらからなるポリペプチド、例えばナノボディとの融合は、除外される。
a)配列番号10のアミノ酸配列を有するリーダーペプチド、又は1若しくは2の点変異を有するその機能的バリアント、
b)配列番号11、12、13及び14からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するリーダーペプチド、
c)配列番号1のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド、又は1若しくは2の点変異を有するその機能的バリアント、並びに
d)配列番号2、3、4及び5からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するシグナルペプチド
からなる群から選択されることを特徴とし、好ましくは、ここで、配列番号2のアミノ酸配列からなるシグナルペプチドの、1以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又はこれらからなるポリペプチド、例えばナノボディとの融合は、除外される。
なお、特定の例に従い、本発明は、成長因子、ホルモン、サイトカイン、抗体及び抗体断片(特に、ここで抗体又は抗体断片は、scFv、ミニボディ、ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディ、Fab、Fc融合タンパク質、及び、完全長抗体、例えばIgG、IgA、IgD、IgM又はIgからなる群、好ましくは、完全長抗体、scFv又はFabからなる群から選択される)からなる群から選択されるPOIと、配列番号11、12、13及び14からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するリーダーペプチドとの融合、又は配列番号2、3、4及び5からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するシグナルペプチドとの融合を提供し、具体的には、配列番号2のアミノ酸配列からなるシグナルペプチドと、このような抗体又は抗体断片のいずれか、具体的には、完全長抗体、scFv又はFabのいずれかとの融合が挙げられる。
発現カセットにおいて使用されるシグナル又はリーダーペプチドをコードする具体的に好ましいヌクレオチド配列は、配列番号3又は配列番号12のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列から成り、好ましくは、配列番号16又は配列番号19からなるか、又は配列番号16又は配列番号19のコドン最適化バリアントからなる。このようなシグナル又はリーダーペプチドは、好ましくは、任意の抗体又は抗体断片を含めた任意のPOIに融合し、具体的には、配列番号3又は配列番号12のアミノ酸配列からなるシグナルペプチド又はリーダーペプチドと1以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又はこれらからなるポリペプチド、例えばナノボディとの融合物を含む。
別の側面に従い、本発明は、
a)シグナルペプチドをコードする、配列番号15、16及び17からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は
b)リーダーペプチドをコードする、配列番号18、19及び20からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は
c)配列番号15、16、17、18、19若しくは20のコドン最適化バリアントであるヌクレオチド配列、
を含む発現カセットをさらに提供し、好ましくは、ここで、配列番号15のヌクレオチド配列が1以上の免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばナノボディをコードするヌクレオチド配列に融合した融合構築物は、除外される。
a)シグナルペプチドをコードする、配列番号15、16及び17からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は
b)リーダーペプチドをコードする、配列番号18、19及び20からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は
c)配列番号15、16、17、18、19若しくは20のコドン最適化バリアントであるヌクレオチド配列、
を含む発現カセットをさらに提供し、好ましくは、ここで、配列番号15のヌクレオチド配列が1以上の免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばナノボディをコードするヌクレオチド配列に融合した融合構築物は、除外される。
なお、特定の例に従って、本発明は、配列番号15のヌクレオチド配列が、scFv、ミニボディ、ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディ、Fab、Fc融合タンパク質及び完全長抗体、例えばIgG、IgA、IgD、IgM又はIgEからなる群から選択される、好ましくは、完全長抗体、scFv又はFabからなる群から選択される抗体又は抗体断片をコードするヌクレオチド配列と融合した融合構築物を、提供する。
具体的に好ましいヌクレオチド配列は、配列番号3のシグナルペプチドをコードする配列番号16である。
別の具体的に好ましいヌクレオチド配列は、配列番号12のリーダーペプチドをコードする配列番号19である。
従って、特定の例に従い、本発明は、配列番号16又は19のヌクレオチド配列が任意の目的のタンパク質(例えば、具体的には、ここではPOIと記載され、任意の抗体又は抗体断片が挙げられるが、これらに限定されない)をコードするヌクレオチド配列と融合した融合構築物を提供し、具体的には、POIが1以上の免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばナノボディを含むか又はこれらからなるポリペプチドである融合構築物を含む。
本発明に従う発現カセットにより、POI、具体的には、正しいネイティブのN末端アミノ酸残基を有する(特に、N末端に追加のアラニンを有さない)分泌された成熟POIの発現を提供することが、初めて可能になった。
具体的には、POIは、抗体又はその断片、酵素及びペプチド、タンパク質抗生物質、毒素融合タンパク質、炭水化物−タンパク質結合体、構造タンパク質、調節タンパク質、ワクチン及びワクチン様タンパク質又は粒子、プロセス酵素、成長因子、ホルモン並びにサイトカインが挙げられる治療用タンパク質から選択されるか、又はここで、このPOIは、好ましくは抗体又はその断片、成長因子、ホルモン及びサイトカインからなる群から選択される、宿主細胞代謝物の産生を媒介する。
特定の例に従い、抗体又はその断片は、scFv、ミニボディ、ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディ、Fab、Fc融合タンパク質及び完全長抗体、例えばIgG、IgA、IgD、IgM又はIgEからなる群から選択され、好ましくは、完全長抗体、scFv又はFabからなる群から選択される。
具体的には、本発明に従う発現カセットは、本発明に従う核酸とPOIをコードする核酸との融合物であり、それ自体で天然に存在しない核酸である。本発明は、本発明に従うリーダーとPOIとの融合タンパク質であり、それ自体で天然に存在しない融合タンパク質を、さらに提供する。
従って、リーダーは、POIの産生の改善、例えば、分泌量の増大のために、及び、質の改善、例えば正しいN末端のために操作されており、先行技術のリーダーとは異なるリーダーを使用する。
本発明に従う発現カセットは、具体的に、シグナルペプチド又はAPVAPAEEAANHLHKR(配列番号7)からなるプロ配列によって伸長されたシグナルペプチドのどちらかからなるリーダー配列をコードする。このプロ配列は、P.パストリスEpx1タンパク質のネイティブの完全長リーダーの一部、すなわち、以下の配列番号8:MKFSTNLILAIAAASTVVSAAPVAPAEEAANHLHKRAYYTDTTKTHTFTEVVTVYRT
の57のアミノ酸配列のアミノ酸21〜36と同一の16のアミノ酸配列である。
の57のアミノ酸配列のアミノ酸21〜36と同一の16のアミノ酸配列である。
両方のリーダー、シグナルペプチド及び本発明の切断型リーダーは、驚くべきことに、先行技術のリーダー(例えば、ここではEpxL−AAとも呼ばれ(21アミノ酸):US2011/0021378A1に従う配列番号21:MKLSTNLILAIAAASAVVSAA)を凌ぐ、予期せぬ改善された特性を有することが判明した。
さらに、EP2258855A1に記載される、配列番号8の57アミノ酸配列であるP.パストリスEpx1タンパク質の完全長リーダー、又は3位におけるロイシンによるそのバリアントと比較して、改善された特性が示され得る。
このことは、より驚くべきことであった。何故なら、プロ配列又は切断型リーダーを有さない、本発明に従う20アミノ酸のシグナルペプチドは、それぞれ、完全長リーダーの35%及び63%の長さしか有さないからである。
本発明のリーダーは、アルファ接合因子(αMF)リーダーとの融合と比較して、POIと融合する場合に、具体的には、POIが、ホルモン、サイトカイン、抗体又は抗体断片(例えば、scFv、ミニボディ、ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディ、Fab、Fc融合タンパク質、及び完全長抗体、例えばIgG、IgA、IgD、IgM又はIgEからなる群から、好ましくは、完全長抗体、scFv又はFabからなる群から選択される)である場合、特定の利点、例えばPOIの分泌の増大及び/又は質の改善、例えば正しいN末端を有する。
本発明に従う発現カセットは、EP2258855A1に記載されるP.パストリスEpx1タンパク質のネイティブのリーダー(配列番号8)をコードする核酸を、明白に除外する。
本発明に従う発現カセットはさらに、P.パストリスEpx1タンパク質の完全長リーダーのアミノ酸1〜21を有するリーダーをコードする核酸、すなわちUS2011/0021378A1に記載される配列番号11を、明白に除外する。
本発明の特定の側面に従い、発現カセットは、任意に、発現構築物、例えばベクター内に、組み込まれる。
さらなる本発明の特定の側面に従い、発現カセット又は発現構築物は、リーダーをコードする核酸に作動可能に連結したプロモーターを含む。
本発明の特定の態様に従い、本発明は、本発明に従う発現カセットを含む組換え酵母宿主細胞、具体的には、酵母宿主細胞株、より具体的には、生産細胞株を提供する。本発明の特定の側面に従い、本発明に従う発現カセットは、ベクター、又はベクターの一部である。
好ましくは、酵母は、ピキア属、カンジダ属(Candida)、トルロプシス属(Torulopsis)、アークスラ属(Arxula)、ハンゼヌラ属(Hansenula)、オガテア属(Ogatea)、ヤロウイア属(Yarrowia)、クリベロミセス属(Kluyveromyces)、サッカロミセス属(Saccharomyces)、コマガタエラ属(Komagataella)、好ましくは、メチロトローフ酵母、及び特に好ましいP.パストリス、コマガタエラ・パストリス、K.ファフィ(K.phaffii)又はK.シュードパストリス(K.pseudopastoris)からなる群の属から選択される。
別の特定の態様に従い、本発明は、酵母宿主細胞においてPOIを産生する方法を提供し、この方法は、
本発明の宿主細胞を準備すること、
上記宿主細胞を培養し、上記POIを発現させること、及び
上記POIを精製し、精製POIの調製を得ること
を含む。
本発明の宿主細胞を準備すること、
上記宿主細胞を培養し、上記POIを発現させること、及び
上記POIを精製し、精製POIの調製を得ること
を含む。
本発明に従い、発現カセットは、好ましくは、酵母宿主細胞において組換え遺伝子の分泌を促進するために使用され、それによって、分泌産物の収量を増大する。
従って、本発明に従う発現カセットは、この発現カセットによって形質転換された宿主細胞におけるPOIの効率的な発現及び分泌を提供する。この点において、本発明に従う発現カセットは、酵母発現カセットと理解される。
具体的に、このPOIは、組換えタンパク質である。この語は、ここで常に、ポリペプチド及びタンパク質の両方、例えば組換え宿主細胞によって産生されるものを含むと理解される。POIは、異種タンパク質、例えば酵母とは異種の、例えば、より高度な真核生物、例えばヒトに由来するタンパク質、若しくはP.パストリス以外の酵母種に由来するタンパク質、又は人工のポリペプチド若しくはタンパク質など、であってもよい。或いは、POIは、酵母、例えばP.パストリスに由来する同種のタンパク質であってもよい。
しかし、これは、本発明に従うベクターによって形質転換されていないネイティブの酵母によっては発現されない又は所望の量で発現されないが、本発明に従う組換え酵母宿主細胞によって、所望の量で発現される(例えば、有為な量のPOI又は代謝産物を産生するように過剰発現される)。
しかし、これは、本発明に従うベクターによって形質転換されていないネイティブの酵母によっては発現されない又は所望の量で発現されないが、本発明に従う組換え酵母宿主細胞によって、所望の量で発現される(例えば、有為な量のPOI又は代謝産物を産生するように過剰発現される)。
具体的には、POIは、ネイティブのN末端アミノ酸配列を有するアミノ酸配列を有する。このPOIは、好ましくは、N末端アミノ酸残基として追加のアラニンを含まないアミノ酸配列を含む。具体的には、このPOIは、リーダー配列に由来する追加のN末端アミノ酸残基を有さない。このことは、組換えタンパク質産生の質及び産生の容易さにおいて、特に重要である。
具体的には、上記POIは、分泌ポリペプチド又はタンパク質であり、これは、可溶性の細胞外分子又は膜結合分子を含む。
具体的には、上記POIは、治療用タンパク質から選択され、これは、抗体又はその断片、酵素及びペプチド、タンパク質抗生物質、毒素融合タンパク質、炭水化物−タンパク質結合体、構造タンパク質、調節タンパク質、ワクチン及びワクチン様タンパク質又は粒子、プロセス酵素、成長因子、ホルモン並びにサイトカインを含む。又は、上記POIは、宿主細胞代謝産物の産生を媒介する。POIはまた、宿主細胞代謝産物の産生を媒介する発現産物であってもよい。
具体的には、POIは、成長因子、ホルモン、サイトカイン、抗体及び抗体断片、好ましくは、完全長抗体、例えばIgG、IgA、IgD、IgM又はIgEなど、scFv、ミニボディ、ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディ、Fab及びFc融合タンパク質からなる群、好ましくは、完全長抗体、scFv又はFabからなる群から選択される。
具体的には、POIは、アラニン以外のN末端アミノ酸残基を含む。従って、先行技術(EP2258855A1)において予測されたVSA−AP(配列番号6)のシグナルペプチダーゼ切断部位は存在しない。
具体的には、POIは、分泌タンパク質、例えばタンパク質の活性な形態又は前駆形態であり得る成熟タンパク質であってもよい。
本発明に従う方法は、好ましくは、培養細胞における宿主細胞の培養を提供し、そして上記POI又は代謝産物が、例えば、分泌POIとして得られ、これは、膜結合の若しくは可溶性若しくは細胞外のタンパク質又は代謝産物を含み、これらは、任意に、細胞培養上清から精製される。
さらなる側面に従い、本発明は、宿主細胞からのPOIの分泌のために、及び/又は宿主細胞からのPOIの分泌の増大のために、好ましくは、分泌POIの少なくとも60、65、70、75、80、85、90、95、98、又は100%がネイティブのN末端アミノ酸配列を含む、本発明の核酸又はリーダーの使用を提供し、特に、本発明のシグナルペプチド又は切断型リーダーをコードする核酸を、提供する。
明細書を通して使用される特定の用語は、以下の意味を有する。
ここで使用される用語「細胞株」は、延長された時間にわたって増殖する能力を獲得している特定の細胞の種類の確立されたクローンを指す。用語「宿主細胞株」は、内因性の若しくは組換えの遺伝子又はこのようなポリペプチドによって媒介されるポリペプチド若しくは細胞代謝産物を産生するための代謝経路の産物を発現するために使用される細胞株を指す。「産生宿主細胞株」又は「産生細胞株」は、産生プロセスの産物、例えばPOIを得るための、バイオリアクターにおける培養のための即時使用用の細胞株であることが、一般に理解されている。用語「酵母宿主」又は「酵母細胞株」又は「酵母宿主細胞」又は「宿主細胞」又は「宿主」は、POI又は宿主細胞代謝産物を産生するために培養され得る、任意の酵母細胞を意味する。
用語「発現」又は「発現系」又は「発現カセット」は、発現産物、例えばPOIの所望のコード配列及び制御配列、例えば作動可能な連結下にあるプロモーターを含むことによって、これらの配列によって形質転換されたか又はトランスフェクトされた宿主が、コードされたタンパク質又は宿主細胞代謝産物を産生することができる、核酸分子を指す。形質転換に作用するため、この発現系は、ベクターに含まれていてもよい;しかし、関連するDNAはまた、宿主染色体に組み込まれていてもよい。発現は、分泌又は非分泌の、ポリペプチド又は代謝産物を含む発現産物を指してもよい。具体的には、この用語は、例えば、ベクターによって運ばれて宿主細胞に導入された外来性のDNAによってコードされるタンパク質の発現について、好適な条件下の宿主細胞及び適合性のベクターを指す。
ここで使用される「発現構築物」又は「ベクター」は、好適な宿主生物において、クローニングした組換えヌクレオチド配列すなわち組換え遺伝子の転写及びそのmRNAの翻訳のために必要とされるDNA配列として定義される。発現ベクターは、発現カセットを含み、そしてさらに、一緒に作動可能に連結した、宿主細胞又はゲノム組み込み部位における自律複製のための起点、1以上の選択可能マーカー(例えば、アミノ酸合成遺伝子又は抗生物質、例えばゼオシン、カナマイシン、G418若しくはヒグロマイシンに対する抵抗性を付与する遺伝子)、いくつかの制限酵素切断部位、好適なプロモーター配列及び転写ターミネーターを通常含む。ここで使用される用語「プラスミド」及び「ベクター」は、自律複製するヌクレオチド配列、並びにゲノムに組み込まれるヌクレオチド配列を含む。
具体的には、この用語は、これによって、DNA又はRNAの配列(例えば外来性遺伝子)が宿主細胞に導入されて、宿主を形質転換させ、そして導入した配列の発現(例えば転写及び翻訳)を促進し得る、ビヒクルを指す。プラスミドは、本発明の好ましいベクターである。
ベクターは、典型的には、外来性のDNAが挿入されている、感染因子であるDNAを含む。DNAの1つのセグメントをDNAの別のセグメント内に挿入する一般的方法は、制限部位と呼ばれる特定の部位(ヌクレオチドの特定の群)でDNAを切断する、制限酵素と呼ばれる酵素の使用を含む。「カセット」は、所定の制限部位にてベクター内に挿入され得るDNAコード配列又は発現産物をコードするDNAのセグメントを指す。カセット制限部位は、正確なリーディングフレーム内でのカセットの挿入を保証するように設計される。一般に、外来性のDNAは、ベクターDNAの1以上の制限部位にて挿入され、次いで、ベクターによって感染性ベクターDNAと共に宿主細胞内に運ばれる。挿入されたか又は付加されたDNAを有するDNAのセグメント又は配列、例えば発現ベクターはまた、「DNA構築物」とも呼ばれる。一般的な種類のベクターは、「プラスミド」であり、これは、一般に、二本鎖DNAの自己完結型分子であり、追加の(外来性の)DNAを容易に受け入れ、好適な宿主細胞内に容易に導入され得る。プラスミドベクターは、多くの場合、コードDNA及びプロモーターDNAを含み、そして、外来性のDNAを挿入するために好適な、1以上の制限部位を有する。コードDNAは、特定のポリペプチド又はタンパク質、例えばPOIについての特定のアミノ酸配列をコードするDNA配列である。プロモーターDNAは、コードDNAの発現を開始するか、調節するか、又はそれ以外で媒介するか若しくは制御するDNA配列である。プロモーターDNA及びコードDNAは、同じ遺伝子由来であっても、又は異なる遺伝子由来であってもよく、同じ又は異なる生物由来であってもよい。組換えクローニングベクターは、多くの場合、クローニング又は発現のための1以上の複製系、宿主における選別のための1以上のマーカー、例えば抗生物質抵抗性、及び1以上の発現カセットを含む。
例えば配列番号1のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドなどの本発明に従う調節配列に関して、又は配列番号10のアミノ酸配列を有するリーダーに関して、ここで使用される用語「機能的バリアント」は、アミノ酸配列において1又は2の点変異を有し、非改変配列と比較して実質的に同じシグナル又はリーダーの活性を有する、これらのバリアントを指す。本発明の核酸の機能的バリアントは、任意の本発明のシグナルペプチド又はリーダーをコードするコドン最適化配列(ここではまた「コドン最適化バリアント」とも呼ばれる)を、さらに含む。核酸のこのようなコドン最適化は、異種の系において発現される組換えDNAにおける、発現のために使用される生物におけるコドン使用頻度のパターンに適合させるための、コドンの体系的改変として理解される。本発明は、具体的には、発現されたタンパク質の収量を増大するものである。
ここで使用される用語「シグナルペプチド」、「リーダー」又は「切断型リーダー」は、常に、それぞれ配列番号1及び配列番号10の特定のアミノ酸、並びにまた、1又は2の点変異を有するその機能的バリアントを指すものと理解される。
ここで使用される用語「実質的に同じシグナル又はリーダーの活性」は、組換え宿主細胞による上清へのPOIの実質的に同じ分泌によって示される活性を指す;例えば、上清におけるPOIレベルが、それぞれ配列番号1又は配列番号10のリーダーによって提供される上清におけるPOIレベルの少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%である。
点変異は、1以上の単一(非連続の)アミノ酸の異なるアミノ酸への置換又は交換によって非操作アミノ酸配列と異なっているアミノ酸配列の発現をもたらすポリヌクレオチドの操作として理解される。好ましい機能的バリアントは、それぞれ配列番号1及び配列番号10の3位及び16位において、1以上の点変異を有する。
さらに好ましい点変異は、同じ極性及び/又は電荷のアミノ酸の交換を指す。この点において、アミノ酸は、64のトリプレットコドンによってコードされる20の天然に存在するアミノ酸を指す。これらの20のアミノ酸は、中性の電荷、正の電荷、及び負の電荷を有するものに分類されてもよい:
「中性」のアミノ酸は、そのそれぞれの3文字及び1文字のコード並びに極性と共に、以下に示される:
アラニン:(Ala、A)非極性、中性;
アスパラギン:(Asn、N)極性、中性;
システイン:(Cys、C)非極性、中性;
グルタミン:(Gln、Q)極性、中性;
グリシン:(Gly、G)非極性、中性;
イソロイシン:(Ile、I)非極性、中性;
ロイシン:(Leu、L)非極性、中性;
メチオニン:(Met、M)非極性、中性;
フェニルアラニン:(Phe、F)非極性、中性;
プロリン:(Pro、P)非極性、中性;
セリン:(Ser、S)極性、中性;
トレオニン:(Thr、T)極性、中性;
トリプトファン:(Trp、W)非極性、中性;
チロシン:(Tyr、Y)極性、中性;
バリン:(Val、V)非極性、中性;及び
ヒスチジン:(His、H)極性、正(10%)中性(90%)。
「中性」のアミノ酸は、そのそれぞれの3文字及び1文字のコード並びに極性と共に、以下に示される:
アラニン:(Ala、A)非極性、中性;
アスパラギン:(Asn、N)極性、中性;
システイン:(Cys、C)非極性、中性;
グルタミン:(Gln、Q)極性、中性;
グリシン:(Gly、G)非極性、中性;
イソロイシン:(Ile、I)非極性、中性;
ロイシン:(Leu、L)非極性、中性;
メチオニン:(Met、M)非極性、中性;
フェニルアラニン:(Phe、F)非極性、中性;
プロリン:(Pro、P)非極性、中性;
セリン:(Ser、S)極性、中性;
トレオニン:(Thr、T)極性、中性;
トリプトファン:(Trp、W)非極性、中性;
チロシン:(Tyr、Y)極性、中性;
バリン:(Val、V)非極性、中性;及び
ヒスチジン:(His、H)極性、正(10%)中性(90%)。
「正」に荷電したアミノ酸は:
アルギニン:(Arg、R)極性、正;及び
リシン:(Lys、K)極性、正である。
アルギニン:(Arg、R)極性、正;及び
リシン:(Lys、K)極性、正である。
「負」に荷電したアミノ酸は:
アスパラギン酸:(Asp、D)極性、負;及び
グルタミン酸:(Glu、E)極性、負である。
アスパラギン酸:(Asp、D)極性、負;及び
グルタミン酸:(Glu、E)極性、負である。
核酸、POI又は他の化合物に関してここで使用される用語「単離された」又は「単離」は、天然に関連する環境から十分に分離されていて、「実質的に純粋な」形態で存在する化合物を指すものとする。「単離された」は、他の化合物若しくは材料との人工すなわち合成の混合物、又は基本的な活性に干渉しない不純物の存在の除外を必ずしも意味するとは限らず、これらは、例えば、不完全な精製に起因して存在していてもよい。特に、本発明の単離された核酸分子はまた、化学的に合成されたものを含むことをも意味する。本発明の核酸に関して、用語「単離された核酸」は、時々使用される。この用語は、DNAに適用される場合、それが由来する生物の天然に存在するゲノムにおいてそれがすぐ連続している配列から分離されているDNA分子を指す。例えば、「単離された核酸」は、ベクター、例えばプラスミド又はウイルスベクター内に挿入されたか、又は原核生物若しくは真核生物の細胞又は宿主生物のゲノムDNA内に組み込まれたDNA分子を含んでもよい。具体的には、本発明に従う用語「単離された核酸」は、EPX1タンパク質をコードする核酸が、本発明に従うリーダーをコードする核酸に連結されることを除外する。RNAに適用される場合、用語「単離された核酸」は、主に、上で定義された単離されたDNA分子によってコードされるRNA分子を指す。或いは、この用語は、その天然の状態(すなわち、細胞内又は組織内)において関連している他の核酸から十分に分離されているRNA分子を指してもよい。「単離された核酸」(DNA又はRNAのどちらか)は、生物学的又は合成的な手段によって、直接的に産生され、その産生の間に存在した他の成分から分離される分子を、さらに表す。
ここで使用される用語「リーダー」は、以下のように理解される。本発明の発現カセットにおけるポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、POIの分泌を指向する、分泌又はシグナルペプチドをコードするさらなるコード領域に関連し得る。分泌経路へと運命付けられたタンパク質は、初期のタンパク質鎖の粗面小胞体を横切る運び出しが一旦開始されたら成熟タンパク質から切断される、N末端リーダー配列を有する。リーダーは、発現されたタンパク質の、細胞膜に向かって、又は細胞膜の外側への輸送を誘導し、それによって、発現されたタンパク質が分離され、そして精製されることを容易にする。一般に、ペリプラズム空間、細胞膜又は細胞外に輸送される膜タンパク質又は分泌タンパク質は、このようなN末端配列を含む。通常、リーダーは、タンパク質が輸送された後、特定化細胞性ペプチダーゼによってタンパク質から切断される。
真核生物細胞によって分泌されたタンパク質は、一般に、このタンパク質のN末端に融合したリーダー配列を有し、これは、完全な、すなわち「完全長の」タンパク質から切断されて、このタンパク質の分泌又は「成熟」形態を産生する。
本発明に従うリーダーの特定の例は、シグナルペプチドからなるリーダー、又はシグナルペプチド及びプロ配列からなるリーダー、例えばここで記載される切断型リーダーである。配列番号1のシグナルペプチドからなるリーダー、又は配列番号10の切断型リーダーは、ここでまた、本発明に従う調節配列とも呼ばれる。
ここで使用される用語は、特に、POI発現の改変を可能にするための制御配列を指す。リーダー(リーダーペプチドとも呼ばれる)は、POIアミノ酸配列のN末端に連結される。リーダーをコードする核酸は、POIをコードする核酸配列の5’末端よりも上流であり、これに作動可能に連結している。選択した宿主細胞において機能する、本発明に従う任意のリーダー配列が、使用されてもよい。
用語「ネイティブのN末端アミノ酸残基」又は「ネイティブのN末端アミノ酸配列」は、N末端配列の1以上のアミノ酸、例えば挙げられたPOIのN末端アミノ酸残基を指すものと理解される。このアミノ酸残基は、発現される挙げられたPOIの配列と比較した場合に、正しいものであると考えられる。従って、ネイティブのN末端アミノ酸残基は、正しい完全なアミノ酸配列を得るために、例えばPOIに対し外来性である追加の(余分な)N末端アミノ酸残基を有さない機能的化合物を得るために必須であるPOIのネイティブのN末端又はN末端領域を提供する。典型的には、任意の野生型タンパク質は、ネイティブのN末端アミノ酸残基を有すると理解される。また、組換えタンパク質もまた、タンパク質の所望の特性を呈示する、前に定義されたネイティブのN末端アミノ酸残基を有してもよい。
具体的には、本発明のシグナルペプチド又は切断型リーダーがPOIのネイティブのN末端アミノ酸残基に直接結合する場合、遊離したタンパク質は、少なくとも一定の程度、天然のN末端アミノ酸残基を含み、そして典型的には、可変長のN末端伸長を含まない。
POIの好ましい組成物は、少なくとも一定の程度、好ましくは、POI分子の大部分、又はPOI分子の少なくとも60、65、70、75、80、85、90、95、98、若しくは100%(w/w)、N末端に追加のアミノ酸残基を有することなく、例えばシグナルペプチド若しくはプロ配列、又はその断片に由来するように、正しいN末端を含むネイティブのN末端アミノ酸残基によって特徴付けられる。
POIの好ましい組成物は、少なくとも一定の程度、好ましくは、POI分子の大部分、又はPOI分子の少なくとも60、65、70、75、80、85、90、95、98、若しくは100%(w/w)、N末端に追加のアミノ酸残基を有することなく、例えばシグナルペプチド若しくはプロ配列、又はその断片に由来するように、正しいN末端を含むネイティブのN末端アミノ酸残基によって特徴付けられる。
ここで使用される用語「プロ配列」は、POIのN末端に作動可能に連結した前駆体アミノ酸配列を指すものとする。プロ配列はまた、プロ配列のN末端に作動可能に連結したシグナル配列を有してもよい。典型的には、プロ配列は、POIから切断され、POIの成熟形態を残す。
本発明に従うプロ配列の特定の例は、切断型リーダーの一部であり、以下のアミノ酸配列を有し:
配列番号7:APVAPAEEAANHLHKR
すなわち、切断型プロ配列:配列番号10の切断型リーダー配列のアミノ酸21〜36である。
配列番号7:APVAPAEEAANHLHKR
すなわち、切断型プロ配列:配列番号10の切断型リーダー配列のアミノ酸21〜36である。
ここで使用される用語「作動可能に連結する」は、1以上のヌクレオチド配列の機能がこの核酸分子上に存在する少なくとも1の他のヌクレオチド配列によって影響を受ける方法での、単一核酸分子、例えばベクターの上の、ヌクレオチド配列の結合を指す。例えば、プロモーターは、コード配列の発現に作用可能である場合、組換え遺伝子のこのコード配列と作動可能に連結する。さらなる例として、シグナルペプチドをコードする核酸は、タンパク質を、分泌形態、例えば成熟タンパク質の前駆形態又は成熟タンパク質で発現可能である場合、POIをコードする核酸配列に作動可能に連結する。具体的には、互いに作動可能に連結したこのような核酸は、直接に、すなわち、シグナルペプチドをコードする核酸とPOIをコードする核酸配列との間にさらなる要素又は核酸配列を有することなく、連結されてもよい。
ここで使用される「プロモーター」は、コード配列又は機能的RNAの発現を制御することができるDNA配列を指す。プロモーター活性は、その転写効率によって評価されてもよい。これは、例えば、プロモーターからのmRNA転写の量のノーザンブロッティングによる測定により直接決定されてもよいか、又は、プロモーターから発現された遺伝子産物の量の測定によって、間接的に決定されてもよい。
ここで使用される用語「目的のタンパク質(POI)」は、宿主細胞において組換え技術によって産生されたポリペプチド又はタンパク質を指し、組換えPOI又は組換え宿主細胞によって産生されたPOIとも呼ばれる。より具体的には、組換えPOIは、宿主細胞において天然に存在しない、すなわち、異種タンパク質であってもよく、又はさもなければ、宿主細胞に対してネイティブである、すなわち、宿主細胞と同種のタンパク質であってもよいが、例えば、POIをコードする核酸配列を有する自己複製ベクターによる形質転換によって、又はPOIをコードする核酸配列の1以上のコピーの組換え技術による宿主細胞のゲノムへの組み込みの際に、又は例えばプロモーター又はシグナル配列のPOIをコードする遺伝子の発現を制御する1以上の調節配列の組換え改変によって、産生される。特定の場合において、異種又は同種のどちらかのPOIである組換えPOIは、組換え宿主細胞によって過剰発現され、高収量の産物を得ている。いくつかの場合、ここで使用される用語POIはまた、組換え的に発現されたタンパク質によって媒介された宿主細胞による任意の代謝産物を指す。
ここで使用される用語「分泌」は、ポリペプチド又はタンパク質、具体的にはPOIの、宿主植物細胞の細胞膜及び細胞壁の両方を横切った移行を指す。分泌POIは、細胞壁の中につなぎ止められている膜結合タンパク質として細胞膜の一部であってもよく、又は、細胞上清に可溶性タンパク質として放出されてもよい。
POIに関してここで使用される用語「分泌」は、具体的には、膜結合POI又は細胞外POIのどちらかのPOIの成熟形態(活性タンパク質の前駆形態又は活性タンパク質を含む)での発現を含むことが、理解される。
ここで使用される用語「組換え」は、「遺伝子操作によって調製されるか、又は遺伝子操作の結果」を意味する。従って、「組換え微生物」は、少なくとも1の「組換え核酸」を含む。組換え微生物は、具体的には発現ベクター又はクローニングベクターを含むか、又は、組換え核酸配列を含むように遺伝子操作されている。「組換えタンパク質」は、宿主においてそれぞれの組換え核酸を発現することによって産生される。
本発明の核酸分子又はペプチド/ポリペプチド/タンパク質は、好ましくは、組換え体であり、リーダーとPOIとの融合のために提供される。ここで使用される「組換え」は、例えば、化学的合成又は遺伝子操作技術による核酸の単離されたセグメントの操作による、そうでなければ分離されている2つの配列のセグメントの人工的な組合せを指す。「組換え」はまた、異種核酸の導入により改変されている、細胞又は発現カセット、又はそのように改変されている細胞に由来する細胞に対する言及をも含むが、天然に存在する事象(例えば、自発的変異、天然の形質転換/形質導入/転移)、例えば熟考したヒトの介入によらずに起こるものによる細胞又はベクターの変化を含まない。
ここで使用される用語「シグナル配列」は、タンパク質の輸送を指示する、通常は短い(3〜60アミノ酸長)ペプチド鎖であるシグナルペプチドをコードする核酸を指すものとする。シグナルペプチドはまた、標的化シグナル、運搬ペプチド又は局在化シグナルとも呼ばれる。シグナルペプチドは、具体的には発現されたタンパク質の、分泌経路に沿った輸送を誘導する。一般に、ペリプラズム空間、細胞膜又は細胞外に輸送される膜タンパク質又は分泌タンパク質は、このようなN末端シグナル配列を含む。通常、シグナルペプチドは、初期のタンパク質鎖の小胞体への移行が一旦達成されると、シグナルペプチダーゼによって、成熟タンパク質から切断される。
本発明に従って使用されるシグナルペプチドの特定の例は、配列番号1のシグナルペプチド、又は1若しくは2の点変異を有するその機能的バリアントである。本発明に従って使用されるシグナルペプチドは、典型的には、配列番号6の切断部位の存在がなくとも、アミノ酸Ala20の後の切断を提供する、本来の特徴を有する。
シグナルペプチドは、典型的には、POIをコードする核酸配列が続き、任意にシグナル配列の下流及びPOIコード配列の上流にプロ配列を有する、核酸配列によってコードされる。
ここで使用される用語「実質的に純粋」又は「精製された」は、化合物、例えば核酸分子又はPOIの少なくとも50%(w/w)、好ましくは、少なくとも60%、70%、80%、90%又は95%を含む調製物を指す。純度は、化合物に適した方法(例えば、クロマトグラフィー方法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、HPLC分析など)によって、測定される。
本発明に従う特定のシグナルペプチドをコードする新規な単離された核酸を、同定し、そして性質決定して、シグナルペプチドが、続くアミノ酸残基から独立したC末端における切断を提供する本来の特性を組み込むことが見出されたことは、驚くべきことであった。これは、ここでは、C末端における「本来の分泌部位」とも呼ばれた。従って、一旦リーダーが切断されると、シグナルペプチド配列に続くアミノ酸配列は、正確な、ネイティブのN末端アミノ酸配列を有する。
予期せぬことに、本発明に従うシグナルペプチドをコードする核酸を用いる場合、ネイティブのP.パストリスEpx1リーダーのシグナル配列とプロ配列との間、すなわち、20位と21位との間に位置することが当該分野で公知である、シグナルペプチダーゼについての切断部位:VSA−AP(配列番号6)のハイフンで示される切断部位は、省略できる。従って、改善された発現系は、POIの正しいネイティブのN末端アミノ酸残基を提供され得た。これは、具体的には、N末端アミノ酸残基として追加のアラニンを含まず、少なくとも一定の程度、例えば、POI分子の殆どがネイティブのN末端配列を100%まで含んだ(LC−MSによって決定された場合)。
従って、20アミノ酸のシグナルペプチドをコールする即時使用用の単離された核酸が、初めて使用可能であった。先行技術の(例えば、US20110021378A1の)シグナル配列は、常に、C末端において、少なくとも1つの追加のアミノ酸残基を含んだ。これは、アラニンであり、発現されるタンパク質の誤ったN末端を生じ得る。
同様に、本発明に従う切断型リーダーは、続くアミノ酸残基から独立したC末端における切断を提供する本来の特性を組み込むことが見出された。これは、ここでは、C末端における「本来の切断部位」とも呼ばれる。従って、切断型リーダーのC末端に続くか、又は切断型リーダーのプロ配列のC末端に続くアミノ酸配列は、このリーダーが一旦切断された後は、正しい、ネイティブのN末端アミノ酸配列を有する。
本発明の単離された核酸及び発現ベクターは、従って、ネイティブのN末端アミノ酸残基を有するPOIの発現及び分泌を提供する。より驚くべきことに、21アミノ酸配列(すなわち、例えばUS20110021378A1において示唆されたように、C末端における追加のアラニンによって伸長された20アミノ酸シグナルペプチド)によって実行された実験と比較した際に、20アミノ酸シグナルペプチドによる分泌収量はずっと多かった。
従って、本発明の別の態様は、本発明に従う核酸又はリーダーペプチドの、POIの分泌のための、及び/又は宿主細胞由来のPOIの分泌を増大するための使用である。ここで、好ましくは、少なくとも60、65、70、75、80、85、90、95、98、又は100%のPOIが、本発明に従うリーダーが一旦切断された後、ネイティブのN末端アミノ酸配列を含む。好ましくは、分泌の増大は、公知のシグナルペプチドである配列番号21と比較して、1.15倍、1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍以上である。最も好ましくは、POIは、以下でさらに定義される抗体若しくは断片又はその誘導体である。
さらに、先行技術のネイティブの完全長リーダーの僅か63%の長さを有する(従って、配列番号8の完全長リーダー配列の有為な部分よりも短い)切断型リーダー配列が使用され得ることが、予期せず見出された。完全長リーダー配列によって実施された実験と比較して、切断型リーダーにより、増大さえした分泌収量が見出されたことは、驚くべきことであった。
本発明に従って、単離された核酸又は発現カセット又はベクターは、天然によって使用されるか、又は組換え発現系において典型的に使用される他の従来の調節エレメント又は配列と共に使用され得、例えば、高収量での組換えタンパク質産生のための構築物を提供する。調節配列の例としては、プロモーター、オペレーター及びエンハンサー、リボソーム結合部位、並びに転写及び翻訳の開始及び停止を制御する配列が、挙げられる。
関連の配列の機能を証明するため、発現カセット又はベクターを、POIの発現を駆動するように構築してもよく、発現された及び/又は分泌された収量を、従来の調節エレメントを有する構築物と比較する。実験手順の詳細な記載は、以下の実施例において見出され得る。
同定された配列は、P.パストリスから特定のヌクレオチドプライマーを用いたPCRによって増幅され、POIのN末端又はPOI配列の上流に機能的に連結した酵母発現ベクター内にクローニングし、そして酵母宿主細胞株、例えばP.パストリス内に、種々の異なるPOIの、分泌形態での高レベル生産のために、形質転換された。POIの収量に対する調節配列、例えば本発明に従うシグナル配列及び切断型リーダーの効果を推定するために、本発明に従って得られた酵母宿主細胞株は、従来の調節エレメントを含む株と比較して、振とうフラスコ実験及びフェドバッチ又はケモスタット発酵において培養されてもよい。
本発明の調節配列、特にシグナルペプチド又は切断型リーダーをコードする配列及び発現ベクターにより、本発明に従う方法は、好ましくは、酵母宿主細胞及び特に、P.パストリス宿主細胞において、分泌の増強による産生の増大を提供するだけでなく、より高い質のPOIも、提供する。POIの分泌における増大は、先行技術のエレメントと比較してタンパク質分泌を増大する調節配列、特にシグナル配列又は切断型リーダーの存在下での、分泌収量の比較に基づいて決定される。
POIは、任意の真核生物の、原核生物の又は合成のポリペプチドであり得る。これは、膜結合タンパク質又は細胞外発現タンパク質のどちらかとして、成熟タンパク質として分泌され得る。本発明はまた、天然に存在するタンパク質の、機能的に同等なバリアント、誘導体及び生物学的活性断片の組換え産生をも提供する。機能的に同等なバリアントは、好ましくは、実質的に同じ機能的特徴又は活性を有する。
ここでいうPOIは、真核生物宿主細胞に同種の産物であってもよく、又は治療的、予防的、診断的、分析的又は産業的使用のための、異種の産物であってもよい。
POIは、好ましくは、酵母細胞において産生された異種の組換えポリペプチド又はタンパク質である。
具体的には、POIは、真核生物タンパク質、好ましくは、哺乳動物タンパク質である。
本発明に従って産生されるPOIは、マルチマータンパク質、好ましくは、ダイマー又はテトラマーであってもよい。
本発明の1つの側面に従い、POIは、組換え又は異種のタンパク質であり、好ましくは、抗体若しくはその断片、酵素及びペプチド、タンパク質抗生物質、毒素融合タンパク質、炭水化物−タンパク質結合体、構造タンパク質、調節タンパク質、ワクチン及びワクチン様タンパク質若しくは粒子、プロセス酵素、成長因子、ホルモン及びサイトカイン、又はPOIの代謝産物を含む、治療用タンパク質から選択される。
特定のPOIは、抗原結合分子、例えば抗体又はその断片である。特定のPOIの中でもとりわけ、抗体、例えばモノクローナル抗体(mAb)、免疫グロブリン(Ig)又は免疫グロブリンクラスG(IgG)、重鎖抗体(HcAb’s)又はその断片、例えば断片−抗原結合(Fab)、Fd、単一鎖可変断片(scFv)、又は操作されたそのバリアント、例えばFvダイマー(ダイアボディ)、Fvトリマー(トライアボディ)、Fvテトラマー、又はミニボディ、及び単一ドメイン抗体様VH若しくはVHH若しくはV−NARである。
さらなる特定のPOIは、アプロチニン、組織因子経路インヒビター又は他のプロテアーゼインヒビター、及びインスリン又はインスリン前駆体、インスリンアナログ、成長ホルモン、インターロイキン、組織プラスミノゲンアクチベーター、形質転換成長因子a又はb、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド1(GLP−1)、グルカゴン様ペプチド2(GLP−2)、GRPP、第VII因子、第VIIl因子、第XIII因子、血小板由来成長因子1、血清アルブミン、酵素類、例えばリパーゼ若しくはプロテアーゼ、又は機能的ホモログ、機能的に同等なバリアント、誘導体、並びにネイティブのタンパク質と類似の機能を有する生物学的に活性な断片である。POIは、ネイティブのタンパク質と構造的に類似であってもよく、ネイティブのタンパク質のC及びN末端のどちらか若しくは両方又は側鎖に対する1以上のアミノ酸の付加、ネイティブのアミノ酸配列における1又はいくつかの異なる部位における1以上のアミノ酸の置換、ネイティブのタンパク質のどちらか若しくは両方の末端、又はアミノ酸配列の1若しくはいくつかの部位における1以上のアミノ酸の欠失、或いは、ネイティブのアミノ酸配列1以上の部位における1以上のアミノ酸の挿入によってネイティブのタンパク質に由来してもよい。このような改変は、上述のタンパク質のいくつかについて、周知である。
POIはまた、生化学反応又はいくつかの反応のカスケードの産物を得る目的で、例えば、宿主細胞の代謝産物を得るために、宿主細胞において生化学反応を提供する基質、酵素、インヒビター又は補因子から選択され得る。産物の例は、本発明に従う組換えタンパク質又はPOIの発現の後に増大した収量で得られ得る、ビタミン、例えばリボフラビン、有機酸及びアルコールであり得る。
具体的には、本発明に従う組換え産物を発現する宿主細胞は、POIの組換え発現に好適な任意の酵母細胞であり得る。
好ましい宿主細胞は、ピキア属、カンジダ属、トルロプシス属、アークスラ属、ハンゼヌラ属、オガテア属、ヤロウイア属、クリベロミセス属、サッカロミセス属又はコマガタエラ属から選択され、好ましくはメチロトローフ酵母であり、そして具体的に好ましくは、P.パストリス、コマガタエラ・パストリス、K.ファフィ、又はK.シュードパストリスから選択される。
本発明に従う好ましい宿主細胞の例としては、ピキア属、例えばP.パストリス若しくはP.メタノリカ(P.methanolica)、又はコマガタエラ属、例えばK.パストリス、K.シュードパストリス若しくはK.ファフィが挙げられるが、これらに限定されない。
新しい文献は、ピキア・パストリスを、コマガタエラ・パストリス、コマガタエラ・ファフィ及びコマガタエラ・シュードパストリスに分類し、再命名している。ここでは、ピキア・パストリスは、コマガタエラ・パストリス、コマガタエラ・ファフィ及びコマガタエラ・シュードパストリスの全てに、同時に使用される。
P.パストリス株の例としては、CBS 704(=NRRL Y−1603=DSMZ 70382)、CBS 2612(=NRRL Y−7556)、CBS 7435(=NRRL Y−11430)、CBS 9173−9189(CBS株:CBS−KNAW Fungal Biodiversity Centre、Centraalbureau voor Schimmel−cultures、ユトレヒト、オランダ)、及びDSMZ 70877(German Collection of Micro−organisms and Cell Cultures)が挙げられるが、Invitrogen由来の株、例えばX−33、GS115、KM71及びSMD1168もまた、挙げられる。上述の株の全ては、形質転換体を産生しそして異種遺伝子を発現させるために、首尾よく使用されている。
本発明に従って、本発明に従うシグナル配列又は切断型リーダーに作動可能に連結したプロモーター配列を含むベクターによって形質転換された酵母宿主細胞を準備することが、好ましい。
本発明の好ましい様式に従い、本発明に従う発現カセットは、プロモーター、例えばP.パストリスpGAP(グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ)プロモーター、pAOX(アルコールオキシダーゼ)プロモーター若しくは配列番号9(図1、pG1プロモーター)、又はこれらの機能的バリアントを含む。有意な配列活性は、このようなプロモーター配列の一部分によってのみ得られてもよい。具体的には、少なくとも150の連続する塩基すなわちbpからなるプロモーター配列の好ましい部分は、より好ましくは、少なくとも200bp、少なくとも300bp、少なくとも400bp、少なくとも500bp、少なくとも600bp、少なくとも700bp、少なくとも800bp若しくは少なくとも900bpからなる。好ましくは、プロモーター領域の3’末端は、プロモーター配列の好ましい部分に含まれる。
好ましい発現系において、プロモーターは、誘導性又は構成的なプロモーターである。
このプロモーターは、内因性プロモーターであってもよく、又は宿主細胞に対して異種であってもよい。誘導性プロモーターの好ましい例は、pG1プロモーターであり、これは、グルコース限定条件によって誘導性であり、配列番号9のヌクレオチド配列を有する。
このプロモーターは、内因性プロモーターであってもよく、又は宿主細胞に対して異種であってもよい。誘導性プロモーターの好ましい例は、pG1プロモーターであり、これは、グルコース限定条件によって誘導性であり、配列番号9のヌクレオチド配列を有する。
本発明に従う特定の宿主細胞は、異種の又は組換えのプロモーター配列を含み、これは、産生宿主とは異なる株に由来していてもよく、例えば、別の酵母株、例えばS.セレビシエ株などに由来していてもよい。別の特定の態様において、本発明に従う宿主細胞は、宿主細胞と同じ属、種又は株に起源を有するプロモーターを含む、本発明に従う組換え発現構築物を含む。
プロモーターは、宿主細胞において転写活性を示し、宿主と同種であるか又は異種であるかのどちらかのタンパク質をコードする遺伝子に由来していてもよい、任意のDNA配列であってもよい。プロモーターは、好ましくは、宿主細胞に同種のタンパク質をコードする遺伝子に由来する。
例えば、本発明に従うプロモーターは、酵母、例えばS.セレビシエ株に由来していてもよい。なお、具体的に好ましい態様は、P.パストリス産生宿主細胞株において組換えPOIを産生する方法における使用のために、P.パストリスに起源を有するプロモーターを利用する。ヌクレオチド配列と同種の起源は、同じ属又は種の宿主細胞内へのその組み込みを容易にし、従って、恐らくは産業製造プロセスにおいて収量が増大した、POIの安定的産生を可能にする。また、他の好適な酵母若しくは他の真菌又は他の生物、例えば脊椎動物若しくは植物由来のプロモーターの機能的に活性なバリアントもまた、使用され得る。
酵母宿主細胞による使用のためのさらなる好適なプロモーター配列は、細胞内で高い濃度で存在することが知られる代謝酵素(例えば、解糖酵素、例えばトリオースリン酸イソメラーゼ(TPI)、ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)、アルコールオキシダーゼ(AOX)、ラクターゼ(LAC)及びガラクトシダーゼ(GAL))をコードする遺伝子から得られるプロモーターが挙げられてもよいが、これらに限定されない。
好適なプロモーターの好ましい例は、酵母細胞において遺伝子転写のためのプロモーターとして機能するDNA配列を含む酵母プロモーターである。好ましい例は、S.セレビシエMal、TPI、CUP、ADH若しくはPGKプロモーター、又はP.パストリスグルコース−6−リン酸イソメラーゼプロモーター(PPGI)、3−ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター(PPGK)若しくはグリセロールアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼプロモーターPGAP、アルコールオキシダーゼプロモーター(PAOX)、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼプロモーター(PFLD)、イソクエン酸リアーゼプロモーター(PICL)、翻訳伸長因子プロモーター(PTEF)、及びP.パストリスエノラーゼ1のプロモーター(PENO1)、トリオースリン酸イソメラーゼ(PTPI)、アルファ−ケトイソカプロン酸デカルボキシラーゼ(PTHI)、リボソームサブユニットタンパク質(PRPS2、PRPS7、PRPS31、PRPL1)、熱ショックタンパク質ファミリーメンバー(PSSA1、PHSP90、PKAR2)、6−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(PGND1)、ホスホグリセリン酸ムターゼ(PGPM1)、トランスケトラーゼ(PTKL1)、ホスファチジルイノシトールシンターゼ(PPIS1)、第一鉄−O2−オキシドレダクターゼ(PFET3)、高親和性鉄パーミアーゼ(PFTR1)、抑制可能アルカリホスファターゼ(PPHO8)、N−ミリストイルトランスフェラーゼ(PNMT1)、フェロモン反応転写因子(PMCM1)、ユビキチン(PUBI4)、一本鎖DNAエンドヌクレアーゼ(PRAD2)及びミトコンドリア内膜の主要ADP/ATPキャリアのプロモーター(PPET9)である。
POIが、宿主細胞に対して同種のタンパク質、すなわち、宿主細胞において天然に存在するタンパク質である場合、宿主細胞におけるPOIの発現は、ネイティブのプロモーター配列の、宿主細胞に対して異種のプロモーター配列又は宿主細胞に対して同種であるがこのPOIのネイティブのプロモーター配列とは異なるプロモーター配列との交換によって、調節されてもよい。
新規なプロモーターを導入するこの目的は、例えば、部位特異的組換えを可能にする標的遺伝子、プロモーター配列及び宿主細胞に好適な選択可能マーカーの、同種配列を含む組換えDNA分子による宿主細胞の形質転換によって、達成されてもよい。部位特異的組換えは、プロモーター配列を、POIをコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結するために行わなければならない。これは、ネイティブのプロモーター配列の代わりに異種プロモーター配列からのPOIの発現をもたらす。
本発明の具体的に好ましい態様において、プロモーター配列は、POIのネイティブのプロモーター配列に対して増大したプロモーター活性を有する。
本発明に従い、本発明に従うシグナル配列又は切断型リーダーを含む、本発明に従うワイルドカードベクター又は発現カセットを提供することも可能である。このようなワイルドカードベクター又は発現カセットは、POIをコードする目的の遺伝子を容易に組み込む。ワイルドカード細胞株は、従って、その発現能力について特徴付けられた、事前形成された宿主細胞株である。このことは、POI産生のために、産生細胞株を生み出すための革新的「ワイルドカード」プラットフォーム戦略を、例えば、部位特異的カセット組み込み又は部位特異的リコンビナーゼ媒介型カセット交換を用いて、追及する。このような新規な宿主細胞は、目的の遺伝子(GOI)の、例えば、所定のゲノム発現部位内への、再生可能な非常に効率的な産生細胞株を得るためのクローニングを容易にする。
好ましい態様に従い、本発明に従う発現ベクターは、宿主細胞のゲノム内への、1細胞あたり1コピー又は複数コピーでの組み込みのために好適なプラスミドである。POIをコードする組換えヌクレオチド配列もまた、1細胞あたり1コピー又は複数コピーで、自己複製プラスミドにおいて提供されてもよい。好ましいプラスミドは、真核生物発現ベクター、好ましくは、酵母発現ベクターである。
発現ベクターは、クローニングベクター、改変クローニングベクター、及び、具体的には、設計されたプラスミドが挙げられてもよいが、これらに限定されない。本発明において使用される好ましい発現ベクターは、宿主細胞における組換え遺伝子の発現に好適な任意の発現ベクターであってもよく、宿主生物に依存して選択される。組換え発現ベクターは、宿主生物のゲノム内に複製可能であるか又は組み込み可能である任意のベクターであってもよく、宿主ベクター、例えば酵母ベクターとも呼ばれ、本発明に従うDNA構築物を運ぶ。好ましい酵母発現ベクターは、ハンゼヌラ属、オガテア属、ピキア属、カンジダ属及びトルロプシス属によって表されるメチロトローフ酵母からなる群から選択される酵母における発現に好適である。
本発明において、ベクターとして、pPICZ、pGAPZ、pPIC9、pPICZalfa、pGAPZアルファ、pPIC9K、pGAPHis若しくはpPUZZLEに由来するプラスミドを使用することが、好ましい。
本発明の好ましい態様に従って、組換え構築物は、関連の遺伝子をベクター内にライゲーションすることによって、得られる。これらの遺伝子は、このようなベクターを用いて宿主細胞を形質転換することにより、宿主細胞ゲノム内に安定的に組み込まれ得る。遺伝子によってコードされるポリペプチドは、形質転換体を培養することによって、組換え宿主細胞株を用いて産生され得、従って、適切な培地中に得られ、培養物から発現されたPOIを単離し、そして発現産物に適切な方法によって精製し、特に、夾雑するタンパク質からPOIを分離する。
POIをコードするDNA配列はまた、好適なターミネーター配列、例えばAOX1(アルコールオキシダーゼ)ターミネーター、CYC1(シトクロムc)ターミネーター、TEF(転写伸長因子)ターミネーターにも、作動可能に接続されてよい。
発現ベクターは、1以上の表現型選択可能マーカー、例えば、抗生物質抵抗性を付与するか又は栄養要求性を満たすタンパク質をコードする遺伝子を、含んでいてもよい。酵母ベクターは、酵母プラスミドからの複製の起源、自己複製配列(ARS)又は代わりに宿主ゲノム内への組み込みのために使用される配列、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写停止のための配列、及び選択可能マーカーを、一般的に含む。
DNA配列、例えばリーダー配列及び/又はPOI、プロモーター及びターミネーターをコードする配列をそれぞれライゲーションするため、及び、これらを組み込み又は宿主複製のために必要な情報を含む好適なベクター内に挿入するために使用される手順は、当業者に周知であり、例えば、J.Sambrookら、「Molecular Cloning第2版」、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)によって記載される。
本発明に従うベクターは、最初に、ベクターの所望のエレメントの完全なDNA配列を含むDNA構築物を調製し、そしてこの構築物を好適な発現ベクター内に挿入することによって構築されても、又は、個々のエレメント、例えばシグナル、リーダー又はPOIについての遺伝情報を含むDNA断片を順次挿入し、その後ライゲーションすることによって構築されてもよいことが、理解される。或いは、発現カセットの個々のエレメントもまた、PCRによって融合され得る。
マルチクローニング部位を有するベクターであるマルチクローニングベクターもまた、本発明に従って使用され得、ここで、所望の遺伝子は、マルチクローニング部位に組み込まれて、発現ベクターを提供し得る。発現ベクターにおいて、プロモーターは、リーダー配列及びPOIの遺伝子の上流に置かれ、遺伝子の発現を調節する。マルチクローニングベクターの場合、リーダー配列及びPOIの遺伝子がマルチクローニング部位に導入されるので、プロモーターは、マルチクローニング部位の上流に置かれる。リーダー配列の遺伝子は、PCR反応又は合成的調製のどちらかの間、POIの遺伝子に融合されていてもよく、又はリーダー配列の遺伝子は、ベクター又は発現カセットにおいて提供され得、標準的クローニング手順によってPOIの遺伝子が導入され得る。
本発明に従って提供される発現ベクター又はカセット及びDNA構築物は、確立された標準的方法、例えばホスホルアミダイト法によって、合成的に調製されてもよい。DNA構築物はまた、ゲノム起源であってもcDNA起源であってもよく、例えば、ゲノム又はcDNAライブラリーを調製し、本発明のポリペプチドの全て又は一部をコードするDNA配列について、標準的技術(Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor、1989)に従い合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるハイブリダイゼーションによりスクリーニングすることによって、得られる。最後に、DNA構築物は、標準的技術に従って、合成起源、ゲノム起源又はcDNA起源アニーリング断片によって調製された、合成起源とゲノム起源との混合であっても、合成起源とcDNAと起源との混合であっても、又はゲノム起源とcDNA起源との混合であってもよく、適切な場合、この断片は完全なDNA構築物の種々の部分に対応する。
リーダー及び/又はPOIをコードするDNA配列が、アルゴリズム及び技術水準に従って、宿主生物のコドン使用頻度選択について最適化されてもよい(市販の供給者、例えばGeneArt、GeneCust、GenScript又はDNA2.0によって提供される)ことは当業者にとって明らかである。
別の好ましい態様において、酵母発現ベクター又はカセットは、例えば、同種組換えによって、酵母ゲノムに安定的に組み込まれ得る。
好ましい側面において、本発明は、発現ベクター又はカセットが、形質転換した宿主細胞によって成熟POIの分泌を引き起こすために有効であるリーダー配列を含む方法に関する。
本発明に従うシグナル配列又は切断型リーダーは、当業者に公知の従来のクローニング技術による組換え発現を意図して、POIをコードするヌクレオチド配列に融合され得る。好ましい態様において、POIのヌクレオチド配列は、分泌リーダーのヌクレオチド配列に融合し、従って、シグナル配列又は切断型リーダーは、タンパク質を分泌経路に標的化して、ここで、リーダーが切断されて、タンパク質が培地中に放出される。
細胞を本発明に従う発現ベクター又はカセットによって形質転換することによって得られた、本発明に従う形質転換宿主細胞は、好ましくは、まず、大きな細胞数まで効率的に増殖させる条件で、POIを発現する負荷を負うことなく培養されてもよい。POI発現についての細胞株が調製されると、発現産物を産生するための培養技術が選択される。
差次的発酵戦略は、増殖期と産生期との間を分ける。増殖及び/又は産生は、バッチ様式、フェドバッチ様式又は連続的様式で、好適に起こり得る。任意の好適なバイオリアクターが使用され得、バッチ、フェドバッチ、連続式、撹拌タンクリアクター、又はエアリフトリアクターが挙げられる。
試験的規模又は産業規模において発酵プロセスを提供することが、有益である。産業処理規模は、好ましくは、少なくとも10L、具体的には少なくとも50L、好ましくは、少なくとも1m3、好ましくは、少なくとも10m3、最も好ましくは、少なくとも100m3の容積を使用する。
産業規模での産生条件が好ましく、これは、例えば、約0.02〜0.4h-1の希釈速度で約50〜1000L又はそれ以上の発酵槽容量での、数日間の典型的な処理時間、又は連続的な方法を使用する、100L〜10m3又はそれ以上の反応容量におけるフェドバッチ培養を指す。
好適な培養技術は、バッチ相で開始し、その後、高速の特定の増殖速度にて短く急激なフェドバッチ相が続き、さらにその後、低い特定の増殖速度でフェドバッチ相が続く、バイオリアクターでの培養を含んでもよい。別の好適な培養技術は、バッチ相及びその後の低希釈速度での連続式培養相を含んでもよい。本発明の好ましい態様は、バイオマスを提供するためのバッチ培養及びその後の高収量POI産生のためのフェドバッチ培養を含む。
本発明に従う宿主細胞株を、増殖条件下でバイオリアクター内にて培養し、少なくとも1g/Lの細胞乾燥重量、より好ましくは、少なくとも10g/L細胞乾燥重量、好ましくは、少なくとも20g/L細胞乾燥重量の細胞密度を得ることが、好ましい。このような収量のバイオマス産生を、試験的規模又は産業規模で提供することが、有益である。
ここで開示される方法は、POIの発現を可能にする条件下で上記の組換え宿主細胞を培養することを、さらに含んでもよいことが、理解される。膜結合型又は可溶性の、組換え的に産生されたPOI又は宿主細胞代謝産物は、次いで、細胞培養培地から単離されて、当業者に周知の技術によって、さらに精製され得る。
宿主細胞によるPOI発現及び分泌のためのいくつかの異なるアプローチが、好ましい。タンパク質は、所望のタンパク質をコードするDNAを有する本発明に従う発現ベクター又はカセットによって真核生物を形質転換することによって、発現され、プロセシングされて分泌され、形質転換生物の培養を調製し、培養を増殖し、そしてタンパク質を培養培地から回収(例えば、細胞培養の画分にこのタンパク質を濃縮して富化する)するか、又はこのタンパク質を精製して、実質的に純粋な調製物を得る。また、(例えば、Heissら、2012;Appl Microbiol Biotechnol.doi:10.1007/s00253−012−4260−4によって記載されるように)1以上の主要な夾雑する宿主細胞タンパク質を取り除いた宿主細胞が、POIの精製を容易にするために、適用され得る。
組換えポリペプチド又はタンパク質産物を得るための単離及び精製の方法として、方法、例えば可溶性の相違を用いる方法、例えば塩析及び溶媒沈殿、分子量の相違を用いる方法、例えば限外濾過及びゲル電気泳動、電荷の相違を用いる方法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、特定の親和性を用いる方法、例えば親和性クロマトグラフィー、疎水性の相違を用いる方法、例えば逆相高速液体クロマトグラフィー、及び等電点の相違を用いる方法、例えば等電点電気泳動が、使用されてもよい。
高度に精製された産物は、夾雑するタンパク質を本質的に含まず、好ましくは、少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、又はなお少なくとも98%、100%までの純度を有する。精製産物は、細胞培養上清の精製、又はそれとも細胞屑からの精製によって、得られてもよい。
単離されたそして精製されたPOIは、従来方法、例えばウェスタンブロッティング又はその活性のアッセイによって同定され得る。精製化合物の構造は、アミノ酸分析、アミノ末端分析、一次構造分析などによって定義され得る。化合物が大容量且つ高純度レベルで入手可能であることが好ましく、従って、製薬組成物における活性成分として使用されるための必要条件を満たす。
本発明に従う好ましい宿主細胞株は、約20世代、好ましくは、少なくとも30世代、より好ましくは、少なくとも40世代、最も好ましくは、少なくとも50世代の培養の後であっても、本発明に従う調節配列及びPOI遺伝子の組み込みを維持し、発現レベルも高く、例えば少なくともμg/Lレベルで保つ。この組換え宿主細胞は、驚くほど安定的であり、このことは、産業規模のタンパク質産生のために使用する際、大きな利点である。
本発明は、以下の実施例においてさらに詳細に記載される。この実施例は、特許請求される本発明の範囲を、決して限定することを意図しない。
[実施例]
例1:P.パストリスEpx1ネイティブのリーダー(配列番号8)を分泌のために用いる、組換えタンパク質の発現のためのP.パストリス宿主細胞株の構築
1a):P.パストリスEpx1ネイティブのリーダー(シグナル配列及びプロ配列;配列番号8、EpxL−RT、「前駆配列」)を含む発現ベクターの構築
P.パストリスにおいてネイティブに分泌されたタンパク質Epx1の同定及び推定分泌リーダー配列EpxL−RT(Epx1シグナル配列及びプロ配列、実験的に決定した成熟Epx1タンパク質のN末端までからなる)の同定は、EP2258855に記載されている。成熟Epx1の実験的に証明されたN末端に先行する最後のアミノ酸は、Arg−Thr(RT)であったので、推定分泌リーダー配列は、EpxL−RTと呼ばれた。
例1:P.パストリスEpx1ネイティブのリーダー(配列番号8)を分泌のために用いる、組換えタンパク質の発現のためのP.パストリス宿主細胞株の構築
1a):P.パストリスEpx1ネイティブのリーダー(シグナル配列及びプロ配列;配列番号8、EpxL−RT、「前駆配列」)を含む発現ベクターの構築
P.パストリスにおいてネイティブに分泌されたタンパク質Epx1の同定及び推定分泌リーダー配列EpxL−RT(Epx1シグナル配列及びプロ配列、実験的に決定した成熟Epx1タンパク質のN末端までからなる)の同定は、EP2258855に記載されている。成熟Epx1の実験的に証明されたN末端に先行する最後のアミノ酸は、Arg−Thr(RT)であったので、推定分泌リーダー配列は、EpxL−RTと呼ばれた。
POIの分泌のためにP.パストリスEpx1タンパク質の分泌リーダー配列を用いる発現ベクターを産生するために、それぞれの配列(配列番号8)を、pPM2_pGAP発現ベクターのPGAPプロモーター(グリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター)のリーディングフレーム内にクローニングした。pPM2_pGAP発現ベクターは、WO2008/128701A2に記載されるpPuzzle_zeoR_AOXTTベクター骨格の誘導体であり、pUC19細菌複製起源、P.パストリスグリセロールアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、S.セレビシエCYC1転写ターミネーター及びゼオシン抗生物質抵抗性カセットからなる。
オリゴヌクレオチドプライマーを用いたP.パストリスゲノムDNAからのPCRによって、Epx1分泌リーダー配列を増幅した(表1)。
その後、PCR産物(189bp)を制限酵素SbfI及びNsiIによって消化し;そしてSbfIによって直鎖化し仔ウシ腸ホスファターゼ(CIP)で処理したpPM2_pGAPベクター内にライゲーションした。NsiI及びSbfIは重なる末端を作るので、生じた構築物pPM2_pGAPxLRTは、EpxL−RT配列の開始コドン直前に1つのSbfI部位を有する。SbfI及びAscIによる得られたプラスミドの消化により、正しい組み込みを確認した。
1b)pPM2_pGAPxLRTベクターを用いた組換えブタトリプシノゲンを分泌するP.パストリス株の構築
組換えブタトリプシノゲン(rpTRP)の発現のために、コドン最適化人工遺伝子を合成した(Geneart、Germany)。オープンリーディングフレーム側方の制限酵素Pfl23II及びSfiIのための部位を、運ばれたプラスミドをテンプレートとして用いるPCR増幅の間に付加した。プライマーを、表2.1に示す。PCR産物を、Pfl23II及びSfiIで消化し、そしてPfl23II、SfiI及びCIP処理プラスミドpPM2_pGAPxLRT(例1a)内にクローニングした。ライゲーションしたプラスミドを、大腸菌(E.coli)TOP10(Invitrogen)に形質転換し、そしてゼオシン被膜したLBアガー上でプレート培養した。制限エンドヌクレアーゼ分析を実施し、プラスミドpPM2_pGAPxLRT_rpTRPの正しいアイデンティティを確認した。
組換えブタトリプシノゲン(rpTRP)の発現のために、コドン最適化人工遺伝子を合成した(Geneart、Germany)。オープンリーディングフレーム側方の制限酵素Pfl23II及びSfiIのための部位を、運ばれたプラスミドをテンプレートとして用いるPCR増幅の間に付加した。プライマーを、表2.1に示す。PCR産物を、Pfl23II及びSfiIで消化し、そしてPfl23II、SfiI及びCIP処理プラスミドpPM2_pGAPxLRT(例1a)内にクローニングした。ライゲーションしたプラスミドを、大腸菌(E.coli)TOP10(Invitrogen)に形質転換し、そしてゼオシン被膜したLBアガー上でプレート培養した。制限エンドヌクレアーゼ分析を実施し、プラスミドpPM2_pGAPxLRT_rpTRPの正しいアイデンティティを確認した。
1c)組換えヒト血清アルブミン又は高感度緑色蛍光タンパク質pPM2_pGAPxLRTベクターを過剰発現するP.パストリス株の構築
ヒト血清アルブミン(HSA)又は高感度緑色蛍光タンパク質(eGFP)をコードする遺伝子を、Stadlmayrら(2010、J Biotechnol.150:519−529)に記載されるベクターから、表2.2に示されるプライマーを用いるPCRによって増幅した。PCR産物を、AccI及びSfiIで消化し、そしてAccI及びSfiI処理プラスミドpPM2_pGAPxLRT(例1a)内にクローニングした。ライゲーションしたプラスミドを、大腸菌TOP10(Invitrogen)に形質転換し、そしてゼオシン被膜したLBアガー上でプレート培養した。配列確認後、ベクターpPM2_pGAPxLRT−HSA及びpPM2_pGAPxLRT−eGFPを、プロモーター領域において直鎖化し、そしてP.パストリスに形質転換した。HSAについては、Stadlmayrら、2010に記載されるネイティブのHSAリーダーを用いる構築物を参照として用い、他方、eGFPを、対照としてS.セレビシエMFαリーダーの後にクローニングした。
ヒト血清アルブミン(HSA)又は高感度緑色蛍光タンパク質(eGFP)をコードする遺伝子を、Stadlmayrら(2010、J Biotechnol.150:519−529)に記載されるベクターから、表2.2に示されるプライマーを用いるPCRによって増幅した。PCR産物を、AccI及びSfiIで消化し、そしてAccI及びSfiI処理プラスミドpPM2_pGAPxLRT(例1a)内にクローニングした。ライゲーションしたプラスミドを、大腸菌TOP10(Invitrogen)に形質転換し、そしてゼオシン被膜したLBアガー上でプレート培養した。配列確認後、ベクターpPM2_pGAPxLRT−HSA及びpPM2_pGAPxLRT−eGFPを、プロモーター領域において直鎖化し、そしてP.パストリスに形質転換した。HSAについては、Stadlmayrら、2010に記載されるネイティブのHSAリーダーを用いる構築物を参照として用い、他方、eGFPを、対照としてS.セレビシエMFαリーダーの後にクローニングした。
例2:組換え分泌タンパク質の発現及び産物分析のためのP.パストリス宿主細胞株の培養
全てのプラスミドを、P.パストリスへの電気的形質転換の前に、それぞれのプロモーター領域又はAOX−TT組み込み領域において直鎖化した。陽性の形質転換体を、酵母抽出物(10g/L)、ペプトン(20g/L)、グルコース(20g/L)及びゼオシンを含むYPDアガープレート上で選別した。
全てのプラスミドを、P.パストリスへの電気的形質転換の前に、それぞれのプロモーター領域又はAOX−TT組み込み領域において直鎖化した。陽性の形質転換体を、酵母抽出物(10g/L)、ペプトン(20g/L)、グルコース(20g/L)及びゼオシンを含むYPDアガープレート上で選別した。
2a)小規模培養における、組換え分泌タンパク質を発現する形質転換P.パストリス株の培養
10g/Lグリセロールを含む5mLのYP培地(10g/L酵母抽出物、20g/Lペプトン)を、例1b、5、7、又は9からのP.パストリス株のシングルコロニーによって植菌し、28℃で一晩増殖させた。これらの培養物のアリコート(0.1の最終OD600に相当する)を、20g/Lグルコースで補った10mLの発現培養培地(培地組成は、各組換えタンパク質について下で示す)に移し、28℃にて48時間にわたり、100mLエルレンマイヤーフラスコ内で170rpmでインキュベートした。或いは、2mLの発現培養培地を、24ディープウェルプレート内での培養のために使用した。グルコース(10g/L)を、12時間毎に繰り返し加え、その後、細胞を、2500×gにて10分間室温での遠心分離により回収し、分析のために調製した。pG1駆動発現のために、グルコース制限増殖条件を、グルコースフィードビーズを用いることによって達成した(Kuhner、CH)。これは、グルコース補充の代わりに、(グルコース)=1.63*t0.74[mg/Disc]の等式に従って長時間にわたりグルコースを放出する。
10mLの主培養のために2フィードビーズを使用した。バイオマスを、1mLの細胞浮遊液の遠心分離後、細胞重量を測定することによって決定した。他方、上清における組換え分泌タンパク質の決定を、以下の例2b〜2eで記載する。
10g/Lグリセロールを含む5mLのYP培地(10g/L酵母抽出物、20g/Lペプトン)を、例1b、5、7、又は9からのP.パストリス株のシングルコロニーによって植菌し、28℃で一晩増殖させた。これらの培養物のアリコート(0.1の最終OD600に相当する)を、20g/Lグルコースで補った10mLの発現培養培地(培地組成は、各組換えタンパク質について下で示す)に移し、28℃にて48時間にわたり、100mLエルレンマイヤーフラスコ内で170rpmでインキュベートした。或いは、2mLの発現培養培地を、24ディープウェルプレート内での培養のために使用した。グルコース(10g/L)を、12時間毎に繰り返し加え、その後、細胞を、2500×gにて10分間室温での遠心分離により回収し、分析のために調製した。pG1駆動発現のために、グルコース制限増殖条件を、グルコースフィードビーズを用いることによって達成した(Kuhner、CH)。これは、グルコース補充の代わりに、(グルコース)=1.63*t0.74[mg/Disc]の等式に従って長時間にわたりグルコースを放出する。
10mLの主培養のために2フィードビーズを使用した。バイオマスを、1mLの細胞浮遊液の遠心分離後、細胞重量を測定することによって決定した。他方、上清における組換え分泌タンパク質の決定を、以下の例2b〜2eで記載する。
発現培養培地は、以下の通りである:
ブタトリプシノゲンについて:1リットルあたり:10g酵母抽出物、10gのエンドウ豆ペプトン、10.2g (NH4)2PO4、1.24g KCl、0.1g CaCl2、HClにてpH5.0に調整。
ブタトリプシノゲンについて:1リットルあたり:10g酵母抽出物、10gのエンドウ豆ペプトン、10.2g (NH4)2PO4、1.24g KCl、0.1g CaCl2、HClにてpH5.0に調整。
HSAについて:1リットルあたり:22gクエン酸、3.15g (NH4)2HPO4、0.027g CaCl2*2H2O、0.9g KCl、0.5g MgSO4*7H2O、2ml 500×ビオチン及び1.47mL微量塩ストック溶液[1リットルあたり:6g CuSO4*5H2O、0.08g NaI、3g MnSO4*H2O、0.2g Na2MoO4*2H2O、0.02g H3BO3、0.5g CoCl2、20g ZnCl2、5g FeSO4*7H2O及び5mL H2SO4];5M KOHでpHを6にした;濾過によって滅菌した。
eGFP及び抗体断片について(例えばFab):1リットルあたり:10g酵母抽出物、10gペプトン、100mMリン酸カリウム緩衝液pH6.0、13.4g酵母窒素塩基及び硫酸アンモニウム、0.4mgビオチン
2b)トリプシンの定量
P.パストリス培養上清を、小プレパック型サイズ排除クロマトグラフィーカラム(Disposable PD−10 Desalting Columns 17−0851−01;GEHealthcare)を用いて脱塩した。2.5mLの上清をカラムに適用し、3.5mLの溶出緩衝液(1mM HCl)で溶出した。溶出後、70μLの2M CaCl2溶液を、加えた。
2b)トリプシンの定量
P.パストリス培養上清を、小プレパック型サイズ排除クロマトグラフィーカラム(Disposable PD−10 Desalting Columns 17−0851−01;GEHealthcare)を用いて脱塩した。2.5mLの上清をカラムに適用し、3.5mLの溶出緩衝液(1mM HCl)で溶出した。溶出後、70μLの2M CaCl2溶液を、加えた。
不活性型トリプシノゲンを活性型トリプシンに変換するため、300μLの脱塩上清(+CaCl2)を、690μLの活性化緩衝液(50mM TRIS/HCl pH8.6;40mM CaCl2及び0.15g/Lエンテロキナーゼ、Sigma;E0632)と混合し、2時間、37℃にてインキュベートした。
165μLの活性化混合物を、1000μLのTAME−溶液(希釈緩衝液(50mM
TRIS/HCl pH8.1;40mM CaCl2)に溶解した446mg/LのNα−p−Tosyl−L−アルギニン−メチル−エステル−塩酸塩(TAME;Sigma;T4626)を含む)と混合し、247nmにおける吸収動態学を、30℃にて、5分間にわたって分光光度計で測定した。必要な場合、活性型トリプシン溶液を、希釈緩衝液で希釈し、本方法の直線範囲(ΔA247/分<0.3)に合わせた。1g/Lのトリプシン濃度は、ΔA247/分=0.101に相当する。
TRIS/HCl pH8.1;40mM CaCl2)に溶解した446mg/LのNα−p−Tosyl−L−アルギニン−メチル−エステル−塩酸塩(TAME;Sigma;T4626)を含む)と混合し、247nmにおける吸収動態学を、30℃にて、5分間にわたって分光光度計で測定した。必要な場合、活性型トリプシン溶液を、希釈緩衝液で希釈し、本方法の直線範囲(ΔA247/分<0.3)に合わせた。1g/Lのトリプシン濃度は、ΔA247/分=0.101に相当する。
2c)ELISAによるHSAの定量
P.パストリス上清におけるHSAの定量のために、ヒトアルブミンELISA Quantitation Set(Cat.No.E80−129、Bethyl Laboratories、TX、USA)を使用した。HSA標準を、400ng/mLの開始濃度で使用した。上清サンプルを、適宜希釈した。
P.パストリス上清におけるHSAの定量のために、ヒトアルブミンELISA Quantitation Set(Cat.No.E80−129、Bethyl Laboratories、TX、USA)を使用した。HSA標準を、400ng/mLの開始濃度で使用した。上清サンプルを、適宜希釈した。
2d)SDS−PAGE及びウェスタンブロット分析
タンパク質ゲル分析のために、NuPAGE(登録商標)Novex(登録商標)Bis−Tris系を、12% Bis−Tris又は4〜12% Bis−Trisゲル及びMOPS泳動緩衝液(全てInvitrogen)を用いて使用した。電気泳動後、タンパク質を、銀染色によって可視化したか、又はウェスタンブロット分析のためにニトロセスロース膜へ移行させた。従って、タンパク質を、湿(タンク)移行(Invitrogen)のためのXCell II(商標)Blot Moduleを製造業者の指示に従って用いて、ニトロセルロース膜上にエレクトロブロットした。ブロッキングの後、ウェスタンブロットを、以下の抗体でプローブ探索した:HSAについて:抗ヒト血清アルブミン−西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合体、Bethyl A80−129P(1:50000);IgGについて軽鎖:抗ヒトカッパ軽鎖(結合及び遊離)−アルカリホスファターゼ(AP)結合体化抗体、Sigma A3813(1:5000);IgG重鎖について:ヤギにおいて産生させた抗ヒト−IgG(γ−鎖特異的)−抗体、Sigma I3382(1:5000)及び抗ヤギAP結合体(1:20000)。
タンパク質ゲル分析のために、NuPAGE(登録商標)Novex(登録商標)Bis−Tris系を、12% Bis−Tris又は4〜12% Bis−Trisゲル及びMOPS泳動緩衝液(全てInvitrogen)を用いて使用した。電気泳動後、タンパク質を、銀染色によって可視化したか、又はウェスタンブロット分析のためにニトロセスロース膜へ移行させた。従って、タンパク質を、湿(タンク)移行(Invitrogen)のためのXCell II(商標)Blot Moduleを製造業者の指示に従って用いて、ニトロセルロース膜上にエレクトロブロットした。ブロッキングの後、ウェスタンブロットを、以下の抗体でプローブ探索した:HSAについて:抗ヒト血清アルブミン−西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合体、Bethyl A80−129P(1:50000);IgGについて軽鎖:抗ヒトカッパ軽鎖(結合及び遊離)−アルカリホスファターゼ(AP)結合体化抗体、Sigma A3813(1:5000);IgG重鎖について:ヤギにおいて産生させた抗ヒト−IgG(γ−鎖特異的)−抗体、Sigma I3382(1:5000)及び抗ヤギAP結合体(1:20000)。
検出を、AP−結合体についてNBT/BCIP系に基づく比色定量AP検出キット(BioRad)によって、そしてHRP−結合体について化学蛍光Super Signal West Chemiluminescent Substrate(Thermo Scientific)によって、実施した。
2e)ELISAによるFabの定量
インタクトなFabの定量を、被膜抗体(1:1000)としての抗ヒトIgG抗体(Abcam ab7497)及び検出抗体としてヤギ抗ヒトカッパ軽鎖(結合及び遊離)−アルカリホスファターゼ結合体化抗体(Sigma A3813)(1:1000)を用いたELISAによって行った。ヒトFab/カッパ、IgG断片(BethylP80−115)を、50ng/mLの開始濃度を有する標準として使用した。上清サンプルを、適宜希釈した。検出を、pNPP基質(Sigma S0942)によって行った。
被膜、希釈、及び洗浄の緩衝液は、PBS(2mM KH2PO4、10mM Na2HPO4.2H2O、2.7mM g KCl、8mM NaCl、pH7.4)に基づき、適宜、BSA(1%(w/v))及び/又はTween20(0.1%(v/v))によって仕上げられた。
インタクトなFabの定量を、被膜抗体(1:1000)としての抗ヒトIgG抗体(Abcam ab7497)及び検出抗体としてヤギ抗ヒトカッパ軽鎖(結合及び遊離)−アルカリホスファターゼ結合体化抗体(Sigma A3813)(1:1000)を用いたELISAによって行った。ヒトFab/カッパ、IgG断片(BethylP80−115)を、50ng/mLの開始濃度を有する標準として使用した。上清サンプルを、適宜希釈した。検出を、pNPP基質(Sigma S0942)によって行った。
被膜、希釈、及び洗浄の緩衝液は、PBS(2mM KH2PO4、10mM Na2HPO4.2H2O、2.7mM g KCl、8mM NaCl、pH7.4)に基づき、適宜、BSA(1%(w/v))及び/又はTween20(0.1%(v/v))によって仕上げられた。
例3:分泌のためにP.パストリスEpx1前駆配列(EpxL−RT、配列番号8)を用いるP.パストリス宿主細胞株による、組換えタンパク質の発現
3a)分泌のためにEpxL−RTを用いる、組換えブタトリプシノゲンを過剰発現するP.パストリスの分析
分泌のためにEpxL−RT配列を用いるpTRPを発現するP.パストリスを、例2aに記載されるように培養し、例2bに記載されるようにトリプシン活性アッセイを用いて、そして例2dに記載されるSDS−PAGEを用いて分析した。分泌のためにMFαを用いるpTRPを発現するP.パストリスを、参照として使用した。
3a)分泌のためにEpxL−RTを用いる、組換えブタトリプシノゲンを過剰発現するP.パストリスの分析
分泌のためにEpxL−RT配列を用いるpTRPを発現するP.パストリスを、例2aに記載されるように培養し、例2bに記載されるようにトリプシン活性アッセイを用いて、そして例2dに記載されるSDS−PAGEを用いて分析した。分泌のためにMFαを用いるpTRPを発現するP.パストリスを、参照として使用した。
予期せぬことに、EpxL−RT分泌リーダーを用いるpTRP発現は、約30kDaのタンパク質スメアをもたらした(図2.1、左側)。他方、MFαは、正しいサイズの分泌pTRPをもたらした(25kDa;図2.1、右側)。EpxL−RTを有する分泌されたpTRPの一部もまた、より少ない程度ではあるが、正しいサイズのpTRPをもたらした。EpxL−RTによって分泌されたpTRPの量は、MFαを用いて分泌された量の50%未満だった(表3、例2bに記載されるように、トリプシン活性アッセイによって測定した)。スメアのバンドは、恐らく、EpxL−RT配列の不適切なプロセシング(切断)によって出現したEpxL−RT−pTRP融合タンパク質を表す。
3b)分泌のためにEpxL−RTを用いる組換えeGFPを過剰発現するP.パストリスの分析
分泌のためにEpxL−RT配列を用いるeGFPを発現するP.パストリスを、例2aに記載するように培養し、SDS−PAGE及びウェスタンブロットを用いて分析した(例2d)。明らかに、ネイティブのEpxL−RTは、MFα(図2.2、右側)とは対照的に、eGFPを完全には分泌できなかった(図2.2、左側)。細胞内で、EpxL−RT配列の一部に未だ結合しているeGFPが観察され、そのようにしてタンパク質発現の欠陥を排除した(示さず)。
分泌のためにEpxL−RT配列を用いるeGFPを発現するP.パストリスを、例2aに記載するように培養し、SDS−PAGE及びウェスタンブロットを用いて分析した(例2d)。明らかに、ネイティブのEpxL−RTは、MFα(図2.2、右側)とは対照的に、eGFPを完全には分泌できなかった(図2.2、左側)。細胞内で、EpxL−RT配列の一部に未だ結合しているeGFPが観察され、そのようにしてタンパク質発現の欠陥を排除した(示さず)。
3c)分泌のためにEpxL−RTを用いる組換えヒト血清アルブミンを過剰発現するP.パストリスの分析
分泌のためにEpxL−RT配列を用いるHSAを発現するP.パストリスを、例2aに記載されるように培養し、そしてHSA ELISA(例2c)及びウェスタンブロット(例2d)を用いて分析した。分泌のためにネイティブのHSAリーダーを用いるHSAを発現するP.パストリスを、参照として使用した(Kobayashi.2006.Biologicals.34(1):55−9)。
分泌のためにEpxL−RT配列を用いるHSAを発現するP.パストリスを、例2aに記載されるように培養し、そしてHSA ELISA(例2c)及びウェスタンブロット(例2d)を用いて分析した。分泌のためにネイティブのHSAリーダーを用いるHSAを発現するP.パストリスを、参照として使用した(Kobayashi.2006.Biologicals.34(1):55−9)。
各構築物の12の別個のクローンを、合成スクリーニング培地中の48時間の振とうフラスコ培養の後に、その分泌挙動について分析した。上清を、還元SDS−PAGE及びその後のHSAの検出のために抗HSA抗体を用いるウェスタンブロッティングによって、定量的に試験した。EpxL−RTによって分泌されたHSAについて、顕著な二重バンドパターンが見えた(図2.3、左側)。ネイティブのリーダーによって分泌されたHSA(図2.3、右側)、及び精製したHSA(示さず)と比較し、下側バンドは、正しく処理されたHSAであった。上側バンドは予期しなかったが、僅かにより大きな分子量により、不適切にプロセシングされたEpxL−RTに起因するEpxL−RT−HSA融合タンパク質を表しているのであろう。バンド強度(ImageJによって分析される)に基づくと、全部の分泌されたHSAの40〜60%は、不適切に大きな分子量形態で表れた。
まとめ:分泌のためにEpxL−RT配列を用いる場合、分泌された組換えタンパク質について、スメア又は二重バンドパターンが見えるが、これは長いリーダーEpxL−RTの不適切なプロセシング又はプロセシングの欠如の指標である。この特徴は、EP2258855A1の完全長Epx1リーダー配列に相当するEpxL−RTが、組換えタンパク質分泌のために好適ではなく、有用ではないことを表す。
例4:HSAを発現する培養物のより高分子量のバンドのN末端の同定
次いで、上の例3c)で記載したようにEpxL−RTを用いて発現させたHSAのN末端を、N末端配列決定によってさらに分析した。
次いで、上の例3c)で記載したようにEpxL−RTを用いて発現させたHSAのN末端を、N末端配列決定によってさらに分析した。
従って、500μLのそれぞれの上清を、タンパク質を濃縮するための遠心分離フィルター(Amicon Ultra−0.5mL 10kDa centrifugal filter、Millipore、UFC5010)上にロードし、5分間遠心分離して、15μLのサンプルを、逆回転によって回収した。
その後、サンプルを、4〜12% Bis−Tris NuPAGEゲルによって分離し、そしてホウ酸塩緩衝液(1リットルあたり:3.09gホウ酸塩[50mM]、100mL MeOH、1M NaOHにてpH9にした)によるウェスタンブロットを、PVDF(フッ化ビニリデン)膜を用いて、2時間にわたって25Vにて実施した。ブロッティングの前に、ゲルを、ホウ酸塩緩衝液中で10分間にわたってインキュベートし、ここで、膜は、30秒間にわたってメタノール中に漬けられ、その後、3分間ホウ酸塩緩衝液に漬けられる。
ブロッティングの後、膜を、3分間にわたってクーマシー(0.1%[w/v]R250、MeOH[40% v/v]、酢酸[10% v/v])によって染色し、その後、脱染色した(MeOH[40% v/v]、酢酸[10% v/v])。膜を、ddH2Oですすぎ、そして上側及び下側のバンド(図3)を切り出して、N末端EDMAN配列決定をした。下側のバンドについて、DがN末端アミノ酸として、結局は、HSAの第1のアミノ酸(HSAのN末端、配列番号30:DAHKSEV)で決定され、それに対し、上側バンドについては、AYYT(配列番号31)が、分泌タンパク質のN末端として決定された。これらのアミノ酸は、EpxL−RT配列(配列番号8)の一部であり、望まない21のアミノ酸が、HSAに突出して残っている。AYYT(配列番号23)に先行するEpxL−RTの配列は、KRであり、これは、二塩基性のLys−Argペプチダーゼ切断モチーフの一部であり得る。プロテアーゼ、例えばKex2による二塩基性Lys−Argモチーフのプロセシングは、モチーフ自体だけではなく、三次元構造及び周囲のアミノ酸環境にも依存する(Baderら、2008、BMC Microbiol.8:116.)。他の酵母(例えばサッカロミセス・セレビシエ、カンジダ亜種)のEpx1ホモログの配列を用いた、EpxL−RTのBLAST分析及び配列アラインメントは、リーダー配列におけるKRモチーフが、保存されないことを明らかにした。従って、プロテアーゼ、例えばKex2によるKRモチーフのプロセシングは、配列分析に基づいては演繹的に推定できない。
例5:分泌のためにP.パストリスEpxL−KR配列(切断型リーダー、3位のXがFであり、そして16位のXがAである配列番号10(配列番号12))を用いる組換えタンパク質の発現のためのP.パストリス宿主細胞株の構築
EpxL−RTにおけるKR配列が本当にプロテアーゼ切断部位であるかどうかを試験するために、分泌のためにEpxL−KR配列を用いる組換えタンパク質の発現のためのベクターを、構築した。
EpxL−RTにおけるKR配列が本当にプロテアーゼ切断部位であるかどうかを試験するために、分泌のためにEpxL−KR配列を用いる組換えタンパク質の発現のためのベクターを、構築した。
5a)分泌のためにEpxL−KR配列を用いるHSAを過剰発現するP.パストリス株の構築
HSAを、表4.1のプライマーを用いて増幅し、そしてBglI及びSbfiIで消化したベクターpPM2_pGAPxLRT内にライゲーションした。配列確認後、ベクターpPM2_pGAPxLKR−HSAをプロモーター領域にて直鎖化し、P.パストリス内に形質転換した。
HSAを、表4.1のプライマーを用いて増幅し、そしてBglI及びSbfiIで消化したベクターpPM2_pGAPxLRT内にライゲーションした。配列確認後、ベクターpPM2_pGAPxLKR−HSAをプロモーター領域にて直鎖化し、P.パストリス内に形質転換した。
5b)分泌のためにEpxL−KR配列を用いるブタトリプシノゲン又はeGFPを過剰発現するP.パストリス株の構築
pTRPを、表4.2のプライマーを用いて増幅し、そしてPvuII及びSbfiIで消化したベクターpPM2_pGAPxLRT内にライゲーションした。発現ベクターpPM2_pGAPxLKR−eGFPを、同じように作製した。配列確認後、ベクターpPM2_pGAPxLKR−pTRP及びpPM2_pGAPxLKR−eGFPを、プロモーター領域で直鎖化し、P.パストリス内に形質転換した。
pTRPを、表4.2のプライマーを用いて増幅し、そしてPvuII及びSbfiIで消化したベクターpPM2_pGAPxLRT内にライゲーションした。発現ベクターpPM2_pGAPxLKR−eGFPを、同じように作製した。配列確認後、ベクターpPM2_pGAPxLKR−pTRP及びpPM2_pGAPxLKR−eGFPを、プロモーター領域で直鎖化し、P.パストリス内に形質転換した。
5c)分泌のためにEpxL−KR配列を用いる、抗体軽鎖又は重鎖を過剰発現するP.パストリス株の構築
抗体HyHELの軽鎖(LC)及び重鎖(HC)を、表4.3のプライマーを用いて増幅し、BglII及びSbfiIで消化したベクターpPM2_pGAPxLRT内にライゲーションした。配列確認後、ベクターpPM2_pGAPxLKR−LC及びpPM2_pGAPxLKR−HCをプロモーター領域において直鎖化し、そしてP.パストリス内に形質転換した。
抗体HyHELの軽鎖(LC)及び重鎖(HC)を、表4.3のプライマーを用いて増幅し、BglII及びSbfiIで消化したベクターpPM2_pGAPxLRT内にライゲーションした。配列確認後、ベクターpPM2_pGAPxLKR−LC及びpPM2_pGAPxLKR−HCをプロモーター領域において直鎖化し、そしてP.パストリス内に形質転換した。
例6:分泌のためにEpxL−KR(切断型リーダー、3位のXがF、及び16位のXがAである配列番号10(配列番号12))を用いるP.パストリス宿主細胞株による組換えタンパク質の発現
6a)分泌のためにEpxL−KRを用いる組換えブタトリプシノゲンを過剰発現するP.パストリスの分析
分泌のためにEpxL−KR配列を用いるpTRPを発現するP.パストリス(例5b)を、例2aで記載したように培養し、例3aのように分析した。
6a)分泌のためにEpxL−KRを用いる組換えブタトリプシノゲンを過剰発現するP.パストリスの分析
分泌のためにEpxL−KR配列を用いるpTRPを発現するP.パストリス(例5b)を、例2aで記載したように培養し、例3aのように分析した。
驚いたことに、我々は、短くしたEpx分泌リーダーEpxL−KR(図4.1、中間部)を用いることによって、プロセシングは本当に増強されたことを観察した。分泌のためにEpxL−RTを用いた際に観察されたタンパク質スメアとは対照的に(図4.1、左側)、EpxL−KRを用いたpTRPの分泌は、正しいサイズのバンドを生じた(図4.1、中間部)。EpxL−KRを用いて分泌されたpTRPの正しいN末端を、質量分析(LC−MS)によって確認した。
従って、約10μgの各サンプルを、SDS−PAGEによって分離し、そして所望のタンパク質バンドを切り出し、そしてゲル内で消化した。タンパク質を、ゲル中でカルバミドメチル化した。このタンパク質を、配列決定等級のトリプシン(Roche)、又はGlu−C(Sigma−Aldrich)、LysC(Roche)及びキモトリプシン(Roche)のどちらかで消化するか、又は消化せずに分析した。全てのタンパク分解反応を、37℃にて一晩実施した。その後、サンプルを、直接、LC−MSシステム(オンラインナノ供給源を備えたLC:Dionex Ultimate 3000 LC、MS:Bruker、amaZon ETD)に注入した。ペプチドを、C−18カラム(Dr.Maisch GmbH、C−18 HPLC カラム ReproSil−Pur 200*0.1mm、3μmパッキング、200A孔径、流速:0.4μL/分)上で分離し、95%溶媒A及び5%溶媒B(溶媒A:水中0.1% FA、ACCN中0.1%FA)から32% Bまでの線形勾配を40分間適用した後に、大きなペプチドの溶出を容易にする32% Bから75% Bまでの15分間の線形勾配を適用し、そしてデータ依存型獲得によるMSによって分析した。データを、標準Brukerソフトウェア(データ分析)及びGPMと組み合わせたフリーウェアプログラムX!−tandemを用いて処理した。
EpxL−KRによって分泌されるpTRPの正しいN末端とは対照的に、分泌のためにMFαを用いる場合に分泌されたpTRPのN末端に、アミノ酸EAEAが残されたことを決定した。さらに、EpxL−KRを用いて分泌されたpTRPの量は、一般的に使用されるMFα−分泌リーダーと比較して、20%を超えて高かった(表5)。
6b)分泌のためにEpxL−KRを用いる、組換えヒト血清アルブミンを過剰発現するP.パストリスの分析
分泌のためにEpxL−KR配列を用いる、HSAを発現するP.パストリス(例5a)を、例2aに記載されるように培養し、ウェスタンブロットを用いて分析した(例2d)。
分泌のためにEpxL−KR配列を用いる、HSAを発現するP.パストリス(例5a)を、例2aに記載されるように培養し、ウェスタンブロットを用いて分析した(例2d)。
分泌のためにEpxL−RTを用いた場合に観察された二重バンドパターン(図2.3、左側)とは対照的に、EpxL−KRを用いるHSAの分泌は、正しいサイズの一本のバンドをもたらした(示さず)。従って、EpxL−KRは、正しくプロセシングされたHSAを分泌できた。
6c)分泌のためにEpxL−KRを用いる、eGFPを過剰発現するP.パストリスの分析
分泌のためにEpxL−KR配列を用いる、eGFPを発現するP.パストリス(例5b)を、例2aに記載されるように培養し、例3bのように分析した。
分泌のためにEpxL−KR配列を用いる、eGFPを発現するP.パストリス(例5b)を、例2aに記載されるように培養し、例3bのように分析した。
EpxL−KRリーダーのみが正しいサイズのeGFPをもたらす(図4.2、左側)のに対し、MFαリーダーの残渣は、より大きな分子量のeGFPをもたらした(図4.2、右側)。LC−MS分析(例6aに記載される)は、EpxL−KRによって分泌されるeGFPの正しいN末端を確認した。このことは、分泌産物について、正しいN末端を有する分子の含量が、少なくとも95%、好ましくは、少なくとも98%、なおより好ましくは少なくとも99%又は約100%(w/w)であるために適格である。対照的に、MFαの使用は、Ste13アミノペプチダーゼによるリーダーペプチドの不適切なプロセシングに起因して、N末端に付加したアミノ酸配列としてアミノ酸EAEAを残した。SDS−PAGEにおけるバンドのサイズに従い、MFαによって分泌されたeGFPの多くが、N末端にEAEAが突出する不適切なアミノ酸を有する。他方、EpxL−KRによって分泌されたeGFPについて、不適切なサイズのバンドは観察されない。pTRPについて(図6a)、EpxL−KRを用いたeGFPの分泌レベルは、MFαを用いたのと比較して20%を超えて高かった(表6)。
6d)分泌のためにEpxL−KRを用いる、抗体軽鎖又は抗体重鎖を過剰発現するP.パストリスの分析
分泌のためにEpxL−KR配列を用いる、HyHEL LC又はHyHEL HCのどちらかを発現するP.パストリス(例5c)を、例2aに記載されるように培養し、例2dのように分析した。
分泌のためにEpxL−KR配列を用いる、HyHEL LC又はHyHEL HCのどちらかを発現するP.パストリス(例5c)を、例2aに記載されるように培養し、例2dのように分析した。
両抗体鎖は、EpxL−KR配列を用いて分泌され得(図4.3)、EpxL−KRが、P.パストリスにおける抗体産生のための貴重な分泌リーダーであることを確認した。
EpxL−KRによって分泌されたHyHEL LCの正しいN末端を、例6aに記載されるように、LC−MS分析によって確認した。
EpxL−KRによって分泌されたHyHEL LCの正しいN末端を、例6aに記載されるように、LC−MS分析によって確認した。
例7:分泌のためにEpxL−AA配列(配列番号21)を用いる組換えタンパク質の発現のための、P.パストリス宿主細胞株の構築
WO2010/135678及びUS20110021378は、MKLSTNLILAIAAASAVVSAA(配列番号21)のアミノ酸配列、すなわち、配列番号8のアミノ酸1〜21を記載し、これは、完全長Epx1リーダーの最初の21アミノ酸に相当する。しかし、この配列が実際に組換えタンパク質の分泌のために好適であることを示す実験データは、WO2010/135678及びUS20110021378において提供されていない。以後EpxL−AAと呼ぶこの断片が、正しくプロセシングされた組換えタンパク質の分泌を可能にするために十分であるかどうかを試験するために、我々は、分泌のためにEpxL−AA配列を用いる組換えタンパク質の発現のためのベクターを構築した。
WO2010/135678及びUS20110021378は、MKLSTNLILAIAAASAVVSAA(配列番号21)のアミノ酸配列、すなわち、配列番号8のアミノ酸1〜21を記載し、これは、完全長Epx1リーダーの最初の21アミノ酸に相当する。しかし、この配列が実際に組換えタンパク質の分泌のために好適であることを示す実験データは、WO2010/135678及びUS20110021378において提供されていない。以後EpxL−AAと呼ぶこの断片が、正しくプロセシングされた組換えタンパク質の分泌を可能にするために十分であるかどうかを試験するために、我々は、分泌のためにEpxL−AA配列を用いる組換えタンパク質の発現のためのベクターを構築した。
抗体軽鎖LC、pTRP、及びeGFPを、表7のプライマーを用いて増幅し、そしてBglI及びSfiIで消化したベクターpPM2_pGAPxLRT内にライゲーションした。配列確認後、ベクターpPM2_pGAPxLAA−LC、pPM2_pGAPxLAA−pTRP及びpPM2_pGAPxLAA−eGFPを、プロモーター領域において直鎖化し、それぞれP.パストリスに形質転換した。
例8:分泌のためにEpxL−AA(配列番号21)を用いるP.パストリス宿主細胞株による組換えタンパク質の発現
8a)分泌のためにEpxL−AAを用いる、eGFPを過剰発現するP.パストリスの分析
分泌のためにEpxL−AA配列を用いる、eGFPを発現するP.パストリス(例7)を、例2aに記載されるように培養し、例3bのように分析した。
8a)分泌のためにEpxL−AAを用いる、eGFPを過剰発現するP.パストリスの分析
分泌のためにEpxL−AA配列を用いる、eGFPを発現するP.パストリス(例7)を、例2aに記載されるように培養し、例3bのように分析した。
SDS−PAGEにおいて、EpxL−AAによるバンドのサイズは、EpxL−KRによるものよりも僅かに大きく(図5.1)、これは、少なくとも1つのAla残基がeGFPのN末端に残されていて、それにより、組換え分泌タンパク質の非ネイティブのN末端を呈示することを示している。
8b)分泌のためにEpxL−AAを用いる、組換えブタトリプシノゲンを過剰発現するP.パストリスの分析
分泌のためにEpxL−AA配列を用いる、pTRPを発現するP.パストリス(例7)を、例2aに記載されるように培養し、例3aのように分析した。
分泌のためにEpxL−AA配列を用いる、pTRPを発現するP.パストリス(例7)を、例2aに記載されるように培養し、例3aのように分析した。
pTRPは、EpxL−AA配列を用いて分泌されたが、しかし、分泌レベルは、EpxL−KR配列によるよりも低かった(表8)。SDS−PAGEにおいて、EpxL−AAによるバンドのサイズは、EpxL−KRによるよりも僅かに大きく(図5.1)、このことは、少なくとも1つのAla残基が、pTRPのN末端に残されていることを示す。
実際に、EpxL−AAによって分泌されたpTRPのN末端配列決定は、組換え分泌タンパク質のN末端が、EpxL−AA配列から残された付加アミノ酸、Alaを含み、それにより、組換え分泌タンパク質の非ネイティブのN末端を呈示することを明らかにした。
8c)分泌のためにEpxL−AAを用いる、LCを過剰発現するP.パストリスの分析
分泌のためにEpxL−AA配列を用いる、HyHEL LCを発現するP.パストリス(例7)を、例2aに記載されるように培養し、例2dのように分析した。LCについて、EpxL−AAによる分泌レベルは、EpxL−KR又はMFアルファと比較して低かった(図5.2)。pTRPについて、EpxL−AAによって分泌されたLCのN末端配列決定は、組換え分泌タンパク質のN末端が、EpxL−AA配列が残した付加アミノ酸、Alaを含んだことを示した。
分泌のためにEpxL−AA配列を用いる、HyHEL LCを発現するP.パストリス(例7)を、例2aに記載されるように培養し、例2dのように分析した。LCについて、EpxL−AAによる分泌レベルは、EpxL−KR又はMFアルファと比較して低かった(図5.2)。pTRPについて、EpxL−AAによって分泌されたLCのN末端配列決定は、組換え分泌タンパク質のN末端が、EpxL−AA配列が残した付加アミノ酸、Alaを含んだことを示した。
これはやはり、シグナル配列に由来する望まぬ残基であり、分泌された組換えタンパク質の産生に対し、EpxL−AAを好適でないものとする。
例9:分泌のためにEpxL−A配列(シグナルペプチド配列、3位のXがFであり、そして16位のXがAである配列番号1、配列番号3)を用いる組換えタンパク質の発現のための、P.パストリス宿主細胞株の構築
従って、我々は、ネイティブのEpx1リーダー(EpxL−Aと呼ぶ)の最初の20アミノ酸のみからなるシグナル配列によって、組換えタンパク質を分泌するP.パストリス株を構築した。Alaは、予測されたシグナルペプチダーゼ切断部位(のC末端)の前の最後のアミノ酸を表し、ここで、SP切断部位のN末端側において、組換えタンパク質が直ちに開始する。このN末端アミノ酸の性質がSPの切断に影響を与えないことを確認するために、我々は、3つの異なる組換えタンパク質:eGFP(疎水性アミノ酸Valで開始する)、並びに抗体LC及びHC(負に荷電したアミノ酸Aspで開始する)の分泌を試験した。
従って、我々は、ネイティブのEpx1リーダー(EpxL−Aと呼ぶ)の最初の20アミノ酸のみからなるシグナル配列によって、組換えタンパク質を分泌するP.パストリス株を構築した。Alaは、予測されたシグナルペプチダーゼ切断部位(のC末端)の前の最後のアミノ酸を表し、ここで、SP切断部位のN末端側において、組換えタンパク質が直ちに開始する。このN末端アミノ酸の性質がSPの切断に影響を与えないことを確認するために、我々は、3つの異なる組換えタンパク質:eGFP(疎水性アミノ酸Valで開始する)、並びに抗体LC及びHC(負に荷電したアミノ酸Aspで開始する)の分泌を試験した。
抗体軽鎖LC、Fab−HC、及びeGFPを、表9のプライマーを用いて増幅し、そしてBglI及びSfiIで消化したベクターpPM2_pGAPxLRT内にライゲーションした。配列確認後、ベクターをプロモーター領域において直鎖化し、そしてP.パストリスに形質転換した。
LC及びFab−HCについて、pGAPプロモーターもまた、ApaI及びSbfIを用いて誘導性pG1プロモーター(配列番号9)と交換し、次いで、両鎖についての発現カセットを、適合する制限酵素MreI及びAgeIを用いることによって、1つのベクター上に合わせた。配列確認後、このベクターをAOX−TT領域において直鎖化し、そしてP.パストリスに形質転換した。
例10:分泌のためにEpxL−A(シグナルペプチド配列、3位のXがFであり、そして16位のXがAである配列番号1(配列番号3))を用いる、P.パストリス宿主細胞株による組換えタンパク質の発現
10a)分泌のためにEpxL−Aを用いる、eGFPを過剰発現するP.パストリスの分析
分泌のためにEpxL−A配列を用いてeGFPを発現するP.パストリス(例9)を、例2aに記載されるように培養し、例3bのように分析した。
10a)分泌のためにEpxL−Aを用いる、eGFPを過剰発現するP.パストリスの分析
分泌のためにEpxL−A配列を用いてeGFPを発現するP.パストリス(例9)を、例2aに記載されるように培養し、例3bのように分析した。
図5.1に見られるように、EpxL−Aを用いるeGFPの分泌レベルは、EpxL−KRと同等であり、EpxL−AAよりも高かった。
Kottmaierら(2011 Appl Microbiol Biotechnol.91:133−141)に記載されるヒドロホビンシグナル及びリーダー配列、並びにMFαプレプロリーダーとは対照的に、EpxL−A配列及びEpxL−KR配列は、eGFPの液胞標的化をもたらさない(共焦点レーザー走査顕微鏡観察によって証明された。データ示さず)。両株は、分泌経路に存在するタンパク質を表す、細胞内eGFP分布を示す(染色は、主に小胞体である);従って、EpxL−Aシグナルペプチド及びEpxL−KR切断型リーダーは、「分泌表現型」を示すので、組換えタンパク質分泌に十分に適すると考えられる。
10b)分泌のためにEpxL−Aを用いる、LCを過剰発現するP.パストリスの分析
分泌のためにEpxL−A配列を用いてHyHEL LCを発現するP.パストリス(例9)を、例2aに記載されるように培養し、例6dのように分析した。
分泌のためにEpxL−A配列を用いてHyHEL LCを発現するP.パストリス(例9)を、例2aに記載されるように培養し、例6dのように分析した。
抗体軽鎖の分泌のためのEpxL−Aの使用は、正しいサイズのタンパク質(図5.2)をもたらし、ここで、分泌は、EpxL−KRによるものと同じくらい効率的で、EpxL−AAによるものよりも8倍高かった(表10)。ImageJソフトウェアを使用して、図5.2に示されるゲル上のバンド強度を定量することにより、分泌レベルを比較した。
EpxL−Aによって分泌されるLCのN末端が、正しいN末端DIVLTQSP(Asp−Ile−Val−Leu−Thr−Gln−Ser−Pro、配列番号54)であることを、LC−MSによって確認した。
従って、Epx1、EpxL−Aのシグナルペプチドは、より長い配列EpxL−AAとは対照的に、正しいN末端を有する組換えタンパク質を分泌するのに十分であり且つ好適である。
構成的pGAPプロモーターの制御下での発現に加え、EpxL−AによるLCの分泌を、誘導性pG1プロモーター(配列番号9)の制御下で試験した。株構築を、例9に記載した。スクリーニング培養物におけるグルコース制限条件を、例2aに記載されるように、グルコースフィードビーズを用いて作成した。このような誘導条件下で、軽鎖の分泌を観察した。
10c)分泌のためにEpxL−Aを用いる、抗体Fab断片を過剰発現するP.パストリスの分析
両鎖の分泌のためにEpxL−A配列を用いてHyHEL抗体のFab断片(軽鎖(vL及びcL)並びに重鎖断片(vH及びcH1)からなる)を発現するP.パストリス(例9に記載する株)を、例2aに記載されるように培養し、例2d及び2eのように分析した。
両鎖の分泌のためにEpxL−A配列を用いてHyHEL抗体のFab断片(軽鎖(vL及びcL)並びに重鎖断片(vH及びcH1)からなる)を発現するP.パストリス(例9に記載する株)を、例2aに記載されるように培養し、例2d及び2eのように分析した。
驚いたことに、HyHEL FabのLC及びHCの両方の分泌のためにEpxL−A配列を用いることにより、分泌されたインタクトなFabのレベルが、MFαプレプロリーダーによるものよりも最大10倍高かった(例2eに記載されるようにELISAによって決定した)。バイオマスあたりのFab収量は、分泌のためにMFαを用いた場合の0.03〜0.13mg Fab/ODと比較して、EpxL−Aを用いた場合に0.15〜0.35mg Fab/ODであった。さらに、EpxL−Aにより、pG1の制御下でHyHEL Fabを分泌するP.パストリスの上清は、高レベルの遊離LC又は組換えタンパク質のより高分子量の凝集体を含まない(図5.3)。
例11:分泌のためにEpxL−A(シグナルペプチド配列、3位のXがFであり、そして16位のXがAである配列番号1(配列番号3)を用いる、P.パストリス宿主細胞株による組換えタンパク質の発現
EpxL−A(配列番号3)を用いることによるP.パストリスからの8種のタンパク質の分泌を、試験した:ヒト成長ホルモン(HGH)、ソマトトロピン、インターフェロンアルファ2a(IFN−α2a)、2つの異なるhis−タグ化scFv(scFv1及びscFv2)並びに3つの異なるFab(Fab1、Fab2及びFab3)。
EpxL−A(配列番号3)を用いることによるP.パストリスからの8種のタンパク質の分泌を、試験した:ヒト成長ホルモン(HGH)、ソマトトロピン、インターフェロンアルファ2a(IFN−α2a)、2つの異なるhis−タグ化scFv(scFv1及びscFv2)並びに3つの異なるFab(Fab1、Fab2及びFab3)。
遺伝子を、P.パストリスについてコドン最適化し、そしてGeneArt(Germany)によって合成した。得られたベクターを、SbfI及びSfiIによって消化し、そして遺伝子を、ベクターpPM2aZ30_pG1内にライゲーションした。Fabの場合、両鎖についての発現カセットを、適合性の制限酵素、MreI及びAgeIを使用することによって、1つのベクター上に合わせた。配列確認後、ベクターを、AOXターミネーター領域において直鎖化し、P.パストリスに形質転換した。
分泌のためにEpxL−A配列(配列番号3)を用いる、組換えタンパク質(ヒト成長ホルモン、ソマトトロピン、インターフェロンアルファ2a、2つのhis−タグ化scFv(scFv1及びscFv2)並びに3つのFab(Fab1、Fab2及びFab3)(Fabは、軽鎖(vL及びcL)並びに重鎖断片(vH及びcH1)からなる))を発現するP.パストリス株を、1リットルあたり:10g酵母抽出物、10gペプトン、100mMリン酸カリウム緩衝液pH6.0、13.4g酵母窒素塩基及び硫酸アンモニウム並びに0.4mgビオチンを含む培地中で培養した。小規模スクリーニングを、2フィードビーズにより、24ウェルプレートにおいて実施した(Kuhner、径6mm)。
上清を、例2dのように分析した。POIを、特定の抗体の使用によってウェスタンブロットにおいて検出した:ソマトトロピン及びヒト成長ホルモンについて:GH1ポリクローナル抗体;Proteintech 17867−1AP(1:5000)及び抗ウサギIgG(分子全体)−アルカリホスファターゼ抗体、Sigma A3687(1:12000)。インターフェロン−アルファ2aについて:インターフェロンアルファ2a抗体;抗体−オンラインABIN573795(1:1,500)及び抗ウサギIgG(分子全体)−アルカリホスファターゼ抗体、Sigma A3687(1:12000)。His−タグ化scFvについて:ペンタ−His HRP結合体;QIAGEN 10149928(1:1,500)。
EpxL−A配列(配列番号3)を使用した場合、全ての試験したタンパク質は、培養培地中に首尾よく分泌された(図6)。
EpxL−A配列(配列番号3)を使用した場合、全ての試験したタンパク質は、培養培地中に首尾よく分泌された(図6)。
以下に、出願当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
[1]
a)配列番号10のアミノ酸配列を有するリーダーペプチド、又は1若しくは2の点変異を有するその機能的バリアント、及び
b)配列番号11、12、13及び14からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するリーダーペプチド
からなる群から選択されるリーダーをコードし、
好ましくは、リーダーペプチドをコードする、配列番号18、19及び20からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は配列番号18、19、若しくは20のいずれかのコドン最適化バリアントである、単離された核酸。
[2]
配列番号12のアミノ酸配列を有するリーダーペプチドであるリーダーをコードし、好ましくは、配列番号19のヌクレオチド配列からなるか、又は配列番号19のコドン最適化バリアントからなる、[1]に記載の核酸。
[3]
a)配列番号1のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド、又は1若しくは2の点変異を有するその機能的バリアント、及び
b)配列番号2、3、4及び5からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するシグナルペプチド
からなる群から選択されるリーダーをコードし、
好ましくは、シグナルペプチドをコードする、配列番号15、16及び17からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は配列番号15、16若しくは17のいずれかのコドン最適化バリアントである、単離された核酸。
[4]
配列番号3のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドであるリーダーをコードし、好ましくは、配列番号16のヌクレオチド配列からなるか、又は配列番号16のコドン最適化バリアントからなる、[3]に記載の核酸。
[5]
DNAである、[1]〜[4]のいずれか1に記載の核酸。
[6]
[1]〜[5]のいずれか1に記載の核酸によってコードされ、好ましくは、配列番号1、2、3、4、5、10、11、12、13及び14からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、単離されたリーダー。
[7]
配列番号3又は配列番号12のアミノ酸配列からなるペプチドである、[6]のリーダー。
[8]
POIをコードする核酸配列に作動可能に連結したリーダーをコードする核酸を含む発現カセットであって、前記リーダーが、
a)配列番号10のアミノ酸配列を有するリーダーペプチド、又は1若しくは2の点変異を有するその機能的バリアント、
b)配列番号11、12、13及び14からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するリーダーペプチド、好ましくは、リーダーペプチドをコードする、配列番号18、19及び20からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は配列番号18、19、若しくは20のいずれかのコドン最適化バリアント、
c)配列番号1のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド、又は1若しくは2の点変異を有するその機能的バリアント、並びに
d)配列番号2、3、4及び5からなる群から選択される、アミノ酸配列を有するシグナルペプチド、好ましくは、シグナルペプチドをコードする、配列番号15、16及び17からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は配列番号15、16、若しくは17のいずれかのコドン最適化バリアント、
からなる群から選択されることによって特徴付けられる、発現カセット。
[9]
前記POIが、ネイティブのN末端アミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む、[8]に記載の発現カセット。
[10]
前記POIが、抗体又はその断片、酵素及びペプチド、タンパク質抗生物質、毒素融合タンパク質、炭水化物−タンパク質結合体、構造タンパク質、調節タンパク質、ワクチン及びワクチン様タンパク質又は粒子、プロセス酵素、成長因子、ホルモン及びサイトカインを含む治療用タンパク質から選択されるか、又は前記POIが、好ましくは抗体又はその断片、成長因子、ホルモン及びサイトカインからなる群から選択される、宿主細胞代謝産物の産生を媒介する、[8]又は[9]に記載の発現カセット。
[11]
前記POIが、成長因子、ホルモン、サイトカイン、抗体及び抗体断片からなる群から選択され、抗体及び抗体断片が、好ましくは、完全長抗体、scFv、ミニボディ、ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディ、Fab及びFc融合タンパク質からなる群から選択される、[10]に記載の発現カセット。
[12]
前記リーダーをコードする前記核酸に作動可能に連結したプロモーターをさらに含む、[8]〜[11]のいずれか1に記載の発現カセット。
[13]
[8]〜[12]のいずれか1に記載の発現カセットを含む、組換え酵母宿主細胞又はベクター。
[14]
前記酵母が、ピキア属、カンジダ属、トルロプシス属、アークスラ属、ハンゼヌラ属、オガテア属、ヤロウイア属、クリベロミセス属、サッカロミセス属及びコマガタエラ属からなる群の属から選択される、[13]に記載の宿主細胞。
[15]
[13]又は[14]に記載の宿主細胞を準備すること、
前記宿主細胞を培養して、前記POIを発現させること、及び
前記POIを精製して、精製POIの調製物を得ること
を含む、酵母宿主細胞においてPOIを産生する方法。
[16]
前記POIが、ネイティブのN末端アミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む、[15]に記載の方法。
[17]
前記POIが、N末端アミノ酸残基として追加のアラニンを含まないアミノ酸配列を含む、[15]又は[16]に記載の方法。
[18]
前記POIが、抗体又はその断片、酵素及びペプチド、タンパク質抗生物質、毒素融合タンパク質、炭水化物−タンパク質結合体、構造タンパク質、調節タンパク質、ワクチン及びワクチン様タンパク質又は粒子、プロセス酵素、成長因子、ホルモン及びサイトカインを含む治療用タンパク質から選択されるか、又は前記POIが、宿主細胞代謝産物の産生を媒介する、[15]〜[16]のいずれか1に記載の方法。
[19]
前記POIが、成長因子、ホルモン、サイトカイン、抗体及び抗体断片からなる群から選択され、抗体及び抗体断片が、好ましくは、完全長抗体、scFv、ミニボディ、ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディ、Fab及びFc融合タンパク質からなる群から選択される、[18]に記載の方法。
[20]
宿主細胞からのPOIの分泌のための、及び/又は宿主細胞からのPOIの分泌を増大するための、[1]〜[5]のいずれか1に記載の核酸、又は[6]若しくは[7]に記載のリーダーの使用。
[21]
分泌POIの少なくとも60、65、70、75、80、85、90、95、98、又は100%が、ネイティブのN末端アミノ酸配列を含む、[20]に記載の使用。
以下に、出願当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
[1]
a)配列番号10のアミノ酸配列を有するリーダーペプチド、又は1若しくは2の点変異を有するその機能的バリアント、及び
b)配列番号11、12、13及び14からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するリーダーペプチド
からなる群から選択されるリーダーをコードし、
好ましくは、リーダーペプチドをコードする、配列番号18、19及び20からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は配列番号18、19、若しくは20のいずれかのコドン最適化バリアントである、単離された核酸。
[2]
配列番号12のアミノ酸配列を有するリーダーペプチドであるリーダーをコードし、好ましくは、配列番号19のヌクレオチド配列からなるか、又は配列番号19のコドン最適化バリアントからなる、[1]に記載の核酸。
[3]
a)配列番号1のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド、又は1若しくは2の点変異を有するその機能的バリアント、及び
b)配列番号2、3、4及び5からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するシグナルペプチド
からなる群から選択されるリーダーをコードし、
好ましくは、シグナルペプチドをコードする、配列番号15、16及び17からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は配列番号15、16若しくは17のいずれかのコドン最適化バリアントである、単離された核酸。
[4]
配列番号3のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドであるリーダーをコードし、好ましくは、配列番号16のヌクレオチド配列からなるか、又は配列番号16のコドン最適化バリアントからなる、[3]に記載の核酸。
[5]
DNAである、[1]〜[4]のいずれか1に記載の核酸。
[6]
[1]〜[5]のいずれか1に記載の核酸によってコードされ、好ましくは、配列番号1、2、3、4、5、10、11、12、13及び14からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、単離されたリーダー。
[7]
配列番号3又は配列番号12のアミノ酸配列からなるペプチドである、[6]のリーダー。
[8]
POIをコードする核酸配列に作動可能に連結したリーダーをコードする核酸を含む発現カセットであって、前記リーダーが、
a)配列番号10のアミノ酸配列を有するリーダーペプチド、又は1若しくは2の点変異を有するその機能的バリアント、
b)配列番号11、12、13及び14からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するリーダーペプチド、好ましくは、リーダーペプチドをコードする、配列番号18、19及び20からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は配列番号18、19、若しくは20のいずれかのコドン最適化バリアント、
c)配列番号1のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド、又は1若しくは2の点変異を有するその機能的バリアント、並びに
d)配列番号2、3、4及び5からなる群から選択される、アミノ酸配列を有するシグナルペプチド、好ましくは、シグナルペプチドをコードする、配列番号15、16及び17からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は配列番号15、16、若しくは17のいずれかのコドン最適化バリアント、
からなる群から選択されることによって特徴付けられる、発現カセット。
[9]
前記POIが、ネイティブのN末端アミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む、[8]に記載の発現カセット。
[10]
前記POIが、抗体又はその断片、酵素及びペプチド、タンパク質抗生物質、毒素融合タンパク質、炭水化物−タンパク質結合体、構造タンパク質、調節タンパク質、ワクチン及びワクチン様タンパク質又は粒子、プロセス酵素、成長因子、ホルモン及びサイトカインを含む治療用タンパク質から選択されるか、又は前記POIが、好ましくは抗体又はその断片、成長因子、ホルモン及びサイトカインからなる群から選択される、宿主細胞代謝産物の産生を媒介する、[8]又は[9]に記載の発現カセット。
[11]
前記POIが、成長因子、ホルモン、サイトカイン、抗体及び抗体断片からなる群から選択され、抗体及び抗体断片が、好ましくは、完全長抗体、scFv、ミニボディ、ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディ、Fab及びFc融合タンパク質からなる群から選択される、[10]に記載の発現カセット。
[12]
前記リーダーをコードする前記核酸に作動可能に連結したプロモーターをさらに含む、[8]〜[11]のいずれか1に記載の発現カセット。
[13]
[8]〜[12]のいずれか1に記載の発現カセットを含む、組換え酵母宿主細胞又はベクター。
[14]
前記酵母が、ピキア属、カンジダ属、トルロプシス属、アークスラ属、ハンゼヌラ属、オガテア属、ヤロウイア属、クリベロミセス属、サッカロミセス属及びコマガタエラ属からなる群の属から選択される、[13]に記載の宿主細胞。
[15]
[13]又は[14]に記載の宿主細胞を準備すること、
前記宿主細胞を培養して、前記POIを発現させること、及び
前記POIを精製して、精製POIの調製物を得ること
を含む、酵母宿主細胞においてPOIを産生する方法。
[16]
前記POIが、ネイティブのN末端アミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む、[15]に記載の方法。
[17]
前記POIが、N末端アミノ酸残基として追加のアラニンを含まないアミノ酸配列を含む、[15]又は[16]に記載の方法。
[18]
前記POIが、抗体又はその断片、酵素及びペプチド、タンパク質抗生物質、毒素融合タンパク質、炭水化物−タンパク質結合体、構造タンパク質、調節タンパク質、ワクチン及びワクチン様タンパク質又は粒子、プロセス酵素、成長因子、ホルモン及びサイトカインを含む治療用タンパク質から選択されるか、又は前記POIが、宿主細胞代謝産物の産生を媒介する、[15]〜[16]のいずれか1に記載の方法。
[19]
前記POIが、成長因子、ホルモン、サイトカイン、抗体及び抗体断片からなる群から選択され、抗体及び抗体断片が、好ましくは、完全長抗体、scFv、ミニボディ、ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディ、Fab及びFc融合タンパク質からなる群から選択される、[18]に記載の方法。
[20]
宿主細胞からのPOIの分泌のための、及び/又は宿主細胞からのPOIの分泌を増大するための、[1]〜[5]のいずれか1に記載の核酸、又は[6]若しくは[7]に記載のリーダーの使用。
[21]
分泌POIの少なくとも60、65、70、75、80、85、90、95、98、又は100%が、ネイティブのN末端アミノ酸配列を含む、[20]に記載の使用。
Claims (21)
- a)配列番号10のアミノ酸配列を有するリーダーペプチド、又は1若しくは2の点変異を有するその機能的バリアント、及び
b)配列番号11、12、13及び14からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するリーダーペプチド
からなる群から選択されるリーダーをコードし、
好ましくは、リーダーペプチドをコードする、配列番号18、19及び20からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は配列番号18、19、若しくは20のいずれかのコドン最適化バリアントである、単離された核酸。 - 配列番号12のアミノ酸配列を有するリーダーペプチドであるリーダーをコードし、好ましくは、配列番号19のヌクレオチド配列からなるか、又は配列番号19のコドン最適化バリアントからなる、請求項1に記載の核酸。
- a)配列番号1のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド、又は1若しくは2の点変異を有するその機能的バリアント、及び
b)配列番号2、3、4及び5からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するシグナルペプチド
からなる群から選択されるリーダーをコードし、
好ましくは、シグナルペプチドをコードする、配列番号15、16及び17からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は配列番号15、16若しくは17のいずれかのコドン最適化バリアントである、単離された核酸。 - 配列番号3のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドであるリーダーをコードし、好ましくは、配列番号16のヌクレオチド配列からなるか、又は配列番号16のコドン最適化バリアントからなる、請求項3に記載の核酸。
- DNAである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の核酸。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の核酸によってコードされ、好ましくは、配列番号1、2、3、4、5、10、11、12、13及び14からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、単離されたリーダー。
- 配列番号3又は配列番号12のアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項6のリーダー。
- POIをコードする核酸配列に作動可能に連結したリーダーをコードする核酸を含む発現カセットであって、前記リーダーが、
a)配列番号10のアミノ酸配列を有するリーダーペプチド、又は1若しくは2の点変異を有するその機能的バリアント、
b)配列番号11、12、13及び14からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するリーダーペプチド、好ましくは、リーダーペプチドをコードする、配列番号18、19及び20からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は配列番号18、19、若しくは20のいずれかのコドン最適化バリアント、
c)配列番号1のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド、又は1若しくは2の点変異を有するその機能的バリアント、並びに
d)配列番号2、3、4及び5からなる群から選択される、アミノ酸配列を有するシグナルペプチド、好ましくは、シグナルペプチドをコードする、配列番号15、16及び17からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は配列番号15、16、若しくは17のいずれかのコドン最適化バリアント、
からなる群から選択されることによって特徴付けられる、発現カセット。 - 前記POIが、ネイティブのN末端アミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む、請求項8に記載の発現カセット。
- 前記POIが、抗体又はその断片、酵素及びペプチド、タンパク質抗生物質、毒素融合タンパク質、炭水化物−タンパク質結合体、構造タンパク質、調節タンパク質、ワクチン及びワクチン様タンパク質又は粒子、プロセス酵素、成長因子、ホルモン及びサイトカインを含む治療用タンパク質から選択されるか、又は前記POIが、好ましくは抗体又はその断片、成長因子、ホルモン及びサイトカインからなる群から選択される、宿主細胞代謝産物の産生を媒介する、請求項8又は9に記載の発現カセット。
- 前記POIが、成長因子、ホルモン、サイトカイン、抗体及び抗体断片からなる群から選択され、抗体及び抗体断片が、好ましくは、完全長抗体、scFv、ミニボディ、ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディ、Fab及びFc融合タンパク質からなる群から選択される、請求項10に記載の発現カセット。
- 前記リーダーをコードする前記核酸に作動可能に連結したプロモーターをさらに含む、請求項8〜11のいずれか1項に記載の発現カセット。
- 請求項8〜12のいずれか1項に記載の発現カセットを含む、組換え酵母宿主細胞又はベクター。
- 前記酵母が、ピキア属、カンジダ属、トルロプシス属、アークスラ属、ハンゼヌラ属、オガテア属、ヤロウイア属、クリベロミセス属、サッカロミセス属及びコマガタエラ属からなる群の属から選択される、請求項13に記載の宿主細胞。
- 請求項13又は14に記載の宿主細胞を準備すること、
前記宿主細胞を培養して、前記POIを発現させること、及び
前記POIを精製して、精製POIの調製物を得ること
を含む、酵母宿主細胞においてPOIを産生する方法。 - 前記POIが、ネイティブのN末端アミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む、請求項15に記載の方法。
- 前記POIが、N末端アミノ酸残基として追加のアラニンを含まないアミノ酸配列を含む、請求項15又は16に記載の方法。
- 前記POIが、抗体又はその断片、酵素及びペプチド、タンパク質抗生物質、毒素融合タンパク質、炭水化物−タンパク質結合体、構造タンパク質、調節タンパク質、ワクチン及びワクチン様タンパク質又は粒子、プロセス酵素、成長因子、ホルモン及びサイトカインを含む治療用タンパク質から選択されるか、又は前記POIが、宿主細胞代謝産物の産生を媒介する、請求項15〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記POIが、成長因子、ホルモン、サイトカイン、抗体及び抗体断片からなる群から選択され、抗体及び抗体断片が、好ましくは、完全長抗体、scFv、ミニボディ、ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディ、Fab及びFc融合タンパク質からなる群から選択される、請求項18に記載の方法。
- 宿主細胞からのPOIの分泌のための、及び/又は宿主細胞からのPOIの分泌を増大するための、請求項1〜5のいずれか1項に記載の核酸、又は請求項6若しくは7に記載のリーダーの使用。
- 分泌POIの少なくとも60、65、70、75、80、85、90、95、98、又は100%が、ネイティブのN末端アミノ酸配列を含む、請求項20に記載の使用。
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